Nghiên cứu tạo giống ngô biến đổi gen kháng sâu

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 412 NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG NGÔ BIẾN ĐỔI GEN KHÁNG SÂU Phạm Thị Lý Thu, Nguyễn Văn Đồng, Phạm Thị Hương, Lê Thị Lan, Nguyễn Thị Hòa, Nguyễn Anh Vũ, Phùng Thị Thu Hà, Lê Huy Hàm Viện Di truyền Nông nghiệp SUMMARY Studies on development of genetically modified maize for insect resistance Insects are major factor to reduce yields of maize. Plant breeding in general and insect resistant maize in particular are important areas where the breeder has been focusing. Nowadays, the genetically modified crops are developed by applying the modern biotechnology methods. Insect resistance is one of the most important traits of the genetically modified crops that have been commercialized. The research is conducted to evaluate the stability of transgene cry1A(c) in the transgenic maize lines for the purposes for development of the transgenic maize varieties for insect resistance in Vietnam. The results revealed that transgene cry1A(c) was not integrated stably into genomic of transformed maize lines of generation T0-T3 origin from VH1, VN106, HR9 and CH9. Among the transgenic lines analyzed, VH1 line has two events carrying 2-3 copies of the transgene cry1A(c). The presence of protein cry1A(c) in the transgenic maize lines from T0 to T3 generation was identified in HR9.20 and CH9.13 lines. The level of toxicity of the protein cry1A(c) in the transgenic lines against Asian stem borer 3 days old is tested under in vitro condition. After 5 days of release insects into the leaves of transgenic maize lines most of the insects were dead. This evidence is expressed remarkable in nine individuals of line CH9.13. These lines show the stability and expression of transgene. This is potential materials in order to produce the transgenic maize lines for insect resistance which could be applied in Vietnam. Keywords: Maize, Zea mays L., genetically modified crops, cry1A(c), insect resistance. I. ĐẶT VẤN ĐỀ* Ngô (Zea mays L.) là cây ngũ cốc quan trọng. Sâu hại là yếu tố hàng đầu làm giảm năng suất của cây ngô (Ali và cs., 2010). Chọn tạo giống cây trồng nói chung và giống ngô kháng sâu nói riêng là lĩnh vực quan trọng mà các nhà tạo giống đã và đang tập trung giải quyết. Ngày nay, bằng việc áp dụng các phương pháp công nghệ sinh học hiện đại các nhà khoa học đã tạo ra các giống cây trồng biến đổi gen mang đặc tính mong muốn. Kháng sâu là một trong những đặc tính quan trọng nhất của các giống cây trồng biến đổi gen đã được thương mại hóa. Trong tổng số 170,3 triệu ha cây trồng biến đổi gen trên thế giới thì ngô chuyển gen kháng sâu chiếm khoảng 7,5 triệu ha (4%) (James, 2012). Trong khuôn khổ chương trình Công nghệ sinh học nông nghiệp, Viện Di truyền Nông nghiệp đang thực hiện đề tài nghiên cứu tạo giống ngô chuyển gen kháng sâu và kháng thuốc trừ cỏ. Giai đoạn 2006-2010 nghiên cứu của đề tài đã thu nhận được các dòng ngô mô hình, dòng ngô chọn Người phản biện: GS. TSKH. Trần Duy Quý lọc thế hệ T1 mang gen kháng sâu cry1A(c). Nhằm mục đích chọn tạo được các giống ngô biến đổi gen kháng sâu tại Việt Nam, trong giai đoạn 2011- 2014 đề tài triển khai các nghiên cứu đánh giá sự ổn định của gen chuyển cry1A(c) ở các dòng ngô chuyển gen đã tạo ra. Kết quả nghiên cứu cho thấy gen chuyển nạp cry1A(c) kết hợp chưa ổn định trong hệ gen của các dòng ngô chuyển gen kháng sâu từ thế hệ T0-T3 thuộc 4 nguồn VH1, VN106, HR9 và CH9. Trong số các dòng chuyển gen phân tích, nguồn VH1 có số cá thể và số dòng chuyển gen thế hệ T3 nhiều hơn, các dòng chuyển gen mang 2-3 bản copy của gen chuyển cry1A(c). Đã xác định được sự hiện diện của protein cry1A(c) trong các dòng ngô chuyển gen từ T0-T3. Đối với dòng HR9.20 và CH9.13 các cây từ T0-T3 đều mang protein cry1A(c). Nguồn VN106 đến thế hệ T3 không thu nhận được cây nào có sự hiện diện của protein cry1A(c). Trong điều kiện invitro, chúng tôi đã đánh giá mức độ gây độc của protein cry1A(c) trong các dòng ngô chuyển gen đối với sâu đục thân châu Á 3 ngày tuổi. Sau 5 ngày thả sâu vào các dòng ngô chuyển gen hầu hết số sâu ăn lá đều bị chết, số còn sống rất ít và khác nhau Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 413 giữa các dòng chuyển gen. Có 09 cây dòng CH9.13 có tất cả số sâu thả đều bị chết do độc tố của protein cry1A(c). Các dòng chuyển gen này bước đầu thể hiện tính ổn định và biểu hiện của gen chuyển nạp, cần được tiếp tục đánh giá tính kháng sâu bền vững trong các thế hệ để tạo ra nguồn vật liệu các dòng ngô chuyển gen kháng sâu có thể áp dụng trong điều kiện Việt Nam. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu Chúng tôi sử dụng nguồn vật liệu là dòng ngô nhập nội HR9, các dòng ngô chọn lọc VN106, VH1 và CH9 thuộc tập đoàn các giống ngô của Viện Di truyền Nông nghiệp. Các dòng ngô mang gen kháng sâu cry1A(c) thế hệ T0 có nguồn gốc từ các dòng HR9, VN106, VH1 và CH9 do nhóm tác giả (Viện Di truyền nông nghiệp) tạo ra bằng kỹ thuật biến nạp gen. Sâu đục thân ngô châu Á (Ostrinia furnacalis Guenée) tuổi 3 do Viện Bảo vệ thực vật cung cấp. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng Đối với mỗi dòng ngô chuyển gen của mỗi thế hệ từ T2 chúng tôi gieo ngẫu nhiên 30 hạt, sau đó tiến hành phân tích các cá thể để đánh giá tính ổn định của gen chuyển. Các dòng ngô chuyển gen này được trồng trong nhà lưới cách ly côn trùng, loại trừ các yếu tố thiên địch. Chế độ chăm sóc cây ngô được tiến hành theo quy trình canh tác chuẩn của ngành 10TCN 341 ( 819499.doc), khi cây ra hoa tiến hành bao cách ly, tự thụ phấn bằng tay. 2.2.2. Các phương pháp phân tích sinh học phân tử Tiến hành thu mẫu khi cây ngô được 4 lá, tách chiết DNA tổng số theo phương pháp CTAB (Saghai-Maroof và cs., 1984). Phân tích PCR tiến hành với cặp mồi S- Cry1A(c) đặc hiệu cho gen cry1A(c) (bảng 1). Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR: 1 chu kỳ: 95°C - 3 phút; 30 chu kỳ: 95°C - 1 phút, 58,5°C - 30s, 72°C - 90s; và 1 chu kỳ kết thúc ở 72°C - 10 phút. Bảng 1. Trình tự đoạn mồi sử dụng trong nghiên cứu Đoạn mồi Trình tự S-Cry1A(c)-F 5’-ACAGAAGACCCTTCAATATC-3’ S-Cry1A(c)-R 5’-GTTACCGAGTGAAGATGTAA-3’ Phân tích Southern blot được tiến hành theo phương pháp lai không đồng vị phóng xạ, xác định số bản copy của gen chuyển sử dụng DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I (Roche). Xác định sự có mặt của protein cry1A(c) trong các dòng ngô chuyển gen bằng phương pháp que thử sử dụng Kit EnviroLogix QuickStixTM (Agdia, USA). 2.2.3. Đánh giá khả năng kháng sâu bằng phương pháp thử sâu invitro Các cây ngô chuyển gen kháng sâu cry1A(c) được trồng trong điều kiện nhà lưới chống côn trùng, loại trừ các yếu tố thiên địch. Đánh giá khả năng kháng sâu đục thân của dòng ngô chuyển gen so với đối chứng trong điều kiện invitro. Tiến hành thu lá khi cây đạt 5-6 lá. Lá của cây ngô chuyển gen kháng sâu và cây đối chứng được cắt thành các đoạn kích thước 4cm  5cm, mỗi dòng chọn ngẫu nhiên 5 cây. Mỗi đĩa petri đặt 3 mẫu lá, thả 5 con sâu non, sau đó giữ đĩa ở nhiệt độ 25±20C, độ ẩm 70%. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần với mỗi cây của mỗi dòng. Tỷ lệ sâu non chết trong từng đĩa sẽ được quan sát và ghi lại hàng ngày, thay lá khi lá bị héo vàng. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân tích PCR sự có mặt của gen cry1A(c) trong các dòng ngô chuyển gen kháng sâu Mẫu DNA tổng số của các dòng chuyển gen (tất cả số cây dòng T0 và T1; 30 cây/dòng T2-T3) được chúng tôi tiến hành phân tích PCR sử dụng cặp mồi S-cry1A(c) đặc hiệu cho gen cry1A(c). Chất lượng DNA tổng số tách chiết theo phương pháp CTAB (Saghai -Maroof et al., 1984) có cải tiến đạt độ tinh sạch cao, hàm lượng DNA thu được lớn (dựa trên giá trị OD) đáp ứng yêu cầu cho phân tích PCR và Southern. Kết quả phân tích PCR cho thấy sự có mặt của gen chuyển cry1A(c) đã biến động từ thế hệ T0 đến T3 ở tất cả các dòng chuyển gen nghiên cứu (bảng 2). VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 414 Bảng 2. Kết quả phân tích PCR các dòng ngô chuyển gen cry1A(c) Số dòng (số cây) có kết quả PCR dương tính TT Tên dòng T0 Thế hệ T0 Thế hệ T1 Thế hệ T2 Thế hệ T3 Nguồn HR9 5 (5) 2 (6) 1 (12) 1 (1) 1 HR9.14 1 1 3 2 HR9.20 1 1 6 1 3 HR9.34 1 3 4 HR9.32 1 0 5 HR9.42 1 0 Nguồn VH1 4 (4) 3 (23) 3 (58) 2 (23) 1 VH1.40 1 3 15 2 VH1.37 1 14 24 15 3 VH1.36 1 6 19 8 4 VH1.48 1 Nguồn VN106 6 (6) 6 (15) 5 (20) 0 1 VN106.21 1 1 9 2 VN106.30 1 6 3 3 VN106.7 1 5 5 4 VN106.19 1 1 2 5 VN106.27 1 1 1 6 VN106.20 1 1 0 Nguồn CH9 2 (2) 1 (13) 1 (3) 1(13) 1 CH9.12 1 2 CH9.13 1 13 3 13 Ở hầu hết các dòng chuyển gen, số cây/dòng và số dòng/nguồn mang gen chuyển đều giảm đáng kể từ thế hệ T0 đến T3, điều đó chứng tỏ gen chuyển nạp cry1A(c) thực tế chưa ổn định trong hệ gen của cây ngô. Trong số 4 nguồn chuyển gen, có các dòng chuyển gen thuộc nguồn VN106 đến thế hệ T3 chúng tôi không nhận được các cây có kết quả PCR dương tính, mặc dù từ thế hệ T0-T2 số cây/dòng và số dòng mang gen là tương đối nhiều so với các nguồn khác. Đến thế hệ T3, với nguồn VH1 chúng tôi nhận được số dòng và số cây/dòng có kết quả PCR dương tính cao nhất (hình 1). Hy vọng rằng đây sẽ là những dòng chuyển gen bền vững có thể được sử dụng cho các nghiên cứu chọn tạo giống ngô biến đổi gen. Hình 1. Kết quả phân tích PCR gen cry1A(c) của dòng chuyển gen VH1 thế hệ T3 (M: Thang DNA chuẩn, (+) DNA plasmid; (-): Cây VH1 không chuyển gen) 600 bp Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 415 3.2. Phân tích Southern blot gen cry1A(c) trong các dòng ngô chuyển gen Các cây thuộc các dòng ngô chuyển gen có kết quả PCR dương tính được tiếp tục phân tích Southern blot nhằm xác định số bản copy của gen chuyển cry1A(c). DNA của các mẫu chuyển gen được cắt bằng enzym BamHI, sản phẩm cắt enzyme sẽ được điện di trên gel agarose 1,2% để kiểm tra sự phân tách các băng DNA sau khi cắt. Mẫu dò cho gen cry1A(c) sử dụng từ sản phẩm PCR với cặp mồi S-cry1A(c), trình tự mồi được miêu tả trong phần phương pháp. Mẫu dò được đánh dấu theo hướng dẫn của Kit DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I (Roche). Kết quả lai Southern blot được trình bày ở bảng 3. Bảng 3. Kết quả phân tích Southern blot các dòng ngô chuyển gen cry1A(c) Số dòng có kết quả Southern blot TT Tên dòng T0 Thế hệ T0 Thế hệ T1 Thế hệ T2 Thế hệ T3 Nguồn HR9 2 2 2 1 1 HR9.14 1 1 2 HR9.20 1 1 1 3 HR9.34 4 HR9.32 5 HR9.42 Nguồn VH1 3 3 3 2 1 VH1.40 1 1 1 2 VH1.37 1 1 1 1 3 VH1.36 1 1 1 1 4 VH1.48 Nguồn VN106 4 4 2 0 1 VN106.21 1 1 1 2 VN106.30 1 1 3 VN106.7 1 1 1 4 VN106.19 1 1 5 VN106.27 6 VN106.20 Nguồn CH9 2 2 2 1 1 CH9.12 1 1 1 2 CH9.13 1 1 1 1 Kết quả lai Southern blot thu được ở bảng 3 cũng cho kết quả tương tự như phân tích PCR đối với các dòng ngô chuyển gen. Số dòng thể hiện sự có mặt và sự kết hợp của gen chuyển nạp cry1A(c) giảm rõ rệt từ thế hệ T0 đến T3 ở hầu hết các nguồn chuyển gen. Tuy nhiên chúng tôi cũng nhận được nguồn VH1 có 02 dòng có kết quả lai DNA dương tính (hình 2). Hình 2. Kết quả lai Southern blot các dòng ngô VH1 chuyển gen cry1A(c) thế hệ T3 M: Marker; 1. Đối chứng dương (DNA plasmid); cây VH1.36.25.2 (giếng 3) có 3 copy; VH1.37.66.2 (giếng 5) có 2 copy của gen chuyển cry1A(c)  VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 416 Kết quả hình 2 cho thấy trong số hai dòng T3 xuất phát từ dòng T0 là VH1.37 và VH1.36 các cây chuyển gen thế hệ T3 của chúng đều mang ít nhất 2 bản copy của gen cry1A(c): Dòng VH1.36.25.2 (giếng 3) có 3 copy; dòng VH1.37.66.2 (giếng 5) có 2 copy của gen chuyển cry1A(c), đoạn gen mang bản copy gen cry1A(c) có kích thước khoảng 2,8-6,1 kb. Các dòng chuyển gen có ít số copy của gen chuyển thì tính ổn định cũng như mức độ biểu hiện của gen chuyển nạp sẽ cao, khả năng thu nhận được các dòng chuyển gen bền vững nhiều hơn. Vì vậy, các dòng chuyển gen VH1 mà chúng tôi thu nhận được trong nghiên cứu này hy vọng sẽ có khả năng duy trì tính ổn định của gen chuyển cry1A(c) trong các thế hệ sau. 3.3. Đánh giá sự hiện diện của protein cry1A(c) trong các dòng ngô chuyển gen kháng sâu Chúng tôi tiến hành xác định sự có mặt của protein cry1A(c) ở các cây chuyển gen có kết quả PCR dương tính với cặp mồi S-Cry1A(c) bằng phương pháp que thử sử dụng Kit EnviroLogix QuickStix TM (Agdia, USA). Kết quả được trình bày ở bảng 4. Bảng 4. Kết quả đánh giá sự hiện diện của protein cry1A(c) trong các dòng ngô chuyển gen kháng sâu Số dòng có kết quả protein dương tính TT Tên dòng T0 Thế hệ T0 Thế hệ T1 Thế hệ T2 Thế hệ T3 Nguồn HR9 1 1 1 1 1 HR9.14 2 HR9.20 1 1 1 1 3 HR9.34 4 HR9.32 5 HR9.42 Nguồn VH1 3 3 3 2 1 VH1.40 1 1 1 2 VH1.37 1 1 1 1 3 VH1.36 1 1 1 1 4 VH1.48 Nguồn VN106 3 3 1 0 1 VN106.21 1 1 2 VN106.30 3 VN106.7 1 1 1 4 VN106.19 1 1 5 VN106.27 6 VN106.20 Nguồn CH9 1 1 1 1 1 CH9.12 2 CH9.13 1 1 1 1 Kết quả bảng 4 cho thấy thí nghiệm xác định sự hiện diện của protein của gen chuyển được tiến hành đối với những cây/dòng chuyển gen đã được xác nhận sự có mặt của gen chuyển, vì vậy các kết quả thu nhận được biến động không nhiều giữa các thế hệ của mỗi dòng chuyển gen. Đối với các dòng thuộc nguồn HR9 và CH9, các cây chuyển gen được xác định có mặt gen cry1A(c) đều cho kết quả dương tính với protein cry1A(c), chúng tôi đã nhận được các dòng HR9.20, CH9.13 với các cây từ T0-T3 đều mang protein cry1A(c). Trong khi đó ở các dòng thuộc nguồn VN106 đến thế hệ T2 và T3 số dòng có mang protein của gen chuyển giảm rõ rệt, điều này cho thấy quá trình dịch mã của gen chuyển cry1A(c) thành protein ở các dòng này chưa thành công, gen chuyển nạp chưa kết hợp ổn định trong hệ gen của cây ngô. Dòng VN106 đến thế hệ T3 không thu nhận được cây nào có sự hiện diện của protein cry1A(c). Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 417 Hình 3. Xác định sự hiện diện protein cry1A(c) trong các dòng ngô VH1 chuyển gen kháng sâu thế hệ T3 1 vạch: Âm tính với protein cry1A(c); 2 vạch: Dương tính với protein cry1A(c). ĐC: Cây VH1 không chuyển gen; Các dòng ngô VH1 có sự hiện diện protein cry1A(c): VH1.37.66.2; VH1.VH1.36.25.2; VH1.36.25.2(1); VH1.36.25.2(2). 3.4. Đánh giá khả năng kháng sâu bằng phương pháp thử sâu invitro Dựa trên kết quả đánh giá sự hiện diện của protein cry1A(c) trong các dòng ngô mang gen kháng sâu thế hệ T3, chúng tôi tiếp tục tiến hành đánh giá mức độ biểu hiện của các protein này thông qua đánh giá tỷ lệ sâu non chết khi ăn lá ngô chuyển gen trong điều kiện phòng thí nghiệm. Bảng 5. Theo dõi số sâu non chết khi ăn lá của các dòng ngô mang gen kháng sâu cry1A(c) thế hệ T3 Số sâu chết TT Tên dòng T3 Số sâu thả Ngày thứ 1 Ngày thứ 2 Ngày thứ 3 Ngày thứ 4 Số sâu còn sống Nguồn CH9 1 CH9.13.159.1.1 5 0 3 5 5 0 2 CH9.13.159.1.3 5 0 4 5 5 0 3 CH9.13.159.1.4 5 0 1 2 5 0 4 CH9.13.159.1.6 5 0 2 5 5 0 5 CH9.13.159.1.10 5 0 1 4 5 0 6 CH9.13.159.10.1 5 0 0 2 4 1 7 CH9.13.159.10.9 5 0 0 4 4 1 8 CH9.13.159.10.10 5 0 0 5 5 0 9 CH9.13.159.15.1 5 0 0 3 5 0 10 CH9.13.159.15.3 5 0 0 3 5 0 11 CH9.13.159.15.4 5 0 0 2 4 1 12 CH9.13.159.15.9 5 0 0 4 5 0 13 CH9.13.159.15.10 5 0 0 1 4 1 CH9 (ĐC) 5 0 0 0 0 5 Nguồn VH1 1 VH1.36.25.2(1) 5 0 0 1 3 2 2 VH1.36.25.2(5) 5 0 1 2 3 2 3 VH1.37.66.2(4) 5 0 0 2 4 1 VH1 (ĐC) 5 0 0 0 0 5 Nguồn HR9 1 HR9.20.21.3(5) 5 0 0 2 3 2 2 HR9.20.21.3(7) 5 0 0 3 4 1 HR9 (ĐC) 5 0 0 0 0 5 VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 418 Kết quả được trình bày ở bảng 5 cho thấy, sau 5 ngày thả sâu vào các dòng ngô chuyển gen hầu hết số sâu được thả đều bị chết, số còn sống rất ít và khác nhau giữa các dòng chuyển gen khác nhau (1-2 con), so sánh với dòng đối chứng không chuyển gen tương ứng, số sâu sau 5 ngày thả còn nguyên vẹn (5 con). Như vậy, trong các cây chuyển gen đã có chứa một lượng nhất định protein cry1A(c) gây độc đối với sâu non. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả đánh giá sự có mặt của protein cry1A(c). Thả sâu trên lá cây chuyển gen Sâu ăn lá cây chuyển gen Sâu chết sau 5 ngày ăn lá cây chuyển gen Thả sâu trên lá cây đối chứng (không chuyển gen) Sâu ăn lá cây đối chứng Sâu còn sống sau 5 ngày ăn lá cây không chuyển gen Hình 4. Đánh giá khả năng kháng sâu của dòng ngô VH1.37.66.2 chuyển gen bằng phương pháp thử sâu invitro Đáng chú ý là trong số các dòng ngô chuyển gen thuộc các nguồn khác nhau, các cây có số sâu chết hết thuộc nguồn CH9 dòng CH9.13, gồm 9 cây, 4 cây còn lại cũng chỉ còn sống sót 1 con sâu. Đối với các dòng chuyển gen khác (VH1, HR9) số sâu sau 5 ngày còn sống sót nhiều hơn (1-2) con (hình 4), điều đó có thể do hàm lượng protein cry1A(c) tạo thành trong các cây này không cao, vì vậy mức độ gây độc đối với sâu non ít hơn. IV. KẾT LUẬN Phân tích PCR và Southern blot cho thấy gen chuyển nạp cry1A(c) kết hợp chưa ổn định trong hệ gen của các dòng ngô chuyển gen kháng sâu từ thế hệ T0-T3 thuộc 4 nguồn VH1, VN106, HR9 và CH9. Trong số các dòng chuyển gen phân tích, nguồn VH1 có số cá thể và số dòng chuyển gen thế hệ T3 nhiều hơn, các dòng chuyển gen mang 2-3 bản copy của gen chuyển cry1A(c). Đã xác định được sự hiện diện của protein cry1A(c) trong các dòng ngô chuyển gen từ T0- T3. Đối với các dòng HR9.20, CH9.13 thuộc nguồn HR9 và CH9, các cây từ T0-T3 đều mang protein cry1A(c). Nguồn VN106 đến thế hệ T3 không thu nhận được cây nào có sự hiện diện của protein cry1A(c). Đã đánh giá được mức độ gây độc của protein cry1A(c) trong các dòng ngô chuyển gen đối với sâu đục thân châu Á 3 ngày tuổi trong điều kiện invitro. Sau 5 ngày thả sâu vào các dòng ngô chuyển gen hầu hết số sâu ăn lá đều bị chết, số còn sống rất ít và khác nhau giữa các dòng chuyển gen. Tất cả số sâu thả trên lá của 9 cây dòng CH9.13 đều bị chết do độc tố của protein cry1A(c). Các dòng chuyển gen này bước đầu thể hiện tính ổn định và biểu hiện của gen chuyển nạp, cần được tiếp tục đánh giá tính kháng sâu bền vững trong các thế hệ để tạo ra nguồn vật liệu các dòng ngô chuyển gen kháng sâu có thể áp dụng trong điều kiện Việt Nam. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ali S, Zafar Y, Ali GM, Nazir F (2010). Bacillus thuringiensis and its application in agriculture. African J. of Biotechnology 9(14): 2022-2031. 2. 499.doc. 3. James C. (2012). Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2012. ISAAA Brief 44-2012. 4. Saghai-Maroof, MA, Soliman K, Jorgensen RA and Allard RW (1984). Ribosomal DNA spacer-length polymorphism in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics. Proc Natl Acad Sci USA 81: 8014-8019.