Nghiên cứu tác dụng điều trị nhồi máu não của chế phẩm cao lỏng trúng phong trên thực nghiệm

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2018 20 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ NHỒI MÁU NÃO CỦA CHẾ PHẨM CAO LỎNG TRÚNG PHONG TRÊN THỰC NGHIỆM Đoàn Xuân Đinh1; Nguyễn Minh Dũng1; Lê Đức Hùng1 Nguyễn Hoàng Ngân2; Nguyễn Thị Thu Hằng2; Nguyễn Hồng Hải2 TÓM TẮT Mục tiêu: đánh giá tác dụng điều trị nhồi máu não của chế phẩm cao lỏng Trúng phong 2:1 trên thực nghiệm. Đối tượng và phương pháp: sử dụng mô hình gây nhồi máu não tại động mạch não giữa trên chuột nhắt trắng bằng phản ứng quang hóa gây bởi chiếu tia laser. 32 chuột nhắt trắng đực, chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 8 con: lô 1 (phẫu thuật không gây nhồi máu + uống nước cất); lô 2 (phẫu thuật gây nhồi máu + uống nước cất); lô 3 (phẫu thuật gây nhồi máu + uống cao lỏng Trúng phong liều 10,5 ml/kg); lô 4 (phẫu thuật gây nhồi máu + uống boluoke liều 200 mg/kg). Kết quả: ở lô 3, 4 có tác dụng hồi phục tổn thương thần kinh, giảm mức độ tổn thương vận động của chuột gây nhồi máu não tại các thời điểm sau 24 giờ, 48 giờ, rõ nhất sau 72 giờ, 168 giờ gây nhồi máu. Liều cao lỏng Trúng phong dùng trong nghiên cứu có tác dụng hồi phục tổn thương não và hoạt động của chuột gây nhồi máu não tương đương với boluoke liều 200 mg/kg. Kết luận: cao lỏng Trúng phong 2:1 liều 10,5 ml/kg (tương đương 21 g dược liệu khô/kg) có tác dụng tốt khi sử dụng điều trị trên mô hình gây nhồi máu não thực nghiệm ở chuột nhắt trắng, tương đương với boluoke liều 200 mg/kg. * Từ khóa: Cao lỏng Trúng phong; Nhồi máu não; Tác dụng điều trị. Experimental Evaluating the Effect of Trung phong Liquid Extract on Treatment of Cerebral Infarction in Mice Summary Objectives: To evaluate the effect of Trung phong liquid extract on treatment of cerebral infarction. Subjects and methods: Using experimental mice model of cerebral infarction in the middle cerebral artery caused by the laser photocoagulation. Total of 32 male mice were divided randomly into four groups, 8 mice of each: Group 1 (surgery without cerebral infarction + distilled water); group 2 (cerebral infarction + distilled water); group 3 (cerebral infarction + Trung phong liquid extract administered 10.5 mL/kg); group 4 (cerebral infarction + boluoke administered 200 mg/kg). Results: In groups 3 and 4, it showed the recoverable effect on the brain, reduced injured movement at time points 24 hour, 48 hour and positive effect was clear after 72 hour, 168 hour. The dose of Trung phong liquid extract used in the study had the recoverable effect on injured brain and mice movement equivalent to boluoke oral of 200 mg/kg. Conclusion: Trung phong liquid extract oral administered 10.5 mL/kg on mice showed good effect on the cerebral infarction mice model and had effect equivalent to boluoke oral administered 200 mg/kg. * Keywords: Cerebral infarction; Trung phong liquid extract; Effective treatment. 1. Viện Y học Cổ truyền Quân đội 2. Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Hồng Hải (dhonghaik85@gmail.com) Ngày nhận bài: 22/06/2018; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 11/09/2018 Ngày bài báo được đăng: 26/09/2018 t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2018 21 ĐẶT VẤN ĐỀ Nhồi máu não (NMN) là một bệnh nguy hiểm, có thể gây tử vong rất nhanh hoặc để lại di chứng hết sức nặng nề. Hiện nay, quá trình điều trị NMN rất khó khăn và phức tạp. Từ thực tế đó, kế thừa và phát triển kinh nghiệm sử dụng các loại dược liệu trong Y học Cổ truyền, Trung tâm Nghiên cứu Ứng dụng sản xuất Thuốc, Viện Y học Cổ truyền Quân đội đã bào chế chế phẩm cao lỏng Trúng phong với mục đích: Xây dựng mô hình gây NMN và đánh giá tác dụng điều trị NMN của chế phẩm trên thực nghiệm. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu. * Chế phẩm nghiên cứu: - Cao lỏng Trúng phong 2:1, do Trung tâm Nghiên cứu Ứng dụng sản xuất Thuốc, Viện Y học Cổ truyền Quân đội bào chế, đạt tiêu chuẩn cơ sở. - Boluoke (lumbrokinase) (Canada RNA Biochemical Inc) dùng làm thuốc tham chiếu. * Động vật nghiên cứu: - Chuột nhắt trắng trưởng thành, chủng Swiss, giống đực, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, 8 - 9 tuần tuổi, cân nặng 25 - 30 g. Động vật thí nghiệm do Ban Cung cấp Động vật thí nghiệm, Học viện Quân y cung cấp, nuôi dưỡng trong phòng nuôi động vật thí nghiệm ít nhất một tuần trước khi tiến hành thí nghiệm, thức ăn và nước uống theo tiêu chuẩn. * Thiết bị dùng trong nghiên cứu: - Thiết bị chiếu laser cải tiến từ bút chiếu laser, bước sóng 568 nm, công suất 6 mW. - Kính hiển vi phẫu thuật. - Máy cắt bệnh phẩm lạnh. - Bảng đục lỗ (Hole Board, Cat. No. 6650, Ugo Basile). - Bộ dụng cụ mổ động vật cỡ nhỏ. - Kim cho chuột uống, chỉ phẫu thuật 6.0 và các dụng cụ thí nghiệm khác. * Hóa chất dùng trong nghiên cứu: - Hồng bengal (Rose bengal dye) (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Nhật Bản) sử dụng trong mô hình gây đột quỵ do ánh sáng. - Các hóa chất nhuộm HE. 2. Phương pháp nghiên cứu. * Nghiên cứu tác dụng điều trị NMN trên thực nghiệm: Tác dụng điều trị NMN của chế phẩm đánh giá trên mô hình gây NMN tại động mạch não giữa của chuột nhắt trắng bằng phản ứng quang hóa gây bởi chiếu tia laser, theo phương pháp của Hiroshi Sugimori và CS (2004) [2]. Vị trí gây nhồi máu T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2018 22 - Chuột gây mê với halothane. - Bộc lộ não, quan sát sự nguyên vẹn bình thường của não, quan sát được động mạch não giữa xa bên phải qua hộp sọ. - Chiếu một chùm tia laser bước sóng 568 nm tập trung vào động mạch não giữa trên hộp sọ còn nguyên vẹn. - Sau 4 phút chiếu xạ, tiêm tĩnh mạch dung dịch hoa hồng bengal. - Tiếp tục chiếu chùm tia laser lấy nét tại động mạch não giữa ngay gần vị trí đầu tiên trong 4 phút. Huyết khối tạo thành trên động mạch. * Phân lô chuột nghiên cứu và cho uống thuốc: Chuột nhắt trắng đực 32 con, đủ tiêu chuẩn thí nghiệm, chia ngẫu nhiên thành các lô: - Lô chứng phẫu thuật (n = 8): phẫu thuật không gây nhồi máu + uống nước cất. - Lô chứng nhồi máu (n = 8): phẫu thuật gây nhồi máu + uống nước cất. - Lô cao lỏng (n = 8): phẫu thuật gây nhồi máu + uống cao lỏng Trúng phong 2:1 liều 10,5 ml/kg (tương đương 21 g dược liệu khô/kg). - Lô boluoke (n = 8): phẫu thuật gây nhồi máu + uống thuốc tham chiếu boluoke liều 200 mg/kg. Với phẫu thuật không gây nhồi máu (sham surgery), phẫu thuật chuột giống như phẫu thuật gây nhồi máu (bộc lộ động mạch não giữa, bộc lộ động mạch cảnh chung) nhưng không gây cục máu đông (không chiếu tia laser). * Đánh giá mức độ tổn thương vận động của chuột theo thang điểm của Clark và CS (1997): Sau đột quỵ não gây ra do NMN ở động mạch não giữa, tổn thương tế bào não gây ra tổn thương thực thể về vận động (gây bại, liệt cơ làm thay đổi dáng đi, thăng bằng, gây đi vòng), đồng thời tổn thương trên não gây ức chế làm giảm hoạt động của chuột. Để đánh giá mức độ tổn thương thực thể vận động (gây bại, liệt cơ làm thay đổi dáng đi, thăng bằng, gây đi vòng) của chuột đột quỵ, Clark và CS (1997) đưa ra thang điểm gồm 7 tiêu chí, mỗi tiêu chí cho điểm từ 0 - 4. Mức độ tổn thương nặng nhất là 28 điểm [2]. Cách cho điểm theo thang điểm của Clark trình bày ở bảng.1. 1. Bảng 1: Thang điểm đánh giá mức độ tổn thương vận động của chuột. Điểm 0 1 2 3 4 Thăng bằng cơ thể (nhìn từ trên xuống) Bình thường Thay đổi nhẹ Thay đổi trung bình Thay đổi dễ thấy Thay đổi nghiêm trọng Dáng đi Bình thường Cứng Khập khiễng Run, ngã Không đi được Trèo dốc 450 Bình thường Trèo yếu Giữ đứng tại dốc Nằm tại dốc, ngã Không chuyển động Hướng di chuyển (thẳng hay xoay vòng) tự nhiên Di chuyển thẳng, không xoay vòng Lật nghiêng chủ yếu một bên Xoay một bên nhưng không ổn định Xoay một bên ổn định Không chuyển động t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2018 23 Hướng di chuyển khi bị kéo đuôi (xoay cưỡng bức) Không có biểu hiện xoay vòng Xu hướng lật một bên Xoay một bên Xoay một bên chậm Không chuyển động Thăng bằng chân trước sau Bình thường Không thăng bằng nhẹ Không thăng bằng rõ Không thăng bằng nghiêm trọng Không vận động cơ thể/chân Đáp ứng với chạm nhẹ phía sau Đáp ứng một cách tự nhiên Mất thăng bằng nhẹ Mất thăng bằng rõ Không đáp ứng cùng bên, giảm đáp ứng đối bên Không đáp ứng cả hai bên Đánh giá mức độ tổn thương vận động của chuột thực hiện tại thời điểm 24 giờ trước khi gây đột quỵ và sau khi gây đột quỵ 6 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 168 giờ. So sánh giữa các lô chuột và rút ra kết luận về tác dụng của chế phẩm. * Đánh giá tác dụng của chế phẩm lên hoạt động của chuột nhắt trắng dùng mô hình bảng đục lỗ (Hole Board): Vào ngày thứ 8 sau gây đột quỵ, đưa chuột vào phòng thí nghiệm yên tĩnh, ánh sáng mờ, ít nhất 1 giờ trước khi làm thí nghiệm. Thử nghiệm tiến hành sau khi uống thuốc 30 phút. Lần lượt đặt từng chuột vào giữa bảng đục lỗ, tiến hành ghi các hành vi của chuột trong 5 phút. Các chỉ tiêu theo dõi gồm: - Số lần chuột thò đầu xuống lỗ. - Số lần chuột chuyển sang vị trí mới, so sánh giữa các lô. * Xử lý số liệu: Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê y sinh học, so sánh bằng Anova test, sử dụng phần mềm SPSS 16.0, khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Kết quả đánh giá tác dụng điều trị NMN trên thực nghiệm. * Kết quả đánh giá mức độ gây tổn thương chức năng thần kinh thông qua đánh giá tổn thương vận động theo thang điểm Clark: Trước khi phẫu thuật, chuột ở các lô vận động bình thường, điểm đánh giá theo thang điểm Clark bằng 0. Sau khi phẫu thuật, chuột ở lô chứng phẫu thuật (phẫu thuật không gây nhồi máu) vẫn hoạt động bình thường (điểm đánh giá theo thang điểm Clark bằng 0), chứng tỏ các bước phẫu thuật bộc lộ động mạch não giữa, động mạch cảnh chung không ảnh hưởng đến chức năng thần kinh não chuột. Chuột ở các lô gây NMN có biểu hiện tổn thương thần kinh rõ khi đánh giá theo thang điểm Clark. Do gây NMN tại động mạch não giữa bên phải, chuột yếu cơ ở nửa thân bên trái, làm thân lệch nghiêng về bên trái, chuột khó giữ thăng bằng, khi di chuyển khó di chuyển thẳng mà có xu hướng xoay vòng về bên trái. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2018 24 Bảng 2: Kết quả đánh giá mức độ suy giảm hoạt động vận động theo thang điểm Clark. Điểm đánh giá theo thang điểm Clark (X ± SD, n = 8) Thời điểm đánh giá Lô chứng nhồi máu Lô cao lỏng Lô boluoke Sau 6 giờ 13,50 ± 1,69 13,00 ± 0,53 12,75 ± 0,89 Sau 24 giờ 12,50 ± 1,31 11,25* ± 0,71 11,00* ± 1,07 Sau 48 giờ 11,50 ± 1,31 9,88* ± 1,46 9,75* ± 1,16 Sau 72 giờ 10,88 ± 0,99 9,38** ± 1,19 9,00** ± 0,76 Sau 168 giờ 7,75 ± 0,46 7,00** ± 0,53 6,75** ± 0,71 (*p < 0,05 khi so sánh với lô chứng nhồi máu; **p < 0,01 khi so sánh với lô chứng nhồi máu) Tại thời điểm 6 giờ sau gây nhồi máu (3 giờ sau uống thuốc hoặc nước cất), điểm đánh giá theo thang điểm Clark ở các lô uống cao lỏng Trúng phong hoặc boluoke nhỏ hơn, nhưng chưa có ý nghĩa thống kê so với lô chứng gây nhồi máu. Sau 3 giờ uống thuốc, thuốc bắt đầu có tác dụng nhưng chưa đủ mạnh để gây ra thay đổi có ý nghĩa thống kê. Tại các thời điểm 24 giờ, 48 giờ sau gây nhồi máu, điểm đánh giá theo thang điểm Clark ở các lô uống cao lỏng Trúng phong và boluoke nhỏ có ý nghĩa thống kê so với lô chứng gây nhồi máu (p < 0,05). Cao lỏng Trúng phong và thuốc tham chiếu boluoke ở các mức liều và cách sử dụng đã có tác dụng hồi phục tổn thương thần kinh, giảm mức độ tổn thương vận động của chuột gây NMN tại các thời điểm sau gây nhồi máu 24 giờ, 48 giờ. Tại thời điểm 72 giờ, 168 giờ sau gây nhồi máu, điểm đánh giá theo thang điểm Clark ở các lô uống cao lỏng Trúng phong và boluoke nhỏ có ý nghĩa thống kê so với lô chứng gây nhồi máu (p < 0,01). Tác dụng hồi phục tổn thương thần kinh của thuốc nghiên cứu đã thể hiện rõ khi đánh giá tại các thời điểm 72 giờ và 168 giờ sau gây nhồi máu. So với lô tham chiếu dùng boluoke 200 mg/kg, lô dùng cao lỏng Trúng phong có thang điểm Clark tương đương, không khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Cao Trúng phong với mức liều dùng trong nghiên cứu có tác dụng hồi phục tổn thương não tương đương với boluoke 200 mg/kg. * Kết quả đánh giá tác dụng của chế phẩm lên hoạt động của chuột nhắt trắng dùng mô hình bảng đục lỗ (Hole Board): t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2018 25 Bảng 3: Kết quả đánh giá tác dụng của các chế phẩm nghiên cứu lên hoạt động của chuột nhắt trắng dùng mô hình bảng đục lỗ (X ± SD, n = 8). Lô thí nghiệm Số lần thò đầu xuống lỗ Số lần di chuyển vị trí Chứng không gây nhồi máu (1) 33,50 ± 4,41 9,38 ± 1,51 Chứng gây nhồi máu (2) 22,75 ± 4,86 5,25 ± 1,83 Cao lỏng Trúng phong (3) 28,38 ± 4,21 7,25 ± 1,75 Tham chiếu boluoke (4) 31,13 ± 3,04 8,00 ± 1,41 p p2-1 < 0,01; p3-2 < 0,05; p4-2 < 0,01; p3-1 < 0,05; p4-1 > 0,05; p3-4 > 0,05 So với lô chứng không gây nhồi máu, số lần thò đầu xuống lỗ và số lần di chuyển vị trí ở lô chứng gây nhồi máu giảm có ý nghĩa thống kê (p2-1 < 0,01). Việc gây nhồi máu động mạch não giữa làm giảm rõ rệt hoạt động của chuột. So với lô chứng gây nhồi máu, số lần thò đầu xuống lỗ và số lần di chuyển vị trí ở các lô dùng thuốc đều tăng có ý nghĩa thống kê (p3-2 < 0,05; p4-2 < 0,01). Lô dùng thuốc tham chiếu boluoke có số lần thò đầu xuống lỗ và số lần di chuyển vị trí tăng rõ rệt (p4-2 < 0,01) và nhiều hơn, tương đương so với lô chứng không gây nhồi máu (p4-1 > 0,05). Lô dùng cao lỏng Trúng phong có số lần thò đầu xuống lỗ và số lần di chuyển vị trí tăng so với lô chứng gây nhồi máu (p3-2 < 0,05) nhưng giảm so với lô chứng không gây nhồi máu (p3-1 < 0,05). So với lô tham chiếu, lô dùng cao lỏng Trúng phong có số lần thò đầu xuống lỗ và số lần di chuyển vị trí tương đương, không khác biệt có ý nghĩa thống kê (p3-4 > 0,05). Cao lỏng Trúng phong với liều sử dụng trong nghiên cứu có tác dụng làm hồi phục hoạt động của chuột gây NMN tương đương so với thuốc tham chiếu boluoke liều 200 mg/kg. BÀN LUẬN * Về mô hình gây NMN: Trong nghiên cứu này, mô hình gây NMN với can thiệp phẫu thuật tối thiểu và không cần khoan hộp sọ của chuột. Kỹ thuật sử dụng trong mô hình nghiên cứu tương đối đơn giản, cho phép ổn định mô hình tốt hơn, tính lặp lại cao hơn. Do can thiệp phẫu thuật tối thiểu, chuột hầu như không bị tổn thương khác ngoài tổn thương do NMN. Do đó, kết quả đánh giá tác dụng điều trị của thuốc có tính tin cậy cao hơn. Thực tế, kết quả nghiên cứu này cho thấy chuột ở lô phẫu thuật không gây đột quỵ không có tổn thương thực thể về vận động, điểm đánh giá theo thang điểm Clark của tất cả chuột ở lô này đều bằng 0. Ngoài ra, mô hình có ưu điểm tương đối ổn định. Khi bộc lộ vùng sọ có động mạch não giữa nằm phía dưới, qua kính hiển vi quan sát được cấu trúc mạch não ở dưới vùng sọ này. Với một số chuột T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2018 26 có cấu trúc mạch não bất thường, loại khỏi nghiên cứu. Điều đó cho phép chuột đưa vào nghiên cứu có cấu trúc mạch não giữa khá tương đồng nhau, tính lặp lại cũng như độ chính xác của thử nghiệm cao. * Về các thử nghiệm đánh giá tổn thương thần kinh gây ra do NMN: Thang điểm Clark đánh giá dựa trên rất nhiều chỉ tiêu về tư thế và vận động của chuột. Thử nghiệm bảng đục lỗ là thử nghiệm đơn giản, có độ nhạy cao, phù hợp với chuột sau đột quỵ não để đánh giá về mức độ hoạt động của chuột. Phương pháp và thang điểm sử dụng trong nghiên cứu là phương pháp đánh giá tác dụng dược lý có tính kinh điển, được nhiều tác giả trong và ngoài nước sử dụng, bảo đảm tính chính xác, độ nhạy và phù hợp với mô hình bệnh. * Về tác dụng của cao lỏng Trúng phong: Trong thiết kế nghiên cứu, lô chứng phẫu thuật không gây nhồi máu và lô chứng phẫu thuật gây nhồi máu sử dụng để bảo đảm tác dụng của cao lỏng Trúng phong được đánh giá rõ ràng khi so sánh với nhóm chứng. Ngoài ra, tác dụng của cao lỏng Trúng phong còn được so sánh với thuốc tham chiếu boluoke (Canada RNA Biochemical Inc) là thuốc được sử dụng rộng rãi trên lâm sàng và cho hiệu quả điều trị tốt. Chế phẩm uống lần đầu tiên tại thời điểm 3 giờ sau gây nhồi máu, sau khi chuột đã hoàn toàn hồi phục không còn tác dụng của gây mê. Tại thời điểm đánh giá sau gây nhồi máu 6 giờ (sau 3 giờ uống thuốc), các lô dùng thuốc đều giảm điểm Clark (mặc dù chưa rõ rệt), cho phép nghĩ tới chế phẩm bắt đầu có tác dụng. Tại thời điểm sau 24 giờ, các lô dùng thuốc có điểm Clark giảm có ý nghĩa thống kê so với lô gây nhồi máu không dùng thuốc, chứng tỏ chế phẩm đã có tác dụng. Chế phẩm có tác dụng sớm là điều rất quan trọng trong điều trị đột quỵ NMN. Tổn thương tế bào não hồi phục càng sớm thì tác dụng điều trị càng tốt và di chứng sau tai biến càng giảm, chứng tỏ thuốc có tác dụng tốt. Chúng tôi cho rằng nếu có thể bào chế ở dạng tiêm thì hiệu quả điều trị sẽ tăng lên, do bệnh lý đột quỵ não là bệnh lý cấp tính. KẾT LUẬN Cao lỏng Trúng phong 2:1 với mức liều 10,5 ml/kg (tương đương 21 g dược liệu khô/kg) có tác dụng tốt khi sử dụng điều trị trên mô hình gây NMN thực nghiệm ở chuột nhắt trắng, thuốc có tác dụng tương đương với thuốc tham chiếu boluoke liều 200 mg/kg. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ Y tế. Quyết định số 371/BYT-QĐ về việc ban hành “Quy chế đánh giá tính an toàn và hiệu lực của thuốc cổ truyền”. 1996. 2. Clark W, Gunion-Rinker L, Lessov N, Hazel K, Macdonald R.L. Citicoline treatment for experimental intracerebral hemorrhage in mice. Stroke. 1998, 29, pp.2136-2140. 3. Hiroshi Sugimori et al. Krypton laser- induced photothrombotic distal middle cerebral artery occlusion without craniectomy in mice. Brain Research Protocols. 2004, 13, pp.189-196.