Nghiên cứu tạo giống ngô chịu hạn bằng công nghệ gen

Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 405 NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG NGÔ CHỊU HẠN BẰNG CÔNG NGHỆ GEN Nguyễn Văn Đồng, Phạm Thị Lý Thu, Lê Thị Mai Hương, Lê Thị Lan, Nguyễn Chiến Hữu, Lê Huy Hàm Viện Di truyền Nông nghiệp SUMMARY Research on breeding of drought tolerant maize using genetic engineering Maize (Zea mays L.) is an important cereal crop not only in Vietnam but also the worldwide. Nowadays, due to global climate change, drought conditions appear more frequently causing negative impacts on annual productivity and yield in maize. Currently, 80% of maize cultivation area in Vietnam depends on natural rainfall. Based on the actual demand for drought resistant maize varieties, we has carried out reseach project "Research on breeding of drought tolerant maize using genetic engineering". The transformation experiments were conducted via Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404, EHA105, EHA101 which carry vector CaMV35S:: NPK1, CaMV35S::ZmNF-YB, CaMV35S:: ZmNAC1, SARK::IPT, rd29A:: ERA1 containing drought tolerance gene to transfer to select maize lines. The results from the first year revealed that using vector CaMV35S::ZmNF-YB containing drought tolerance gene and phosphinothricin resistant selectable marker (bar) and vector SARK::IPT containing drought tolerance gene and hygromycin resistant selectable marker (hpt) respectively is more effective than 3 extant vector. Base on this, we used 2 drought tolerance genes ZmNF-YB, IPT to generate drought tolerant transgenic maize for further studies of project. Keywords: Agrobacterium tumefaciens, maize (Zea mays L), transformation, NPK1, ZmNF-YB, ZmNAC1, IPT, ERA1, bar, hpt, immature embryos. I. ĐẶT VẤN ĐỀ* Hạn hán đang là một vấn đề toàn cầu và mối đe dọa này đang đến cùng với sự biến đổi khí hậu. Nghiên cứu về giống cây trồng chịu hạn đang là chủ đề nghiên cứu của nhiều tổ chức và các nhà khoa học nhằm phát triển giống cây trồng mới có khả năng tăng trưởng khi nguồn cung ứng nước bị thiếu, trong đó có cây ngô. Các nhà khoa học Viện Di truyền Nông nghiệp đã sử dụng công nghệ gen để tạo ra giống ngô chịu hạn đáp ứng được nhu cầu của sản xuất và sự thay đổi của khí hậu bởi cây ngô là cây trồng quan trọng hàng đầu ở nước ta. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1. Vật liệu thực vật Các cây ngô mẹ cho vật liệu phôi non của các dòng ngô chọn lọc có khả năng tiếp nhận gen lạ và tái sinh tốt được trồng tại trại thí nghiệm của Viện Di truyền Nông nghiệp. 2.1.2. Vật liệu di truyền Chúng tôi sử dụng chủng vi khuẩn A. tumefaciens (LBA4404/EHA105/EHA101) mang các vector chứa gen chịu hạn. Người phản biện: GS. TSKH. Trần Duy Quý 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng Phương pháp trồng, chăm sóc, thụ phấn, thu mẫu các dòng ngô vật liệu cho các thí nghiệm chuyển gen chịu hạn được thực hiện tại nhà lưới - Trại thực nghiệm Văn Giang, Hưng Yên theo quy trình chuẩn cấp ngành 10TCN 341 năm 2007 đối với cây ngô ( 819499.doc). 2.2.2. Phương pháp tách chiết gen và thiết kế vector Được tiến hành theo phương pháp của Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp và Phòng thí nghiệm Hệ gen học đậu tương và Di truyền phân tử, Đại học Tổng hợp Missouri (Columbia, Mỹ). Các vector mang gen chịu hạn được biến nạp vào các chủng A. tumefaciens thích hợp cho chuyển gen vào cây 1 lá mầm (LBA4404/EHA105/EHA101) bằng phương pháp xung điện theo quy trình của Weigel và Glazebrook (2002). Kiểm tra các chủng A. tumefaciens sau biến nạp bằng cách nuôi cấy trên môi trường LB có bổ sung kháng sinh thích hợp. Nuôi cấy lỏng, tách ADN plasmid theo quy VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 406 trình của Sambrook và Russell (2001). Tiến hành phản ứng PCR khuẩn lạc và ADN plasmid với cặp mồi của gen tương ứng. 2.2.3. Phương pháp biến nạp Phôi non sau khi tách được lây nhiễm và đồng nuôi cấy với vi khuẩn A. tumefaciens theo quy trình của Phạm Thị Lý Thu (2007), Hensel và cs. (2009) có cải tiến theo quy trình của Phòng thí nghiệm Hệ gen học đậu tương và Di truyền phân tử, Đậi học Tổng hợp Missouri (Columbia, Mỹ). Các phôi non sau khi lây nhiễm được cấy với mật độ 25 - 30 phôi/đĩa petri 10cm trên môi trường đồng nuôi cấy. Sau đó, phôi non lần lượt được chuyển qua các môi trường nuôi phục hồi và chọn lọc. Những mô sẹo tạo thành sống sót sau quá trình chọn lọc được đưa vào môi trường tái sinh. Cây chuyển gen tái sinh thu được trên môi trường chọn lọc được đưa ra trồng tại nhà lưới. 2.2.4. Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ mô lá ngô ADN được tách chiết và tinh sạch theo phương pháp CTAB (Hoisington, 1992) có cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm. Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của ADN tổng số bằng máy quang phổ nanodrop, sau đó tiến hành điện di trên gel agarose 1%. Dựa vào kết quả điện di có thể thấy ADN được đảm bảo về độ tinh sạch và tính nguyên vẹn, có thể dùng làm khuôn cho các phân tích sinh học phân tử. 2.2.5. Phương pháp phân tích PCR Kiểm tra sự có mặt của gen chọn lọc trong các mẫu ADN thu được sau biến nạp: Phân tích sự có mặt của gen chuyển bằng phương pháp PCR với cặp mồi HPT-F/HPT-R đặc hiệu cho gen hpt và cặp mồi BAR-F/BAR- R đặc hiệu cho gen bar (bảng1); thành phần PCR được bổ sung betaine và DMSO để tăng độ nhạy; chương trình phản ứng với cặp mồi HPT-F/HPT-R được khởi động ở 94oC/5 phút, tiếp theo là 35 chu kì ở 94oC/30 giây, 53oC/30 giây, 72oC/60 giây và kết thúc ở 72oC/5 phút; chương trình phản ứng với cặp mồi BAR- F/BAR-R được khởi động ở 94oC/5 phút, tiếp theo là 35 chu kì ở 94oC/30 giây, 57oC/30 giây, 72oC/60 giây và kết thúc ở 72oC/5 phút; Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Kiểm tra sự có mặt của gen chịu hạn trong các mẫu ADN thu được sau biến nạp: Xác định sự có mặt của gen chịu hạn bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi pRTL2_35S_F/ZmNFYB2-s-r đặc hiệu cho gen ZmNF-YB và cặp mồi pZY-End-R/IPT_F2 đặc hiệu cho gen IPT (bảng 1); thành phần PCR được bổ sung betaine và DMSO để tăng độ nhạy; chương trình phản ứng với cặp mồi pRTL2_35S_F/ZmNFYB2-s-r được khởi động ở 95oC/5 phút, tiếp theo là 35 chu kì ở 94oC/30 giây, 60oC/30 giây, 72oC/90 giây và kết thúc ở 72oC/5 phút; chương trình phản ứng với cặp mồi pZY-End-R/IPT_F2 cũng diễn ra tương tự; sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Bảng 1. Trình tự các đoạn mồi sử dụng trong nghiên cứu Đoạn mồi Trình tự HPT-F 5’-AGAAGAAGATGTTGGCGACCT-3‘ HPT-R 5’-GTCCTGCGGGTAAATAGCTG-3‘ BAR-F 5’-CTTCAGCAGGTGGGTGTAGAG-3’ BAR-R 5’-GACTCGACGACGCGTAAAAC-3’ pRTL2_35S_F 5’- ttcgcaagacccttcctcta-3’ ZmNFYB2-s-r 5’-GCCATGGCCCACAGCAGATC-3’ pZY-End-R 5’-Gtttaaactgaaggcgggaaacga-3’ IPT_F2 5’-CCAACTTGCACAGGAAAGAC-3’ * Các chỉ tiêu theo dõi và đánh giá Các thông số sau được quan tâm để đánh giá hiệu quả của quá trình nuôi cấy và biến nạp gen: Tỷ lệ tạo mô sẹo chuyển gen (%) = Số mô sẹo chuyển gen tạo thành  100%/Tổng số phôi biến nạp. Tỷ lệ tái sinh cây chuyển gen (%) = Số cây chuyển gen tái sinh  100%/Tổng số mô sẹo chuyển gen phôi hóa. Hiệu suất biến nạp (%) = Số cây hữu thụ mang gen chuyển  100%/Tổng số phôi biến nạp. Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 407 III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả biến nạp các vector mang gen chịu hạn vào một số dòng ngô chọn lọc Chúng tôi đã biến nạp 5 vector chuyển gen chịu hạn vào 3 dòng ngô chọn lọc là VH1, CM8 và VN106, kết quả thí nghiệm được thể hiện trong bảng 2. Từ kết quả thu được cho thấy hiệu quả chuyển gen của vector 2: CaMV35S::ZmNF-YB và vector 4: SARK::IPT tốt hơn so với 3 vector còn lại (vector 2 thu được số cây sống sót sau khi đưa ra đất là 64cây/470 cây tái sinh sống sót trên môi trường chọn lọc; vector 4 thu được 42cây/426 cây tái sinh; vector 1 thu được 41cây/451 cây tái sinh; vector 3 thu được 21cây/534 cây tái sinh; vector 5 không thu được cây nào). Bảng 2. Tổng hợp các thí nghiệm biến nạp với 5 vector chuyển gen chịu hạn Vector biến nạp Dòng ngô Số cây tái sinh sống sót trên môi trường chọn lọc Số cây sống sót khi đưa ra đất VH1 180 4 CM8 177 21 Vector 1: CaMV35S:: NPK1 VN106.2 94 16 VH1 369 21 CM8 72 33 Vector 2: CaMV35S:: ZmNF-YB VN106.2 29 10 VH1 246 15 CM8 123 1 Vector 3: CaMV35S:: ZmNAC1 VN106.2 165 5 VH1 318 13 CM8 68 28 Vector 4: SARK::IPT VN106.2 40 1 VH1 28 0 CM8 15 0 Vector 5: rd29A:: ERA1 VN106.2 19 0 Tổng số 1943 168 Trên cơ sở kết quả nghiên cứu bước đầu thu nhận được, chúng tôi tiếp tục thực hiện các thí nghiệm biến nạp với 2 vector plasmid mang gen chịu hạn là CaMV35S:: ZmNF-YB và SARK::IPT. Kết quả thí nghiệm được thể hiện trong bảng 3. Các vector chịu hạn có chứa gen quan tâm cùng với gen chỉ thị chọn lọc (kháng hygromycin hoặc phosphinothricin). Do đó chỉ các tế bào thực vật mang gen chuyển nạp mới phát triển được trên môi trường nuôi cấy có chất chọn lọc tương ứng. So sánh số liệu biến nạp của 2 vector mà chúng tôi đã tiến hành (bảng 3) cho thấy, thí nghiệm biến nạp sử dụng vector CaMV35S::ZmNF-YB với chỉ thị chọn lọc kháng phosphinothricin mang lại kết quả khả quan hơn hẳn so với thí nghiệm biến nạp với vector SARK::IPT có chỉ thị chọn lọc kháng hygromycin. Tỉ lệ tạo mô sẹo chuyển gen khi sử dụng vector CaMV35S::ZmNF-YB đạt từ 60,3 - 67,6% cao hơn so với tỉ lệ 30,8 - 52,5% của vector SARK::IPT. Từ kết quả biến nạp với hơn 55.000 phôi của 3 dòng ngô, chúng tôi đã đưa 139 cây ra bầu đất, khi đưa ra môi trường tự nhiên có 96 cây sống sót khỏe mạnh, trong đó có 39 cây kết hạt (hình 1). Những cây đưa ra bầu đất sống sót trong môi trường tự nhiên sẽ được thu mẫu lá để tách chiết ADN và phân tích PCR. VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 408 Bảng 3. Tổng hợp các thí nghiệm biến nạp với 2 vector chuyển gen chịu hạn Số lượng mẫu TT Vector biến nạp Dòng CCM REM ECM SeM TL tạo mô sẹo (%) TL tái sinh chồi (%) Số cây đưa ra đất Số cây sống sót khi đưa ra đất Số cây hữu thụ VH1 17000 5147 2565 893 49,8 34,8 20 5 2 CM8 10400 5009 1541 411 30,8 26,7 20 9 2 1 SARK::IPT C8H9 9000 4240 2228 709 52,5 31,8 23 18 9 VH1 8197 5945 4016 1708 67,6 42,5 30 27 7 CM8 4621 2808 1694 232 60,3 13,7 11 6 0 2 CaMV35S::ZmNF-YB C8H9 6640 4538 3067 894 67,6 29,1 35 31 19 Tổng số 55858 27687 15111 5264 139 96 39 Hình 1. Thu nhận các dòng ngô chọn lọc chuyển gen chịu hạn. Phôi non sau khi lây nhiễm trên môi trường đồng nuôi cấy (A); phôi non trên môi trường nuôi phục hồi (B); chọn lọc và tạo mô sẹo phôi hóa (C); tái sinh chồi từ mô sẹo (D); chồi tái sinh tạo rễ (E); cây tái sinh (F) từ phôi non sau biến nạp với gen chịu hạn; cây chuyển gen tái sinh đưa ra đất (G); cây chuyển gen sống sót trong môi trường tự nhiên hữu thụ tạo bắp (H) và bắp của dòng ngô chuyển gen To (I). A B C D E F G H I Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 409 3.2. Kết quả phân tích, đánh giá các cá thể thu được sau biến nạp Sau khi tiến hành thí nghiệm phân tích PCR các cây ngô chuyển gen thu được sau biến nạp, chúng tôi nhận thấy trong 96 mẫu ADN của 3 dòng ngô thí nghiệm có 16 mẫu thuộc 3 dòng VH1, CM8 và C8H9 từ thí nghiệm biến nạp với vector SARK::IPT cho kết quả dương tính với kích thước băng ADN thu được khoảng 200 bp phù hợp với gen chỉ thị chọn lọc hpt, 13 mẫu thuộc 2 dòng VH1, C8H9 từ thí nghiệm biến nạp với vector CaMV35S::ZmNF-YB cho kết quả dương tính với kích thước băng ADN thu được khoảng 500 bp phù hợp với gen chỉ thị chọn lọc bar và 10 mẫu thuộc 2 dòng trên cho kết quả dương tính với kích thước băng ADN thu được khoảng 450 bp phù hợp với một đoạn của gen ZmNF-YB. Kết quả thể hiện trong bảng 4, hình 2, 3 và hình 4. Trong tổng số 39 cây kết hạt, dòng VH1 thu được 1 cây T0 có chứa gen hpt, 7 cây T0 chứa gen bar và 6 cây mang đồng thời hai gen bar và ZmNF-YB. Dòng CM8 thu được 2 cây T0 có chứa gen hpt. Dòng C8H9 thu được 9 cây T0 có chứa gen hpt, 6 cây T0 chứa gen bar và 4 cây mang đồng thời hai gen bar và ZmNF-YB. Căn cứ vào số liệu tính toán, thống kê đến thời điểm hiện tại cho thấy hiệu suất biến nạp gen chịu hạn của dòng VH1 và C8H9 tỏ ra ưu thế hơn hẳn so với dòng CM8, VH1 đạt hiệu suất biến nạp là 0,073%, C8H9 đạt 0,060% trong khi dòng CM8 có hiệu suất biến nạp 0%. Trong 2 hệ thống biến nạp tạo cây ngô mang gen chịu hạn sử dụng 2 cấu trúc vector chọn lọc được tiến hành song song, hệ thống biến nạp sử dụng vector CaMV35S::ZmNF-YB mang lại hiệu suất biến nạp khả quan hơn so với hệ thống biến nạp sử dụng vector SARK::IPT. Kết quả này tạo cơ sở quan trọng cho những nghiên cứu chuyển gen và phân tích cây chuyển gen tiếp theo nhằm tạo ra dòng ngô biến đổi gen chịu hạn. Bảng 4. Kết quả phân tích PCR các dòng ngô chuyển gen thế hệ T0 Kết quả phân tích PCR Hiệu suất biến nạp gen chịu hạn (%) TT Vector biến nạp Dòng Cây đưa ra đất gen bar gen hpt gen ZmNF-YB gen IPT gen ZmNF-YB Gen IPT VH1 20 1 0 0 CM8 20 4 0 0 1 SARK::IPT C8H9 23 11 0 0 VH1 30 7 6 0,073 CM8 11 0 0 0 2 CaMV35S::ZmNF-YB C8H9 35 6 4 0,060 Tổng số 139 Hình 2. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose sử dụng cặp mồi HPT-F/HPT-R. M. Marker 1 kb (Fermentas); (-). Mẫu H2O; (+). Đối chứng dương tính (DNA plasmid mang gen hpt); Từ giếng C8H9.I.26a - CM8.I.18. 9 mẫu DNA tổng số tách từ lá của các cây chuyển gen thế hệ T0; Các dòng C8H9.I.26a, CM8.I.24, C8H9.I.23, H1.I.5 và CM8.I.18 có mang gen hpt; dòng C8H9.I.22, CM8.I.21a, CM8.I.20b, CM8.I.20a không mang gen hpt. VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 410 Hình 3. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose sử dụng cặp mồi BAR-F/BAR-R. M. Marker 1 kb (Fermentas); P1. Plasmitd pZY; P2. Plasmitd pZY 35S; (+). Đối chứng dương tính (DNA plasmid NFYB mang gen bar); Từ giếng C8H9.F.1-H1.F.12. 8 mẫu DNA tổng số tách từ lá của các cây chuyển gen thế hệ T0; Các dòng H1.F.5, H1.F.6, C8H9.F.7, H1.F.12 có mang gen bar; dòng C8H9.F.1, C8H9.F.2, C8H9.F.3, C8H9.F.4 không mang gen bar. Hình 4. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose sử dụng cặp mồi pRTL2_35S_F/ZmNFYB2-s- r. M. Marker 1 kb (Fermentas); (+). Đối chứng dương tính (DNA plasmid mang gen ZmNF-YB); (-). Mẫu H2O; Từ giếng C8H9.F.1- C8H9.F.15. 13 mẫu DNA tổng số tách từ lá của các cây chuyển gen thế hệ T0; Các dòng H1.F.5, H1.F.6, H1.F.6a, H1.F.6b, C8H9.F.7, H1.F.12, C8H9.F.15 có mang gen ZmNF-YB; dòng C8H9.F.1, C8H9.F.2, C8H9.F.3, C8H9.F.4 không mang gen ZmNF-YB. IV. KẾT LUẬN Qua nghiên cứu biến nạp các gen chịu hạn vào các dòng, giống ngô chọn lọc đã tiến hành trong thời gian vừa qua, chúng tôi thu được một số kết quả như sau: Sử dụng hệ thống biến nạp với 2 vector CaMV35S::ZmNF-YB, SARK::IPT chứa gen chịu hạn và gen chỉ thị chọn lọc bar (kháng phosphinothricin), gen chỉ thị chọn lọc hpt (kháng hygromycin) tương ứng mang lại kết quả chuyển nạp ổn định và đồng đều trên 2 dòng ngô chọn lọc VH1 và C8H9. Trong đó, hệ thống biến nạp sử dụng vector CaMV35S::ZmNF-YB cho thấy hiệu suất biến nạp khả quan hơn so với hệ thống sử dụng vector SARK::IPT. Tuy nhiên, đây chỉ là kết quả bước đầu vì thực tế cho thấy cây ngô là một trong những cây chịu ảnh hưởng nhiều bởi các yếu tố môi trường. Sự sinh trưởng của cây mẹ cho vật liệu phôi non trong các thời vụ khác nhau trong năm sẽ ảnh hưởng lớn đến chất lượng phôi non, do vậy, ảnh hướng tới khả năng tiếp nhận gen ngoại lai, mức độ tạo thành mô sẹo phôi hoá cũng như tỉ lệ tái sinh cây hoàn chỉnh (Phạm Thị Lý Thu 2007). Mặt khác, một yếu tố ảnh hưởng khá nhiều đến hiệu quả của quá trình chuyển gen ở cây ngô đó là khả năng sống và mức độ hữu thụ rất thấp khi đưa cây ngô chuyển gen tái sinh từ điều kiện invitro ra đất trồng. Đây cũng là một vấn đề gây khó khăn khi tiến hành các nghiên cứu chuyển gen vào đối tượng này. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Đinh Văn Trình và cs. (2009). Nghiên cứu chuyển gen nguyên cây ở ngô. Tạp chí Công nghệ sinh học 7(2):221-227. Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 411 2. Nguyễn Văn Đồng và cs. (2009). Kết quả bước đầu nghiên cứu chuyển gen kháng sâu cryIA(c)vào phôi non các dòng ngô mô hình. Tạp chí Công nghệ Sinh học 8(1): 1-8. 3. Phạm Thị Lý Thu (2007). Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non và xác định phương pháp chuyển gen thích hợp ở ngô. Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 4. Assem S., Hussein E., Hussein H., Basry M. (2009). Genetic Transformation of the Nicotiana Protein Kinase (NPK1) Gene Confers Osmotic Tolerance in Egyptian Maize. Australian Journal of Basic and Applied Sciences,3(2): 828-835. 5. Hensel G., Kastner C., Oleszczuk S., Riechen J., Kumlehn J. (2009). Agrobacterium-Mediated Gene Transfer to Cereal Crop Plants: Current Protocols for Barley, Wheat, Triticale, and Maize.International Journal of Plant Genomics 2009. 6. James C. (2012). Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2012. ISAAA Brief 44-2012. 7. Mochida K., Yoshida T., Sakurai T., Yamaguchi- Shinozaki K., Shinozaki K., Tran L-SP (2009). In silico analysis of transcription factor repertoire and prediction of stress responsive transcription factors in soybean. DNA Res. 2009. 8. Nelson E.D. Repetti P.P, Adams R.T., Creelman A.R., Wu J., Warner C.D., Anstrom C.D., Bensen J.R., Castiglioni P.P., Donnarummo G.M., Hinchey S.B., Kumimoto W.R., Maszle R.D., Canales D.R., Krolikowski A.K., Dotson B.S., Gutterson N., Sambrook J, Russell D (2001). Molecular Cloning, 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. 9. Tran L-S.P., Nishiyama R., Shinozaki Y.K., Shinozaki K. (2010). Potential utilization of NAC transcription factors to enhance abiotic stress tolerance in plants by biotechnological approach. GM Crops 1:1, 32-39.