Nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng chống oxy hóa cây kim thất láng (Gynura Nitidadc, Asteraceae)

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 201 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƯỚNG CHỐNG OXY HÓA CÂY KIM THẤT LÁNG (GYNURA NITIDA DC., ASTERACEAE) Hoàng Đức Thuận*, Bùi Mỹ Linh** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Kim thất láng là một loài thuộc chi Gynura, họ Cúc. Nhiều loài thuộc chi Gynura (G. procumbens, G. bicolor) được sử dụng để điều trị viêm tại chỗ, hạ huyết áp, cải thiện tuần hoàn máu, chứng thống kinh, ho ra máu và trị tiểu đường. Hiện nay, chưa có công bố nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của Kim thất láng. Đề tài bước đầu tiến hành khảo sát hoạt tính chống oxy hóa các cao chiết trên mô hình quét gốc tự do DPPH và nghiên cứu thành phần hóa học của cây Kim thất láng (Gynura nitida DC.) ở Việt Nam. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Cây Kim thất láng thu hái tại Buôn Ma Thuột, Đắc Lắc. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa trên mô hình quét gốc tự do DPPH dịch chiết cồn 96% và các cao phân đoạn ether dầu hỏa, cloroform, ethyl acetat, n-butanol, cao nước. Sử dụng phương pháp chiết ngấm kiệt với cồn 96%, phân bố lỏng – lỏng, sắc ký cột pha thuận và các phương pháp tinh chế để phân lập các hợp chất tinh khiết. Cấu trúc chất phân lập được xác định bằng phổ MS và NMR. Kết quả: Dịch chiết cồn 96% và các cao phân đoạn đều có hoạt tính chống oxy hóa với độ mạnh giảm dần cao ethyl acetat > cao chloroform > cao n-butanol > cao nước > cao ether dầu hỏa với các giá trị IC50 lần lượt là 34,29, 37,79, 166,4, 207,61, 266,46 g/ml. Từ 9,12 kg bột dược liệu chiết ngấm kiệt với cồn 96% thu được 1,24 kg dịch chiết đậm đặc. Lắc phân bố lỏng-lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần, sau đó loại dung môi thu được cao ether dầu hỏa (19,9 g), cao chloroform (45,03 g), cao ethyl acetat (4,24 g), cao n-butanol (81,25 g). Từ 4,24 g cao EA phân lập được 2 hợp chất lần lượt là uracil (16 mg), 3,7-dimethyloct-3-en-1,2,6,7-tetrol (4,2 mg). Kết luận: Dịch chiết cồn 96% và các cao phân đoạn đều thể hiện hoạt tính chống oxy hóa, trong đó, cao ethyl acetat thế hiện khả năng chống oxy hóa mạnh với IC50 lần lượt là 34,29 g/ml. Uracil và 3,7-dimethyloct-3-en- 1,2,6,7-tetrol lần đầu tiên được phân lập từ Gynura nitida. Từ khóa: Kim thất láng, hoạt tính chống oxy hóa ABSTRACT STUDY ON CHEMICAL CONSTITUENTS AND ANTIOXIDANT ACTIVITY OF GYNURA NITIDA DC., ASTERACEAE Hoang Duc Thuan, Bui My Linh * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 – No. 4 - 2019: 201 - 205 Objectives: Gynura nitida DC. belongs to the plant family Asteraceae. Many species of the genus Gynura Cass. are commonly consumed as a culinary cooked vegetable and believed to possess a wide range of benefits, such as anti-inflammatory and antihypertensive agents, improvement of blood circulation, dysmenorrhea, hemoptysis, and diabetes. The aim of this study was to analyze the phytochemical constituents, study on antioxidant activity and isolate the active compounds of Gynura nitida. Materials and Methods: Antioxidant activity was performed by DPPH radical scavenging method for 96% ethanolic extract and subextracts obtained by liquid-liquid extraction of G. nitida. Phytochemical study: percolation, liquid – liquid distribution, vaccum liquid chromatography, silica gel column *Khoa Dược - Đại học Lạc Hồng **Khoa Dược - Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS. Hoàng Đức Thuận ĐT: 097 775 2500 Email: hoangthuand08@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 2019 202 chromatography, eluted by suitable solvent system. The structures of isolated coumpounds were identified by MS, NMR spectroscopic methods. Results: The descending order of DPPH scavenging activity of G. nitida extracts was ethyl acetate > chloroform > n-butanol > water > petroleum ether with IC50 values of 34.29, 37.79, 166.4, 207.61, 266.46 g/ml, respectively. 9.1 kg of finely dried material was percolated with 96% ethanol. The ethanol residue was dissolved in water and partitioned with petroleum ether, chloroform, ethyl acetate and n-butanol to yield four subextracts after evaporation: petroleum ether (19.9 g), chloroform (45.0g), ethyl acetate (4.2 g), and n-butanol (81.3 g). From 4.2 g ethyl acetate extract, uracil (16 mg) and 3,7-dimethyloct-3-en-1,2,6,7-tetrol (4.2 mg) were isolated. Conclusion: The 96% ethanolic extract and subextracts showed potentially antioxidant activity, the ethyl acetate extract showed significant effect in scavenging DPPH radicals with IC50 value of 34.29 g/ml, respectively. The antioxidant activity-guided isolation of G. nitida led to the identification of uracil and 3,7- dimethyloct-3-en-1,2,6,7-tetrol. Key words: gynura nitida, antioxidant ĐẶT VẤN ĐỀ Kim thất láng là một loài thuộc chi Gynura, họ Cúc. Nhiều loài thuộc chi Gynura (G. procumbens, G. bicolor) đã được sử dụng trong dân gian để điều trị viêm tại chỗ, hạ huyết áp, cải thiện tuần hoàn máu, chứng thống kinh, ho ra máu và trị tiểu đường(1,3,8). Các nghiên cứu đã chứng minh rằng gốc tự do là nguyên nhân gây ra các chứng viêm, xơ vữa động mạch, Alzheimer và gây lão hóa ở người(2), các hoạt chất có tác dụng bắt gốc tự do giúp loại bỏ nguy cơ gây bệnh và bảo vệ sức khỏe con người(9). Với mong muốn bước đầu làm sáng tỏ thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của Kim thất láng, đề tài tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính chống oxy hóa các cao chiết trên mô hình quét gốc tự do DPPH của cây Kim thất láng (Gynura nitida DC.) ở Việt Nam. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu thí nghiệm. Đối tượng nghiên cứu Phần trên mặt đất cây Kim thất láng (Gynura nitida DC., Asteraceae) được thu hái tại thành phố Buôn Ma Thuột vào tháng 07/2017, tỉnh Đắc Lắc. Mẫu dược liệu được định danh bởi TS. Võ Văn Chi và PGS.TS. Bùi Mỹ Linh (nguyên giảng viên Bộ môn Dược liệu, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh. Mẫu được sấy khô, ép tiêu bản thực vật và lưu tại Bộ môn Dược liệu, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh với mã số (BĐR08-2015). Dung môi hóa chất, trang thiết bị Dung môi sử dụng trong nghiên cứu là các dung môi đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng trong phân tích bao gồm ethanol, methanol, n-hexan, chloroform và ethyl acetat của hãng Xilong (Trung Quốc) sản xuất. Silica gel sắc ký cột: silica gel hạt mịn (kích thước hạt 0,025 – 0,04 mm) và hạt vừa (kích thước hạt 0,04 – 0,063 mm) của hãng Merck (Đức) sản xuất. Silica gel sắc ký lớp mỏng: bản nhôm tráng sẵn Silica gel GF254 (Merck). Phổ khối (ESI-MS) được đo trên máy ALIGENT 1100 MC-LSD Trap tại Viện Công nghệ hóa học. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: 1H- NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC được đo trong dung môi DMSO-d6 trên máy Bruker AM 500 FT-NMR spectrometer tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam. Chiết xuất, phân lập Bột dược liệu khô (9,12 kg) được xay mịn tới kích thước 0,1 mm, được chiết ngấm kiệt bằng ethanol 96%. Ngâm dược liệu 24 giờ rồi rút dịch chiết với tốc độ 3 ml/phút. Tổng dịch chiết thu được là 90 lít. Cô thu hồi dung môi, thu được 1,24 kg cao toàn phần, để lạnh loại chlorophyll tách lớp. Cao toàn phần sau khi loại chlorophyll Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 203 được thêm nước với tỷ lệ 1:1, lần lượt lắc phân bố với các dung môi có độ phân cực tăng dần : ether dầu hỏa, cloroform, ethyl acetat, n-butanol (với tỷ lệ cao toàn phần: dung môi là 2:1, chiết nhiều lần cho tới khi dịch chiết nhạt màu). Cô thu hồi dung môi thu 4 cao đặc: ether dầu hỏa (19,9 g), cloroform (45,03 g), ethyl acetat (4,24 g), n-buthanol (81,25 g). Phần dịch còn lại đem cô thu hồi dung môi thu được cao nước (207,61 g). Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH Nguyên tắc DPPH (l,l-diphenyl-2-picrylhydrazyl) là chất tạo ra gốc tự do được dùng để thực hiện phản ứng mang tính chất sàng lọc có tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu. Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc đánh bắt gốc tự do, làm giảm màu của DPPH chuyển từ màu tím sang màu vàng nhạt, sự giảm màu đó sẽ được xác định bằng cách đo quang ở bước sóng 517 nm. Tiến hành đo quang 3 lần, lấy giá trị trung bình. Tiến hành Dùng 0,5 ml dung dịch DPPH (nồng độ 0,5 mM trong methanol, pha dùng trong ngày) cho vào 0,5 ml dung dịch cao thử có nồng độ khác nhau, thêm 3 ml methanol. Hỗn hợp được lắc đều và ủ ở nhiệt độ phòng trong bóng tối. Sau 30 phút, đo độ hấp thu ở bước sóng 517 nm. Tiến hành đồng thời với mẫu trắng (4 ml MeOH), mẫu chứng (0,5 ml DPPH + 3,5 ml methanol). Tiến hành 3 lần, lấy giá trị trung bình. Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) được tính theo công thức: chung thu chung trang Abs Abs HTCO(%) x100% Abs Abs Abschung: độ hấp thu mẫu chứng, Absthu: độ hấp thu mẫu thử, Abstrang: độ hấp thu mẫu chứng trắng. Xây dựng đường chuẩn y = ax + b với phần trăm ức chế DPPH ở các nồng độ khác nhau. Từ đó, tính giá trị IC50 của vitamin C và các cao chiết. KẾT QUẢ Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa: Dịch chiết cồn 96% và các cao phân đoạn đều có hoạt tính chống oxy hóa với độ mạnh giảm dần cao ethyl acetat (EA) > cao chloroform (CF) > cao n- butanol (n-BuOH)> cao nước > cao ether dầu hỏa (EP) với IC50 lần lượt là 34,29, 37,79, 166,4, 207,61, 266,46 g/ml (Bảng 1, Hình 1). Bảng 1. Bảng giá trị IC50 của các cao cây Kim thất láng Mẫu Cao tổng Cao EP Cao CF Cao EA Cao n-BuOH Cao nước Acid ascorbic Giá trị IC50 (µg/ml) 98,95 266,46 37,79 34,29 166,4 207,61 2,26 Hình 1. Biểu đồ so sánh giá trị IC50 của các dịch chiết Kim thất láng Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 2019 204 Trong các cao phân đoạn, cao ethyl acetat và cao cloroform là có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất với các giá trị IC50 lần lượt là 34,29 và 37,79 g/ml, tiếp đó là cao n-butanol, cao nước và cao ether dầu hỏa với IC50 lần lượt là 166,4, 207,6, 266,5 g/ml. Cao ethyl acetat cho hoạt tính chống oxy hóa mạnh và là phân đoạn tập trung nhiều polyphenol. Như vậy, cao ethyl acetat là phân đoạn chủ đạo quyết định hoạt tính chống oxy hóa của cây Kim thất láng. Tiến hành sắc ký cột nhanh cao ethyl acetat thu được 9 phân đoạn (PĐ 1-9). Phân đoạn 4 (PĐ-4) được triển khai qua sắc ký cột rây phân tử sephadex LH-20 thu được hợp chất 1 (4,2 mg). Từ phân đoạn PĐ-6 thu được tủa màu xám, tủa được rửa sạch bằng methanol thu được hợp chất 2 (16 mg). Hợp chất 1 Bảng 2. Dữ liệu NMR ((DMSO-d6, 500 MHz) hợp chất 1 C DEPT C ppm H ppm, m (J, Hz) HMBC (H Cn) -NH - 10,96 s - 2 >C=O 151,5 - - -NH - 10,79 s - 4 >C=O 164,3 - - 5 >CH- 100,2 5,44 d (1H; 7.5 Hz) C-4, C-6 6 >CH- 142,1 7,38 t (1H; 6.0 Hz) C-2, C-4, C-5 Bột vô định hình màu vàng nâu, phổ ESI-MS m/z [M-H]- = 111,1, ứng với khối lượng phân tử 112, công thức phân tử C4H4N2O2. Phổ 1H-NMR, 13C-NMR (DMSO-d6) được trình bày ở Bảng 1. Trên phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz), có 4 tín hiệu, trong đó có 2 tín hiệu của 2 hydro linh động ở δH 10,98 và 10,79, đây là 2 proton gắn N. Hai tín hiệu proton còn lại ở δ 7,38 t (6,0) và δ 5,45 d (7,5) có khả năng là liên kết đôi –CH=CH- cấu dạng cis. Quan sát phổ 13C-NMR, thấy có 4 tín hiệu, trong đó có hai tín hiệu δ 164,3 và 151,4 ppm có thể là tín hiệu nhóm amid –CO-N-. Hai tín hiệu carbon còn lại ở vị trí 100,2 và 142,1 ppm, dựa trên phổ HSQC thì đây là tín hiệu của 2 carbon của liên kết đôi –CH=CH-. Kết hợp các dữ liệu và so sánh với tài liệu tham khảo(7) hợp chất 1 được xác định là uracil (Bảng 2). Hợp chất 2 Dạng dịch đậm đặc không màu, phổ khối ESI-MS cho pic ion tại m/z 227,2 [M+Na]+ và 431,3 [2M+Na]+ tương ứng khối lượng phân tử là 204, tương ứng với công thức phân tử là C10H20O4. Phổ 1H-NMR, 13C-NMR (DMSO-d6) được trình bày ở Bảng 1. Trên phổ 13C-NMR kết hợp các dữ liệu trên DEPT và HSQC, thấy có 1 tín hiệu oxymethylen –CH2O- tại δ 64,7 ppm, 2 tín hiệu oxymethin -CH-O- tại δ 77,7 và 77,0 ppm, 1 tín hiệu -CIV-O- tại δ 71,6 ppm, 1 nhóm – CH2- tại δ 29,5 ppm, 3 nhóm CH3- tại δ 26,4; 24,4; 12,3 ppm. Cặp tín hiệu tại δ 135,7 và 124,3 ppm cho thấy trong cấu trúc có 1 nối đôi. Trên phổ 1H-NMR, có 1 tín hiệu H gắn với Csp2 ở 5,48 ppm, có 3 tín hiệu đỉnh đơn của 3 nhóm methyl tại δ 1,01; 1,06 và 1,51 ppm, 4 tín hiệu của proton –OH gắn với Csp3 tại các vị trí δ 4,08; 4,30; 4,35; 4,56 ppm. Kết hợp các dữ liệu và so sánh với tài liệu tham khảo(6) hợp chất 2 được xác định là 3,7- dimethyl-3-octen-1,2,6,7-tetrol (Bảng 3, Hình 2). Bảng 3. Dữ liệu phổ NMR (DMSO-d6, 500 MHz) hợp chất 2 Vị trí C ppm DEPT H m (J, Hz), nH COSY (H Hn) HMBC (H Cn) 1 64,7 >CH2 3,30 t (5,5); 1H 3,27 m; 1H H-2, 1-OH C-2, C-3 2 77,7 >CH- 3,83 brs, 1H H-1, 2-OH C-1, C-3, C-4, C-9 3 135,75/135,72 C - - - 4 124,35/124,36 >CH- 5,48 brs; 1H H-5 C-2, C-5, C-9 5 29,49/29,47 >CH2 2,28 m [5] (7,0); 1H 1,85 m [6] (7,5); 1H H-4, H-6 C-3, C-4, C-6 6 77,0 >CH- 3,10 m, 1H H-5, 6-OH C-4, C-7, C-8 7 71,6 C - - - 8 24,4 -CH3 1,01 s; 3H - C-6, C-7, C-10 9 12,3 -CH3 1,51 s; 3H H-5 C-3, C-4 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 205 Vị trí C ppm DEPT H m (J, Hz), nH COSY (H Hn) HMBC (H Cn) 10 26,4 -CH3 1,06 s; 3H - C-6, C-7, C-8 - 1-OH 4,35 brs; (CH2-OH) C-1 - 2-OH 4,56 brs; (>CH-OH) C-1, C-3 - 6-OH 4,30 d (2,5); (>CH-OH) C-6, C-7 - 7-OH 4,08 s; (C-OH) - C-6, C-7, C-8, C-9 1 2 Hình 2. Dữ liệu phổ NMR (DMSO-d6, 500 MHz) hợp chất 2 BÀN LUẬN Hai hợp chất uracil và 3,7-dimethyloct-3-en- 1,2,6,7-tetrol lần đầu tiên được phân lập trong chi Gynura. Uracil là một base nitơ tham gia cấu tạo nucleosid, tham gia cấu tạo của mRNA. Uracil cũng đã được phân lập từ loài Gynostemma burmanicum(9), Boehmeria nivea(5) 3,7- dimethyloct-3-en-1,2,6,7-tetrol là một monoterpennoid, tồn tại ở dạng đồng phân dia trong tự nhiên nên trên phổ 13C-NMR xuất hiện các cặp tín hiệu xấp xỉ bằng nhau. Hợp chất này đã được phân lập từ quả loài Passiflora quadrangularis, Cnidium monnieri(4). Hiện nay, chưa có các nghiên cứu công bố về tác dụng chống oxy hóa và tác dụng dược lý của uracil và 3,7-dimethyloct-3-en-1,2,6,7-tetrol, đề tài sẽ tiếp tục khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của hai hợp chất này trong thời gian sắp tới. KẾT LUẬN Dịch chiết cồn 96% và các cao phân đoạn của Kim thất láng đều thể hiện hoạt tính chống oxy hóa, trong đó, cao ethyl acetat thế hiện khả năng chống oxy hóa mạnh với giá trị IC50 là 34,29 g/ml. Hai hợp chất phân lập từ cao ethyl acetat là 3,7-dimethyloct-3-en-1,2,6,7-tetrol, uracil là những hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ cây Kim thất láng. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Algariri K, Meng KY, et al (2013). “Hypoglycemic and anti– hyperglycemic study of Gynura procumbens leaf extracts”. Asian Pacific journal of Tropical Biomedicine, 3:358-366. 2. Carmen PB, et al (2019). “Free radicals in Alzheimer's disease: Lipid peroxydation biomarkers”. Climica chimica Acta, 49:85-90. 3. Chen J, Mangelinckx S, et al (2014). “Caffeoylquinic acid derivatives isolated from the aerial parts of Gynura divaricata and their yeast α-glucosidase and PTP1B inhibitory activity”. Fitoterapia, 99:1-6. 4. Kitajima J, Aoki Y, et al (1998). “Monoterpenoid Polyols in Fruit of Cnidium monnieri”. Chemical and Pharmaceutical bulletin, 46:1580-1582. 5. Liu C, Zou K, et al (2010). “Chemical constituents from leaves of Boehmeria nivea”. China Journal of Chinese Materia Medica, 35:1432- 1434. 6. Osorio C, Duque C, and Fujimoto Y (2000). “Oxygenated monoterpenoids from badea (Passiflora quadrangularis) fruit pulp”. Phytochemistry, 53:97-101. 7. RunHui L, Heng L, et al (2009). “N-containing compounds from the traditional Chinese medicine ChanSu”. Chemistry of Natural Compounds, 45:599-600. 8. Teoh WY, Sim KS, et al (2013). “Antioxidant capacity, cytotoxicity, and acute oral toxicity of Gynura bicolor”. Evidence- Based Complementary and Alternative Medicine, pp.8-10. 9. Vũ Thị Ngọc Anh, Phạm Thanh Kỳ (2016). “Uracil, adenin, adenosin phân lập từ loài Gynostemma burmanicum King ex Chakrav. ở Việt Nam”. Tạp chí Dược học, 55:41-43. Ngày nhận bài báo: 28/07/2019 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20/08/2019 Ngày bài báo được đăng: 14/09/2019