Nghiên cứu quá trình tái sinh chồi của hương nhu tía (ocimum tenuiflorum) trong nuôi cấy in vitro

22 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 2(87)/2018 Khurnpoon, L., Siriphanich, J. and Labavitch, J. M., 2008. Cell wall metabolism during durian fruit dehiscence. Postharvest Biology and Technology 48:391-401. Knee, M. 1987. Development of ethylene biosynthesis in pear fruits at -1 ºC. Journal of Experimental Botany 38:1724-1733. Miguela, S., Demetrio, V., Elda., B. and Merly, A., 2006. Postharvest behavior and storage life of 3 durian cultivars with varying maturity, waxing and temperature. Philippine Journal of Crop Science, 31(1): 29-46. Nafsi N., 2007. Diversity analysis of durian (Durio zibethinus Murr.) varieties using microsatellite markers. Thesis School of Bioscience and Biotechnology, Bandung Institute of Technology. Bandung. Indonesia. Oeticker, J.H and Yang S.F., 1995. The role of ethylene in fruit ripening. Acta Hort. 398: 167-178. Ofelia, K.B and Elda B.E., 1990. Postharvest Technology for Southeast Asian Perishable Crops. (Ed). Chapter 12: Ripening, degreening and color adding, 171:190. Siriphanich, J. and Jarimopas, B., 1993. Postharvest loss of durian. National Agricultural Machinery Center Newsletter, 6(4):1-3. Sutthaphan, S., 1993. Postharvest change in chemical composition of Chanee and Monthong durian pulp. MS Thesis, Kasetart University, Bangkok. Tira-daengkanit., 1995. Relationships between activities of polygalacturonase, pectin methylesterase, cellulase and beta-galactosidase and pulp softening of ripe durians, Bangkok (Thailand), 64p. Tongdee, S.C., Chayasombat, A and Neamprem, S., 1988. Respiration, ethylene production and changes in interal atmospheres of durian (Durio zibethinus Murr.) In: Proceedings of the seminar on durian. Thailand Institute of Scientific and Technological Research, Bangkok, 31-36. Study on ripening process of Ri 6 durian fruit by exogenous ethylene gas Duong Thi Cam Nhung and Nguyen Van Phong Abstract Study on the effect of exogenous ethylene fumigation approaches on the ripening process of “Ri 6” durian fruit was conducted to find out ripening effective method. The experiment was arranged in completely randomized design with different treatments (ethephone dip 500 ppm, ethylene from ethephone in NaOH, ethylene generator with conc. 200 ppm - 24 hrs and control) and five replications; each replication was one fruit. Durian fruits with 90% of mature and uniform size were harvested from durian orchard belonging to Thanh Binh commune, Vinh Long province. After harvesting, fruits were carefully transported to the postharvest laboratory and treated with ethylene as described above. After treatment, the samples were kept in ambient (27 - 29oC) and recorded the number of days to ripening edibility. Among three ripening approaches, fumigations with ethylene gas obtained from ethylene generator and ethephone reacted with NaOH could be considered as the most suitable for ripening Ri-6 durian fruits. The ripening time of Ri-6 durian fruits using the fumigation was shortened down 2 days and fruit gave optimum eating quality. Keywords: Ethephon, ethylene, respiration, Ri 6 durian, ripening Ngày nhận bài: 15/1/2018 Ngày phản biện: 30/1/2018 Người phản biện: PGS.TS. Lê Nguyễn Đoan Duy Ngày duyệt đăng: 12/2/2018 1 Viện Dược liệu; 2 Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TÁI SINH CHỒI CỦA HƯƠNG NHU TÍA (Ocimum tenuiflorum) TRONG NUÔI CẤY IN VITRO Lương Thị Hoan1, Hoàng Thị Như Nụ1, Nguyễn Đăng Minh Chánh2 TÓM TẮT Hương nhu tía (Ocimum tenuiflorum) là một trong các loài dược liệu có giá trị trong điều trị đường hô hấp, tiêu chảy, nhức đầu và làm mỹ phẩm. Tuy nhiên, nhân giống bằng con đường hữu tính đã giảm do tỷ lệ nảy mầm hạt giống thấp. Mục tiêu của nghiên cứu này xác định quá trình tái sinh chồi của Hương nhu tía trong nuôi cấy in vitro. Chồi của hương nhu tía lấy từ vườn cây thuốc tại Hà Nội, được khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong các thời gian khác nhau (2, 4, 6, và 8 phút) và được đưa vào môi trường MS; môi trường tái sinh chồi gồm MS + 0,5 mg/l BA, MS + 0,25 mg/l BA và môi trường ½ MS + 0,5 mg/l BA, ½ MS + 0,25 mg/l BA. Kết quả cho thấy mẫu chồi khử trùng tối ưu nhất khi dùng HgCl2 0,1% trong 4 phút, đạt tỷ lệ bật chồi cao nhất (32%); môi trường tái sinh chồi ½ MS bổ 23 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 2(87)/2018 sung 0,25 mg/l BA cho hệ số nhân chồi trung bình 4,5 chồi/mẫu và chiều cao trung bình 1,5 cm/chồi. Kết quả nghiên cứu này là cơ sở tìm ra môi trường nhân nhanh chồi, tái sinh hữu hiệu và tạo cây con hoàn chỉnh ngoài vườn ươm làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo. Từ khóa: Hương nhu tía, tái sinh chồi, nuôi cấy mô, nhân giống I. ĐẶT VẤN ĐỀ Hương nhu tía (Ocimum tenuiflorum) là một loại cây thân thảo, thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae), có nguồn gốc dân gian từ Ấn độ, được trồng rộng rãi ở nước Đông Nam Á. Ở Việt Nam, trước đây cây chủ yếu mọc hoang dại ở một số địa phương như Quảng Ninh, Hà Giang, Phú Thọ, Yên Bái và Cửu Long... Đến nay, cây đã được trồng ở một số tỉnh Nam Hà, Lạng Sơn, Sơn La, Lai Châu, Đắc Lắc, Vĩnh Phúc và một số tỉnh Đông Nam bộ... Theo y học cổ truyền, Hương nhu tía có tinh dầu với tỷ lệ 0,2 - 0,3% ở cây tươi và 0,5% ở cây khô; thành phần chính của tinh dầu là eugenol (trên 70%), methyleugenol (trên 12%) và β- caryophyllen. Sử dụng chữa trị nhiều căn bệnh về đường hô hấp, tiêu chảy, nhức đầu, sốt, bệnh về da và viêm phổi. Chiết xuất từ cây này chứa các chất có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và hoạt tính chống sốt rét, chảy máu camvà dùng làm mỹ phẩm (Đỗ Tất Lợi, 2004; Jurges et al., 2009; Adebolu et al., 2005; Gopi et al., 2006). Ở một số nước, Hương nhu tía đã được trồng và phát triển với quy mô thương mại phục vụ cho sản xuất đám ứng yêu cầu về dược liệu và mỹ phẩm cho loài cây này. Ở Ấn Độ, hương nhu là loài quan trọng và nằm trong số 178 loài cây cao cấp và là một trong số 36 loài cây ổn định hệ thống nông nghiệp ở địa phương của Ấn Độ (Ved and Goraya, 2008). Theo truyền thống, nhân giống bằng hạt tỷ lệ nảy mầm hạt giống thấp ≤ 10% (Gopi et al., 2006), cách tiếp cận này dẫn đến mức độ đa dạng hóa cao, các sản phẩm thảo dược không phù hợp với yêu cầu thương mại (Engels & Brinckmann, 2013; Tyub & Kamili, 2009) đã giảm hoạt tính và tạo ra sản phẩm kém chất lượng. Để nâng cao trong ngành công nghiệp sản phẩm chăm sóc sức khỏe tự nhiên, nhân giống trong ống nghiệm in vitro là một kỹ thuật hữu ích và nhân giống được chọn lọc có giá trị cao (Paek et al., 2005; Rout et al., 2000) giúp tuân thủ được các quy định và hướng dẫn, tiêu chuẩn chất lượng thực hành khai thác nông nghiệp sạch đối với sức khỏe ở Canada và Ấn Độ (Government of Canada, 2004; Ved & Goraya, 2008). Do đó, việc cung cấp Hương nhu tía chất lượng cao, sản xuất hàng loạt thông qua việc nhân giống trong ống nghiệm kết hợp với sản xuất nhà kính sẽ là một hệ thống lý tưởng. Ở Việt Nam, phát triển và khai thác nguồn giống dược liệu phục vụ cho sản xuất đang là vấn đề cấp bách. Trong đó, Hương nhu tía là một trong các loài cây nằm trong định hướng phát triển nguồn dược liệu quốc gia, nhưng hiện nay trồng Hương nhu tía còn tản mạn, phân tán rải rác nên chưa được quan tâm. Để đáp ứng như cầu của người dân vùng trồng dược liệu nói riêng và cả nước nói chung, mục tiêu của nghiên cứu này xác định quá trình tái sinh chồi của Hương nhu tía (Ocimum tenuiflorum) trong nuôi cấy in vitro nhằm tạo nguồn cây giống có giá trị đáp ứng nhu cầu sản xuất cây trồng trên quy mô thương mại. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Đoạn chồi của Hương nhu tía được lấy từ cây giâm hom 6 tháng tuổi ở vườn cây thuốc, Trung tâm Nghiên cứu Trồng và Chế biến cây thuốc Hà Nội, Viện Dược liệu. 2.2. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp khử trùng và chuẩn bị mẫu: Đoạn chồi được cắt dài 6 - 8 cm xử lý sạch trên bề mặt trước, sau đó dùng HgCl2 0,1% khử trùng trong thời gian 2, 4, 6 và 8 phút, được rửa sạch bằng nước cất vô trùng, khi đưa vào bình cấy mẫu được cắt thành từng đoạn 2 cm và cấy trên môi trường MS. - Phương pháp nuôi cây tái sinh chồi: Sau khi mẫu vào 20 ngày bật chồi, các chồi được tách ra và cấy vào môi trường. Bốn công thức tái sinh chồi từ mẫu được sử dụng là TS1 (MS + 0,5 mg/l BA), TS2 (MS + 0,25 mg/l BA), TS3 (1/2 MS + 0,5 mg/l BA) và TS4 (1/2 MS + 0,25 mg/l BA). Thí nghiệm được nhắc lại 3 lần đánh giá khả năng hình thành chồi sau 5 tuần nuôi cấy. - Điều kiện nuôi cấy: Mẫu được nuôi cấy trong bình tam giác, giữ điều kiện nhiệt độ nuôi cấy 25 ± 2oC, môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng 15 phút ở 121oC, 1atm. Thời gian chiếu sáng 14 - 16 giờ/ngày. - Phương pháp xử lý số liệu: Các số liệu thu thập khử trùng mẫu và tái sinh chồi được sử dụng phần mền SPSS và Excel để tính toán. 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 8 đến tháng 12 năm 2017 tại phòng Công nghệ sinh học, Viện Dược liệu. 24 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 2(87)/2018 III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả khử trùng mẫu chồi của hương nhu tía Mẫu chồi hương nhu tía sau khi được làm sạch khử trùng HgCl2 0,1% với 4 công thức khác nhau về thời gian, sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy khởi đông, kết quả thu được ở bảng 1. Bảng 1. Kết quả về thời gian khử trùng đến tỷ lệ mẫu sạch bật chồi Hương nhu tía Bảng 1 cho thấy rằng khi sử dụng dung dịch HgCl2 0,1% để khử trùng với thời gian khác nhau cho khả năng tạo mẫu sạch và khả năng bật chồi của Hương nhu tía khác nhau. Trong đó, công thức CT2 cho tỷ lệ mẫu sạch bật chồi tốt nhất vào 4 phút, đây cũng là công thức khử trùng đạt hiệu quả cao nhất đối với chồi Hương nhu tía (32%). Khi tăng thời gian khử trùng lên 6 và 8 phút, tỷ lệ mẫu sạch nảy chồi và mẫu chết giảm dần, tỷ lệ mẫu chết tăng ở công thức khử trùng 8 phút (CT4), tỷ lệ mẫu sống bật chồi 12%, không có mẫu nhiễm nào, trong khi mẫu chết đạt 88%. Ở công thức CT2 (thời gian khử trùng 2 phút) tỷ lệ mẫu nhiễm khuẩn cao 90% trên tổng số mẫu, tỷ lệ mẫu sạch bật chồi thấp (10%), không có mẫu nào chết. Điều này cho thấy nếu kéo dài thời gian khử trùng với HgCl2 0,1%, hóa chất sẽ ngấm vào mô thực vật sẽ làm hỏng và gây độc do đó protocorm không thể phát sinh chồi, phù hợp với các nghiên cứu trước đây của Jaime et al. (2015) và Nguyễn Văn Việt (2017). Kết quả nghiên cứu cho thấy công thức khử trùng phù hợp là công thức CT2 với thời gian khử trùng 4 phút cho tỷ lệ mẫu sạch và tỷ lệ bật chồi 32% (Hình 1). Hình 1. (a) chồi sau khi khử trùng đưa vào môi môi trường khởi động; (b) chồi xuất hiện sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường khởi động; (c) sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy khởi đông Công thức Thời gian khử trùng (phút) Tỷ lệ mẫu sạch nảy chồi (%) Tỷ lê mẫu nhiễm (%) Tỷ mẫu mẫu chết (%) CT1 2 10 90 0 CT2 4 32 40 28 CT3 6 25 20 55 CT4 8 12 0 88 Kết quả này phù hợp với phân tích thống kê về phương sai một nhân tố Ftính < 0,05 (= 0,002) thời gian khử trùng khác nhau ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng tạo mẫu sạch bật chồi của Hương nhu tía. 3.2. Tái sinh chồi Hương nhu tía Những chồi tái sinh từ mẫu đưa vào trong môi trường nuôi cấy khởi động được cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh chồi. Thí nghiệm được bố trí với 4 công thức có sử dụng 2 loại môi trường MS và ½ MS bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BA ở nồng độ 0,5 mg/l và 0,25 mg/l, sau 5 tuần nuôi cấy kết quả thu được thể hiện ở bảng 2. Số liệu bảng 2 cho thấy, hàm lượng vi lượng và đa lượng ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ nảy chồi của Hương nhu tía. Trong môi trường cả MS số chồi trung bình/mẫu đạt 1,5 - 2,0 chồi/mẫu và chiều dài của các chồi đạt từ 0,4 tới 0,7 cm, thấp hơn so với các công thức giảm ½ thành phần khoáng (vi lượng và đa lượng) ở công thức thí nghiệm TS3 và TS4. Có lẽ trong môi trường MS nồng độ các chất khoáng đa lượng và vi lượng cao hơn nên không thích hợp cho sự tái sinh chồi nên chồi tái sinh ngắn, các đầu lá xoăn lại. Trong môi trường ½ MS có tỷ lệ các chất khoáng phù hợp với sự phát triển của tái sinh chồi nên số chồi trung bình/mẫu đạt 3,0 - 4,5 chồi, chiều cao từ 1,1 - 1,5 cm (Hình 2). Kết quả này chứng tỏ môi trường ½ MS cho khả năng tái sinh chồi Hương nhu tía phát triển nhanh và cây xanh tốt và dài hơn môi trường còn lại. Vì vậy thành phần môi trường nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của bộ phận nuôi cấy (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002; Ngô Xuân Bình, 2009), đặc biệt thành phần khoáng có vai trò quan trọng trong việc cảm ứng, tăng trưởng và tái sinh chồi trong nuôi cấy mô do lượng chất dinh dưỡng trong 2 môi trường khác nhau. Kết quả này phù hợp với với lý thuyết về khả năng chuyển hóa và bảo toàn vật chất (Ngô Xuân Bình, 2009). (a) (b) (c) 25 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 2(87)/2018 Hình 2. (a) môi trường nuôi cấy 1/2 MS + 0,25 mg/l BA; (b) môi trường nuôi cấy MS + 0,5 mg/l BA; (c) môi trường nuôi cấy ½ MS + 0,5 mg/l BA Bảng 2. Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng tái sinh chồi Hương nhu tía Ngoài ra, nồng độ chất điều hòa sinh trưởng ảnh hưởng đến tái sinh chồi Hương nhu tía. Ở nồng độ khác nhau cho số chồi khác nhau. Trong nghiên cứu này, nồng độ BA 0,25 mg/l thích hợp hơn so với nồng độ BA 0,5 mg/l. Trong 2 loại môi trường MS và ½ MS số chồi ở nồng độ BA 0,25 mg/l đạt 2,2 chồi/mẫu và 4,5 chồi /mẫu, trong khi ở nồng độ 0,5 mg/l cho số chồi thấp hơn dao động là 1,5 chồi/mẫu và 3 chồi/ mẫu. Điều này nhận thấy rằng nồng độ BA có ảnh hưởng đáng kể đến sự hình thành chồi của Hương nhu tía vì BA là chất cytokinin có vai trò trong việc hình thành chồi (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Qua kiểm tra số chồi/mẫu giữa các công thức thí nghiệm p < 0,000, vì vậy điều này chứng tỏ rằng giữa các công thức thí nghiệm có sự khác nhau rõ rệt. Kết quả này phù hợp với một vài nghiên cứu về Hương nhu tía nhân giống in vitro trên thế giớí sử dụng BA với nồng độ 0,25 mg/l đối với việc tái sinh chồi (Neeti, 2013; Helgde et al., 2015). Công thức Môi trường Nồng độ BA (mg/l) Số chồi trung bình/mẫu Chiều cao trung bình/chồi (cm) TS1 MS 0,5 1,5 0,4 TS2 0,25 2,2 0,7 TS3 ½ MS 0,5 3,0 1,1 TS4 0,25 4,5 1,5 Sig = 0.000 IV. KẾT LUẬN Mẫu chồi Hương nhu tía được khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong thời gian 4 phút cho tỷ lệ tái sinh chồi tốt nhất. Nhân nhanh chồi tái sinh được tạo ra trên môi trường ½ MS có bổ sung 0,25 mg/l BA cho hệ số nhân chồi và khả năng phát triển chiều dài của chồi cao hơn so với ở nồng độ 0,5 mg/l, cao hơn môi trường MS cùng nồng độ. TÀI LIỆU THAM KHẢO Ngô Xuân Bình, 2009. Nuôi cấy tế bào thực vật cơ sở lý luận và ứng dụng. Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật. Đỗ Tất Lợi, 2004. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB Y học. Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên, 2002. Công nghệ tế bào. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. Nguyễn Văn Việt, 2017. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy Invitro trong nhân giống Lan Hoàng Thảo Kèn (Dendrobium lituiflorum Lindley). Tạp chí Khoa học và Công nghệ Lâm nghiệp số 4: 39-45. Adebolu TT, Aladimeji SA., 2005. Antimicrobial activity of leaf extracts of Ocimum gratissimum on selected diarrhoea causing bacteria in Southwestern Nigeria. African Journal of Biotechnology Vol 4 (7):682-684. Engels G, Brinckmann J., 2013. Hly Basil Ocimum tenuiflorum (syn. O.sanctum) HerbalGram 2013. American Botanical Council:1-6. Gopi C, Nataraja Sekhar Y, Ponmurugan P., 2006. In vitro Multiplication of Ocimum gratissimum L. through direct regeneration. African Journal of Biotechnology Vol 5 (9): 723-726. Government of Canada, 2013. Natural Health products Regulations. Helgde VK, Sunil Kumar MAKH, Deepa Kumari AB., 2015. In vitro callus induction and multiple shoot induction of Ocimum tenuiflorum. Global Journal of Multidisciplinary Studies Vol 4 No. 5, 2348-2495. Jaime Ateixeira da Silva, jean arlos Cardoso et al., 2015. Dendrobium micropropagation a review. Plant Cell Rep. 30: 671-704. Jurges G, Beyerle K, tosenberger M, Haser A, Nick P., 2009. Development and validation of microscopical diagnostics for “Tulsi” (Ocimum tenuiflorum L.) in ayurvedic preparation. European Food Research and Technology 229: 99-106. (a) (b) (c)