Nghiên cứu sản xuất chế phẩm men vi sinh từ chủng Bacillus subtilis b-N - Vũ Văn Dũng

Hóa học và Kỹ thuật môi trường V.V.Dũng, L.Đ.Anh, V.D.Nhàn, N.T.Nhàn, T.T.Nguyệt, “Nghiên cứu sản xuất B-N.” 60 NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM MEN VI SINH TỪ CHỦNG Bacillus subtilis B-N Vũ Văn Dũng1, Lê Đức Anh1, Vũ Duy Nhàn1, Nguyễn Thị Nhàn1, Trần Thị Nguyệt1 Tóm tắt: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố (nhiệt độ, pH, nguồn cacbon, nito, thời gian...) đến sự sinh trưởng từ đóxác định được môi trường và thời gian thích hợp để lên men thu sinh khối chủng Bacillus subtilis B-N. Đã lựa chọn được môi trường nhũ hóa(sữa gầy 10%, trehalose10%; mì chính 5%) tỷ lệ sốngsót đạt 88%, mật độ vi sinh vật trong chế phẩm đạt 1,78.1010 cfu/g. Tỷ lệ sống sót sau 6 tháng bảo quản ở nhiệt độ phòng đạt 60%, sau 12 tháng còn 48%. Từ khóa: Bacillus subtilis, Men vi sinh, Probiotic 1. MỞ ĐẦU Bacillus subtilis là loài vi sinh vật được sử dụng rộng rãi trong các chế phẩm probiotic (vi sinh vật sống) có tác dụng duy trì sự cân bằng hệ vi khuẩn ở ruột, ngăn ngừa rối loạn tiêu hóa do có khả năng tạo bào tử, sinh các enzyme tiêu hóa (amylase, protease), các chất kháng sinh, các chất kích thích miễn dịch và một số vitamin B[3]. Chủng Bacillus subtilis B-N (B.subtilis B-N) phân lập từ chế phẩm men vi sinh Bioractaze của Nhật bản, đã đượcđịnh danh bằng phương pháp giải trình tự rARN 16S và xác định một số đặc tính probiotic như: có khả năng chịu pH thấp, sinh bacteriocin và một số enzyme tiêu hóa như protease, amylase. Với mục tiêu sản xuất chế phẩm men vi sinh từ chủng B.subtilisB-N làm nguồn nguyên liệu bổ sung vào khấu phần ăn cho bộ đội chúng tôi tiến hành nghiên cứu sản xuất chế phẩm men vi sinh từ chủng vi sinh vật này với nội dung: - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố như nhiệt độ, pH, nguồn cacbon, nguồn nitơ đến khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng B.subtilisB-N từ đó lựa chọn được điều kiện và môi trường thích hợp cho quá trình nhân, thu sinh khối tế bào. - Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm men vi sinh từ chủng B.subtilisB-N và đánh giá sự suy giảm mật độ tế bào vi sinh vật theo thời gian bảo quản. 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vi sinh vật Chủng vi sinh vật Bacillus subtilis B-N được giữ giống trên môi trường thạch nghiêng và dạng đông khô tại phòng Hóa sinh, Viện Hoá học - Vật liệu. 2.2. Hoá chất Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Viện Hóa học – Vật liệu, 10 - 2015 61 Cao thịt (Canada), nước mắm (Phú quốc),Các hóa chất do Trung quốc sản xuất: tinh bột, saccharose, glucose, fructose, maltose, dung dịch H2SO4 đặc 98%, dung dịch glucose chuẩn 1g/l, phenol, NaOH 0.1 N, Na2CO3), BSA protein huyết thanh bò. Môi trường NB: peptone 5g/l; cao thịt 3g/l 2.3. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật: Phương pháp đến tế bào bằng buồng đếm hồng cầu, phương pháp đo độ đục (OD) và xác định số lượng tế bào bằng phương pháp pha loãng tới hạn và nuôi cấy trên môi trường thạch (CFU)[1] - Phương pháp xác định đường tổng bằng Phenol và acid Sulfuric[2] - Phương pháp định lượng protein bằng phương pháp Lowry[2] - Phương pháp tính toán lượng môi trường bổ sung trong lên men tạo sinh khối cao [4]. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự phát triển của chủng B.subtilis B-N 3.1. 1. Ảnh hưởng của nhiệt độ Chủng B.subtilisB-N được nuôi cấy trên môi trường NB ở các nhiệt độ 20, 25, 27, 30, 34, 37, 40 và 450C. Sau 24 giờ lên men, xác định khả năng sinh trưởng bằng phương pháp đếm khuẩn lạc (CFU). Hình 1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của chủng B.subtilis B-N. Kết quả cho thấy nhiệt độ 370C thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của chủng B.subtilisB-N. 3.1.2. Ảnh hưởng của pH Chủng B.subtilisB-N được nuôi cấy trên môi trường NB có pH: 5; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8. Sau 24 giờ nuôi cấy, đánh giá khả năng sinh trưởng bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Hình 2. Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của chủng B.subtilis B-N. Qua hình 2 ta thấy tại pH 7 cho số lượng tế bào lớn nhất. Sau khi xác định được pH tối ưu chúng tôi tiến hành quá trình lên men ổn định pH 7 trong suốt quá trình nuôi cấy bằng HCl 1N. Kết quả được trình bày trong bảng dưới đây. Hóa học và Kỹ thuật môi trường V.V.Dũng, L.Đ.Anh, V.D.Nhàn, N.T.Nhàn, T.T.Nguyệt, “Nghiên cứu sản xuất B-N.” 62 Bảng 1. Ảnh hưởng của sự ổn định giá trị pH tối ưu đến sự phát triển của chủng B.subtilis B-N. pH CFU/ml (*108) OD Thay đổi 4.21±0.05 1.32 7 5.20±0.02 1.45 Như vậy, nếu ổn định pH trong quá trình nuôi cấy ở giá trị pH tối ưu thì cho mật độ tế bào cao hơn. 3.1.3. Ảnh hưởng của nguồn cacbon Cacbon là nguồn cung cấp năng lượng, dinh dưỡng quan trọng và không thể thiếu cho tế bào. Các nguồn cacbon: glucoza, saccharose, tinh bột, fructose, maltose được bổ sung vào môi trường NB với hàm lượng 10g/l. Kết quả thí nghiệm sau 24h nuôi cấy được khảo sát bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Chủng B.subtilis B-N có khả năng sử dụng cả các loại đường trên. Khi nguồn cacbon là đường glucose thì số khuẩn lạc là lớn nhất và hàm lượng đường sót là ít nhất. Qua thí nghiệm này chúng tôi quyết định chọn đường glucose bổ sung vào môi trường NB. Hình 3. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự phát triển của chủng B.subtilis B-N. Hình 4. Ảnh hưởng của nồng độ glucose đến sự phát triển của chủng B.subtilis B-N. 3.1.4. Ảnh hưởng của nồng độ glucose Mỗi chủng vi sinh vật thường có một nguồn cacbon và nồng độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển. Thí nghiệm này nhằm tìm ra hàm lượng glucose thích hợp nhất cho chủng B.subtilis B-N sinh trưởng và phát triển. Hàm lượng glucose được sử dụng là 3, 5, 7,10, 13, 15, 20, 25, 30g/l. Sau 24h nuôi cấy chúng tôi tiến hành đếm mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Kết quả cho thấy: mật độ tế bào tang khi hàm lượng đường tăng từ 7-20g/l. Tuy nhiên, mật độ cao nhất khi hàm lượng đường là 10 g/l. 3.1.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ Nguồn nito được khảo sát gồm:nước mắn, cao nấm men.Môi trường NB được bố sung 10g glucose/l được sử dụng để làm các thí nghiệm để tìm nguồn nito thích hợp. Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Viện Hóa học – Vật liệu, 10 - 2015 63 a. Nguồn nito từ cao nấm men Bảng 2. Ảnh hưởng của cao nấm men đến sự phát triển của chủng B.subtilis B-N. MT Thành phần Cfu/ml *108 OD MT1 NB 2.89 ± 0.03 0.89 MT2 NB+10g glucose/l 3.34 ± 0.02 1.12 MT3 MT2+1g cao men/l 3.52 ± 0.04 1.20 MT4 MT2+2g cao men/l 3.92 ± 0.02 1.38 MT5 MT2+3g cao men/l 5.10 ± 0.04 1.58 MT6 MT2+4g cao men/l 5.20 ± 0.05 1.61 MT7 MT2+5g cao men/l 4.20 ± 0.05 1.41 Kết quả cho thấy hàm lượng cao nấm men thích hợp là 3- 4 g/l. b. Nguồn nito từ nước mắm Bảng 3. Ảnh hưởng của nước mắm đến sự phát triển của chủng B.subtilis B-N. MT Thành phần Cfu/ml *108 OD MT1 NB 2.85± 0.05 0.84 MT2 NB+10g glucose/l 3.35 ± 0.03 1.14 MT8 MT2+1g/l đạm mắm 3.47 ± 0.02 1.14 MT9 MT2+2g/l đạm mắm 3.87 ± 0.04 1.32 MT10 MT2+3g/l đạm mắm 5.05 ± 0.06 1.52 MT11 MT2+4g/l đạm mắm 5.15 ± 0.05 1.55 MT12 MT2+5g/l đạm mắm 4.15 ± 0.05 1.35 Kết quả cho thấy đạm mắm phù hợp: 3g/l c. Nguồn nito từ nước mắm + cao nấm men Bảng 4. Ảnh hưởng của nguồn nito kết hợp nước mắm + cao nấm men đến sự phát triển của chủngB.subtilis B-N. MT Thành phần Cfu/ml (.108) OD MT1 NB 2.85±0.05 0.84 MT2 NB+ 10g glucose/l 3.35±0.06 1.14 MT5 MT2+ 3g/l cao men 5.10±0.04 1.58 MT10 MT2+ 3 g/l đạm mắm 5.05±0.03 1.52 MT13 MT2+ 3 g/l đạm mắm +3g/l cao men 7.21±0.04 1.87 Tỷ lệ nước mắm : cao men thích hợp là 3 g/l đạm mắm: 3g/l cao men 3.1.6. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất thu sinh khối Hóa học và Kỹ thuật môi trường V.V.Dũng, L.Đ.Anh, V.D.Nhàn, N.T.Nhàn, T.T.Nguyệt, “Nghiên cứu sản xuất B-N.” 64 Thời gian là yếu tố ảnh hưởng quan trọng đến lượng sinh khối sinh ra. Để tìm ra thời gian thích hợp và một số đặc tính của hai chủng nghiên cứu chúng tôi đã tiến hành lên men thu sinh khối ở quy mô nhỏ. Thực hiện quá trình lên men trong bình tam giác 500ml. Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ sau: Giống Hoạt hoá Nuôi cấy Khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của chủng bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Trong quá trình nuôi cấy cứ 5- 6h giờ lấy mẫu một lần. Hình 5. Động học quá trình lên men. Qua hình 5 ta thấy: Pha sinh trưởng bắt đầu từ mốc 0h đến 39h, tại thời điểm 39h cho số lượng tế bào lớn nhất. Pha ổn định( cân bằng) cũng không được thể hiện rõ trên đồ thị, điều này có thể do pha cân bằng rất ngắn, mà khoảng cách thời gian khảo sát lại thưa nên không thể hiện được. Qua khảo sát chúng tôi thấy nội bào tử xuất hiện tại thời điểm 21h, nhưng đến 33h mới xuất hiện bào tử tự do nhưng lượng thấp (2.107 bào tử/ml). Đến thời điểm 39h lên men cho số tế bào cực đại thì lượng bào tử mới đạt 5.107 bào tử/ml. Nồng độ chất dinh dưỡng giảm mạnh trong quá trình lên men. Nồng độ đường ở thời điểm ban đầu là 10.92 g/l, bước vào pha suy vong sau 39 h lên men còn 3.11 g/l. Nguồn đạm tuy có sự thay đổi nhưng giảm không đáng kể, điều này có thể do trong quá trình sinh trưởng vi khuẩn sinh ra enzym hoặc các chất trao đổi có bản chất protein. Như vậy chúng tôi nhận thấy thời điểm 39h là thời điểm tốt nhất để thu sinh khối. 3.2. Lên men tạo sinh khối cao Để thu được sinh khối cao, ngoài việc tạo được môi trường lên men phù hợp, điều chỉnh các yếu tố lên men thì việc bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng sau khi bị tiêu hao là cơ sở để duy trì sự phát triển sinh khối tối đa. Tuy nhiên cần tính toán lượng chất dinh dưỡng bổ sung để tránh dư thừa gây ảnh hưởng đến quá trình pháttriển của vi khuẩn. Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Viện Hóa học – Vật liệu, 10 - 2015 65 Qua nghiên cứu ở trên chúng tôi thấy chủng vi khuẩn bắt đầu kết thúc pha sinh trưởng ở thời điểm 39h. Do đó ta tiến hành bổ sung thêm dinh dưỡng vào ngay sau thời điểm này. Sau 6h ta lấy dịch nuôi cấy để kiểm tra lượng sinh khối. Ta được kết quả như sau: Bảng 5. Tính toán lượng đường và đạm cần bổ sung vào môi trường lên men. µ Qđạm (g/l/h) Qđường (g/l/h) Yđạm/đường Đường bổ sung (g/l) Đạm bổ sung (g/l) 0.024 0.29 0.15 1.86 9.1 10.2 Hình 6. Động học quá trình lên men có bổ sung chất dinh dưỡng. Qua hình 6 ta thấy rõ tác dụng của việc bổ sung môi trường dinh dưỡng vào quá trình lên men. Quá trình này làm tăng lượng sinh khối lên 2 lần so với thời điểm 39h. Lượng đường và đạm giảm song song với quá trình tăng sinh khối 3.3. Nghiên cứu xây dựng quy trình tạo chế phẩm 3.3.1. Lựa chọn chất bảo vệ tế bào Trên cở sở một số tài liệu trong và ngoài nước chúng tôi đã lựa chọn: natri glutamat, sữa gầy và lactose, trehalose làm chất bảo vệ tế bào trong quá trình sấy [5]. Sinh khố ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong khoảng thời gian 5 phút, sau đó được hoà vào môi trường chứa chất bảo vệ tế bào dưới đây sao cho mật độ tế bào đạt khoảng 1- 2*1011 CFU/ml:MT1 có tỉ lệ sữa gầy 15% và mì chính 5%; MT2 có tỉ lệ lactose 15% và mì chính 5% ; MT3 có tỉ lệ trehalose 15% và mì chính 5%; MT4 có tỉ lệ sữa gầy 10%, lactose 10% và mì chính 5% ; MT5 có tỉ lệ sữa gầy 10%, trehalose10% và mì chính 5%. Hóa học và Kỹ thuật môi trường V.V.Dũng, L.Đ.Anh, V.D.Nhàn, N.T.Nhàn, T.T.Nguyệt, “Nghiên cứu sản xuất B-N.” 66 Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm 3.3.2. Khả năng sống sót của vi sinh vật trong quá trình sấy Sơ đồ quá trình tạo hạt và sấy Bảng 8. Khả năng sống sót của chủng B.subtilis B-N trong quá trình sấy. Như vậy, trong quá trình sấy, tế bào vi khuẩn chết khá nhiều, mật độ chế phẩm gốc chỉ đạt khoảng 1.1010 cfu/g. Hiệu suất quá trình đạt trên 80%. Môi trường chứa sữa gầy, trehalose và mì chính cho khả năng sống sót cao nhất. 3.3.3. Khả năng sống sót của vi sinh vật trong quá trình bảo quản Mật độ tế bào trước sấy(*1010cfu/g) Mật độ tế bào sau sấy(*1010cfu/g) Nhiệt độ 0C Thời gian h Sống sót % MT1 2.14±0.05 1.67±0.03 45 4 80.9 MT2 2.31±0.06 1.89±0.02 45 4 81.9 MT3 1.98±0.03 1.75±0.05 45 4 79.1 MT4 2.21±0.05 1.63±0.04 45 4 87.9 MT5 2.12±0.04 1.78±0.03 45 4 88.1 Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Viện Hóa học – Vật liệu, 10 - 2015 67 Từ kết quả trên chúng tôi tiến hành tạo chế phẩm và đánh giá sự biến động số lượng vi sinh vật theo thời gian bảo quản.Từ chế phẩm gốc chúng tôi tiến hành tạo các chế phẩm có mật độ thấp hơn (2-5*109cfu/ml) bằng cách trộn chế phẩm gốc với các tá dược là lactose và tinh bột sắn. Bảng 9. Theo dõi sự suy giảm mật độ tế bào. Thời gian (tháng) Chế phẩm gốc(cfu/g) Chế phẩm trộn Lactose(cfu/g) Chế phẩm trộn tinh bột sắn(cfu/g) Tủ lạnh (4-60C) Nhiệt độ phòng(<320C) Tủ lạnh (4-60C) Nhiệt độphòng(<300C) Tủ lạnh (4-60C) Nhiệt độ phòng(<300C) 0 1.81*1010 1.81*1010 5.21*109 5.21*109 5.21*109 5.21*109 3 1.82*1010 1.82*1010 4.91*109 4.72*109 4.71*109 4.81*109 6 1.79*1010 1.60*1010 4.70*109 3.49*109 4.15*109 4.48*109 9 1.5*1010 1.1*1010 4.0*109 2.49*109 3.12*109 4.30*109 12 1.1*1010 0.88*1010 2.20*109 1.1*109 2.05*109 2.38*109 Qua bảng kết quả trên chúng tôi có một số nhận xét sau: - Sau 6 tháng bảo quản chế phẩm gốc được bảo quản trong tủ lạnh và nhiệt độ phòng có mật độ tế bào thay đổi không đáng kế so với thời điểm ban đầu. Sau 12 tháng mật độ tế bào sống đạt khoản 60% với các chế phẩm bảo quản 4-60C , đạt 40% với các chế phẩm bảo quản ở nhiệt độ phòng. - Việc sử dụng đường lactose và tinh bột sắn làm tá dược để trộn không ảnh hưởng đến khả năng sống sót của tế bào trong chế phẩm trong quá trình bảo quản. Tùy mục đích sử dụng sản phẩm có thể chọn lactose hay tinh bột làm tá dược trộn. 4. KẾT LUẬN 1. Điều kiện thích hợp cho quá trình lên men và thu sinh khối: Nhiệt độ 370C; pH 7; Nguồn đường bổ sung: glucose 10g/l; Nguồn đạm bổ sung: 3g/l đạm nước mắm + 3g/l cao nấm men;Thời gian thu sinh khối khi không bổ sung môi trường là 39h; Thời gian thu sinh khối khi lên men có bổ sung môi trường là 45h; 2. Chất mang thích hợp cho quá trình sấy: MT5 có tỉ lệ sữa gầy 10%, trehalose 10% và mì chính 5%, thời gian sấy là 4h,tỉ lệ sống sót đạt 88%. Mật độ vi sinh vật trong chế phẩm đạt 1.78 cfu/g. Tỷ lệ sống sót sau 6 tháng bảo quản ở nhiệt độ phòng đạt 60%, sau 12 tháng còn 48%. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, ”Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật”. NXB Khoa học và kĩ thuật, Hà nội,1989, 27-35. 2. Nguyễn Văn Mùi. ”Thực hành Hoá sinh học”. NXB ĐHQG Hà Nội, 2001,57-63. Hóa học và Kỹ thuật môi trường V.V.Dũng, L.Đ.Anh, V.D.Nhàn, N.T.Nhàn, T.T.Nguyệt, “Nghiên cứu sản xuất B-N.” 68 3.T.R. Callaway, T. S. Edrington, R. C. Anderson. “Probiotics, prebiotics and competitive exclusion for prophylaxis against bacterial disease”. Animal Health Research Reviews,2008, 9, pp 217-225. 4.J. Stratton, V. Chiruvolu, M. Meagher.”High Cell-Density Fermentation” .Methods in Molecular Biology™, 1998, 103, pp 107-120. 5. Zdenek Hubálek. “Protectants used in the cryopreservation of microorganisms” .Cryobiology, 2003, 46, pp 205–229. ABSTRACT STUDY ON PRODUCTION OF PROBIOTIC FROM Bacillus subtilis B-N The influence of some factors such as temperature, pH, carbon and nitrogen sources to the growth and development of strain B.subtilis B-N were studied.Based on those results, an optimal medium and cultured time were selected to collect biomass cell ofB.subtilis B-N. A medium of emulsifiers for protection cells during the drying was chosen with the survival rate 88%, the cell density reached 1,78.1010cfu/g.Survival rates after 6 months and 12 months of storage at room temperature reached 60 % and 48 %, respectively. Keywords: Bacillus subtilis , Probiotic Nhận bài ngày 09 tháng 07 năm 2015 Hoàn thiện ngày 18 tháng 08 năm 2015 Chấp nhận đăng ngày 07 tháng 09 năm 2015 Địa chỉ: 1Phòng Hóa sinh, Viện Hóa học- Vật liệu, Viện KH-CNQS, BQP Email: vandungbio46@yahoo.com