Nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro một số giống khoai sọ (colocasia antiquorum) - Trần Thị Lệ

41 TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 67, 2011 NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO MỘT SỐ GIỐNG KHOAI SỌ (Colocasia antiquorum) Trần Thị Lệ, Trần Thị Triệu Hà Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế TÓM TẮT Mẫu chồi mầm 2 giống khoai sọ Tây nguyên và Hà Tĩnh được khử trùng bằng HgCl2 0,2% với thời gian là 12 phút cho kết quả tốt nhất. Môi trường MS có 3 mg/l BAP thích hợp cho quá trình tái sinh chồi từ mẫu chồi nuôi cấy. Môi trường MS có 3 mg/l BAP và 0,5 mg/l α-NAA phù hợp cho quá trình nhân nhanh chồi và môi trường MS có 0,5 mg/l α-NAA thích hợp cho việc ra rễ. Việc bổ sung 10% nước dừa giúp tăng hệ số nhân và phát triển chồi. Số lần cấy chuyển chồi không nên quá 5 lần. Giá thể cát cho tỷ lệ sống của cây in vitro ở vườn ươm là cao nhất. 1. Đặt vấn đề Khoai sọ (Colocasia antiquorum) là một trong những cây nông nghiệp ngắn ngày hiện đang được trồng phổ biến ở Việt Nam. Đây là loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, thường dùng để ăn tươi, chế biến nhiều loại sản phẩm, sử dụng làm thuốc và thức ăn gia súc [4]. Trong tự nhiên, cây khoai sọ được phát triển từ thân củ. Tuy nhiên, phương pháp này khó bảo quản củ giống, thường làm mất đi một lượng lớn sản phẩm và dễ lây truyền mầm bệnh. Kỹ thuật nhân giống in vitro cho phép nhân nhanh những cá thể đồng nhất về mặt di truyền, sinh trưởng và phát triển một cách đồng đều và có hệ số nhân cao. Như vậy, chỉ cần một lượng nhỏ giống ban đầu dùng làm nguyên liệu nuôi cấy trong một thời gian ngắn và không gian nhỏ sẽ cho một lượng lớn cây con hoàn chỉnh [2]. Xuất phát từ những lý do đó, chúng tôi đã nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro một số giống khoai sọ (Colocasia antiquorum). 2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu Nguyên liệu được sử dụng trong nghiên cứu là chồi của các giống khoai sọ (Colocasia antiquorum) sau: khoai sọ Tây Nguyên và khoai sọ Hà Tĩnh có kích thước 1 cm x 1 cm x 0,5 cm. Chúng tôi sử dụng dung dịch HgCl2 0,2% để thăm dò khả năng khử trùng mẫu 42 vật ở các khoảng thời gian khác nhau từ 6 đến 14 phút. Điều kiện thí nghiệm: Tiến hành trong điều kiện nhân tạo với chế độ chiếu sáng 2000 lux. Thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày, nhiệt độ: 25-27oC. Tái sinh chồi từ mẫu chồi: Môi trường MS (Murashige-Skoog, 1962)[3] + 30 g/l saccharose + 7 g/l agar, bổ sung kinetin từ 0,5-2 mg/l benzyl aminopurine (BAP) từ 1-4 mg/l, pH môi trường 5,8. Nhân nhanh chồi: Môi trường MS có bổ sung BAP với nồng độ là 3 mg/l và α- NAA với các nồng độ từ 0,2-1 mg/l. Tạo rễ cho chồi in vitro (chồi khoảng 3-4 cm): Môi trường MS + 30 g/l saccharose + 7 g/l agar + 1 g/l than hoạt tính, bổ sung α-NAA từ 0,1-0,7 mg/l. Số lượng mẫu cho mỗi thí nghiệm là 30 mẫu. Điều kiện tự nhiên: Được bố trí trong điều kiện ánh sáng tán xạ, có che mưa, che nắng và cách ly côn trùng. Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD), 3 lần nhắc lại. Các số liệu được xử lý thống kê bằng chương trình Statistix 9.0. 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận 3.1. Khử trùng mẫu vật Tạo nguồn vật liệu khởi đầu là bước quan trọng có ý nghĩa quyết định đến sự thành công của quy trình nhân giống in vitro. Thành công của giai đoạn này không chỉ phụ thuộc vào đối tượng cụ thể, cách lấy mẫu, thời điểm lấy mẫu mà còn phụ thuộc vào chất khử trùng và thời gian khử trùng. Giai đoạn này cần đạt các tiêu chuẩn sau: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao và sinh trưởng tốt. Chúng tôi sử dụng HgCl2 0,2% để khử trùng chồi khoai sọ ở các thời gian khác nhau. Kết quả sau 1 tuần theo dõi được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Ảnh hưởng của thời gian lên hiệu quả khử trùng mẫu vật Giống Thời gian khử trùng (phút) Tỷ lệ mẫu chết (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) Khoai sọ Hà Tĩnh 6 0,00 100,00 0,00 8 13,33 86,67 0,00 10 16,67 76,67 6,67 12 20,00 26,67 53,33 14 46,67 20,00 33,33 43 Khoai sọ Tây Nguyên 6 0,00 100,00 0,00 8 20,00 80,00 0,00 10 23,33 70,00 6,67 12 26,67 16,67 56,67 14 60,00 13,33 26,67 Bảng 3.1 cho thấy, hiệu quả khử trùng ở các công thức có sự khác nhau rõ rệt. Tỷ lệ sống không tăng cùng với thời gian khử trùng mẫu, đạt mức cao nhất ở thời gian 12 phút với 53,33% (khoai sọ Hà Tĩnh) và 56,67% (khoai sọ Tây Nguyên). Khi tăng thời gian khử trùng lên 14 phút thì tỷ lệ mẫu nhiễm giảm, nhưng tỷ lệ chết lại tăng do thời gian khử trùng dài. Như vậy, thời gian khử trùng mẫu chồi thích hợp cho cả hai giống khoai sọ là 12 phút. 3.2. Tái sinh chồi 3.2.1. Ảnh hưởng của kinetin Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật, sự thành công hay thất bại phụ thuộc rất nhiều vào môi trường nuôi cấy. Các chất kích thích sinh trưởng, đặc biệt là các chất thuộc nhóm cytokinin có vai trò rất lớn trong việc kích thích sự hình thành chồi [1, 2]. Chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy khởi động trên các môi trường có bổ sung kinetin có nồng độ khác nhau. Kết quả sau 4 tuần nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tái sinh của mẫu nuôi cấy Kinetin (mg/l) Số chồi/mẫu cấy Khoai sọ Hà Tĩnh Khoai sọ Tây Nguyên 0,0 1,20 c 1,13 c 0,5 1,53 b 1,47 b 1,0 1,70 ab 1,57 ab 1,5 1,77 a 1,70 ab 2,0 1,73 ab 1,73 a LSD 0,05 0,23 0,23 Các chữ cái khác nhau trong cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p<0,05 (Duncan’s test). Kết quả theo dõi cho thấy, ở môi trường có bổ sung hoặc không có kinetin thì mẫu đều có khả năng tái sinh, tuy nhiên, sự hình thành chồi ở các môi trường có bổ 44 sung kinetin sai khác có ý nghĩa thống kê so với môi trường không có kenitin (Bảng 3.2). Khả năng tái sinh chồi lớn nhất ở môi trường có 1,5 mg/l kinetin đối với khoai sọ Hà Tĩnh (1,77 chồi/mẫu) và 2,0 mg/l đối với Tây Nguyên (1,73 chồi/mẫu). 3.2.2. Ảnh hưởng của BAP Kinetin tuy có ảnh hưởng tích cực đến khả năng tái sinh chồi từ mẫu nuôi cấy nhưng chưa cao. Vì vậy, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của một loại cytokinin khác đến khả năng tái sinh chồi là BAP. Kết quả sau 4 tuần nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.3. Bảng 3.3. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh của mẫu nuôi cấy BAP (mg/l) Số chồi/mẫu Khoai sọ Hà Tĩnh Khoai sọ Tây Nguyên 0,0 1,30 d 1,27 c 1,0 1,90 c 2,10 b 2,0 2,30 b 2,33 b 3,0 2,63 a 2,63 a 4,0 2,10 bc 2,23 b LSD 0,05 0,26 0,29 Các chữ cái khác nhau trong cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p<0,05 (Duncan’s test). Kết quả bảng 3.3 cho thấy, BAP có ảnh hưởng tốt đến khả năng tái sinh chồi của mô nuôi cấy. Khi bổ sung BAP với nồng độ tăng dần từ 1 đến 3 mg/l thì khả năng tái sinh chồi cũng tăng, đối với cả khoai sọ Hà Tĩnh và khoai sọ Tây Nguyên. Tuy nhiên, khi tăng BAP lên 4 mg/l thì khả năng tái sinh chồi giảm xuống. Vì thế, môi trường có bổ sung 3 mg/l BAP được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.3. Nhân nhanh chồi in vitro 3.3.1. Ảnh hưởng của BAP và NAA Chồi thu được từ thí nghiệm trên được sử dụng cho thí nghiệm nhân nhanh. Trong giai đoạn này, vai trò của chất kích thích sinh trưởng rất quan trọng, đặc biệt là tỷ lệ giữa hai nhóm chất kích thích sinh trưởng auxin và cytokinin. Sự kết hợp giữa hai nhóm chất này ở nồng độ thích hợp có tác dụng tốt trong việc nhân nhanh chồi và tăng chất lượng chồi [1], [2]. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP và NAA lên khả năng nhân nhanh của chồi các giống khoai sọ. Kết quả sau 8 tuần nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.4. 45 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của BAP và α-NAA đến khả năng nhân chồi khoai sọ BAP (mg/l) NAA (mg/l) Số chồi/mẫu Khoai sọ Hà Tĩnh Khoai sọ Tây Nguyên 3,0 0,0 2,63 d 2,63 e 3,0 0,2 3,10 c 3,27 d 3,0 0,5 4,90 ab 5,03 a 3,0 0,7 5,23 a 4,30 b 3,0 1,0 4,80 b 3,90 c LSD 0,05 0,37 0,32 Các chữ cái khác nhau trong cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p<0,05 (Duncan’s test). Kết quả trình bày ở bảng 3.3 cho thấy, môi trường có bổ sung 3 mg/l BAP và 0,7 mg/l NAA cho số chồi cao nhất đối với khoai sọ Hà Tĩnh, còn môi trường có bổ sung 3 mg/l BAP và 0,5 mg/l α-NAA cho số chồi cao nhất đối với khoai sọ Tây Nguyên. Như vậy, khả năng tái sinh của mô nuôi cấy không những phụ thuộc vào các chất kích thích sinh trưởng mà còn phụ thuộc vào tỷ lệ giữa chúng. Mỗi loài cần một tỷ lệ auxin/cytokinin thích hợp khác nhau. 3.3.2. Ảnh hưởng của nước dừa Nhiều nghiên cứu cho thấy trong thành phần nước dừa có các amino acid, các acid hữu cơ, đường, các chất kích thích sinh trưởng là cytokinin và auxin [5]. Vì vậy, trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành thử nghiệm ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng nhân nhanh của cụm chồi cũng như chất lượng chồi. Chúng tôi sử dụng môi trường MS có bổ sung 3 mg/l BAP, 0,5 mg/l NAA và nước dừa từ 5 đến 20%. Kết quả sau 8 tuần nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.5. Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nước dừa đến số chồi/mẫu và chất lượng chồi Nước dừa (%) Khoai sọ Hà Tĩnh Khoai sọ Tây Nguyên Số chồi/mẫu Chất lượng chồi Số chồi/mẫu Chất lượng chồi 0 4,90 c +++ 5,03 d +++ 5 5,67 b ++++ 5,90 b ++++ 10 6,17 a +++++ 6,37 a +++++ 46 15 5,27 c +++ 5,43 c +++ 20 4,47 d +++ 4,70 d +++ LSD0,05 0,38 0,34 Các chữ cái khác nhau trong cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p<0,05 (Duncan’s test). +++++: chồi khỏe mạnh, to, lá màu xanh đậm. ++++: chồi khỏe mạnh, lá màu xanh. +++: chồi nhỏ nhiều, lá có màu xanh nhạt. Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy, các môi trường có bổ sung nước dừa đều tăng số chồi và tăng chất lượng của chồi. Chồi sinh trưởng tốt, to, xanh, và khỏe. Ở tất cả các công thức có bổ sung nước dừa, số chồi đều tăng cao và đạt giá trị cao nhất ở 10% nước dừa. Tuy nhiên, khi tăng hàm lượng nước dừa lên 15-20% thì số chồi giảm. Điều này phù hợp với nhiều nghiên cứu trước đây khuyến cáo rằng không nên sử dụng nước dừa quá 10% [5], [6]. Hình 3.1. Cây khoai sọ Hà Tĩnh in vitro ở giai đoạn nhân chồi Hình 3.2. Chồi khoai sọ Hà Tĩnh in vitro sau 5 lần cấy chuyển 3.3.4. Ảnh hưởng của số lần cấy chuyển Một trong những ưu điểm của nuôi cấy mô tế bào là có thể cung cấp một lượng lớn cây giống đồng đều. Do đó, phải cấy chuy nhiều lần để tạo ra một số lượng lớn cây giống. Tuy nhiên, số lần cấy chuy có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của mô nuôi cấy. Nếu số lần cấy chuy quá lớn thì sẽ dẫn đến hiện tượng cây bị thoái hóa và sinh trưởng kém, có thể mất đi những đặc tính ban đầu của cây mẹ. Vì vậy, ngoài mục đích là xác định phương thức nhân nhanh bằng môi trường dinh dưỡng, chúng ta cần phải xác định số lần cấy chuyển hợp lý. Ở thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của số lần cấy chuyển đến khả năng nhân nhanh và chất lượng chồi. Kết quả được trình bày ở bảng 3.6 và hình 3.2. 47 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của số lần cấy chuyển lên khả năng nhân nhanh và chất lượng chồi Số lần cấy chuyển Khoai sọ Hà Tĩnh Khoai sọ Tây Nguyên Số chồi/mẫu Chất lượng chồi Số chồi/mẫu Chất lượng chồi 2-3 6,13 a ++++ 6,40 a ++++ 4-5 6,10 a +++ 6,37 a +++ >5 4,03 b ++ 4,33 b ++ LSD 0,05 0,35 0,36 Các chữ cái khác nhau trong cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p<0,05 (Duncan’s test). ++++: chồi khỏe mạnh, lá màu xanh đậm. +++: chồi khỏe, lá màu xanh. ++: chồi nhỏ, lá có màu hơi vàng. Từ kết quả trên, chúng tôi nhận thấy khi số lần cấy chuyển từ 6 đến 11 lần thì số chồi giảm mạnh, chỉ còn 4,03 chồi/mẫu. Quan sát thí nghiệm cho thấy, khi số lần cấy chuyển cao, đặc biệt khi lớn hơn 5 lần, thì chất lượng chồi giảm. Chồi nhỏ, lá nhỏ, không có màu xanh đậm và xoăn lại. Một số chồi không chắc và có hiện tượng xốp. Từ kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi đi đến kết luận rằng số lần cấy chuyển đối với khoai sọ Hà Tĩnh và Tây Nguyên không nên vượt quá 5 lần. 3.4. Tạo rễ này, các chồi in vitro của giống khoai sọ đạt kích thước khoảng 3 cm được sử dụng để tạo cây hoàn chỉnh. Kết quả sau 2 tuần nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.7. Bảng 3.7. Ảnh hưởng của NAA lên khả năng tạo rễ và phát triển cây hoàn chỉnh của chồi in vitro Giống NAA Số rễ/chồi Chiều dài rễ (cm) Số lá Khoai sọ Hà Tĩnh 0,0 2,60 d 2,49 d 2,93 b 0,1 2,87 d 2,63 d 2,93 b 0,3 3,47 c 3,46 c 3,63 a 0,5 5,07 a 4,51 b 3,63 a 48 0,7 4,20 b 4,97 a 3,60 a LSD 0,05 0,33 0,22 0,28 Khoai sọ Tây Nguyên 0,0 2,47 d 2,79 d 2,87 b 0,1 2,67 d 2,83 d 2,93 b 0,3 3,20 c 3,16 c 3,40 a 0,5 4,97 a 4,36 b 3,63 a 0,7 4,20 b 4,98 a 3,60 a LSD 0,05 0,35 0,22 0,25 Các chữ cái khác nhau trong cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p<0,05 (Duncan’s test). Trong thí nghiệm này, chúng tôi nhận thấy 100% chồi đều tạo rễ sau khoảng 10 ngày nuôi cấy. Tuy nhiên, số lượng rễ, chiều dài rễ cũng như số lá có khác nhau giữa các môi trường có nồng độ NAA khác nhau. Các chồi in vitro tạo rễ tốt trên môi trường có bổ sung 0,5 mg/l NAA. Khi tăng nồng độ NAA lên thì số rễ giảm, nhưng chiều dài rễ tăng. Điều này có thể làm cho rễ dễ bị đứt khi chuyển cây ra ngoài môi trường. Hình 3.3. Cây khoai sọ Hà Tĩnh sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS + 0,0 mg/l đến 0,7 mg/l α NAA 3.5. Giai đoạn vườn ươm Ở giai đoạn này chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây con in vitro. Các giá thể được sử dụng là: cát, trấu, đất phù sa, đất:cát (1:1), đất:trấu (1:1). Kết quả được trình bày ở bảng 3.8. 49 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của các loại giá thể đến tỷ lệ sống của cây con in vitro Giống Giá thể Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ chết (%) Khoai sọ Hà Tĩnh Cát 100,00 0,00 Trấu 93,33 6,67 Đất phù sa 13,33 86,67 Đất:Cát (1:1) 46,67 53,33 Đất:Trấu (1:1) 53,33 46,67 Khoai sọ Tây Nguyên Cát 100,00 0,00 Trấu 96,67 3,33 Đất phù sa 26,67 73,33 Đất:Cát (1:1) 46,67 53,33 Đất:Trấu (1:1) 56,67 43,33 Giá thể là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây con in vitro khi đưa ra vườn ươm. Trong các loại giá thể nghiên cứu, cát và trấu là hai loại giá thể cho tỷ lệ sống cao nhất. Giá thể đất phù sa cho tỷ lệ sống thấp nhất đố cả hai giống khoai sọ. Nguyên nhân là do đất phù sa thoát nước kém nên gây úng làm thối và chết cây. Sau khoảng 2 tuần trồng trên giá thể, cây đã bén rễ hồi xanh và bắt đầu xuất hiện lá mới. Lúc này có thể đem trồng ở ruộng hoặc vườn. 4. Kết luận Dựa vào những kết quả thu được từ các thí nghiệm trên chúng tôi rút ra các kết luận sau: Thời gian khử trùng thích hợp cho chồi khoai sọ Hà Tĩnh và khoai sọ Tây Nguyên là 12 phút với HgCl2 0,2% đạt tỷ lệ mẫu sống sạch tương ứng là 53,33% và 56,67%. Môi trường cơ bản MS có 3 mg/l BAP thích hợp nhất cho quá trình tái sinh chồi từ mẫu cấy, đạt 2,63 chồi/mẫu cấy ở cả 2 giống khoai sọ. Môi trường cơ bản MS có 3 mg/l BAP, 0,5mg/l NAA cho số chồi cao nhất, đạt 4,9 chồi/mẫu ở giống khoai sọ Hà Tĩnh và 5,03 chồi/mẫu ở khoai sọ Tây Nguyên. Môi trường cơ bản MS có 10% nước dừa đã tăng số lượng và chất lượng chồi, đạt 6,17 chồi/mẫu ở giống khoai sọ Hà Tĩnh và 6,37 chồi/mẫu ở khoai sọ Tây Nguyên. Số lần cấy chuyển tốt nhất đối với 2 giống khoai sọ là không quá 5 lần. Môi trường cơ bản MS có 0,5 mg/l NAA là thích hợp nhất cho quá trình tạo rễ và tạo cây hoàn chỉnh, đạt 5,07 rễ/chồi ở giống khoai sọ Hà Tĩnh và 4,97 rễ/chồi ở khoai sọ Tây Nguyên. Giá thể sử dụng để ươm cây con 2 giống khoai sọ tốt nhất là cát. 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Trần Thị Lệ (chủ biên), Trương Thị Bích Phương, Giáo trình Công nghệ sinh học thực vật, Nxb. Nông nghiệp, 2008. [2]. Nguyễn Hoàng Lộc, Giáo trình Nhập môn công nghệ sinh học, Nxb. Đại học Huế, 2007. [3]. Murashige T., Skoog F., A revised medium for rapid growth and bioassay with tobaco tissue cultures, Physiol Plant 15, 1962, 473-497. [4]. Trương Thị Bích Phượng, Nguyễn Thị Duy Khoa, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Hân, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Văn Huệ, Nhân giống in vitro cây môn sáp vàng (Xanthosoma nigrum), Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc: Nghiên cứu cơ bản trong Khoa học sự sống, Nxb. Khoa học và Kỹ thuật, 2004, 575-578. [5]. Nguyễn Văn Uyển, Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống cây trồng, Nxb. Nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh, 1993. [6]. Keolanui R., Sanxtex S., Handbook for commercial-scale taro (Colocasia esculenta) tisue culture in Hawaii, University of Hawaii, 1993. [7]. MICROPROPOGATION OF COLOCASIA ANTIQUORUM Tran Thi Le, Tran Thi Trieu Ha College of Agriculture and Forestry, Hue University SUMMARY The shoot explants have been decontaminated by HgCl2 0,2% for 12 minutes and good results have been obtained. The MS medium with 3 mg/l BAP is suitable for the shoot regeneration from the tissue culture. The MS + 3 mg/l BAP and 0,5 mg/l NAA are good for the multiplication of the shoot and the MS + 0,5 mg/l NAA suits for increasing the number of the roots. The supplementary of 10% cocunut water support the shoot developmentl and increases the multiplicative coefficient. The number of subcultures should not exceed 5 times. The seedlings are planted in the best place which consists of 100% survival rate. Keywords: BAP, Colocasia esculenta, cocunut water, NAA, micropropogation.