Nghiên cứu phân bố các týp virut dengue ở bệnh nhân đến khám tại khoa cấp cứu, Bệnh viện Quân y 103 năm 2017 – Lê Thị Bảo Quyên

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2019 36 NGHIÊN CỨU PHÂN BỐ CÁC TÝP VIRUT DENGUE Ở BỆNH NHÂN ĐẾN KHÁM TẠI KHOA CẤP CỨU, BỆNH VIỆN QUÂN Y 103 NĂM 2017 Lê Thị Bảo Quyên1; Trịnh Thị Mỹ Anh1; Nguyễn Giang Hòa2; Nguyễn Văn Bằng2 Phạm Văn Tiến2; Bùi Quốc Chính3; Ngô Quý Lâm3; Hoàng Xuân Sử3 TÓM TẮT Mục tiêu: nghiên cứu nhằm xác định phân bố và lưu hành týp dengue ở bệnh nhân đến khám tại Khoa Cấp cứu, Bệnh viện Quân y 103 năm 2017. Đối tượng và phương pháp: tổng số 149 bệnh nhân nhiễm dengue trong giai đoạn cấp được thu thập tại Khoa Cấp cứu, Bệnh viện Quân y 103 năm 2017. Thu thập mẫu huyết thanh làm xét nghiệm huyết học và huyết thanh học phát hiện NS1 Ag-IgM/IgG, sử dụng xét nghiệm nhanh OnSite Duo Dengue Ag-IgG/IgM Rapid test - CTK Biotech, Mỹ. Sử dụng kỹ thuật multiplex onestep RT-PCR để phát hiện và định týp virut Dengue lưu hành. Kết quả: trong số 149 bệnh nhân nhiễm Dengue có kết quả xét nghiệm NS1 Ag và IgM dương tính, phân tích PCR cho kết quả dương tính 111/149 (74,5%), tỷ lệ nhiễm týp DENV1 và týp DENV2 lần lượt là 69/111 (62,2%) và 42/111 (37,8%). Không có trường hợp nào nhiễm týp DENV3 và DENV4 cũng như đồng nhiễm týp DENV1 và týp DENV2. Tỷ lệ phân bố theo nhóm tuổi cho thấy khác biệt có ý nghĩa ở bệnh nhân nhóm tuổi 20 - 29 (p = 0,015) so với các nhóm còn lại. Phân tích phân bố týp Dengue theo khu vực trên địa bàn Hà Nội cho thấy Hà Đông là quận có tỷ lệ nhiễm virut Dengue cao nhất với 58/111 trường hợp (52,25%), trong đó 38/58 trường hợp (65,5%) nhiễm DENV1 và 20/58 trường hợp (34,5) nhiễm DENV2. Tỷ lệ bệnh nhân nhiễm týp DENV1 giảm số lượng bạch cầu cao hơn so với bệnh nhân nhiễm DENV2 (36,04% so với 13,51%; p = 0,02). Không có sự khác biệt về phân bố giữa hai týp DENV1 và DENV2 liên quan đến giảm số lượng hồng cầu và tiểu cầu. Kết luận: nghiên cứu phân bố và lưu hành các týp Dengue ở bệnh nhân đến khám tại Khoa Cấp cứu, Bệnh viện Quân y 103 năm 2017 cho thấy chỉ phát hiện týp DENV1 và DENV2, trong đó týp DENV1 chiếm ưu thế. * Từ khóa: Virut Dengue; Phân bố týp dengue. Study of Distribution of Dengue Virus in Patients Admitted into the Emergency Department, 103 Military Hospital in 2017 Summary Objectives: To investigate the distribution of Dengue virus serotypes in acute phase of illness. Subject and methods: A total of 149 patients infected with Dengue virus admitted into the Emergency Department of 103 Military Hospital. NS1 Ag-IgM tested using OnSite Duo Dengue Ag-IgG/IgM Rapid test CTK Biotech, (USA), whereas, multiplex onestep RT-PCR was used for detecting and typing of Dengue virus. Results: Among 149 patients with NS1 Ag-IgM positive detected in 111/149 cases (74.5%) positive with PCR. 1. Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội 2. Bệnh viện Quân y 103 3. Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Hoàng Xuân Sử (hoangxuansu@vmmu.edu.vn) Ngày nhận bài: 20/12/2018; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 15/01/2019 Ngày bài báo được đăng: 22/02/2019 T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2019 37 Serotypes were found in 69/111 (62.2%) of DENV1 and 42/111 (37.8%) of DENV2, respectively. No cases of DENV3 and DENV4 were observed. The significant difference between the distribution of DENV1 and DENV2 associated with age groups ranging from 20 - 29 (p = 0.015). Cases infected with DENV1 had higher leucopenia than those infected with DENV2 (36.04% versus 13.51%; p = 0.02). No differences were found between the DENV serotypes in relation to platelet count and red blood cells at presentation. Conclusion: This study indicated that the DENV1 and DENV2 were the most predominant DENV serotypes isolated from patients with dengue infection admitted into in the emergency setting during 2017. * Keywords: Dengue virus; Dengue serotypes. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh sốt dengue (SD) và sốt xuất huyết (SXHD) do virut Dengue (DENV) gây ra là vấn đề y tế thách thức mang tính toàn cầu, ước tính có khoảng 3,6 tỷ người đang sống trong khu vực có nguy cơ nhiễm Dengue, 390 triệu trường hợp mắc mỗi năm, 96 triệu người nhiễm DENV có triệu chứng, 2 triệu trường hợp biểu hiện bệnh nặng và 21.000 ca tử vong mỗi năm [4]. Tại Việt Nam, SD và SXHD là bệnh truyền nhiễm phổ biến lưu hành khắp 63 tỉnh thành trên cả nước, gây dịch hàng năm với hàng chục nghìn ca mắc bệnh, diễn biến phức tạp. DENV thuộc họ Flaviviridae gồm 4 týp là DENV1, DENV2, DENV3, DENV4. Ở nước ta gặp cả 4 týp, nhưng chủ yếu là týp DENV1 và DENV2 [5]. Nhiễm DENV có biểu hiện lâm sàng rất đa dạng, từ mức độ nhẹ như người nhiễm virut không triệu chứng đến nhiễm DENV mức độ nặng, có dấu hiệu cảnh báo và hội chứng sốc dengue. Các nghiên cứu lâm sàng và dịch tễ học chỉ ra phân bố khác nhau của týp DENV và mức độ gây bệnh khác nhau của týp DENV giữa các quốc gia và khu vực [4]. Do đó, nghiên cứu tìm hiểu phân bố và đặc điểm di truyền của các týp DENV trong vụ dịch không những có giá trị trong theo dõi diễn biến bệnh mà còn giúp hỗ trợ dự báo các vụ dịch xảy ra tiếp theo. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu nhằm mục tiêu: Xác định tỷ lệ phân bố các týp virut Dengue ở bệnh nhân đến khám tại Khoa Cấp cứu, Bệnh viện Quân y 103 năm 2017. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nghiên cứu thực hiện từ tháng 8 - 2017 đến tháng 9 - 2017 tại Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y. 1. Đối tượng nghiên cứu. 149 bệnh nhân (BN) có xét nghiệm IgM dương tính hoặc NS1 dương tính với DENV trong đợt dịch năm 2017 đến khám tại Khoa Cấp cứu, Bệnh viện Quân y 103. 2. Phương pháp nghiên cứu. Thí nghiệm thực hiện theo phương pháp mô tả phòng thí nghiệm từ tháng 8 đến 9 - 2017 tại Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y. Chẩn đoán lâm sàng BN SD và SXHD theo Hướng dẫn của Bộ Y tế, BN có triệu chứng lâm sàng nghi ngờ nhiễm virut Dengue, không phân biệt tuổi, giới tính, được chọn vào để sàng lọc xét nghiệm chẩn đoán nhanh và phân tích PCR xác định týp DENV. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2019 38 * Thu thập mẫu huyết tương: thu thập 5 ml máu tĩnh mạch ngoại vi của BN vào ống chứa chất chống đông EDTA-K3, sau đó ly tâm 3.000 vòng/phút trong 10 phút. Hút huyết tương vào các tuýp vô trùng, bảo quản lạnh (-20oC) cho đến khi tiến hành xét nghiệm chẩn đoán. * Kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu: Xét nghiệm chẩn đoán nhanh: phát hiện đồng thời kháng thể IgM, kháng thể IgG và kháng nguyên DENV-NS1 trong máu toàn phần, huyết thanh hoặc huyết tương của BN, sử dụng bộ kít OnSite Duo Dengue Ag-IgG/IgM rapid test-CTK Biotech (Mỹ). Tách chiết ARN của DENV từ mẫu huyết tương BN sốt xuất huyết. Tách chiết ARN từ 200 µl huyết tương theo quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất (High pure ARN viral kit, Roche, Thụy Sỹ). Ly giải ARN trong 50 µl elution buffer, bảo quản ở -80oC cho đến khi phân tích PCR. Xét nghiệm multiplex onestep RT-PCR: thực hiện tại Phòng Vi sinh vật và các mầm bệnh sinh học, Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự. Thực hiện multiplex onestep RT-PCR theo quy trình của bộ kít QIAGEN onestep RT-PCR (Đức). Các cặp mồi phát hiện và định týp dựa trên vùng gen CprM của DENV [6]. Bảng 1: Thông tin mồi sử dụng trong nghiên cứu. Tên mồi Chức năng Trình tự Kích thước (bp) F Mồi xuôi 5’- TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG-3’ R1 Mồi ngược týp DENV1 5’- CGTCTCAGTGATCCGGGGG-3’ 482 R2 Mồi ngược týp DENV2 5’- CGCCACAAGGGCCATGAACAG-3’ 119 R3 Mồi ngược týp DENV3 5’- TAACATCATCATGAGACAGAGC-3’ 290 R4 Mồi ngược týp DENV4 5’- CTCTGTTGTCTTAAACAAGAGA-3’ 392 Phản ứng multiplex onestep RT-PCR thực hiện trên máy Master cycler PCR (Eppendorf, Đức) với chu trình nhiệt của phản ứng như sau: 50°C (30 phút), 95°C (15 phút), 35 chu kỳ [94°C (15 giây), 55°C (30 giây), 72°C (30 giây), 72°C (10 phút), (4°C, +∞). Kiểm tra sản phẩm onestep RT-PCR bằng điện di trên gel agarose 1,2%, nhuộm EtBr 30 phút. - Chứng dương ARN: chứng dương ARN của týp DENV được tổng hợp in vitro theo hướng dẫn bộ kít TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific, Mỹ). Xác định nồng độ ARN bằng máy Nanodrop (Thermoscientific, Mỹ). Từ dung dịch ARN ban đầu, tiến hành pha loãng trong dung dịch TE tới nồng độ 104 copies/ml sử dụng làm đối chứng dương trong phản ứng multiplex onestep RT-PCR. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2019 39 * Các chỉ số phân tích: - Về đặc điểm dịch tễ học: tuổi, giới tính, nơi sinh sống và làm việc. - Về chỉ số xét nghiệm: BN được làm xét nghiệm huyết học và lấy máu làm xét nghiệm multiplex onestep RT-PCR xác định týp virut Dengue gây bệnh, làm xét nghiệm huyết thanh học chẩn đoán tìm kháng thể đặc hiệu dengue (IgG/IgM). - Chỉ những trường hợp có kết quả IgM hoặc NS1 dương tính với DENV được chọn vào nghiên cứu. * Tiêu chuẩn loại trừ: khi nghi ngờ BN có bội nhiễm thêm các bệnh cấp tính khác. * Thu thập và xử lý số liệu: thông tin BN và kết quả xét nghiệm được mã hóa và nhập liệu bằng phần mềm Excel. Phân tích và xử lý số liệu, sử dụng phần mềm SPSS 20.0, giá trị p < 0,05 được xem có ý nghĩa thống kê. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Hình 1: Phát hiện và định týp DENV bằng multiplex onestep RT-PCR. (1: Marker 50 bp (Thermo Fisher); 2: Đối chứng âm; 3: Đối chứng dương; 4 - 10: Các mẫu bệnh phẩm) Trong nghiên cứu, 270 BN trong vụ bùng phát dịch dengue năm 2017 đến khám tại Khoa Cấp cứu, Bệnh viện Quân y 103 được chẩn đoán lâm sàng sốt xuất huyết. Kết quả cho thấy 149 BN có IgM hoặc NS1 dương tính được lựa chọn để phân tích PCR nhằm xác định tỷ lệ nhiễm DENV cũng như xác định týp DENV. Kết quả PCR dương tính ở 111/149 (74,5%) trường hợp. Hình ảnh PCR định týp DENV với các băng đều sáng, đậm nét và không có sản phẩm phụ. Trong số 111 BN có kết quả dương tính với PCR định týp DENV, tỷ lệ nhiễm týp DENV1 và týp DENV2 lần lượt là 69/111 (62,2%) và 42/111 (37,8%). Không trường hợp nào nhiễm týp DENV3 và týp DENV4 cũng như đồng nhiễm týp DENV1 và týp DENV2. Phân bố và lưu hành của týp DENV trong T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2019 40 nghiên cứu này khác biệt so với nghiên cứu của Đặng Thị Thúy trong vụ dịch DENV xảy ra năm 2011 - 2012 khi có cả 4 týp DENV lưu hành gây bệnh, trong đó týp DENV2 chiếm ưu thế (64,4%), tiếp theo là týp DENV1 (25,4%), týp DENV3 và DENV4 (mỗi týp chiếm 3,4%), đồng nhiễm giữa DENV1 VÀ DENV2 gặp 2 trường hợp (3,4%) [1]. Bảng 2: Phân bố týp DENV theo tuổi và giới. Chỉ tiêu Số ca nhiễm DENV Tỷ lệ (%) p DENV 1 69 62,2 Týp DENV (n = 111) DENV 2 42 37,8 0,013 nam 47 42,3 Giới (n = 111) nữ 64 57,7 0,128 < 20 17 15,9 20 - 29 40 37,4 30 - 39 24 22,4 Tuổi* (n = 107) > 40 26 24,3 0,015 (*n = 107 do có 4 giá trị bị lỗi về tuổi khi thu thập số liệu) Đi sâu phân tích tỷ lệ BN nhiễm DENV1 với DENV2 cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p = 0,013). Tuy nhiên, không có sự khác biệt về tỷ lệ nhiễm DENV giữa nam và nữ (p = 0,128). So sánh tỷ lệ nhiễm DENV theo nhóm tuổi khác nhau giữa các týp DENV với tỷ lệ nhiễm DENV thấy cao nhất ở nhóm 20 - 29 tuổi (p = 0,015). Bảng 3: Phân bố các týp DENV theo khu vực địa lý. Khu vực DENV1 DENV2 Tỷ lệ chung (%) Đống Đa 0 1 1 0,90 Ứng Hòa 1 0 1 0,90 Phú Xuyên 1 0 1 0,90 Thường Tín 0 1 1 0,90 Hoàng Mai 0 2 2 1,80 Từ Liêm 2 0 2 1,80 Chương Mỹ 0 3 3 2,70 Thanh Xuân 2 2 4 3,60 Hoài Đức 4 2 6 5,41 Thanh Oai 6 2 8 7,21 Thanh Trì 5 4 9 8,11 Hà Nội Hà Đông 38 20 58 52,25 Tỉnh khác* 9 6 15 13,51 Tổng 68 43 111 100 (*: Bao gồm Thái Bình, Thanh Hóa, Nam Định, Nghệ An, Ninh Bình, Bình Phước) T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2019 41 Tiếp tục khảo sát phân bố các týp DENV theo khu vực địa lý trên địa bàn Thành phố Hà Nội cho thấy Quận Hà Đông có tỷ lệ nhiễm DENV cao nhất (58/111 BN = 52,25%), trong đó 38/58 BN (65,52%) nhiễm DENV1 và 20/58 BN (34,48%) nhiễm DENV2. Tỷ lệ nhiễm DENV cao ở khu vực Hà Đông có thể giải thích đây là quận có tốc độ đô thị hóa cao, mật độ dân cư đông đúc là khu vực thu dung điều trị của Bệnh viện Quân y 103. Ngoài ra chúng tôi gặp 15/111 BN (13,51%) đến từ các tỉnh khác như Thái Bình, Nam Định, Ninh Bình, Nghệ An, Thanh Hóa, Bình Phước. Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với các báo cáo trước đây về tỷ lệ nhiễm cao ở các quận nội thành của Hà Nội và lưu hành các týp DENV trong vụ dịch xảy ra năm 2008 [7] và 2011 [1]. Nhiều nghiên cứu chỉ ra dịch SD/SXHD xảy ra tại Hà Nội với chu kỳ 2 - 3 năm có xu hướng ngày càng lan rộng với sự lưu hành của týp DENV1 và DENV2 chiếm ưu thế. Các týp DENV3 và DENV4 cũng xuất hiện, tuy nhiên týp DENV không chiếm ưu thế như các vụ dịch bùng phát ở những tỉnh thành khác như Hải Phòng năm 2013 [2] và TP. Huế năm 2014 [8]. Bảng 4: Phân bố các týp theo chỉ số xét nghiệm cận lâm sàng. Týp DENV Thông số DENV 1 (n = 69) DENV 2 (n = 42) Tổng (n = 111) p < 4 T/l 25 (22,50%) 17 (15,30%) 42 (37,80%) Hồng cầu ≥ 4 T/l 44 (40,00%) 25 (22,50%) 69 (62,50%) 0,65 < 4,5 G/l 40 (36,04%) 15 (13,51%) 55 (49,55%) Bạch cầu ≥ 4,5 G/l 29 (26,13%) 27 (24,32%) 56 (50,45%) 0,02 < 100 G/l 14 (12,61%) 6 (5,41%) 20 (18,02%) Tiểu cầu ≥ 100 G/l 55 (49,55%) 36 (32,43%) 91 (81,98%) 0,42 IgM (+), NS1 (-) 4 (3,6%) 2 (1,8%) 6 (5,4%) 0,81 NS1 (+), IgM (-) 43 (38,74%) 29 (26,13%) 72 (64,87%) 0,47 IgM (+) và NS1 (+) 22 (19,82%) 11 (9,91%) 33 (29,73%) 0,52 Phân tích mối liên quan giữa phân bố týp DENV với các chỉ số xét nghiệm cận lâm sàng theo hướng dẫn của WHO và những nghiên cứu công bố gần đây [9, 10]. Kết quả phân tích cho thấy không khác biệt có ý nghĩa về tình trạng giảm số lượng hồng cầu và tiểu cầu. Tuy nhiên, khác biệt có ý nghĩa giữa giảm số lượng bạch cầu với phân bố týp DENV1 và DENV2 (p = 0,02). Nghiên cứu gần đây của Trần Thanh Hải và CS cho thấy giảm số lượng bạch cầu, tiểu cầu trung bình khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa BN nhiễm DENV2 và DENV1 [2]. Nghiên cứu của các tác giả khác trên thế giới như Chee-Fu Yung ở Singapore cho thấy BN T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2019 42 nhiễm DENV2 có số lượng tiểu cầu trung bình thấp hơn BN nhiễm DENV1 (114 G/l so với 128 G/l; p < 0,01), trong khi đó không có sự khác biệt về giảm số lượng bạch cầu giữa nhóm BN nhiễm các týp DENV khác nhau [11]. Kết quả nghiên cứu của Jeyanthi Suppiah gần đây ở Malaysia chỉ ra BN nhiễm DENV2 có số lượng bạch cầu và tiểu cầu trung bình thấp hơn so với BN nhiễm DENV1 và DENV3, tuy nhiên khác biệt không có ý nghĩa thống kê [12]. KẾT LUẬN Nghiên cứu phân bố và lưu hành các týp DENV ở BN đến khám tại Khoa Cấp cứu, Bệnh viện Quân y 103 năm 2017 cho thấy chỉ phát hiện týp DENV1 và DENV2, trong đó týp DENV1 chiếm ưu thế (62,2% so với 37,8%). Xác định đặc điểm dịch tễ và phân bố týp DENV giúp công tác dự báo, giám sát và kiểm soát dịch DENV xảy ra trong những năm tiếp theo ở Việt Nam. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Đặng Thị Thúy; Bùi Vũ Huy; Nguyễn Văn Kính. Đặc điểm dịch tễ các týp dengue gây bệnh trong giai đoạn 8/2011 - 7/2012. Tạp chí Nghiên cứu Y học. 2013, 83 (3), tr.138-143. 2. Trần Thanh Hải. Mối tương quan giữa đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng với týp và nồng độ virut Dengue trong sốt xuất huyết dengue trẻ em. Tạp chí Y học Dự phòng. 2017, 27 (11), tr.232-240. 3. Le Viet T et al. A dengue outbreak on a floating village at Cat Ba Island in Vietnam. BMC public health. 2015, 15 (1), p.940. 4. Guzman M.G et al. Dengue infection. Nature Reviews Disease Primers. 2016, 2, p.16055. 5. Thai K.T et al. Clinical, epidemiological and virological features of Dengue virus infections in Vietnamese patients presenting to primary care facilities with acute undifferentiated fever. Journal of Infection. 2010, 60 (3), pp.229-237. 6. Lanciotti R.S et al. Rapid detection and typing of Dengue viruses from clinical samples by using reverse transcriptase- polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology. 1992, 30 (3): pp.545-551. 7. Fox A et al. Immunological and viral determinants of dengue severity in hospitalized adults in Hanoi, Vietnam. PLoS Neglected Tropical Diseases. 2011, 5 (3), p.e967. 8. Lee H.S et al. Seasonal patterns of dengue fever and associated climate factors in 4 provinces in Vietnam from 1994 to 2013. BMC Infectious Diseases. 2017, 17 (1), p.218. 9. Rocha B.A et al. Dengue-specific serotype related to clinical severity during the 2012 - 2013 epidemic in centre of Brazil. Infectious Diseases of Poverty. 2017, 6 (1), p.116. 10. Organization W.H. Comprehensive guideline for prevention and control of dengue and dengue haemorrhagic fever. 2011. 11. Yung C.F et al. Dengue serotype- specific differences in clinical manifestation, laboratory parameters and risk of severe disease in adults, Singapore. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 2015, 92 (5), pp.999-1005. 12. Suppiah J et al. Clinical manifestations of dengue in relation to dengue serotype and genotype in Malaysia: A retrospective observational study. PLoS Neglected Tropical Diseases. 2018, 12 (9), p.e0006817.