Nghiên cứu nuôi cấy rễ cây bán tự mốc (hemigraphis glaucescens c. b. clarke) làm nguồn nguyên liệu thu nhận betuline - Quách Ngô Diễm Phương

TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 145-151 145 NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY RỄ CÂY BÁN TỰ MỐC (Hemigraphis glaucescens C. B. Clarke) LÀM NGUỒN NGUYÊN LIỆU THU NHẬN BETULINE Quách Ngô Diễm Phương*, Vũ Thị Bạch Phượng, Giống Hối Khoánh, Trần Ngọc Trung, Bùi Văn Lệ Trường Đại học Khoa học tự nhiên, tp. Hồ Chí Minh, *qndphuong@hcmus.edu.vn TÓM TẮT: Bán tự mốc (Hemigraphis glaucescens), một loài cây có hình thái tương tự như hoàn ngọc đỏ (Pseuderanthemum bacteatum), có dược tính do mang chất betuline và đang được sử dụng như một bài thuốc dân gian khá phổ biến và hữu hiệu trong điều trị cao huyết áp nhưng chưa có công bố khoa học nào về thành phần hóa học cũng như dược tính. Nghiên cứu này đã chứng minh so với hoàn ngọc đỏ, bán tự mốc cũng có hoạt tính kháng oxi hóa và mang cùng dược chất betuline. Nghiên cứu của chúng tôi chủ yếu tập trung sàng lọc và tìm ra nguồn nguyên liệu có hoạt tính kháng oxi hóa từ cây bán tự mốc, từ đó ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy in vitro nhằm thu nhận nguồn nguyên liệu này một cách chủ động. Bằng cách sử dụng phương pháp thử năng lực khử Yen & Duh và phương pháp đánh bắt gốc tự do DPPH, phân đoạn ethanol rễ được xác định có hoạt tính kháng oxi hóa mạnh nhất trong các phân đoạn cao có độ phân cực khác nhau từ các bộ phân khác nhau của bán tự mốc. Để tạo nguồn rễ in vitro, chúng tôi đã sử dụng phương pháp tạo rễ bất định bằng auxin và tạo rễ tơ bằng phương pháp chuyển gen tự nhiên nhờ Agrobacterium rhizogenesATCC 15834. Với 2 phương pháp này, rễ cây bán tự mốc có thể được tạo thành một cách chủ động chỉ sau 10 ngày nuôi cấy. Từ khóa: Hemigraphis glaucescens, Pseuderanthemum bacteatum, chống oxi hóa, rễ bất định, rễ tơ. MỞ ĐẦU Theo kinh nghiệm dân gian, phần trên mặt đất của cây bán tự mốc thường được dùng chữa viêm đại tràng cấp và mạn tính, rối loạn tiêu hóa, đau bụng co thắt, đầy chướng bụng, trĩ nội chảy máu, đại tiện ra máu, chảy máu do chấn thương; có nơi dùng chữa viêm loét dạ dày, hoặc chữa bệnh cao huyết áp. Lá cây bán tự mốc có thể dùng tươi, hoặc phơi khô sắc với nước, hoặc dùng đắp vết thương giúp vết thương mau lành [7]. Tuy nhiên, hiệu quả chữa bệnh của cây này chưa có luận cứ khoa học nào cụ thể. Betuline (C30H50O2) là một hợp chất triterpen có nhiều giá trị dược liệu quý, đang được quan tâm hiện nay: chống viêm, chống virus, chống ung thư [4]. Hiện nay, betuline được phân lập từ vỏ cây bạch dương, cây hoàn ngọc đỏ và chiếm khoảng 30% trọng lượng khô [2, 3]. Betuline có thể dễ dàng chuyển đổi thành acid betulinic (nhóm rượu được thay thế bởi một nhóm acid carboxylic) [1], có hoạt tính sinh học hoạt động mạnh hơn so với betuline. Acid betulinic có khả năng chữa bệnh tương tự như betuline: có tác dụng chống lại một số khối u ác tính, một số dạng herpes và thậm chí AIDS [5]; chống viêm, chống HIV, chống sốt rét cũng như có khả năng gây độc đối với một số dòng tế bào ung thư [6]. Vì vậy, nghiên cứu này thực hiện nhằm chứng minh hoạt tính kháng oxi hóa và sự hiện diện của betuline trong rễ cây bán tự mốc, đồng thời nghiên cứu nuôi cấy in vitro rễ nhằm hướng đến việc thu nhận nguồn vật liệu sản xuất betuline một cách chủ động trong tương lai. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa của các bộ phận khác nhau trong các hệ dung môi khác nhau từ cây bán tự mốc Điều chế cao: cây tươi được chia làm ba phần rễ, thân, lá (kg) đem sấy khô ở 50oC đến khối lượng không đổi, xay nhuyễn tạo bột (g). Lần lượt ngâm dầm bột cây với các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: diethy eter, chloroform, etanol, nước ở nhiệt độ phòng; lọc sau 48 giờ. Phương pháp cô quay chân không được dùng để tạo cao đối với các dung môi diethyl eter, chloroform và ethanol. Đối với dung môi nước, cao được tạo bằng phương pháp đông khô. Quach Ngo Diem Phương et al. 146 Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa bằng phương pháp thử năng lực khử Yen & Duh: hút 1 ml (nồng độ 0,5 mg/ml) chất thử nghiệm; 2,5 ml dung dịch đệm sodium phosphate 0,2M pH 6,6; 2,5 ml dung dịch potassium ferricyanide 1%; ổn định ở 20oC sau 20 phút; thêm 2,5 ml acid tricloroacetic 10%; ly tâm 2.000 vòng/phút trong 10 phút; thu dịch nổi; hút 1ml dịch nổi qua ống nghiệm khác; thêm 2 ml nước cất và 0,5 ml dung dịch FeCl3 1%; lắc đều rồi để yên sau 5 phút; đo ở bước sóng 700 nm. Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa bằng phương pháp đánh bắt gốc tự do DPPH: bảy loại cao có kết quả tốt nhất từ phương pháp Yen & Duh được đem xác định giá trị IC50 bằng phương pháp đánh bắt gốc tự do DPPH. Pha dung dịch DPPH có nồng độ 0,6 mM trong ethanol bằng cách hòa tan 4,728 mg với 20 ml dung dịch methanol. Mỗi phân đoạn cao được pha thành các nồng độ: 500; 250; 125; 62,5; 31,25 µg/ml. Thực hiện phản ứng cho các nồng độ đã pha như sau: ethanol (3 ml), dịch thử (0,5 ml), dung dịch DPPH (0,5 ml); lắc hỗn hợp trong 15 giây; sau đó ủ hỗn hợp trong tối ở nhiệt độ phòng 30 phút và đo mật độ quang ở bước sóng 516 nm. Hoạt tính kháng oxi hóa (%) được tính theo công thức sau: (HTCO%) = [(ODchứng - ODthử)/ODchứng]. Từ đồ thị biễu diễn sự tương quan giữa HTCO% và nồng độ các mẫu, giá trị IC50 sẽ được xác định. Chứng minh sự hiện diện của betuline trong cây bán tự mốc Các mẫu cao ethanol của thân, lá, rễ của bán tự mốc được gửi đi phân tích sự hiện diện và xác định hàm lượng betuline bằng HPLC-UV tại phòng thí nghiệm Phân tích trung tâm, trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh. Nuôi cấy rễ in vitro cây bán tự mốc nhằm thu nhận nguồn nguyên liệu in vitro chủ động trong sản xuất betuline Nguồn mẫu: cây bán tự mốc được thu hái tại quận Tân Phú, tp. Hồ Chí Minh; chủng vi khuẩn A. rhizogenes ATCC 15834, được mua từ tổ chức RIKEN-PRC thông qua dự án của Mext, Nhật Bản. Môi trường sử dụng: Murrashige và Skoog (MS), bổ sung đường (30g/l), pH 5,8 dùng nuôi cấy thực vật và môi trường Nutrient Broth (NB) dùng tăng sinh vi khuẩn A. rhizogenes ATCC 15834. Điều kiện nuôi cấy: chiếu sáng 16 giờ/ngày; với cường độ chiếu sáng 3.000 lux; nhiệt độ phòng nuôi cấy: 22-25oC; ẩm độ trung bình: 70%. Khử trùng tạo nguồn mẫu in vitro Quy trình khử trùng chồi bên cây bán tự mốc gồm rửa xà phòng, lắc với acid benzoid 0,3% trong 45 phút, rửa lại bằng nước cất. Chuyển mẫu vào tủ cấy vô trùng, lắc với cồn 70% trong 1 phút, rửa bằng nước cất vô trùng; lắc mẫu trong dung dịch javen: nước (1:2) có bổ sung tweens 20 trong 15 phút, rửa lại bằng nước cất vô trùng. Mẫu được cấy vào môi trường MS để tạo nguồn nguyên liệu in vitro ban đầu. Khảo sát sự tạo rễ bất định do cảm ứng của các loại hormon khác nhau Các mẫu lớp mỏng khác nhau của cây (rễ, thân, lá) được cấy trên các môi trường có bổ sung các loại hormone thực vật khác nhau: (1) MS; (2) MS+0,5 mg/l NAA; (3) MS+0,5 mg/l BA; (4) MS+0,5 mg/l Kinetin; (5) MS+0,5 mg/l 2,4D. Sau 5 tuần nuôi cấy, theo dõi tỷ lệ mẫu tạo rễ (%), và chiều dài rễ (cm) trong từng công thức. Khảo sát sự tạo rễ tơ bằng A. rhizogenes ATCC 15834 Chủng A. rhizogenes ATCC 15834 hoạt hóa trong 48 giờ trên môi trường NB ở 25-28oC dùng xâm nhiễm lên mô thực vật. Cắt và tạo vết thương ở các bộ phận của cây rồi ngâm trong dịch khuẩn 30 phút. Chuyển mẫu vào môi trường MS, sau 5-7 ngày, khi khuẩn lạc phát triển, rửa mẫu với kháng sinh cefotaxime 200 mg/l, chuyển mẫu vào môi trường MS mới. Sau 5 tuần, theo dõi tỷ lệ tạo rễ (%), chiều dài rễ (cm). Khảo sát điều kiện tăng trưởng của rễ Dựng đường cong tăng trưởng của rễ và so sánh hiệu quả của bước nuôi chuyển tiếp sang môi trường lỏng trước khi nuôi cấy rễ độc lập: 0,5 g rễ cây con in vitro mỗi loại (rễ lỏng, rễ agar) được nuôi lỏng lắc trong 6 erlen 100 ml chứa 50 ml môi trường MS trong điều kiện 180 vòng/phút, ở 25-28oC, trọng lượng tươi và trọng TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 145-151 147 lượng khô của rễ được xác định sau mỗi 6 ngày, trong vòng 30 ngày. Khảo sát thành phần môi trường thích hợp: 0,5 g rễ cây con in vitro được nuôi lỏng lắc (100 vòng/phút, 25-28oC) trong erlen 100 ml chứa 50 ml với các môi trường: MS, B5, SH. Sau 3 tuần, ghi nhận sự tăng trưởng của rễ qua sự chênh lệch khối lượng Δ(g). KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa của các bộ phận của cây trong các hệ dung môi khác nhau Sau khi hút ẩm và sấy khô các loại cao đến khối lượng không đổi, so sánh với khối lượng khô ban đầu, thu được kết quả cao nước với phương pháp đông khô có hiệu suất cao nhất. Riêng đối với phương pháp cô quay chân không, ở bộ phận rễ dung môi ethanol có hiệu suất tạo cao tốt nhất, ở bộ phận thân và lá dung môi chloroform có hiệu suất tạo cao tốt nhất (bảng 1). Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa bằng phương pháp thử năng lực khử theo Yen & Duh Kết quả định tính khả năng kháng oxi hóa của các loại cao được trình bày trong bảng 2. Từ phương pháp của Yen & Duh, chúng tôi sàng lọc được bảy loại cao có kết quả kháng oxi hóa tốt nhất, đó là cao R2, R3, R4, T1, T2, T3 và T4, trong đó, cao ethanol rễ (R3) có kết quả tốt nhất. Bảng 1. Hiệu suất các loại cao từ các bộ phận rễ, thân, lá Khối lượng cao (g) Hiệu suất cao (%) Dung môi Rễ khô (270g) Thân khô (500g) Lá khô (600g) Rễ Thân Lá Diethyl eter 0,7379 2,7832 1,8855 0,2733 0,5566 0,3143 Chloroform 0,9336 3,8900 11,3502 0,3458 0,7780 1,8917 Etanol 2,3377 2,3741 1,6181 0,8658 0,4748 0,2697 Nước 26,9416 55,1300 39,1506 9,9784 11,0260 6,5251 Bảng 2. Tính khử của các loại cao theo phương pháp Yen & Duh (1993) Dung dịch đo ABS ± SE Chứng dương Vit E 1,507±0,07353 Bộ phận của cây Chứng âm ĐC 0,595±0,05231 Cao diethyl eter R1 0,679±0,12929 Cao chloroform R2 0,966±0,14757 Cao ethanol R3 1,968±0,22379 Rễ Cao nước R4 0,919±0,10303 Cao diethyl eter T1 0,696±0,10930 Cao chloroform T2 0,825±0,15060 Cao ethanol T3 1,324±0,19654 Thân Cao nước T4 0,823±0,24229 Cao diethyl eter L1 0,642±0,15829 Cao chloroform L2 0,631±0,13949 Cao ethanol L3 0,673±0,10468 Lá Cao nước L4 0,624±0,04814 Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa bằng phương pháp đánh bắt gốc tự do DPPH Gía trị IC50 của bảy loại cao có kết quả tốt nhất ở phương pháp Yen & Duh được xác định Quach Ngo Diem Phương et al. 148 bằng phương pháp DPPH theo hình 1. Cao ethanol rễ có hoạt tính kháng oxi hóa cao nhất với IC50=75 µg/ml, cao ethanol thân (T3) cũng có hoạt tính kháng oxi hóa ở mức cao với giá trị IC50=97 µg/ml. Tính kháng oxi hóa theo phương pháp DPPH của bảy loại cao xếp theo thứ tự giảm dần như sau: R3>T3>R2>R4> T4>T2>T1. Như vậy, rễ là bộ phận có hoạt tính kháng oxi hóa tốt nhất trong cây bán tự mốc và ethanol là dung môi thích hợp để có thể tách chiết các hoạt chất có hoạt tính cao từ rễ. Hình 1. Biểu đồ thể hiện giá trị IC50 (µg/ml) của bảy phân đoạn cao Chứng minh sự hiện diện của betuline Các mẫu cao ethanol rễ, thân, lá sau khi phân tích HPLC cho kết quả định lượng như ở hình 2. Kết quả ở bảng 3 cho thấy, rõ ràng các bộ phận của cây bán tự mốc đều có sự hiện diện của betuline, trong đó, mẫu rễ có chứa hàm lượng betuline cao nhất. Bảng 3. Kết quả định lượng betuline bằng phương pháp HPLC-UV Tên mẫu Kết quả phân tích (µg/g) Lá 13,4 Thân 7,0 Rễ 59,3 Nuôi cấy rễ in vitro nhằm thu nhận nguồn nguyên liệu in vitro chủ động trong sản xuất betuline Khảo sát sự tạo rễ bất định do cảm ứng của các loại hormone khác nhau Kết quả cảm ứng tạo rễ bằng hormone thực vật từ các bộ phận khác nhau (rễ, thân, lá) của cây bán tự mốc in vitro được trình bày trong hình 3 và 4. Trong đó, rễ bất định chỉ được cảm ứng tạo thành trên môi trường MS bổ sung NAA 0,5 mg/l. Hình 2. Sắc kí đồ của A: betuline 20 ppm; B: mẫu lá; C: mẫu thân; D: mẫu rễ Hình 3. Đồ thị chiều dài rễ bất định trên môi trường MS+0,5mg/l NAA sau 5 tuần Sau 5 tuần nuôi cấy, rễ bất định từ thân và lá phát triển dài hơn rễ bất định từ rễ, do đó, để tạo rễ bất định bằng cảm ứng hormone thực vật, chúng tôi đề xuất bộ phân thích hợp là thân hay lá, và hormone thích hợp là NAA. Khảo sát sự tạo rễ tơ bằng A. rhizogenes ATCC 15834 Sau 10 ngày nuôi cấy, kết quả cho thấy rõ hiệu quả tác động tạo rễ của A. rhizogenes ATCC 15834 lên mẫu cắt ngang (lá, thân, rễ) có tạo vết thương: xuất hiện rễ trên công thức có bổ sung A. rhizogenes, trong khi công thức đối chứng A B C D TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 145-151 149 không có (hình 5). Khả năng phát triển của rễ (chiều dài rễ) được cảm ứng bởi A. rhizogenes ATCC 15834 sau đó được ghi nhận sau 5 tuần tiếp theo được trình bày ở hình 6. Hình 4. Mẫu sau 10 ngày nuôi cấy: A: MS; B:MS+0,5 mg/l NAA; C: MS+0,5mg/l Kinetin; D:MS+0,5 mg/l 2,4D; E: MS+0,5 mg/l 2,4D; F: Rễ trên môi trường B (5 tuần) Hình 5. A. Mẫu không nhiễm A. rhizogenes; B. Mẫu có nhiễm A. Rhizogenes Hình 6. Đồ thị thể hiện chiều dài của rễ sau 5 tuần nuôi cấy từ các bộ phận được nhiễm A. rhizogenes Để chứng minh sự hiện diện của gen chuyển trong gennome của rễ được tạo thành nhờ A. rhizogenes ATCC 15834, phản ứng PCR nhằm khuếch đại trình tự gen đặc trưng của A. rhizogenes ATCC 15834 hiện diện trong gennome của rễ tạo thành đã được tiến hành, kết quả được trình bày trong hình 7. Hình 7. Sản phẩm PCR A. cặp mồi rolBF-rolBR; B. cặp mồi rolCF-rolCR; 1. Thang; 2. Rễ invitro đối chứng; 3. Rễ invitro chuyển gen. Kết quả PCR cho thấy sự hiện diện của đoạn gen rolB (422bp) và rolC (625bp) của A. rhizogenes ATCC 15834 trong genome của rễ tạo thành. Như vậy, A. rhizogenes ATCC 15834 đã cảm ứng tạo được rễ tơ từ mẫu cây bán tự mốc. Khảo sát điều kiện tăng trưởng của nguồn rễ độc lập Vẽ đường cong tăng trưởng của rễ và so sánh hiệu quả của bước nuôi chuyển tiếp sang môi trường lỏng trước khi nuôi cấy rễ độc lập ở điều kiện lỏng-lắc (hình 8). Kết quả cho thấy, rễ tăng trưởng đều đặn và đạt trọng lượng tối đa sau 18 ngày nuôi cấy, sau đó trọng lượng giảm dần vì lúc này rễ bắt đầu tổng hợp và sản sinh hợp chất thứ cấp, làm nồng độ áp suất thẩm thấu trong môi trường tăng cao, cản trở hấp thu chất dinh dưỡng, dẫn đến tăng trưởng giảm. Hình 8. Đường cong tăng trưởng rễ lỏng Hình 9. Đường cong tăng trưởng rễ agar A B 600bp B 400bp A 1cm 1cm 1cm 1cm 1cm 1cm A B C D E F Quach Ngo Diem Phương et al. 150 Kết quả dựng đường cong tăng trưởng rễ agar được trình bày ở hình 9. Rễ của cây con được nuôi từ môi trường agar (rễ agar), khi chuyển qua môi trường lỏng-lắc, do chưa thích nghi được nên rễ bị sốc, hóa nâu và chết dần (hình 10). Kết quả cho thấy đã thành công việc trong nuôi cấy lỏng lắc rễ cây bán tự mốc, trong đó bước chuyển sang nuôi lỏng trước nuôi cấy lỏng-lắc là phù hợp, điều kiện nuôi này giúp khẳng định hướng thu nhận nguồn rễ có thể được ứng dụng ở quy mô công nghiệp sau này. Hình 10. Sự khác biệt giữa rễ lỏng (A) và rễ agar (B) khi nuôi lỏng-lắc sau 1 tuần Khảo sát thành phần môi trường thích hợp Kết quả tăng trưởng rễ được thể hiện qua sự chênh lệch khối lượng Δ(g) (hình 11). Mỗi loài thực vật có sự hấp thu khác nhau về thành phần môi trường. Trong thí nghiệm này, có thể thấy khi nuôi cấy trên môi trường SH, rễ có sự tăng trưởng cao hơn. Hình 11. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của các loại môi trường lên sự tăng trưởng rễ KẾT LUẬN Rễ cây bán tự mốc có hoạt tính kháng oxi hóa khá mạnh (IC50 = 75 µg/ml), nó cũng chính là nguồn vật liệu mang betuline cao nhất của cây. Nguồn rễ cây bán tự mốc bất định có thể thu được một cách chủ động bằng cách nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l NAA. Rễ tơ cũng có thể được tạo thành bằng phương pháp chuyển gen tự nhiên nhờ A. rhizogenes ATCC 15834. Nguồn rễ độc lập này hoàn toàn có thể nuôi cấy lỏng lắc với bước chuyển nuôi cấy lỏng trước đó và bằng môi trường SH nhằm hướng đến thu nhận sinh khối rễ ở quy mô sản xuất công nghiệp. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Csuk R., Schmuck K., Schäfer R., 2006. A practical synthesis of betulinic acid. Tetrahedron letters, 47(49): 8769-8770. 2. Gao Y., Xu H., Lu Z., Xu Z., 2009. Quantitative determination of steroids in the fruiting bodies and submerged-cultured mycelia of Inonotus obliquus. Se pu= Chinese Journal of Chromatography/ Zhongguo hua xue hui, 27(6): 745. 3. Green B., Bentley M. D., Chung B. Y., Lynch N. G., Jensen B. L., 2007. Isolation of betulin and rearrangement to allobetulin. A biomimetic natural product synthesis. Journal of Chemical Education, 84(12): 1985. 4. Hiroya K., Takahashi T., Miura N., Naganuma A., Sakamoto T., 2002. Synthesis of betulin derivatives and their protective effects against the cytotoxicity of cadmium. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 10(10): 3229-3236. 5. Kim D. S. H. L., Pezzuto J. M., Pisha E., 1998. Synthesis of betulinic acid derivatives with activity against human melanoma. A B 1cm 1cm K hố i l ượ ng ( g) Môi trường TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 145-151 151 Bioorganic & Medicinal Chemistry letters, 8(13): 1707-1712. 6. Wolfgang W., Grimmel C., Wagenknecht B., Dichgans J., Weller M., 1999. Betulinic acid-induced apoptosis in glioma cells: A sequential requirement for new protein synthesis, formation of reactive oxygen species, and caspase processing. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 289(3): 1306-1312. A STUDY ON ROOT CULTURES OF Hemigraphis glaucescens C. B. Clarke FOR BETULINE PRODUCTION Quach Ngo Diem Phuong, Vu Thi Bach Phuong, Giong Hoi Khoanh, Tran Ngoc Trung, Bui Van Le University of Sicence, Ho Chi Minh City SUMMARY Up to now, there has not been any scientific publication related to chemistry and pharmaceutical value of Hemigraphis glaucescens C. B. Clarke. However, they have been used as a popular and effective therapy for hypertensive patients like Pseuderanthemum bracteatum, which has been posted in many publications to include medicinal properties of betuline. This research demonstrated that Hemigraphis glaucescens also contains betuline, the same substance in Pseuderanthemum bracteatum. Besides, it focused on screening and finding out antioxidant extract fraction of Hermigraphis glaucescens; accordingly, we can apply in vitro culture technique on getting antioxidant materials actively. In details, by using Ferric cyanine reducing antioxidant power (Yen and Duh) and free radicals scavenging (DPPH) assay, we elucidated that ethanol fraction of root Hermigraphis glaucescens was the best. Adventitious roots were formed by using 0.5 mg/l NAA and hairy roots were also formed by co-culturing with Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 after 10 days. Keywords: Agrobacterium rhizogenes, Hemigraphis glaucescens, betuline, hairy root culture. Ngày nhận bài: 15-7-2013