Nghiên cứu sản xuất chế phẩm Enzym ngoại nào tử mùn trồng của các lợi nấu ăn phổ biến ở Việt Nam - Trần Thị Thu Hường

Hãa sinh T.T.T.H­êng, P.K. C­êng, B.T. Hµ, §. H. Giang, "Nghiªn cøu s¶n xuÊt ë ViÖt Nam." 146 Nghiªn cøu s¶n xuÊt chÕ phÈm enzym ngo¹i bµo tö mïn trång cña c¸c lo¹i nÊm ¨n phæ biÕn ë viÖt nam TRẦN THỊ THU HƯỜNG, PHẠM KIÊN CƯỜNG, BÙI THU HÀ, ĐÀO HƯƠNG GIANG Tóm tắt: Sự ứng dụng của chế phẩm enzym trong đời sống đã mang lại rất nhiều hiệu quả to lớn cho toàn nhân loại. Hiện nay, chế phẩm enzym đã bước đầu được sử dụng trong xử lý ô nhiễm môi trường và mang lại hiệu quả kinh tế. Trong bài báo này chúng tôi trình bày kết quả nghiên cứu sản xuất chế phẩm enzym ngoại bào có chứa các enzym phân hủy lignin gồm: lignin peroxidaza, mangan peroxidaza và laccaza từ mùn trồng của một số loại nấm ăn phổ biến ở Việt Nam. Từ khóa: Lignin peroxidaza; Mangan peroxidaza; Laccaza; Chế phẩm enzym ngoại bào 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Cho đến nay, cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ, con người đã có nhiều ứng dụng to lớn của chế phẩm enzym để phục vụ cho cuộc sống. Chế phẩm enzym đã được sử dụng trong rất nhiều ngành công nghiệp như công nghiệp thực phẩm, dầu ăn, chế biến thức ăn chăn nuôi, giấy và bột giấy, dệt may, da giày... Và một trong những ứng dụng mới nhất của chế phẩm enzym đó là sử dụng trong công nghệ xử lý các chất gây ô nhiễm môi trường bởi enzym đã mang lại hiệu quả vượt trội cho quá trình xử lý. Các enzym ngoại bào phân huỷ lignin (EPL) được các loài nấm mục trắng tiết ra trong quá trình sinh trưởng, bao gồm 3 enzym chính là lignin peroxidaza (LiP), mangan peroxidaza (MnP) và laccaza (Lac) lần đầu tiên được Tien và Kirk phát hiện vào năm 1983 [1]. Đến năm 1985 [2], Bumpus và các cộng sự trong nghiên cứu của mình đã cho rằng với đặc tính đặc hiệu cơ chất tương đối của hệ enzym ngoại bào phân hủy lignin, có thể sử dụng các enzym này cho mục đích sinh phân huỷ nhiều hợp chất gây ô nhiễm môi trường có cấu tạo tương tự như phân tử lignin. Đã có rất nhiều nghiên cứu về các enzym phân hủy lignin từ các loài vi sinh vật nói chung và từ các loài nấm mục trắng nói riêng cho thấy, các enzym này có khả năng phân hủy nhiều loại chất hữu cơ gây ô nhiễm môi trường như các loại thuốc nhuộm, các loại hydrocacbon vòng thơm... [3, 4, 5, 6]. Do đó, việc nghiên cứu sản xuất các chế phẩm enzym có chứa các enzym phân hủy lignin sẽ có ý nghĩa thực tiễn trong các công nghệ xử lý các chất gây ô nhiễm môi trường nói chung và các chất gây ô nhiễm môi trường đặt thù quốc phòng nói riêng. Kể từ khi các enzym ngoại bào phân hủy lignin được phát hiện khả năng phân hủy nhiều hợp chất gây ô nhiễm môi trường, đã có một số tác giả ở Việt Nam nghiên cứu chế tạo chế phẩm chứa các enzym này. Tuy nhiên, các nghiên cứu tập trung chủ yếu vào các enzym phân hủy lignin từ quá trình lên men chìm hoặc lên men rắn chủ động các chủng vi sinh vật [5, 7]. Việc nghiên cứu để chế tạo chế phẩm enzym từ các enzym phân hủy lignin được thu nhận tự nhiên từ mùn trồng nấm, phụ phẩm của quá trình sản xuất nấm thương phẩm, chưa được công bố nhiều. Do vậy, trong báo cáo này, chúng tôi trình bày kết quả nghiên cứu các điều kiện để sản xuất chế phẩm enzym ngoại bào có chứa các enzym phân hủy lignin gồm: lignin peroxidaza, mangan peroxidazavà laccaza từ mùn trồng của một số loại nấm ăn phổ biến ở Việt Nam. Nghiªn cøu khoa häc c«ng nghÖ T¹p chÝ Nghiªn cøu KH&CN qu©n sù, Sè 31, 06 - 2014 147 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP * Cơ chất tách chiết enzym: mùn trồng của 03 loại nấm ăn phổ biến ở Việt Nam là: nấm sò trắng (Pleurotus pulmonarius), nấm sò tím (Pleurotus ostreatus), nấm sò vua (Pleurotus eryngii). * Xác định hoạt tính enzym: 1) Phản ứng xác định hoạt tính MnP gồm: đệm axit tartaric, cơ chất phenolsulfonphthalein, MnSO4, H2O2, dịch enzym. Phản ứng được bắt đầu bằng việc bổ sung H2O2, sau đó xác định lượng cơ chất còn lại trong phản ứng bằng máy quang phổ ở bước sóng 564nm. Đối chứng là hỗn hợp phản ứng không có MnSO4. Hoạt tính MnP được tính thông qua lượng cơ chất mất đi khi có MnSO4 so với khi không có MnSO4. 2) Phản ứng xác định hoạt tính LiP gồm: đệm axit tartaric, azureB, H2O2, dịch enzym. Phản ứng được bắt đầu bằng việc bổ sung H2O2, sau đó xác định lượng cơ chất còn lại trong phản ứng bằng máy quang phổ ở bước sóng 651nm. 3) Phản ứng xác định hoạt tính Lac tương tự phản ứng của MnP nhưng không bổ sung MnSO4 và H2O2. Đối chứng của phản ứng LiP và Lac là hỗn hợp phản ứng trong đó dịch nuôi cấy được khử trùng ở 121oC trong 30 phút.1 đơn vị hoạt tính enzym là lượng enzym xúc tác để biến đổi 1M cơ chất trong 1 phút. Các mẫu được quy hoạt tính theo 1g bã nấm tươi ban đầu hoặc theo g chế phẩm khô. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Lựa chọn điều kiện thu nhận enzym ngoại bào để sản xuất chế phẩm 3.1.1. Lựa chọn dung dịch tách hệ enzym phân huỷ lignin Vì hệ EPL trong mùn trồng nấm là ngoại bào, nên chúng tôi nhận thấy, việc lựa chọn loại dung dịch tách chiết là rất cần thiết để có thể thu được lượng enzym có hoạt tính cao nhất. Để lựa chọn loại dung dịch tách chiết phù hợp, chúng tôi chọn 3 loại dung dịch thông dụng trong nghiên cứu là nước cất, đệm acetate 30mM pH5 và đệm photphat 30mM pH5 để tách enzym từ bã nấm. Kết quả được trình bày trong bảng 1. Bảng 1. Hoạt độ EPL các mẫu mùn trồng nấm được tách chiết bằng các loại dung dịch khác nhau. S T T Loại nấm/ Cơ chất Hoạt độ enzym (U/g bã nấm tươi) LiP MnP Lac Loại dung dịch tách chiết Nước cất Đệm axetate Đệm photphat Nước cất Đệm axetate Đệm photphat Nước cất Đệm axetate Đệm photphat 1 Sò tím/ MC+B 43,8 44,2 32,4 0,16 0,16 0,08 257 267 141 2 Sò trắng/ MC+B 46,7 47,6 33,3 0,18 0,19 0,09 275 278 162 3 Sò vua/ MC+B 36,8 33,4 38,6 0,11 0,08 0,06 360 391 233 Từ kết quả trên cho thấy, họat độ của các EPL nói chung cao hơn khi mẫu mùn trồng nấm được chiết bằng hệ đệm acetate 30mM pH5 hoặc nước cất. Tuy nhiên, việc sử dụng hệ đệm acetate 30mM pH5 sẽ làm tăng chi phí của quy trình thu nhận chế phẩm enzym, do đó chúng tôi lựa chọn nước cất là dung dịch tách chiết sẽ được sử dụng để tách chiết enzym phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.1.2. Xác định tỷ lệ dung dịch tách/khối lượng mùn thích hợp để thu nhận enzym ngoại bào Để có thể thu nhận được tối đa lượng EPL từ mùn trồng nấm chuyển sang dung dịch tách chiết, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tỷ lệ dung dịch tách/khối lượng mùn thích hợp. Từ kết quả Hãa sinh T.T.T.H­êng, P.K. C­êng, B.T. Hµ, §. H. Giang, "Nghiªn cøu s¶n xuÊt ë ViÖt Nam." 148 của thí nghiệm ở mục 3.1.1, chúng tôi lựa chọn các tỷ lệ dung dịch : mùn (thể tích : trọng lượng) = 1:1; 2:1; 3:1; 4:1 và 5:1 để khảo sát. Xác định hoạt độ các enzym EPL từ dung dịch tách chiết thu được. Kết quả được trình bày ở bảng 2a, 2b, 2c. Bảng 2a. Hoạt độ LiP các mẫu mùn trồng nấm được tách chiết theo các tỷ lệ dung dịch tách khác nhau. STT Loại nấm/ Cơ chất Hoạt độ enzym LiP (U/g bã nấm tươi) Tỷ lệ dung dịch tách chiết 1:1 2:1 3:1 4:1 5:1 1 Sò tím/MC+B 20,8 42,5 44,2 44,3 44,2 2 Sò trắng/MC+B 22,4 45,6 48,0 48,1 48,0 3 Sò vua/MC+B 25,6 36,7 37,8 37,8 37,8 Bảng 2b. Hoạt độ MnP các mẫu mùn trồng nấm được tách chiết theo các tỷ lệ dung dịch tách khác nhau. STT Loại nấm/ Cơ chất Hoạt độ enzym MnP (U/g bã nấm tươi) Tỷ lệ dung dịch tách chiết 1:1 2:1 3:1 4:1 5:1 1 Sò tím/MC+B 0,08 0,17 0,18 0,18 0,18 2 Sò trắng/MC+B 0,09 0,17 0,17 0,17 0,17 3 Sò vua/MC+B 0,06 0,10 0,11 0,11 0,11 Bảng 2c. Hoạt độ Pac các mẫu mùn trồng nấm được tách chiết theo các tỷ lệ dung dịch tách khác nhau. STT Loại nấm/ Cơ chất Hoạt độ enzym Lac (U/g bã nấm tươi) Tỷ lệ dung dịch tách chiết 1:1 2:1 3:1 4:1 5:1 1 Sò tím/MC+B 162 257 277 278 278 2 Sò trắng/ MC+B 178 271 298 295 298 3 Sò vua/ MC+B 201 382 394 395 395 Kết quả bảng trên cho thấy, với tỷ lệ dung dịch : mùn (thể tích : trọng lượng) = 3:1 cho hoạt độ enzym tính theo gam bã nấm tươi cao nhất. Tuy nhiên, tỷ lệ dung dịch : mùn (thể tích : trọng lượng) = 2:1, cũng cho hoạt độ tương đối cao. Để tiết kiệm, giảm bớt thể tích mẫu làm việc và thuận tiện hơn cho các bước tiếp theo của quy trình thu nhận chế phẩm enzym, chúng tôi lựa chọn tỷ lệ dung dịch: mùn (thể tích : trọng lượng) = 2:1 là tỷ lệ tách chiết enzym trong các thí nghiệm tiếp theo. 3.2. Xác định các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính của enzym trong chế tạo chế phẩm 3.2.1. Xác định loại cơ chất nuôi trồng cho hoạt độ enzym phân hủy lignin cao Trong số các yếu tố nuôi trồng ảnh hưởng tới sự phát triển của nấm nói chung hay sự tạo thành EPL nói riêng thì loại nguyên liệu nuôi trồng là yếu tố mang tính quyết định. Vì vậy, để lựa chọn được loại mùn trồng nấm cho hoạt độ enzym cao nhất, chúng tôi tiến hành xác định hoạt độ EPL trong mùn trồng ở cùng một giai đoạn phát triển của mỗi loại nấm trên các loại nguyên liệu khác nhau (đối với những loại nấm có thể trồng trên nhiều loại nguyên liệu). Kết quả thể hiện ở bảng 3. Kết quả bảng 3 cho thấy, có sự khác nhau về hoạt độ EPL giữa các loại mùn trồng ở cùng một giai đoạn phát triển của mỗi loại nấm trên những cơ chất khác nhau. Đối với cả ba loại nấm, hỗn hợp cơ chất mùn cưa + bông (MC+B) cho hoạt độ EPL cao hơn loại cơ chất còn lại (là bông đối với nấm sò tím và sò trắng, là mùn cưa đối với nấm sò vua). Đối chiếu với kết quả nuôi trồng nấm để thu quả thể của Trung tâm Công Nghiªn cøu khoa häc c«ng nghÖ T¹p chÝ Nghiªn cøu KH&CN qu©n sù, Sè 31, 06 - 2014 149 nghệ Sinh học Thực vật thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp chúng tôi nhận thấy điều này cũng rất phù hợp. Bảng 3. Hoạt độ EPL trong mùn trồng của các loại nấm khác nhau, trên các loại cơ chất khác nhau. STT Loại nấm/ Cơ chất Hoạt độ enzym (U/g bã nấm tươi) LiP MnP Lac 1 Sò tím/ B 41,1 0,08 175 2 Sò tím/ MC + B 43,2 0,15 262 3 Sò trắng/ B 40,2 0,09 166 4 Sò trắng/ MC + B 46,6 0,17 268 5 Sò vua/ MC 33,6 0,09 318 6 Sò vua/ MC + B 37,3 0,11 388 Theo đó, loại nấm được trồng trên loại cơ chất cho hoạt độ EPL trong mùn trồng cao thì có tốc độ sinh trưởng nhanh hơn và cho hiệu suất thu hoạch quả thể cao hơn so với khi được trồng trên những loại cơ chất khác. Từ kết quả trên, chúng tôi chọn bịch nấm có cơ chất trồng là hỗn hợp mùn cưa + bông là đối tượng nghiên cứu trong các thí nghiệm tiếp theo. 3.2.2. Xác định giai đoạn phát triển của nấm cho hoạt độ enzym phân hủy lignin cao Trên cơ sở kết quả thí nghiệm trên, chúng tôi lựa chọn loại nấm trồng trên cơ chất tối ưu để tiến hành xác định hoạt độ EPL trong mùn trồng của các loại nấm, ở các giai đoạn phát triển khác nhau nhằm xác định thời điểm tốt nhất để thu được lượng EPL cao nhất. Bảng 4. Hoạt độ EPL ở các giai đoạn phát triển khác nhau của các loại mùn trồng nấm. TT Loại nấm/ Cơ chât Giai đoạn phát triển của nấm Kín sợi Sau thu quả thể lần 1 Sau thu quả thể lần 2 Khi ngừng thu hoạch Hoạt độ enzym (U/g bã nấm tươi) LiP MnP Lac LiP MnP Lac LiP MnP Lac LiP MnP Lac 1 Sò tím/ MC + B 28,6 0,08 237 31,1 0,11 326 43,3 0,14 408 15,7 - 292 2 Sò trắng/ MC + B 31,1 0,08 278 35,7 0,14 343 48,1 0,26 420 18,6 - 359 3 Sò vua/ MC + B 25,5 0,05 307 26,8 0,09 382 32,8 0,32 457 10,3 0,18 403 Kết quả được trình bày ở bảng 4 cho thấy: Có sự khác nhau về hoạt độ enzym phân hủy lignin trong mùn trồng giữa các loại nấm, giữa các giai đoạn phát triển của nấm. Với mùn của một loại nấm nhất định, có thể có hoạt độ enzym này cao nhất so với enzym cùng loại trong mùn trồng của các loại nấm khác nhưng hoạt độ các enzym khác lại thấp hơn. Nhưng nhìn chung, ở giai đoạn sau khi thu quả thể lần thứ hai, hoạt độ các EPL đạt cao nhất. Theo chúng tôi nghĩ, đây là do ở giai đoạn này, cơ chất mới được phân huỷ hoàn toàn do hệ sợi đã ăn sâu đến trung tâm của bịch nấm, hệ sợi nấm đã được phát triển đến mức cực đại để phân hủy cơ chất, do đó, hoạt độ của các EPL do nấm tiết ra môi trường cũng đạt mức cao nhất. Từ kết quả trên, chúng tôi chọn bịch nấm ở giai đoạn sau khi thu quả thể lần 2 là đối tượng nghiên cứu cho các thí nghiệm tiếp theo. Hãa sinh T.T.T.H­êng, P.K. C­êng, B.T. Hµ, §. H. Giang, "Nghiªn cøu s¶n xuÊt ë ViÖt Nam." 150 3.3. Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzym từ dịch chiết enzym ngoại bào Theo một số tài liệu đã được công bố [3, 5], trong dịch chiết của các loài nấm mục trắng, ngoài sự có mặt của các enzym EPL, còn có sự có mặt của một số enzym có tác dụng bổ trợ cho quá trình phân hủy lignin của nấm như là enzym xúc tác cho quá trình tạo ra H2O2... Chính vì vậy, để tận dụng tối đa các yếu tố thuận lợi cho việc ứng dụng của các EPL trong xử lý, tăng hiệu quả của chế phẩm enzym, chúng tôi lựa chọn sử dụng dịch chiết enzym ngay sau ly tâm để làm nguồn nguyên liệu sản xuất chế phẩm enzym ngoại bào. Với mục đích tạo chế phẩm thuận lợi cho quá trình sử dụng cũng như bảo quản, chúng tôi lựa chọn kỹ thuật đông khô theo điều kiện tiêu chuẩn là kỹ thuật để sản xuất chế phẩm enzym dạng bột. Để đánh giá hiệu quả của kỹ thuật đông khô, chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính các EPL có trong chế phẩm enzym trước và sau đông khô (chế phẩm sau đông khô được tái hòa tan về thể tích trước đông khô bằng dung dịch phù hợp để so sánh). Kết quả được trình bày ở bảng 5. Bảng 5: Hoạt tính EPL của chế phẩm enzym ngoại bào trước và sau đông khô. TT Loại nấm Hoạt độ enzym (U/ml dung dịch) Trước khi đông khô Sau khi đông khô LiP MnP Lac LiP MnP Lac 1 Sò tím 23,3 0,08 268 22,3 0,07 234 2 Sò trắng 25,1 0,11 290 24,7 0,09 272 3 Sò vua 21,8 0,06 357 19,8 0,05 339 Kết quả bảng 5 cho thấy, quá trình đông khô hầu như không làm ảnh hưởng tới hoạt tính của các EPL, hoạt tính của các EPL đều còn lại trên 95% so với ban đầu. Đây là một điều rất khả quan, thuận lợi cho việc chế tạo và sử dụng chế phẩm. Từ kết quả này, chúng tôi nhận thấy, kỹ thuật đông khô là kỹ thuật phù hợp để chế tạo chế phẩm enzym ngoại bào từ mùn trồng của một số loại nấm ăn phổ biến tại Việt Nam. 4. KẾT LUẬN Từ các bịch mùn trồng của 03 loại nấm ăn phổ biến ở Việt Nam, ở giai đoạn sau khi thu quả thể lần 2 có thể thu nhận hệ enzym phân hủy lignin để sản xuất chế phẩm enzym ngoại bào theo các điều kiện cơ bản: bịch trồng nấm trên hỗn hợp cơ chất mùn cưa và bông, sau khi đã thu hái quả thể được tách chiết enzym ngoại bào bằng nước theo tỷ lệ dung dịch/cơ chất = 2:1; dịch enzym sau tách chiết được loại bỏ bã và cặn thô, được đông khô theo điều kiện tiêu chuẩn sẽ cho kết quả thu nhận được chế phẩm enzym ngoại bào có dạng bột. Đây là một kết quả rất có ý nghĩ về kinh tế vì mùn trồng nấm ăn sau khi thu quả thể là phế phẩm của quá trình sản xuất nông nghiệp, việc tận dụng nguồn thải này sẽ góp phần làm giảm chi phí trong việc sản xuất chế phẩm enzym ngoại bào có chứa các enzym phân hủy lignin đồng thời vẫn đảm bảo được nhu cầu sản xuất chế phẩm. Với tính đặc hiệu cơ chất tương đối của các enzym phân hủy lignin, sự ứng dụng của chế phẩm enzym này trong việc xử lý các chất gây ô nhiễm môi trường cần tiếp tục được nghiên cứu sâu hơn và chắc chắn sẽ mang lại nhiều kết quả ứng dụng thực tiễn có ý nghĩa. Lời cảm ơn: Nhóm tác giả xin trân trọng cảm ơn Thủ trưởng Viện KHCNQS, Thủ trưởng Viện CNM, các cơ quan, phòng ban chức năng, phòng nghiên cứu đã tạo điều kiện cho chúng tôi thực hiện nghiên cứu trên. Nghiªn cøu khoa häc c«ng nghÖ T¹p chÝ Nghiªn cøu KH&CN qu©n sù, Sè 31, 06 - 2014 151 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. "An toàn thuốc phóng, thuốc nổ". Thông tin chuyên đề bảo đảm kỹ thuật, Trung tâm thông tin KHKTQS, Tổng cục kỹ thuật, 1993. [2]. Archibald F S, "A new assay for lignin-type peroxydase employing the dye azure B". Appl Environ Microbiol, Vol. 58(1992), pp. 3110-3116. [3]. Call H P, Mucke J, "History, overview and application of mediated ligninolytic system, especially laccase-mediator-systems". J Biotechnol, Vol. 53 (1997), pp. 163-202. [4]. Crawford R L, "The microbiology and treatment of nitroaromatic compounds". Current Opinion Biotechnol, Vol. 6 (1995), pp. 329-336. [5]. Đặng Thị Cẩm Hà, "Nghiên cứu công nghệ sản xuất enzym ngoại bào laccase, manganese peroxydase, lignin peroxydase (MnP, LiP) từ vi sinh vật phục vụ xử lý các chất ô nhiễm đa vòng thơm". Báo cáo tóm tắt đề tài độc lập cấp Nhà nước (2012). [6]. FRTR, Biological Treatment Techlologies for Explosives, ABSTRACT MANUFACTION EXTRACELLULAR ENZYME PRODUCTS FROM THE HUMUS CULTIVATION OF EDIBLE MUSHROOMS POPULAR IN VIETNAM The application of enzyme products in life has brought a huge advantages for the whole world. Currently, enzyme products were initially used in environmental remediation and gain a high commercial efficiency. In this paper, we present research results produced from the extracellular enzyme products containing lignin degradation enzymes including: lignin peroxidase (LiP), manganese peroxidase (MnP) and laccase (Lac) from humus cultivation of edible mushrooms popular in Vietnam. Keywords: Lignin peroxidase, Manganese peroxidase, Laccase, Ligninolytic extracellular enzyme products. Nhận bài ngày 13 tháng 01 năm 2014 Hoàn thiện ngày 19 tháng 02 năm 2014 Chấp nhận đăng ngày 05 tháng 05 năm 2014 Địa chỉ: Viện Công nghệ mới/Viện KHCNQS Hãa sinh T.T.T.H­êng, P.K. C­êng, B.T. Hµ, §. H. Giang, "Nghiªn cøu s¶n xuÊt ë ViÖt Nam." 152