Nghiên cứu quy trình sản xuất mẫu huyết thanh đặc hiệu toxocara canis để sử dụng ngoại kiểm

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 213 NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT MẪU HUYẾT THANH ĐẶC HIỆU TOXOCARA CANIS ĐỂ SỬ DỤNG NGOẠI KIỂM Vũ Quang Huy*,**, Nguyễn Nhật Giang*** TÓM TẮT Mục tiêu: Sản xuất thử nghiệm mẫu huyết thanh đặc hiệu Toxocara canis theo phương pháp đông khô và đông lạnh. Đánh giá tính đồng nhất và độ ổn định của mẫu huyết thanh sản xuất theo phương pháp đông khô và đông lạnh. Phương pháp: Sàng lọc mẫu huyết thanh có kháng thể kháng Toxocara canis bằng kỹ thuật ELISA; khẳng định độ đặc hiệu của kháng thể kháng Toxocara canis bằng kỹ thuật Western blot. Sản xuất mẫu thử nghiệm bằng phương pháp đông khô và đông lạnh. Đánh giá đồng nhất bằng phép phân tích phương sai một yếu tố và độ ổn định bằng phép kiểm định t – test. Kết quả: 11 mẫu huyết thanh có kháng thể kháng Toxocara canis nồng độ cao: từ 31,517 NTU đến 56,581 NTU được sàng lọc bằng ELISA. Khẳng định độ đặc hiệu kháng thể kháng Toxocara canis bằng Western blot: 01 mẫu âm tính và 10 mẫu dương tính. Mẫu huyết thanh đặc hiệu Toxocara canis đưa vào sản xuất 2 lô mẫu: lô mẫu đông khô nồng độ 31,012 NTU; lô mẫu đông lạnh nồng độ 27,184 NTU. Sản xuất bằng phương pháp đông khô và đông lạnh đều đạt độ đồng nhất có ý nghĩa thống kê Fisher. Mẫu huyết thanh sản xuất bằng phương pháp đông khô đạt độ ổn định trong 1 tháng khi bảo quản ở nhiệt độ ­80°C với p > 0,05. Mẫu huyết thanh sản xuất bằng phương pháp đông lạnh đạt độ ổn định trong 3 tháng khi bảo quản ở nhiệt độ­80°C với p > 0,05. Mẫu huyết thanh sản xuất bằng phương pháp đông khô và đông lạnh đạt độ ổn định ở nhiệt độ 30°C trong thời gian 7 ngày với p > 0,05. Kết luận: Sản xuất được mẫu huyết thanh đặc hiệu Toxocara canis theo phương pháp đông khô và đông lạnh để sử dụng ngoại kiểm. Mẫu sản xuất theo phương pháp đông khô và đông lạnh đạt tính đồng nhất và độ ổn định: mẫu đông khô ổn định trong 1 tháng, mẫu đông lạnh ổn định trong 3 tháng ở nhiệt độ bảo quản ­80°C; mẫu ổn định trong 7 ngày ở nhiệt độ 30°C. Từ khoá: Toxocara canis, ngoại kiểm, ELISA, Western blot. ABSTRACT RESEARCH PROCESS OF PILOT PRODUCTION SERUM HAS TOXOCARA CANIS SPECIFIC ANTIBODIES USING FOR EXTERNALQUALITY ASSESSMENT Vu Quang Huy, Nguyen Nhat Giang * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 22 - No 5- 2018: 213 – 218 Objectives: To produce pilot batches of anti­Toxocara canis specific antibodies serum by freeze­drying and freezing methods. To evaluate homogeneity and stability of serum samples produced by freeze­drying and freezing methods. Methods: Serum samples were screened for anti­Toxocara canis antibodies by ELISA, then the presence of anti­Toxocara canis specific antibodies was confirmed by Western blot. Samples were produced in pilot production by using freeze­drying and freezing methods. Homogeneity and stability of final samples were Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 5 * 2018 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 214 evaluated by F test and t­test, respectively. Results: 11 serum samples containing high concentrations of anti­Toxocara canis antibodies ranging from 31.517 NTU to 56.581 NTU were screened; and the specificity of anti­Toxocara canis antibodies was confirmed by Western blot: 01 negative sample, 10 positive samples. Two anti­Toxocara canis specific antibodies serum sample plots were produced: by freeze­drying method with the concentration of 31.012 NTU; and by freezing method with concentration of 27.184 NTU. Serum samples produced by freeze­drying and freezing were homogeneity with F test. Serum samples produced by freeze­drying were stable for 1 month when stored at ­80°C with p > 0.05. Serum samples produced by freezing were stable for 3 months when stored at ­80°C with p > 0.05. Samples produced by either method were stable for 7 days at 30°C with p > 0.05. Conclusions: Production of anti­Toxocara canis specific antibodies serum samples by freeze­drying and freezing method using for external quality assessment is feasible. Samples produced by freeze­drying and freezing were homogeneous and stable: freeze­dried samples were stable for 1 month, frozen samples were stable for 3 months at ­80°C; Samples were stable for 7 days at 30°C. Keywords: EQA, Toxocara canis, ELISA, Western blot. ĐẶT VẤN ĐỀ Phòng xét nghiệm là một hệ thống phức tạp liên quan đến nhiều người và bao gồm nhiều hoạt động để cho ra sản phẩm là kết quả xét nghiệm. Nếu kết quả xét nghiệm không chính xác có thể gây ra những hậu quả nghiêm trọng. Theo khuyến cáo của CLSI, CDC, WHO(9): để đảm bảo chất lượng kết quả xét nghiệm cần tiến hành nội kiểm tra và ngoại kiểm tra chất lượng. Ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm đang được triển khai rộng rãi trong các lĩnh vực xét nghiệm: hoá sinh, huyết học, vi sinh Tuy nhiên, ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm ký sinh trùng, đặc biệt là huyết thanh chẩn đoán ký trùng trong đó có huyết thanh chẩn đoán Toxocara canis (ELISA) còn nhiều hạn chế: cho đến nay, chưa có bất kỳ một công trình nào được công bố về mẫu ngoại kiểm ký sinh trùng trong nước.Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu quy trình sản xuất mẫu huyết thanh đặc hiệuToxocara canis để sử dụng ngoại kiểm” nhằm sản xuất được mẫu huyết thanh đạt tiêu chuẩn theo ISO/IEC 17043:2011(3,8): độ đặc hiệu, tính đồng nhất, độ ổn định để sử dụng trong chương trình ngoại kiểm huyết thanh học chẩn đoán ký sinh trùng Toxocara canis. Mục tiêu nghiên cứu Sản xuất thử nghiệm mẫu huyết thanh đặc hiệu Toxocara canis theo phương pháp đông khô và đông lạnh. Đánh giá tính đồng nhất và độ ổn định của mẫu huyết thanh sản xuất theo phương pháp đông khô và đông lạnh. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu thực nghiệm. Đối tượng nghiên cứu Mẫu huyết thanh có kháng thể kháng Toxocara canis. Tiêu chuẩn chọn mẫu Mẫu huyết thanh được lấy bằng phương pháp đảm bảo vô khuẩn, mẫu dương tính với Toxocaracanis, sàng lọc kháng nguyên HBsAg, anti-HCV và anti-HIV 1/2. Mẫu huyết thanh không có chất chống đông, không bị tán huyết và không đục màu. Mẫu huyết thanh được lấy không quá 48 giờ và được bảo quản ở tủ lạnh 2 – 8°C kể từ khi lấy mẫu cho đến khi thu thập mẫu. Phương pháp tiến hành Thu thập mẫu, lưu trữ -80°C. Loại trừ các tác nhân nhiễm trùng. Sàng lọc mẫu có kháng thể kháng Toxocara canis bằng kỹ thuật ELISA (Toxocara IgG ELISA – NOVATEC Immundiagnostica GMBH – REF: TOCG0450; LOT: TOCG-061). Khẳng định độ đặc hiệu của kháng thể kháng Toxocaracanis có trong nguyên liệu sản Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 215 xuất bằng kỹ thuật Western blot(1) (Toxocara IgG Western blot – LDBIO Diagnostics, FRACE – SN: KTX12-00239; LOT: P01003-12T-016). Phân phối mẫu vào eppendorf, mỗi mẫu 100µl. Tiến hành đông khô/ đông lạnh mẫu: đông khô ở điều kiện nhiệt độ -40°C, áp suất hơi 0,129 mBar trong 18 giờ; đông lạnh ở nhiệt độ -80°C trong 24 giờ. Đánh giá tính đồng nhất, độ ổn định: số liệu từ kết quả Toxocara IgG ELISA. + Độ ổn định dài hạn: bảo quản ở tủ lạnh 2 – 8°C và ở tủ đông -80°Cđể đánh giá độ ổn định sau 1 tháng, 3 tháng. + Độ ổn định ngắn hạn: để đánh giá tác động của yếu tố nhiệt độ và thời gian trong khi vận chuyển mẫu đến các đơn vị, giả định nhiệt độ trong quá trình vận chuyển là 30°C, đánh giá mẫu sau 5 ngày, 7 ngày. Thu thập và xử lý số liệu Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 và SPSS 20.0. Sử dụng phân tích one way ANOVA để đánh giá tính đồng nhất và t-test để đánh giá độ ổn định của mẫu huyết thanh sản xuất. KẾT QUẢ Sản xuất thử nghiệm mẫu huyết thanh đặc hiệu Toxocara canis theo phương pháp đông khô và đông lạnh. 11 mẫu huyết thanh có kháng thể khángToxocara canisxác định bằng kỹ thuật ELISA có nồng độ cao được sàng lọc: thấp nhất là mẫu TXA08 với 31,517 đơn vị NTU; cao nhất là mẫu TXA05 với 56,581 đơn vị NTU. Khẳng định kháng thể đặc hiệu kháng Toxocara canis bằng kỹ thuật Western blot(1): mẫuTXA01 (bảng 1, hình 1) xuất hiện 2 băng trong nhóm 100 – 200 kDa, 2 băng trong nhóm 70 – 90 kDa, không đặc hiệu Toxocara canis;mẫu TXA02, TXA03, TXA04, TXA05, TXA06, TXA07, TXA08, TXA09, TXA10, TXA11 (bảng 1, hình 1) xuất hiện 5 băng trong nhóm băng có trọng lượng phân tử thấp 24 – 35 kDa, tương ứng với mẫu chứng dương,đặc hiệu Toxocara canis. Bảng 1. Kết quả đánh giá độ đặc hiệu kháng thể kháng Toxocara canis Stt Mã số mẫu ELISA WESTERN BLOT Cut off OD NTU Kết luận 1 Chứng dương Dương tính 2 TXA01 0,547 2,178 39,817 Dương tính Âm tính 3 TXA02 0,547 3,038 55,539 Dương tính Dương tính 4 TXA03 0,547 2,609 47,697 Dương tính Dương tính 5 TXA04 0,547 2,864 52,358 Dương tính Dương tính 6 TXA05 0,547 3,095 56,581 Dương tính Dương tính 7 TXA06 0,547 3,039 55,558 Dương tính Dương tính 8 TXA07 0,547 2,988 54,625 Dương tính Dương tính 9 TXA08 0,547 1,724 31,517 Dương tính Dương tính 10 TXA09 0,547 2,341 42,797 Dương tính Dương tính 11 TXA10 0,547 1,909 34,899 Dương tính Dương tính 12 TXA11 0,547 2,559 46,782 Dương tính Dương tính Hình 1. Kết quả xét nghiệm Western blot Toxocara sp Mẫu huyết thanh chứa kháng thể đặc hiệu kháng Toxocara canis được phân phối vào eppendorf và xử lý đông khô/ đông lạnh. Kết quả, chúng tôi sản xuất được 2 lô mẫu huyết thanh đặc hiệu Toxocara canis: Mẫu đông khô: 100 mẫu, mỗi mẫu có thể tích trước đông khô là 100µl huyết thanh, nồng độ ban đầu 31,012 NTU. Mẫu đông lạnh: 100 mẫu, mỗi mẫu có thể Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 5 * 2018 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 216 tích 100µl huyết thanh, nồng độ ban đầu 27,184 NTU. Kết quả đánh giá độ đồng nhất Bảng 2. Đánh giá độ đồng nhất của mẫu sản xuất bằng phương pháp đông khô và đông lạnh Chỉ số Mẫu đông khô Mẫu đông lạnh Trung bình (NTU) 31,012 27,184 SD 1,140 0,994 CV (%) 3,68 3,66 F thực nghiệm 2,517 0,591 F lý thuyết Với k1 = 9, k2 = 10, α = 0,05 ta có F = 3,02 Lô mẫu sản xuất bằng phương pháp đông khô có giá trịF thực nghiệm = 2,517 < F lý thuyết = 3,02; lô mẫu sản xuất bằng phương pháp đông lạnh có giá trị F thực nghiệm = 0,591 < F lý thuyết = 3,02. Mẫu sản xuất bằng phương pháp đông khô và đông lạnh đạt tính đồng nhất. Mẫu sản xuất theo phương pháp đông lạnh có độ lệch chuẩn = 0,994 và hệ số biến thiên = 3,66% thấp hơn so với mẫu sản xuất bằng phương pháp đông khô có độ lệch chuẩn = 1,140 và hệ số biến thiên = 3,68%. Kết quả đánh giá độ ổn định Bảng 3. Độ ổn định của mẫu đông khô và đông lạnh theo thời gian và nhiệt độ Thời điểm Chỉ số Mẫu đông khô Mẫu đông lạnh -80°C 2 - 8°C -80°C 2 - 8°C 1 tháng Trung bình (NTU) 31,865 28,853 27,301 26,078 SD 1,411 1,173 0,320 0,900 CV (%) 4,43 4,07 1,17 3,50 P 0,140>0,050,0000,05 0,023<0,05 3 tháng Trung bình (NTU) 28,479 25,430 26,795 24,556 SD 1,136 0,712 0,314 1,097 CV (%) 3,99 2,80 1,17 4,50 P 0,0000,05 0,000<0,05 Các mẫu huyết thanh sản xuất bằng phương pháp đông khô bảo quản nhiệt độ -80°C đạt độ ổn định trong 1 tháng với p = 0,140 > 0,05. Các mẫu huyết thanh sản xuất bằng phương pháp đông lạnh đạt độ ổn định trong 3 tháng với p = 0,359 > 0,05. Nồng độ trung bình kháng thể trong mẫu sản xuất giảm: nhiệt độ -80°C, mẫu đông khô sau 1 tháng là 31,865 NTU, sau 3 tháng là 28,479 NTU, mẫu đông lạnh sau 1 tháng là 27,301 NTU, sau 3 tháng là 26,795 NTU; nhiệt độ 2 - 8°C, mẫu đông khô sau 1 tháng là 28,853 NTU, sau 3 tháng là 25,430 NTU, mẫu đông lạnh sau 1 tháng là 26,087 NTU, sau 3 tháng là 24,556 NTU. Bảng 4. Độ ổn định của mẫu đông khô và đông lạnh ở nhiệt độ 30°C Thời điểm Chỉ số Mẫu đông khô Mẫu đông lạnh 5 ngày Trung bình (NTU) 25,466 26,256 SD 0,651 1,036 CV (%) 2,56 3,95 P 0,929 > 0,05 0,251 > 0,05 7 ngày Trung bình (NTU) 25,501 26,312 SD 0,660 1,045 CV (%) 2,59 3,97 P 0,860 > 0,05 0,305 > 0,05 Ở điều kiện vận chuyển giả định có nhiệt độ 30°C, các mẫu sản xuất theo phương pháp đông khô và đông lạnh đạt độ ổn định trong 7 ngày. BÀN LUẬN Sản xuất thử nghiệm mẫu huyết thanh đặc hiệu Toxocara canis theo phương pháp đông khô và đông lạnh Quy trình sản xuất mẫu huyết thanh có kháng thể kháng Toxocara canis bắt đầu từ khi thu thập nguyên liệu sản xuất. Đề tài nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện sản xuất và bảo quản khác nhau lên mẫu huyết thanh được lấy từ một bệnh nhân, không thêm chất bảo quản. Nguyên liệu huyết thanh người là lựa chọn tốt nhất nhưng lại được khuyến cáo chỉ sử dụng trong trường hợp huyết thanh động vật không thích hợp hoặc có độ nhiễu cao để đảm bảo vấn đề về y đức. Đáp ứng miễn dịch đối với Toxocara sp trên các loài động vật: chó, mèo, thỏ và trên vật chủ người là hoàn toàn khác nhau(4,5,7). Nghiên cứu này, sử dụng huyết thanh người, được lấy từ một bệnh nhân. Nguyên liệu sản xuất là huyết Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 217 thanh có màu vàng trong, không lẫn máu, không đục, không tiêu huyết. Những mẫu huyết thanh với nồng độ 10 mg/ml hemoglobin, 5 mg/ml triglycerid và 0,2 mg/ml bilirubin có thể gây nhiễu cho kết quả ELISA. Mẫu sản xuất có kết quả sàng lọc HbsAg, anti – HCV và anti – HIV 1/2 âm tính, tuy nhiên cần được xử lý giống như mẫu nhiễm. Nghiên cứu của chúng tôi đánh giá độ đặc hiệukháng thể kháng Toxocara canis trên 11 mẫu có kết quả xét nghiệm ELISA dương tính cao. Kết quả cho thấy 11 mẫu đều xuất hiện các băng giữa 15 – 200 kilodaltons (kDa) tương ứng với các kháng thể kháng kháng nguyên ngoại tiết TES của Toxocara canis. Trong 11 mẫu nghiên cứu, có một mẫu chỉ xuất hiện các băng ở nhóm băng có trọng lượng phân tử cao 100 – 200 kDa và 70 – 90 kDa, đây là những băng không đặc hiệu cho bệnh giun đũa chó mèo, do có phản ứng chéo với nhiễm các loại giun, sán khác. Do đó, việc khẳng định độ đặc hiệu của kháng thể kháng Toxocara canis trong nguyên liệu sản xuất mẫu ngoại kiểm là cần thiết, để loại trừ trường hợp dương tính giả. 10 mẫu xuất hiện 5 băng ở nhóm băng có trọng lượng phân tử thấp 24 – 35 kDa, đây là những băng đặc hiệu Toxocara canis, phù hợp với các nghiên cứu trên đối tượng này(1,10). Các giai đoạn tiếp theo được thực hiện theo đúng ISO/IEC 17043:2011(3,8) về việc đánh giá sự phù hợp – Yêu cầu chung đối với thử nghiệm thành thạo. Và chúng tôi đánh giá tính đồng nhất và độ ổn định của mẫu sản xuất theo ISO 13528:2015(2). Độ đồng nhất và ổn định của lô mẫu sản xuất theo 2 phương pháp: đông khô và đông lạnh Đây là hai phương pháp được sử dụng phổ biến trong quá trình sản xuất mẫu ngoại kiểm trên thế giới. 2 phương pháp đều cho kết quả lô mẫu sản xuất đạt tính đồng nhất. Mẫu sản xuất bằng phương pháp đông lạnh có tính đồng nhất cao hơn so với mẫu sản xuất bằng phương pháp đông khô. Điều này là hợp lý do nguyên liệu sản xuất mẫu của chúng tôi là huyết thanh được lấy từ một người, không thêm chất bảo quản, do đó vẫn giữ nguyên chất nền và đảm bảo tính đồng nhất. Mẫu sản xuất theo phương pháp đông khô có tính đồng nhất thấp hơn có thể do ảnh hưởng của quá trình xử lý đông khô mẫu và kỹ thuật hoàn nguyên mẫu. Về độ ổn định dài hạn, lô mẫu sản xuất theo phương pháp đông lạnh có độ ổn định cao hơn lô mẫu sản xuất theo phương pháp đông khô: các liên kết hydro trong nước góp phần đáng kể vào sự ổn định của cấu trúc protein. Trong trường hợp này, phương pháp đông khô, với sự loại trừ nước thường sẽ gây ra sự bất ổn định về mặt vật lý của protein. Hơn nữa, ngay cả sau khi đông khô thành công, cấu trúc protein có thể trải qua một loạt sự bất ổn định bao gồm: sự tổng hợp, sự oxy hóa, phản ứng Maillard và thủy phân; do đó, độ ổn định dài hạn của phương pháp đông khô có thể vẫn còn hạn chế, đặc biệt là ở nhiệt độ lưu trữ cao. Những vấn đề bất ổn trong quá trình đông khô cũng như lưu trữ có thể được giảm thiểu bằng cách lựa chọn đúng pH, hàm lượng hơi ẩm còn lại, và quan trọng hơn là các chất ổn định giúp ngăn chặn sự đóng băng mô và sự phá huỷ tế bào trong quá trình làm lạnh(6). KẾT LUẬN Đã xuất được 2 lô mẫu huyết thanh đặc hiệu Toxocara canis theo phương pháp đông khô và đông lạnh để sử dụng ngoại kiểm: lô 1 - mẫu đông khô, nồng độ ban đầu 31,012 NTU; lô 2 - mẫu đông lạnh, nồng độ ban đầu 27,184NTU. Mẫu sản xuất theo phương pháp đông khô và đông lạnh đạt tính đồng nhất và độ ổn định.Mẫu sản xuất bằng phương pháp đông lạnh có tính đồng nhất và độ ổn định cao hơn mẫu sản xuất bằng phương pháp đông khô: ở nhiệt độ -80°C, mẫu sản xuất bằng phương pháp đông khô ổn định trong 1 tháng, mẫu sản xuất bằng phương pháp đông lạnh ổn định trong 3 tháng. Ở nhiệt độ 30°C, mẫu sản xuất theo cả 2 phương pháp ổn định trong 7 ngày. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Fillaux J, Magnaval JF (2013). Laboratory diagnosis of human toxocariasis, Vet. Parasitol, vol. 193, no 4, 327-336. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 5 * 2018 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 218 2. ISO 13528 (2015), “Statistical methods for use in proficiency testing by interlaboratory comparisons”, International Organization for Standardization, First edition. 3. ISO/IEC 17043:2011(2011), “Conformity assessment - General requirements for proficiency testing”, International Organization for Standardization, First edition. 4. Nguyen HH, Vo DT, Thai TT, Le TT, Le TD, Hoang NS (2017) "The 33.1 kDa Excretory/secretory Protein Produced by Toxocara canis Larvae Serves as a Potential Common Biomarker for Serodiagnosis of Toxocariasis in Paratenic Animals and Human". Iran J Parasitol, 12 (1), 69-82. 5. Roldan WH, Espinoza YA (2009) "Evaluation of an enzyme- linked immunoelectrotransfer blot test for the confirmatory serodiagnosis of human toxocariasis". Mem Inst Oswaldo Cruz, 104 (3), 411-8. 6. Song JG, Lee SH, Han HK (2016) "Biophysical evaluation of aminoclay as an effective protectant for protein stabilization during freeze-drying and storage". Int J Nanomedicine, 11, 6609-6619. 7. Sudhakar NR, Samanta S, Sahu S, Raina OK, Gupta SC, Goswami TK, et al. (2014) "Characterization of excretory- secretory antigens of adult Toxocara canis by western blotting". J Parasit Dis, 38 (2), 166-9. 8. Tiêu chuẩn quốc gia TCVN ISO/IEC 17043:2011(2011), Đánh giá sự phù hợp – Yêu cầu chung đối với thử nghiệm thành thạo, Nhà xuất bản Hà Nội, 9 - 11. 9. Who (2011) Laboratory quality management system: handbook. 10. Zibaei M, Firoozeh F, Bahrami P, Sadjjadi SM (2013), Investigation of Anti-Toxocara Antibodies in Epileptic Patients and Comparison of Two Methods: ELISA and Western Blotting, Epilepsy Res. Treat, vol. 2013, p. 1-5. Ngày nhận bài báo: 31/07/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 31/08/2018 Ngày bài báo được đăng: 20/10/2018