Nghiên cứu tách chiết polyphenol và khảo sát khả năng kháng oxy hóa, kháng khuẩn của dịch chiết từ lá cây kim vàng (barleria lupulina l.)

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 3 * 2018 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2018 35 NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT POLYPHENOL VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA, KHÁNG KHUẨN CỦA DỊCH CHIẾT TỪ LÁ CÂY KIM VÀNG (Barleria lupulina L.) Phạm Ngọc Khôi* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Cây kim vàng (Barleria lupulina L.) là thực vật có hoa thuộc họ Acanthaceae, trồng khá phổ biến ở Đông Nam Á. Theo dân gian, cây kim vàng có khả năng kháng khuẩn và kháng viêm, cải thiện các biến chứng của bệnh tiểu đường, chống thoái hóa, kháng khối u và các bệnh ung thư. Tuy nhiên, các hoạt tính sinh học đặc biệt là khả năng kháng oxy hóa, kháng khuẩn ở cây kim vàng vẫn chưa được công bố đầy đủ. Mục tiêu: Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình tách chiết polyphenol bao gồm: loại dung môi, nồng độ dung môi, tỷ lệ nguyên liệu:dung môi, thời gian chiết và nhiệt độ tách chiết để chọn ra điều kiện chiết tối ưu nhất nhằm đánh giá khả năng kháng oxy hóa và kháng khuẩn từ dịch chiết lá cây kim vàng. Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết polyphenol từ lá cây kim vàng. Hàm lượng polyphenol được xác định bằng phương pháp so màu, hoạt tính kháng oxy hóa được xác định dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH. Xác định khả năng kháng khuẩn của dịch chiết bằng phương pháp đặt đĩa kháng sinh đối với các chủng Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus. Kết quả: Dịch chiết từ lá cây kim vàng thu được có hàm lượng polyphenol cao nhất khi chiết trong dung môi ethanol 70%, tỷ lệ nguyên liệu:dung môi là 1:10 (g/mL), thời gian tách chiết 60 phút, nhiệt độ tách chiết 60 oC. Dịch chiết từ lá cây kim vàng có khả năng kháng oxy hóa cao IC50 = 61,94 μg/mL, nhưng vẫn thấp hơn vitamin C là mẫu đối chứng với IC50 = 28,47 μg/mL. Dịch chiết từ lá cây kim vàng có khả năng kháng khuẩn cao đối với các chủng Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus ở nồng độ 40 mg/mL. Kết luận: Nghiên cứu này đã khảo sát được điều kiện chiết tách polyphenol tốt nhất từ lá cây kim vàng qua đó đánh giá được khả năng kháng oxy hóa và kháng khuẩn của dịch chiết lá cây kim vàng trên nhiều loại vi khuẩn gây bệnh như Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus. Từ khóa: Cây kim vàng, polyphenol, kháng oxy hóa, kháng khuẩn ABSTRACT A STUDY ON EXTRACTING POLYPHENOLIC COMPOUNDS INDICATES THAT ANTIOXIDANT AND ANTIBACTERIAL ACTIVITIES OF Barleria lupulina L. Pham Ngoc Khoi * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 3- 2018: 35- 43 Background: Barleria lupulina L. is a plant of the Acanthaceae family, it occurs in Southeast Asia. Traditional medicine studies have demonstrated the possibility of using the biological compounds derived from plants in the prevention and treatment of infectious diseases, inflammation, improve the complications of diabetes, antidegradation, antitumor and anticancer. However, the antioxidant and antibacterial activities of Barleria lupulina L. are not well studied. Aims: The aim of this study is to study the best extraction process to obtain the highest polyphenol content * Bộ môn Mô Phôi - Di truyền Trường Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch Tác giả liên lạc: TS. Phạm Ngọc Khôi ĐT: 0909 097 802 Email: pnkhoi@pnt.edu.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2018 36 Barleria lupulina L. such as solvent, concentration of solvent, the ratio of material/solvent, time and temperature to use in antioxidant and antibacterial activities. Methods: Survey of factors affecting performance polyphenol extracted from Barleria lupulina L. leaves. Polyphenol content was determined by a colorimetric method, antioxidant activity is based on the ability to eliminate free radicals DPPH. Indenting antibacterial extracts of method antibiotic disks set for the strain of Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Staphylococcus aureus. Results: Ethanol 70%, the ratio of material: solvent (1:10), 60 minutes, 60 oC for polyphenol extraction efficiency is the highest Barleria lupulina L. leaves. This study evaluated the ability to capture free radicals DPPH IC50 value of the ability to capture free radicals DPPH (61.94 μg/mL), whereas vitamin C (28.47 μg/mL). In this study, polyphenol extracts capable of inhibiting the expression of Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Staphylococcus aureus at the concentration in 40 mg/mL. Conclusions: In this study, for the first time, we were carried out to optimize extracting conditions of polyphenol from Barleria lupulina L. leaves. Evaluated the ability of antioxidants of polyphenol extracted though the ability to capture free radicals DPPH. Polyphenol extracts are decent variety of bacterial diseases, such as Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Staphylococcus aureus. Keywords: Barleria lupunia L., polyphenol, antioxidant, antibacterial MỞ ĐẦU Cây kim vàng (Barleria lupunia L.) hay còn gọi là gai kim vàng, gai kim bóng có nguồn gốc từ Madagasca ở Châu Phi, phân bố phổ biến ở các vùng núi phía Nam và Tây Ấn Độ, ngoài ra còn tìm thấy ở Thái Lan, Indonesia, Trung Quốc, Myanmar, Campuchia. Cây kim vàng thường được nhiều nhà trồng làm cây cảnh hoặc làm hàng rào vì có gai nhọn. Ở nước ta, cây kim vàng mọc hoang và trồng nhiều nơi, phân bố nhiều ở các tỉnh phía nam(1,2,4,6). Theo y hoc cổ truyền, cây kim vàng có vị cay, đắng, tính ôn, thông kinh, giải độc. Lá cây kim vàng dùng để trị đau răng, xuất huyết, ho, cắt cơn suyễn hoặc có thể dùng toàn thân để trị viêm họng, sưng tấy, tê bại, nhức mỏi, trật khớp. Ngoài ra lá, thân và hoa kim vàng còn có khả năng kháng khuẩn và kháng viêm, cải thiện các biến chứng bệnh tiểu đường, chống thoái hóa, chống khối u và các bệnh ung thư(2,6). Suba và cộng sự đã công bố kết quả nghiên cứu hoạt động chống viêm của chiết xuất methanol từ cây kim vàng trên chuột, kết quả cho thấy dịch chiết đã ức chế sự hoạt động của acid acetic và giảm đau ở chuột(9). Ở Việt Nam, theo tác giả Nguyễn Duy Điệt và Nguyễn Tư Hiền đã xác định trong cây kim vàng có chứa 12 loại nguyên tố hóa học khác nhau(4). Ngoài ra, với những phản ứng hóa học đặc trưng xảy ra các tác giả đã định tính được sự hiện diện một số hợp chất hữu cơ thiên nhiên có trong cây kim vàng như: saponin, triterpenoid, flavone, phytosterol, tannin, caroten, đường khử và chất béo(3). Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu này nhằm khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình tách chiết bao gồm: loại dung môi, nồng độ dung môi, tỷ lệ nguyên liệu:dung môi, thời gian chiết và nhiệt độ tách chiết để chọn ra điều kiện chiết tối ưu có hàm lượng polyphenol cao nhất nhằm đánh giá khả năng kháng oxy hóa và kháng khuẩn từ dịch chiết lá cây kim vàng. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu Lá cây kim vàng thu hái từ Thành phố Thủ Dầu Một, Tỉnh Bình Dương vào tháng 03 năm 2017. Các chủng vi khuẩn thử nghiệm dùng trong nghiên cứu này như Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus do Bộ môn Sinh học phân Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 3 * 2018 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2018 37 tử, Khoa Dược, Trường Đại học Quốc tế Hồng Bàng cung cấp. Xử lý mẫu Thu hái lá cây kim vàng còn tươi. Lá sau khi hái về đem rửa sạch với nước máy, loại bỏ bụi bẩn và những lá hư, vàng, sau đó phơi héo và sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 55 oC đến khối lượng không đổi. Tiến hành xay lá đã sấy khô thành bột mịn. Quá trình này làm phá vỡ các màng tế bào, giúp tăng sự khuếch tán và thẩm thấu các chất trong mẫu vào dung môi. Mẫu được đậy kín và bảo quản ở nhiệt độ phòng. Định tính sơ bộ thành phần hóa học của lá cây kim vàng Nguyên tắc là nhằm chiết tách hỗn hợp các chất có trong nguyên liệu thực vật thành 3 phân đoạn theo độ phân cực tăng dần: kém phân cực, phân cực trung bình và phân cực mạnh rồi xác định các nhóm hợp chất trong dung dịch chiết bằng các phản ứng hóa học đặc trưng. Chiết tách nguyên liệu thành các phân đoạn theo độ phân cực tăng dần với các dung môi là ether ethylic, ethanol và nước. Xác định các nhóm hợp chất trong từng dịch chiết bằng các phản ứng hóa học đặc trưng theo phương pháp của Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh(5,7,8). Phương pháp tách chiết Cân chính xác 10 g mẫu (đã được sấy khô và nghiền nhỏ) cho vào chai thủy tinh 100 mL, rồi tiến hành khảo sát một điều kiện tách chiết trong khi các thông số khác được giữ cố định bằng phương pháp ngấm kiệt. Sau đó tính hiệu quả quá trình trích ly polyphenol thể hiện qua hàm lượng polyphenol tổng số (TPC) được tính bằng phương pháp Foline - Ciocalteu. Xác định hàm lượng polyphenol tổng số Hàm lượng polyphenol tổng được xác định theo phương pháp của Singleton và cộng sự (1999) với một vài hiệu chỉnh nhỏ, cụ thể như sau: dịch chiết được hòa loãng ở nồng độ thích hợp, sau đó 0,1 mL dịch chiết đã pha loãng trộn với 0,9 mL nước cất trước khi thêm 1 mL thuốc thử Foline - Ciocalteu. Hỗn hợp được trộn đều trước khi thêm 2,5 mL Na2CO3 7,5%. Sau đó, hỗn hợp phản ứng được giữ ở 30 oC trong 30 phút trước khi đi đo ở bước sóng 760 nm sử dụng máy quang phổ kế (Carry 50, Varian, Australia). Kết quả được báo cáo bởi miligam acid gallic tương đương (mg GAE)/g chất khô. Công thức tính: PP = X * V * k / v * m * (1 – w), trong đó PP là hàm lượng polyphenol tổng số (mg GAE/g db), X là nồng độ acid gallic xác định theo đường chuẩn (mg/mL), V là thể tích dịch chiết từ m (g) mẫu cây kim vàng (mL), k là hệ số pha loãng, v là thể tích dịch dược liệu sử dụng (mL), m là khối lượng dược liệu thí nghiệm (g), w là độ ẩm của dược liệu (%)(5,7,8). Khảo sát điều kiện tách chiết Để nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi chiết, sử dụng ba loại dung môi có độ phân cực khác nhau, bao gồm: ethanol 99,5%, methanol 99,5% và nước cất. Các thông số về thời gian chiết, nhiệt độ chiết và tỷ lệ nguyên liệu:dung môi chiết được giữ cố định với giá trị tương ứng là: 60 phút, nhiệt độ phòng và 1/10 (g/mL). Loại dung môi chiết thích hợp được chọn dựa vào hàm lượng polyphenol cao nhất. Sau đó sử dụng dung môi này để nghiên cứu các thông số khác. - Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến hàm lượng polyphenol được thực hiện ở nồng độ dung môi là 30, 50, 70, 90, 99,5%. - Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu:dung môi chiết đến hàm lượng polyphenol được thực hiện ở các mức 1:5, 1:10, 1:15, 1:20 (g/mL). - Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol được thực hiện ở các mốc thời gian 30, 45, 60, 75, 90 phút. - Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol được thực hiện ở các mốc nhiệt độ 30, 40, 50, 60 oC. Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH (1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl) Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo phương pháp của Fu và Shieh (2002) Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2018 38 với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Cụ thể như sau: khoảng 20 - 140 µL dịch chiết đã pha loãng đến nồng độ thích hợp được trộn với nước cất để đạt thể tích tổng cộng 3 mL. Sau đó thêm 1 mL dung dịch DPPH 0,2 mM, lắc đều và để yên trong bóng tối 30 phút. Độ hấp thu quang học được đo ở bước sóng 517 nm (Carry 50, Varian, Australia). Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo công thức sau: DPPH (%) = 100 × (ACT-ASP)/ACT (trong đó: ACT là độ hấp thu quang học của mẫu trắng không chứa dịch chiết, ASP là độ hấp thu quang học của mẫu có chứa dịch chiết). Kết quả báo cáo bởi giá trị IC50 là nồng độ của dịch chiết khử được 50% gốc tự do DPPH ở điều kiện xác định. Giá trị IC50 càng thấp thì hoạt tính khử gốc tự do DPPH càng cao. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của cao chiết Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp đặt đĩa giấy để khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch chiết polyphenol từ lá cây kim vàng. - 1: Mẫu đối chứng (DMSO) - 2: Dịch chiết nồng độ 40 mg/mL - 3: Dịch chiết nồng độ 60 mg/mL - 4: Dịch chiết nồng độ 80 mg/mL - Số nghiệm thức/đĩa petri: 4 nghiệm thức - Tổng số đĩa petri cho 1 loại vi sinh vật: 3 đĩa - Tổng số đĩa petri cho 4 loại khuẩn: 12 đĩa - Thể tích môi trường/đĩa petri: 20 mL Phương pháp xử lý số liệu Tất cả các thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần để đảm bảo tiến hành phân tích ANOVA. Số liệu được phân tích ANOVA bằng phần mềm xử lý số liệu thống kê chuyên dụng SAS 8.0. Kiểm định Tukey được thực hiện để đánh giá mức độ khác biệt có ý nghĩa giữa các giá trị với mức ý nghĩa P < 0,05. KẾT QUẢ Kết quả định tính một số hợp chất tự nhiên Khảo sát định tính sơ bộ các hợp chất có trong lá cây kim vàng nhằm chọn được hợp chất thích hợp cho các thí nghiệm cần nghiên cứu. Dịch chiết được chiết với dung môi methanol 70%, tỷ lệ nguyên liệu:dung môi là 1:10 (g/mL), ở nhiệt độ phòng và chiết trong 24 giờ. Kết quả khảo sát định tính được trình bày ở bảng 1. Bảng 1. Kết quả định tính các hợp chất tự nhiên có trong dịch chiết lá cây kim vàng STT Hợp chất Thuốc thử/ phương pháp Hiện tượng Kết quả 1 Polyphenol FeCl3 5% Xanh đen + 2 Tannin Chì acetat 10% Tủa màu vàng nhạt + 3 Flavonoid Kim loại magie, HCl đậm đặc Màu đỏ tía + 4 Terpenoid Chloroform, Libermann-Burchard Màu nâu đỏ + 5 Alkaloid Bouchardat Kết tủa màu nâu + 6 Saponin Nước cất Không có bọt - Chú thích: (-): không có sự hiện diện; (+): có sự hiện diện Theo nghiên cứu sơ bộ các hợp chất tự nhiên có trong cây kim vàng của Sarmad Moin, Sahaya Shibu Babu và Arumugam Mahalakshmipriya (2012) cho thấy trong dịch chiết methanol có sự hiện diện của carbohydrate, flavonoid, phenol, steroid, terpenoid, tannin, không có sự hiện diện của alkaloid và saponin. Tuy nhiên, Sudipa Mandal và Subrata Mandal (2014) nghiên cứu trên lá, thân và hoa cây kim vàng cho thấy ngoài những chất trên còn có sự hiện diện của alkaloid, đường, protein, amino acid. Qua quá trình thí nghiệm định tính sơ bộ các hợp chất hữu cơ tư nhiên, kết quả ở đề tài nghiên cứu này gần giống với nghiên cứu Sudipa Mandal và Subrata Mandal (2014), sự khác biệt về hiện diện của alkaloids có thể vì nguồn gốc thu hái nguyên liệu ở hai vùng khác nhau, điều kiện khí hậu cũng như vùng thổ dưỡng khác nhau, phương pháp chăm sóc và phương pháp nghiên cứu cũng khác nhau sẽ ảnh hưởng đến sự hình thành hay thành phần các hợp chất trong cây kim vàng. Từ kết quả định tính trên, ta thấy trong lá cây kim vàng có chứa các hợp chất tự nhiên như: polyphenol, tannin, flavonoid, terpenoid, alkaloid. Tuy nhiên lại không có saponin. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 3 * 2018 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2018 39 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện tách chiết đến hàm lượng polyphenol trích ly từ lá cây kim vàng Ảnh hưởng của loại dung môi đến hàm lượng polyphenol trích ly từ lá cây kim vàng Khảo sát tách chiết lá cây kim vàng bằng 3 loại dung môi là ethanol, methanol và nước cất. Với khối lượng mẫu là 2 g, chiết với tỷ lệ là 1:10 ở nhiệt độ thường trong 1 giờ. Kết quả thu được thể hiện thông qua đồ thị 1. Đồ thị 1. Ảnh hưởng của loại dung môi đến hàm lượng polyphenol trích từ lá cây kim vàng Ta thấy hàm lượng polyphenol được chiết bằng dung môi ethanol là cao nhất đạt được 130,20 ± 0,33% mgGAE/g db, hàm lượng polyphenol được chiết bằng nước là thấp nhất đạt được 56,21 ± 0,35% mgGAE/g db. Hiệu suất chiết polyphenol với các loại dung môi được sắp xếp theo thứ tự giảm dần: ethanol > methanol > nước. Như vậy ta chọn được dung môi có hiệu suất chiết polyphenol cao nhất là ethanol để tiếp tục khảo sát các điều kiện ảnh hưởng sau. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng polyphenol trích ly từ lá cây kim vàng Sau khi chọn được dung môi tách chiết tốt nhất là ethanol. Tiến hành khảo sát các nồng độ dung môi ethanol khác nhau là: 30, 50, 70, 90, 99,5%. Với khối lượng mẫu là 2 g, chiết với tỷ lệ là 1:10, chiết ở nhiệt độ thường trong 1 giờ. Kết quả thu được thể hiện thông qua đồ thị 2. Hàm lượng polyphenol tăng dần khi nồng độ ethanol tăng từ 30 đến 70% và bắt đầu giảm xuống khi tăng nồng độ ethanol từ 70 đến 99,5%. Hàm lượng polyphenol thu được cao nhất với ethanol 70% đạt được 169,32 ± 0,23% mgGAE/g db và ở nồng độ ethanol 30% thì hàm lượng polyphenol thu được thấp nhất đạt được 127,43 ± 0,86% mgGAE/g db. Như vậy ta chọn được nồng độ ethanol là 70% là tối ưu nhất để tiếp tục khảo sát các yếu tố khác. Đồ thị 2. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng polyphenol trích từ lá cây kim vàng Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu:dung môi đến hàm lượng polyphenol trích ly từ lá cây kim vàng Sau khi chọn được dung môi tách chiết tốt nhất là ethanol 70%, tiến hành khảo sát tiếp quá trình chiết với 4 tỷ lệ nguyên liệu:dung môi lần lượt là: 1:5, 1:10, 1:15, 1:20. Với khối lượng mẫu bột lá là 2 g, chiết ở nhiệt độ thường trong thời gian 1 giờ. Kết quả thu được thể hiện thông qua đồ thị 3. Đồ thị 3. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu:dung môi đến hàm lượng polyphenol trích từ lá cây kim vàng Ta thấy từ tỷ lệ nguyên liệu:dung môi là 1:5 lên tỷ lệ 1:10 hàm lượng polyphenol thu được tăng rất mạnh đạt 60,45 ± 0,39% mgGAE/g db lên 132,04 ± 0,79% mgGAE/g db (tăng 2,2 lần). Và tỷ lệ nguyên liệu:dung môi là 1:10 thu được hàm lượng polyphenol là cao nhất. Khi ta tăng tỷ lệ mẫu trong dung môi lên 1:15 và 1:20 thì hàm lượng polypheol lại giảm mạnh xuống (giảm 1,6 lần) đạt 80,05 ± 0,48% mgGAE/g db ở tỷ lệ 1:15 và tiếp tục giảm so với tỷ lệ 1:15 đạt được là 69,17 ± 0,27% mgGAE/g db ở tỷ lệ 1:20 (giảm 1,2 lần). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2018 40 Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng polyphenol trích ly từ lá cây kim vàng Sau khi chọn được tỷ lệ nguyên liệu:dung môi tách chiết tốt nhất là 1:10 (g/mL), ta tiếp tục khảo sát với 5 mốc thời gian khác nhau là: 30, 45, 60, 75, 90 phút. Với khối lượng mẫu là 2 g, chiết trong dung môi ethanol, ở nhiệt độ thường. Kết quả thu được thể hiện thông qua đồ thị 4. Đồ thị 4. Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng polyphenol trích từ lá cây kim vàng Khi ta tăng thời gian từ 30 lên 45, 60 và 75 phút thì hàm lượng polyphenol tổng số cũng tăng dần lên. Ở thời gian chiết là 30 phút hàm lượng polyphenol thu được là 83,94 ± 0,57% mgGAE/g db, tiếp tục tăng thời gian lên 75 phút thì hàm lượng polyphenol thu được là cao nhất đạt được 133,82 ± 1,57% mgGAE/g db (tăng gấp 1,59 lần) so với ở 30 phút. Tuy nhiên ở thời gian 60 phút thì hiệu suất thu hàm lượng polyphenol không có sự khác biệt so với thời gian chiết 75 phút đạt được là 132,35 ± 0,35% mgGAE/g db, ta sẽ chọn thời gian chiết là 60 phút để tiết kiệm thời gian nhưng hiệu suất chiết vẫn cao. Từ thời gian 75 phút ta tăng lên 90 phút thì hàm lượng thu được lại bắt đầu giảm 109,62 ± 0,35% mgGAE/g db (giảm 1,2 lần). Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol trích ly từ lá cây kim vàng Tiến hành khảo sát đến nhiệt độ chiết với 4 nhiệt độ khác nhau là: 30, 40, 50, 60 oC. Với khối lượng mẫu 2 g, chiết với ethanol 70%, tỷ lệ nguyên liệu:dung môi là 1:10, trong thời gian 1 giờ với nhiệt độ theo các nghiệm thức. Kết quả thu được thể hiện thông qua đồ thị 5. Đồ thị 5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol trích từ lá cây kim vàng Khi tăng nhiệt độ từ 30 lên 60 oC thì hàm lượng polyphenol cũng tăng dần lên, ở nhiệt độ 30 oC hàm lượng polyphenol tổng số thu được thấp nhất với giá trị là 97,88 ± 0,47% mgGAE/g db và ở nhiệt độ 60 oC thì hàm lượng polyphenol thu được cao nhất đạt được 185,98 ± 0,53% mgGAE/g db tăng 1,1 lần so với ở 30 oC. Như vậy, sau khi khảo sát các ảnh hưởng của các điều kiện tách chiết đến hàm lượng polyphenol trích từ lá cây kim vàng, chúng tôi xác định được các thông số tách chiết tốt nhất sau: dung môi chiết là ethanol, nồng độ của dung môi ethanol là 70%, tỷ lệ nguyên liệu:dung môi là 1:10, thời gian chiết là 60 phút, nhiệt độ tách chiết là 60 oC. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 3 * 2018 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2018 41 Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết từ lá cây kim vàng Các nồng độ vitamin C được biểu thị dưới dạng đường thẳng với phương trình y = 0,602x + 32,86, với hệ số tương quan R = 0,998 thể hiện cho khả năng ức chế DPPH của vitamin C. Từ phương trình trên ta tìm được giá trị IC50 của vitamin C là 28,47 µg/mL. Trong khảo sát kháng oxy hóa này ta lấy vitamin C làm mẫu đối chứng để so sánh và đánh giá khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết toàn phần có hàm lượng polyphenol cao này chiết từ lá cây kim vàng. Trong khi đó, phương trình y = 0,581x + 14,01 và hệ số tương quan R = 0,993 thể hiện cho khả năng ức chế DPPH của dịch chiết lá cây kim vàng. Từ phương trình trên ta tính được giá trị IC50 của dịch chiết là 61,94 µg/mL. Khả năng khử gốc tự do bằng phương pháp DPPH là phương pháp phân tích đánh giá khả năng kháng oxy hóa trong các thử nghiệm, tiến hành bởi phương pháp in vitro được sử dụng phổ biến nhất trong nghiên cứu và theo Joon Kwan và Takaki, năm 2009 thì 90% các đề tài nghiên cứu về chất kháng oxy hóa đã sử dụng chất này. Gía trị IC50 của dịch chiết từ lá cây kim vàng là 61,94 µg/mL và của vitamin C là 28,47 µg/mL, so sánh hai giá trị IC50 này ta thấy dịch chiết toàn phần có hàm lượng polyphenol cao này có khả năng kháng oxy hóa cao, tuy nhiên vẫn không tốt bằng vitamin C, thấp hơn 2,18 lần so với vitamin C. Từ kết quả có được ta thấy polyphenol chính là thành phần chính trong những chất có khả năng kháng oxy hóa từ dịch chiết lá cây kim vàng. Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch chiết từ lá cây kim vàng Bảng 2. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch chiết toàn phần có hàm lượng polyphenol cao từ lá cây kim vàng Loại vi khuẩn Nồng độ dịch chiết (mg/mL) Đường kính vòng vô khuẩn (mm) Khả năng kháng khuẩn Escherichia coli DMSO 0,00 - 40 10,50 ± 0,20 ++ 60 14, 43 ± 0,12 ++ 80 19,27 ± 0,25 +++ Klebsiella pneumoniae DMSO 0,00 - 40 9,07 ± 0,12 + 60 11,33 ± 0,42 ++ 80 13,37 ± 0,23 ++ Pseudomonas aeruginosa DMSO 0,00 - 40 8,10 ± 0,10 + 60 12,20 ± 0,17 ++ 80 15,17 ± 0,15 +++ Staphylococcus aureus DMSO 0,00 - 40 7,03 ± 0,15 + 60 10,37 ± 0,40 ++ 80 11,53 ± 0,35 ++ Chú thích: (-): không kháng khuẩn, (+): khả năng kháng khuẩn yếu, (++): khả năng kháng khuẩn trung bình, (+++): khả năng kháng khuẩn mạnh Đối với 4 chủng vi khuẩn này thì đều có vòng kháng khuẩn ở mỗi nồng độ, khi tăng nồng độ từ 40 đến 80 mg/mL, các vòng kháng đều tăng lên và thường cao nhất ở nồng độ 80 mg/mL. Ta thấy ở mỗi vi khuẩn đều có đường kính vòng kháng cao hơn so với đối chứng bằng DMSO, đều này chứng tỏ dịch chiết toàn phần có hàm lượng polyphenol cao từ lá cây kim vàng có khả năng kháng được các loại vi khuẩn sau đây như Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2018 42 Hình 1. Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết toàn phần có hàm lượng polyphenol cao trích từ lá cây kim vàng trên các chủng vi khuẩn (A: Escherichia coli, B: Klebsiella pneumoniae, C: Pseudomonas aeruginosa, D: Staphylococcus aureus) Chú thích: (ĐC): đối chứng âm DMSO, (1): dịch chiết từ lá cây kim vàng với nồng độ 40 mg/Ml, (2): dịch chiết từ lá cây kim vàng với nồng độ 60 mg/mL, (3): dịch chiết từ lá cây kim vàng với nồng độ 80 mg/mL KẾT LUẬN Lá cây kim vàng sau khi đã xử lý, sấy và xay ta thu được nguyên liệu ở dạng bột. Tiến hành tách chiết bột lá trong dung môi là ethanol, nồng độ của ethanol là 70%, tỷ lệ nguyên liệu:dung môi là 1:10 (g/mL), thời gian chiết là 60 phút và ở nhiệt độ 60 oC cho hàm lượng polyphenol là cao nhất. Khi khảo sát khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết toàn phần có hàm lượng polyphenol cao từ lá kim vàng có giá trị IC50 = 61,94 µg/mL chứng minh là dịch chiết này có khả năng kháng oxy hóa cao, nhưng vẫn thấp hơn với vitamin C có giá trị IC50= 28,47 µg/mL. Bên cạnh đó, dịch chiết từ lá cây kim vàng cho thấy với mỗi nồng độ dịch chiết khác nhau sẽ kháng các vi khuẩn ở mức khác nhau. Tuy nhiên trên Escherichia coli có khả năng kháng khuẩn cao nhất. Do điều kiện nghiên cứu còn giới hạn nên còn nhiều khía cạnh vẫn chưa thể khai thác được, chúng tôi xin đề nghị một số vấn đề cần nghiên cứu tiếp theo như khảo sát thêm một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tinh sạch dịch polyphenol từ cây kim vàng, khảo sát khả năng kháng một số chủng vi khuẩn gây bệnh phổ biến khác để thấy được hoạt tính kháng khuẩn mạnh, phổ kháng khuẩn rộng của dịch chiết polyphenol từ cây kim vàng, đồng thời tiến hành thử nghiệm tác dụng của cây kim vàng trong điều trị một số bệnh nhiễm khuẩn, nhiễm trùng trên động vật thử nghiệm, từ đó ứng dụng vào việc phòng và trị bệnh trên người. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương (2004). Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tập II, trang 301 - 304, 912 - 915, 1007 - 1010. 2. Đỗ Tất Lợi (2001). Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Y học, trang 559. 3. Lại Thị Ngọc Hà, Vũ Thị Thư (2009), “Stress oxy hóa và các chất chống oxy hóa tự nhiên”, Tạp chí Khoa học và Phát triển, tập 7, số 5, trang 667 - 677. 4. Nguyễn Duy Điệt và Nguyễn Tư Hiền (1998), “Nghiên cứu thành phần hóa học của cây kim vàng”. Tạp chí Dược học, số 4, trang 13 - 14. 5. Nguyễn Minh Cẩm Tiên, Phạm Ngọc Khôi (2016), “Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng oxy hóa của hợp chất polyphenol chiết xuất từ rễ cây mướp gai (Lasia spinosa L.)”. Tạp chí Y học TP. Hồ Chí Minh, Tập 20, Phụ bản số 20, trang 436 - 446. 6. Phạm Hoàng Hộ (2006). Cây có vị thuốc ở Việt Nam. Nhà xuất bản Trẻ, trang 575. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 3 * 2018 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2018 43 7. Phạm Ngọc Khôi, Lê Trọng Nghĩa (2016), “Khảo sát các điều kiện thu hồi dịch chiết và hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa của dịch chiết bắp cải tím (Brassica oleracea)”. Tạp chí Khoa học Yersin, Số 01 (11/2016), trang 23 - 29. 8. Phạm Ngọc Khôi, Nguyễn Bùi Minh Tâm (2016), “Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch chiết bromelain từ cây Dứa (Ananas comosus) trên vi khuẩn Shigella và Salmonella ứng dụng trong phòng ngừa và điều trị bệnh đường tiêu hóa”. Tạp chí Y học TP. Hồ Chí Minh, Tập 20, Phụ bản số 5, trang 21 - 26. 9. Suba V, Murugesan T, Kumaravelrajan R, Mandal C, Saha P (2005), “Antiinflammatory, analgesis and antiperoxidative efficacy of Barleria lupulina Lindl”, Extract Phytother. Res., 19 (8), trang 695. Ngày nhận bài báo: 26/12/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 15/01/2018 Ngày bài báo được đăng: 20/04/2018