Nghiên cứu sử dụng gel Fibrin chứa kháng sinh trong phòng ngừa và điều trị Biofilm vi khuẩn

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 261 NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG GEL FIBRIN CHỨA KHÁNG SINH TRONG PHÒNG NGỪA VÀ ĐIỀU TRỊ BIOFILM VI KHUẨN Đoàn Nguyên Vũ*, Trương Thanh Tùng*, Phạm Anh Vũ Thụy**, Trần Lê Bảo Hà* TÓM TẮT Mở đầu: Nhiễm trùng vật ghép là một trong những biến chứng nghiêm trọng nhất sau phẫu thuật. Gel fibrin với nhiều ưu điểm như tương hợp sinh học, phân hủy sinh học, tính bám dính và cầm máu; phù hợp để làm hệ thống phân phối kháng sinh tại chỗ. Đối tượng và phương pháp: Trong nghiên cứu này, huyết tương thu nhận từ máu ngoại vi được sử dụng để tạo gel fibrin bằng cách bổ sung ion Ca2+. Sau đó, gel fibrin chứa kháng sinh được đánh giá một số tính chất như cấu trúc bề mặt, phân hủy sinh học, phân phối kháng sinh và khả năng phòng ngừa/điều trị biofilm vi khuẩn in vitro. Kết quả: Kết quả cho thấy gel fibrin là vật liệu thích hợp để phân phối kháng sinh kéo dài. Quan trọng, gel fibrin chứa kháng sinh có khả năng ức chế sự phát triển của biofilm vi khuẩn in vitro. Kết luận: Nghiên cứu này là bước đầu cho việc phát triển hệ thống phân phối kháng sinh nhằm điều trị hiệu quả đối với nhiễm trùng vật ghép. Từ khóa: kháng sinh, biofilm, hệ thống phân phối thuốc, gel fibrin, nhiễm trùng vật ghép ABSTRACT THE RESEARCH ON USING FIBRIN GEL CONTAINING ABTIBIOTICS IN PREVENTION AND TREATMENT OF BACTERIAL BIOFILM Doan Nguyen Vu, Truong Thanh Tung, Pham Anh Vu Thuy, Tran Le Bao Ha * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 – No. 4 - 2019: 261 - 267 Objectives: Prosthetic vascular graft infection is one of the most serious complications after vascular surgery. Fibrin gel has many useful characteristics as biocompatibility, biodegradation, adhesion and haemostasis for development of local antibiotic delivery system. Materials and method: In this study, plasma was collected from peripheral blood that was used to create fibrin gel by supplement ion Ca2+. Fibrin gel containing antibiotic was then evaluated in some characteristics such as surface structure, biodegradation, antibiotic delivery, and prevention of bacterial biofilm in vitro. Results: The results showed that fibrin gel was excellent material for extended delivery of antibiotic. Most importantly, fibrin gel containing antibiotic were able to inhibit growth of bacterial biofilm in vitro. Conclusion: This research is the first step for development of antibiotic delivery system for effective treatments for graft infection. Keywords: antibiotic, biofilm, drug delivery system, fibrin gel, graft infection ĐẶT VẤN ĐỀ Gánh nặng chi phí hàng năm liên quan đến nhiễm trùng vật ghép là 640 triệu USD(8). Tỷ lệ mắc bệnh của nhiễm trùng vật ghép dao động từ 1-5%, thay đổi tùy theo vị trí cấy ghép, vật liệu sinh học được sử dụng và các bệnh đồng mắc phải của bệnh nhân. Tỷ lệ tử vong là khoảng 10- 25% trong vòng 30 ngày sau khi phát hiện và *Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh **Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS. Đoàn Nguyên Vũ ĐT: 0348064416 Email: dnvu@hcmus.edu.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 262 gần 50% sau 1 năm(13). Trong quá trình phẫu thuật, bệnh nhân thường được cung cấp kháng sinh; đặc biệt là trong phẫu thuật chỉnh hình vì diện tích phẫu thuật lớn và vật liệu được cấy ghép trong cơ thể. Ngoài ra, khi nhiễm trùng xảy ra ở vị trí cấy ghép nơi mật độ mạch máu thấp, bệnh nhân phải điều trị bằng kháng sinh liều cao và trong một thời gian dài. Do đó, làm tăng nguy cơ gây độc cho cơ thể bệnh nhân và tạo ra vi khuẩn kháng kháng sinh(1,12). Ngoài ra, biofilm phát triển trên bề mặt vật liệu cấy ghép đóng một vai trò quan trọng trong những khó khăn khi điều trị nhiễm trùng vật ghép. Trong trường hợp này, điều trị nhiễm trùng vật ghép bằng kháng sinh mà không loại bỏ vật ghép bị nhiễm là không thể(13). Để khắc phục những nhược điểm của việc chữa trị nhiễm trùng vật ghép và cũng để ngăn ngừa sự hình thành biofilm trên bề mặt vật liệu cấy ghép, một hệ thống phân phối kháng sinh có kiểm soát và trúng đích là cần thiết. Gel fibrin có nhiều đặc điểm để trở thành một ứng cử viên tiềm năng cho mục đích trên, như tính tương hợp sinh học, đặc tính bám dính và cấu trúc lỗ xốp tạo điều kiện cho việc phân phối các dược phẩm(3,7). Mục đích của nghiên cứu này là phát triển hệ thống phân phối kháng sinh tại chỗ từ gel fibrin nhằm điều trị nhiễm trùng vật ghép hiệu quả và ngăn ngừa biofilm vi khuẩn. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu thí nghiệm. Đối tượng nghiên cứu Máu ngoại vi được cung cấp bởi Trung tâm truyền máu Chợ Rẫy, Bệnh viện Chợ Rẫy, Thành phố Hồ Chí Minh. Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) và nguyên bào sợi người được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Kỹ thuật mô và Vật liệu y sinh (TEBM), Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. Phương pháp tạo gel fibrin Máu ngoại vi được ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút. Sau khi ly tâm, lớp huyết tương trên cùng được thu nhận và lặp lại bước ly tâm một lần nữa. Sau đó, huyết tương được bảo quản ở 4°C cho đến khi sử dụng. Huyết tương được bổ sung 3 nồng độ dung dịch CaCl2 (Merck): 0,011M CaCl2 (gel A); 0,013M CaCl2 (gel B); CaCl2 0,015M (gel C) và được ủ ở 37oC để tạo gel fibrin. Phương pháp đánh giá cấu trúc gel fibrin Cấu trúc gel fibrin được xác định bằng nhuộm Hematoxylin-Eosin (H&E) và kính hiển vi điện tử quét (SEM). Phương pháp đánh giá độ phân hủy gel fibrin Độ phân hủy của gel fibrin được đánh giá bằng cách ủ trong huyết tương người ở 37oC trong 7 ngày. Khối lượng còn lại của gel fibrin được xác định mỗi ngày. Phương pháp đánh giá khả năng nạp và thải kháng sinh của gel fibrin Tạo đường chuẩn (Phương pháp Kirby- Bauer) Các dung dịch huyết tương chứa vancomycin được chuẩn bị ở các nồng độ khác nhau (0,0625 mg/ml; 0,125 mg/ml; 0,25 mg/ml; 0,5 mg/ml; 1 mg/ml). Sau đó, khoanh giấy lọc Whatman vô trùng được thêm 30 μl mỗi dung dịch kháng sinh đã chuẩn bị, sau đó đặt trên đĩa vi khuẩn và ủ ở 37°C. Sau 18 giờ, đường kính của vòng kháng khuẩn được đo. Dựng đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa nồng độ kháng sinh và đường kính vòng kháng khuẩn(16). Đánh giá khả năng nạp kháng sinh của gel fibrin in vitro Huyết tương được cho vào đĩa 4 giếng, sau đó vancomycin được thêm vào cùng lúc với dung dịch CaCl2 và ủ ở 37oC. Sau khi tạo gel fibrin, dung dịch còn lại được thu nhận để xác định nồng độ kháng sinh dựa trên đường chuẩn. Đánh giá khả năng thải kháng sinh của gel fibrin in vitro Gel fibrin chứa kháng sinh được ủ trong Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 263 huyết tương và lắc 100 vòng/phút ở 37°C trong 7 ngày. Huyết tương được thu nhận và bảo quản ở -20°C. Nồng độ kháng sinh được xác định trong mỗi ngày thí nghiệm dựa trên đường chuẩn. Phương pháp tạo mô hình biofim in vitro P. aeruginosa được nuôi trong môi trường TSA (Oxoid) ở 37oC qua đêm trong tủ ủ lắc. Sau đó, P. aeruginosa tiếp tục được nuôi trong môi trường TSB (Oxoid) chứa 2% glucose ở 37oC qua đêm trong tủ ủ lắc. Dung dịch P. aeruginosa được pha loãng để đạt mật độ 5x105 CFU/ml trong môi trường TSB chứa 2% glucose. Sau đó, dịch huyền phù vi khuẩn được nuôi cấy trong các đĩa 96 giếng phủ huyết tương và ủ ở 37oC trong 7 ngày. Phương pháp đánh giá sự hình thành mô hình biofilm in vitro Mô hình biofilm hình thành trên các đĩa được rửa hai lần bằng dung dịch PBS (Sigma) để loại bỏ vi khuẩn tự do và bám dính lỏng lẻo. Sau đó, các tế bào được cố định bằng cồn tuyệt đối trong 10 phút và nhuộm crystal violet 1% trong 20 phút; sau khi rửa hai lần bằng PBS, các giếng được làm khô tự nhiên. Crystal violet được hòa tan với acid acetic 33% và độ hấp thụ của thuốc nhuộm được đọc ở bước sóng 570 nm(14). Bảng 1. Phân loại sự hình thành biofilm in vitro Sự hình thành biofilm Average OD results Không có biofilm OD ≤ 0,163 Biofilm yếu 0,163 OD ≤0,326 Biofilm trung bình 0,326 OD ≤0,652 Biofilm mạnh OD 0,652 Phương pháp đánh giá khả năng phòng ngừa sự hình thành của biofilm in vitro Gel fibrin chứa kháng sinh được đặt vào từng giếng trong các đĩa 96 giếng vô trùng cùng lúc với bổ sung dịch vi khuẩn và ủ ở 37°C trong 7 ngày. Khả năng phòng ngừa sự hình thành biofilm in vitro được đánh giá bằng phương pháp MTT và nhuộm crystal violet. Phương pháp đánh giá khả năng điều trị biofilm in vitro Gel fibrin chứa kháng sinh được đặt vào từng giếng trong các đĩa 96 giếng vô trùng đã có mô hình biofilm sau 24 giờ và ủ ở 37°C trong 7 ngày. Khả năng điều trị biofilm in vitro được đánh giá bằng phương pháp MTT và nhuộm crystal violet. Phương pháp MTT Các mẫu biofilm trên đĩa được rửa hai lần bằng dung dịch PBS để loại bỏ vi khuẩn bám dính lỏng lẻo. Môi trường nuôi cấy được pha với dung dịch MTT 5 mg/ml và ủ trong 3 giờ ở 37°. Dung dịch được loại bỏ nhẹ nhàng và tủa được hòa tan trong dimethylsulfoxide (DMSO), sau đó đo ở bước sóng 570nm. Xử lý số liệu Số liệu thu nhận được xử lý theo chương trình Statgraphic 7.0 của Trường Đại học Michigan (Mỹ). KẾT QUẢ Kết quả tạo gel fibrin Máu ngoại vi được ly tâm ở 3000 vòng/ phút trong 10 phút; sau đó chất lỏng bề mặt được thu nhận. Tốc độ ly tâm này không gây lắng protein trong máu; đồng thời, các tế bào máu không bị phá vỡ. Sau 2 lần ly tâm, huyết tương thu nhận có màu vàng, thể tích huyết tương khoảng 45% so với tổng thể tích máu ngoại vi (Hình 1). A B C Hình 1. Huyết tương thu nhận từ máu ngoại vi. A. Máu ngoại vi; B. Máu ngoại vi sau ly tâm; C. Huyết tương Bảng 2. Thời gian hình thành của gel fibrin Gel A B C Thời gian hình thành (phút) 20,67 0,58 15,33 0,58 13,33 0,58 Sau khi thêm dung dịch CaCl2, huyết tương chuyển sang màu vàng đục. Sau khoảng 20 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 264 phút, gel fibrin được hình thành với hình dạng của các vật chứa (Hình 2). Nồng độ dung dịch CaCl2 càng cao thì thời gian hình thành của gel fibrin càng nhanh (Bảng 2). Hình 2. Gel fibrin hình thành với các dung dịch CaCl2 nồng độ khác nhau Kết quả cấu trúc gel fibrin Hình ảnh chụp SEM cho thấy gel fibrin có cấu trúc xốp được hình thành bởi các sợi protein đan xen. Những sợi protein này có đường kính khoảng 0,5 μm (Hình 3). Hình 3. Hình ảnh chụp SEM của gel fibrin (x10.000) Kết quả nhuộm H&E cho thấy kích thước lỗ trung bình của gel fibrin tăng dần khi nồng độ dung dịch CaCl2 tăng. Mặt khác, mật độ của các lỗ trong gel giảm (Hình 4). A B C Hình 4. Hình ảnh nhuộm H&E của gel fibrin (x400). A: Gel A, B: Gel B, C: Gel C Kết quả đánh giá độ phân hủy của gel fibrin Kết quả sự phân hủy của gel fibrin trong huyết tương người cho thấy gel fibrin phân hủy liên tục trong 7 ngày. Khối lượng gel fibrin giảm nhanh trong ngày đầu tiên (30 - 50%) và giảm chậm hơn trong những ngày sau đó. Sau 7 ngày, gel A và C bị phân hủy hoàn toàn; gel B còn lại 25% khối lượng ban đầu (Hình 5). Kết quả này cho thấy gel fibrin có khả năng phân hủy sinh học trong huyết tương người và gel B có thể tồn tại lâu hơn 7 ngày. Hình 5. Phần trăm khối lượng gel fibrin còn lại trong 7 ngày Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 265 Kết quả tạo đường chuẩn Vancomycin được pha loãng với các nồng độ khác nhau trong huyết tương thu nhận, sau đó tạo vòng kháng khuẩn bằng phương pháp Kirby- Bauer. Đường chuẩn cho thấy mối quan hệ giữa nồng độ vancomycin và đường kính vòng kháng khuẩn được xác nhận với độ chính xác là 98,9% (Hình 6). Hình 6. Đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa nồng độ vancomycin và đường kính vòng kháng khuẩn Kết quả đánh giá khả năng nạp kháng sinh của gel fibrin in vitro Kết quả cho thấy lượng vancomycin được giữ lại của gel A và B tương đương (67,1% và 65,5%), lớn hơn lượng vancomycin được giữ lại trong gel C (44,8%). Kết quả đánh giá khả năng thải kháng sinh của gel fibrin in vitro Kết quả cho thấy gel A và B có khả năng giải phóng lượng vancomycin tương đương (khoảng 30% lượng vancomycin trong gel) trong ngày đầu tiên, trong khi đó gel C rất thấp (khoảng 14% lượng vancomycin trong gel). Gel A và B có khả năng giải phóng vancomycin trong 5 đến 7 ngày, trong khi gel C chỉ có thể giải phóng vancomycin trong 3 ngày. Kết quả sự hình thành biofilm in vitro Nghiên cứu này tạo biofilm trên các đĩa 96 giếng polypropylene được bao phủ bởi huyết tương người bằng P. aeruginosa sinh trưởng trong môi trường TSB chứa 2% glucose. Phân tích SEM cho thấy các biofilm trưởng thành được hình thành và phát triển dày đặc trên các đĩa polystyrene với cấu trúc ba chiều nhiều lớp (Hình 7). Ngoài ra, kết quả đạt được khi nhuộm crystal violet sinh khối biofilm trong 24 giờ là 2,798 (>0,652) chứng minh rằng có sự hình thành biofilm mạnh. A B Hình 7. Sự hình thành biofilm trên bề mặt của đĩa 96 giếng sau 24 giờ. A. Quan sát bằng kính hiển vi đảo ngược (x100), B. Quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét (x5.000) Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 266 Kết quả đánh giá ảnh hưởng của gel fibrin chứa kháng sinh lên sự hình thành của biofilm in vitro Hình 8. Đường cong tăng trưởng của vi khuẩn trong các nhóm thí nghiệm Với mục đích phòng ngừa sự hình thành biofilm in vitro, gel fibrin chứa kháng sinh có khả năng giải phóng lượng vancomycin lớn trong vài ngày đầu (khoảng 30%) nhằm ngăn chặn sự bám dính của tế bào vi khuẩn trên bề mặt đĩa polypropylene. Ngoài ra, vancomycin liên tục được giải phóng trong những ngày tiếp theo để tiêu diệt tất cả các tế bào vi khuẩn còn lại. Sự tăng sinh của vi khuẩn và hình thành biofilm (OD570nm <0,163) không xuất hiện trong các giếng chứa gel fibrin (Hình 8, Bảng 3). Với mục đích điều trị biofilm in vitro, sau khi gel fibrin chứa kháng sinh được thêm vào giếng, sự tăng sinh của vi khuẩn giảm dần. Đến ngày thứ 7, không có sự hiện diện của biofilm trong các giếng nuôi cấy (OD570nm <0,163) (Hình 8, Bảng 3). Bảng 3. Kết quả nhuộm crystal violet của sinh khối biofiilm Thời gian (giờ) Đối chứng Nhóm phòng ngừa Nhóm điều trị 24 2,798 ± 0,494 0,044 ± 0,002 2,798 ± 0,494 168 0,781 ± 0,079 0,039 ± 0,002 0,039 ± 0,002 BÀN LUẬN Vai trò của Ca2+ trong sự hình thành gel fibrin là sự kích hoạt thrombin trong huyết tương để giúp chuyển fibrinogen thành các đơn phân fibrin, chúng sẽ liên kết với nhau nhờ liên kết disulfide tạo thành sợi polymer. Nồng độ CaCl2 tăng ảnh hưởng đến việc kích hoạt thrombin để đẩy nhanh quá trình chuyển đổi fibrinogen thành fibrin, cũng như thúc đẩy việc kích hoạt yếu tố đông máu XIII làm cho mạng lưới polymer của fibrin ổn định.Ngoài ra, mức độ kích hoạt của thrombin ảnh hưởng đến cấu trúc của mạng sợi fibrin. Mức độ hoạt động cao của thrombin làm cho các sợi lớn hơn, ít phân nhánh hơn, với các lỗ lớn hơn(6). Đồng thời, thời gian tạo gel fibrin càng lâu thì mật độ lỗ càng lớn(2). Gel fibrin là vật liệu cầm máu từ protein đông máu của huyết tương, thường được sử dụng trong các quá trình phẫu thuật. Chúng tương hợp và phân hủy sinh trong nhiều ngày hoặc vài tuần tùy thuộc vào vị trí. Nhiều nghiên cứu cho rằng kháng sinh có độ hòa tan thấp đặc biệt phù hợp với hệ thống này(16), có thể do kháng sinh hòa tan và khuếch tán chậm từ gel fibrin. Hơn nữa, các kháng sinh có độ hòa tan cao như gentamicin và ciprofloxacin được giải phóng từ gel fibrin in vitro khoảng 5-7 ngày đối với gentamicin(9) và khoảng 60 ngày đối với ciprofloxacin(15), mặc dù hơn 66% được giải phóng trong 2 ngày đầu tiên. Kiểm tra độ nhạy của các tế bào vi khuẩn tự do không thể giúp dự đoán khả năng kháng kháng sinh in vivo của thiết bị y tế bị nhiễm trùng. Ngày nay, nhiều nghiên cứu cho rằng biofilm vi khuẩn có độ nhạy cảm với kháng sinh thấp, trong khi vi khuẩn tự do thì không(10). P.aeruginosa gây ra nhiễm trùng liên quan đến biofilm và thường được tìm thấy trong các vết thương và thiết bị y tế bị nhiễm trùng mãn tính như chân giả, stent, ống thông và ống nội khí quản(5,11). Nhiều nghiên cứu in vitro và lâm sàng đã chỉ ra rằng biofilm có khả năng hình thành trên bề mặt polypropylen và một trong những nguyên nhân chính là P. aeruginosa(4,17). KẾT LUẬN Tạo thành công gel fibrin có kích thước lỗ từ 5 đến 28 μm, có khả năng tự phân hủy sinh học, có khả năng nạp và thải kháng sinh hiệu quả. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 267 Ngoài ra, gel fibrin chứa kháng sinh có khả năng phòng ngừa và điều trị mô hình bioflm in vitro. Lời cảm ơn: Nghiên cứu được tài trợ bởi Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh (ĐHQG-HCM) trong khuôn khổ Đề tài mã số C2017-18-22. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Archer NK, Mazaitis MJ, Costerton JW, Leid JG, Powers ME, Shirtliff ME (2011). Staphylococcus aureus biofilms: properties, regulation, and roles in human disease. Virulence, 2:445-459. 2. Blombäck B, Carlsson K, Fatah K, Hessel B, Procyk R (1994). Fibrin in human plasma: gel architectures governed by rate and nature of fibrinogen activation. Thrombosis Research, 75:521-538. 3. Canonico S (2003). The use of human fibrin glue in the surgical operations. Acta bio-medica: Atenei Parmensis, 74:21-25. 4. Engelsman A, Van der Mei H, Busscher H, Ploeg R (2008). Morphological aspects of surgical meshes as a risk factor for bacterial colonization. British Journal of Surgery, 95:1051-1059. 5. Hubert D, Réglier-Poupet H, Sermet-Gaudelus I, Ferroni A, Le Bourgeois M, Burgel P-R, et al (2013). Association between Staphylococcus aureus alone or combined with Pseudomonas aeruginosa and the clinical condition of patients with cystic fibrosis. Journal of Cystic Fibrosis, 12:497-503. 6. Janmey PA, Winer JP, Weisel JW (2009). Fibrin gels and their clinical and bioengineering applications. Journal of the Royal Society Interface, 6:1-10. 7. Katrancioglu N, Karahan O, Kilic AT, Katrancioglu O, Celik C, Bakici MZ, et al (2012). Is sustained release of vancomycin from fibrin glue effective to prevent methicillin-resistant Staphylococcus aureus graft infection? African Journal of Microbiology Research, 6:798-801. 8. Kilic A, Arnaoutakis DJ, Reifsnyder T, Black III JH, Abularrage CJ, Perler BA, et al (2016). Management of infected vascular grafts. Vascular medicine, 21:53-60. 9. Kram HB, Bansal M, Timberlake O, Shoemaker WC (1991). Antibacterial effects of fibrin glue-antibiotic mixtures. Journal of Surgical Research, 50:175-178. 10. Melake NA, Mahmoud HA, Al-Semary MT (2012). Bactericidal activity of various antibiotics versus tetracycline-loaded chitosan microspheres against Pseudomonas aeruginosa biofilms. African Journal of Microbiology Research, 6:5387-5398. 11. Percival SL, Suleman L, Vuotto C, Donelli G (2015). Healthcare- associated infections, medical devices and biofilms: risk, tolerance and control. Journal of Medical Microbiology, 64:323-334. 12. Pye A, Lockhart D, Dawson M, Murray C, Smith A (2009). A review of dental implants and infection. Journal of Hospital infection, 72:104-110. 13. Revest M, Jacqueline C, Boudjemaa R, Caillon J, Le Mabecque V, Breteche A, et al (2016). New in vitro and in vivo models to evaluate antibiotic efficacy in Staphylococcus aureus prosthetic vascular graft infection. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 71:1291-1299. 14. Stepanović S, Vuković D, Hola V, Bonaventura GD, Djukić S, Ćirković I, et al (2007). Quantification of biofilm in microtiter plates: overview of testing conditions and practical recommendations for assessment of biofilm production by staphylococci. Apmis, 115:891-899. 15. Tsourvakas S, Hatzigrigoris P, Tsibinos A, Kanellakopoulou K, Giamarellou H, Dounis E (1995). Pharmacokinetic study of fibrin clot-ciprofloxacin complex: an in vitro and in vivo experimental investigation. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery, 114:295-297. 16. Woolverton CJ, Fulton JA, Salstrom S-J, Hayslip J, Haller NA, Wildroudt ML, et al (2011). Tetracycline delivery from fibrin controls peritoneal infection without measurable systemic antibiotic. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 48:861-867. 17. Yadav MK, Chae S-W, Go YY, Im GJ, Song JJ (2017). In vitro multi-species biofilms of methicillin-resistant Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa and their host interaction during in vivo colonization of an otitis media rat model. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 7:125. Ngày nhận bài báo: 28/07/2019 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20/08/2019 Ngày bài báo được đăng: 14/09/2019