Nghiên cứu nhận dạng phân tử một số nguồn gen vải địa phương bằng chỉ thị scot

14 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 4(77)/2017 I. ĐẶT VẤN ĐỀ Cây vải có tên khoa học là Litchi chinensis Sonn, thuộc học bồ hòn Sapindaceae, bộ bồ hòn Sapindales. Với hơn 1600 loài, vải là cây trồng nhiệt đới và á nhiệt đới trên 20 quốc gia có giá trị kinh tế cao. Hiện nay, Việt Nam đứng thứ 3 về sản lượng xuất khẩu vải trên thế giới, sau Trung Quốc và Ấn Độ (AgroData, 2014). Theo phương pháp truyền thống việc phân biệt các giống dựa vào các tính trạng nông học như đặc tính quả, mùa thu hoạch (Batten, 1984), nhưng những tính trạng này thường bị giới hạn bởi ảnh hưởng của môi trường, hơn nữa thường rất khó để phân biệt giữa các giống có quan hệ gần gũi. Những hạn chế này có thể được khắc phục bằng cách sử dụng các chỉ thị phân tử lập tiêu bản ADN để so sánh các giống với nhau. Một thế hệ chỉ thị mới được phát triển đó là chỉ thị ScoT dựa trên vùng trình tự bảo thủ ngắn nằm xung quanh codon bắt đầu dịch mã ATG của gen (Collard, Mackill, 2009; Wu, 2013). Thế hệ chỉ thị mới này đã được phát triển khá rộng rãi tại nhiều phòng thí nghiệm khác nhau trên thế giới, đối với nhiều loại cây trồng khác nhau như lúa (Collard and Mackill, 2009), lạc (Xiong et al., 2010), nhãn (Chen et al., 2010), bưởi (Han et al., 2011), nho (Zhang et al., 2011), hoa mẫu đơn (Hou et al., 2011), hồng (Deng et al., 2012) Trong nghiên cứu này đã sử dụng chỉ thị phân tử ScoT để nghiên cứu lập tiêu bản ADN cho một số nguồn gen vải Việt Nam. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu - Nguồn gen: 14 giống vải được lưu giữ tại Viện Nghiên cứu Rau Quả và Viện KHKT Nông Lâm nghiệp miền núi phía Bắc. - Chỉ thị: 46 chỉ thị ScoT (Collard and Mackill 2009; Wu, Li et al., 2013) là thế hệ chỉ thị mới dựa trên vùng trình tự bảo thủ ngắn gồm 18-20 nucleotid nằm xung quanh codon bắt đầu dịch mã ATG của gen cũng được sử dụng trong nghiên cứu nhằm đánh giá đa dạng di truyền và xây dựng tiêu bản ADN của 14 giống vải bản địa. 1 Viện Di truyền Nông nghiệp; 2 Trung tâm Tài nguyên thực vật 3 Bộ Nông nghiệp và PTNT NGHIÊN CỨU NHẬN DẠNG PHÂN TỬ MỘT SỐ NGUỒN GEN VẢI ĐỊA PHƯƠNG BẰNG CHỈ THỊ ScoT Nguyễn Thị Ngọc Lan1, Nguyễn Thị Lan Hoa2, Nguyễn Thị Thanh Thủy3 TÓM TẮT Nghiên cứu thiết lập tiêu bản ADN của tập đoàn 14 giống vải đia phương, 46 chỉ thị ScoT đã được lựa chọn cho nghiên cứu đa hình giữa các mẫu giống vải. Hai mươi hai trên tổng số 46 chỉ thị ScoT cho alen đa hình giữa các giống nghiên cứu, với tổng cộng 178 alen đã được thu nhận, nội dung thông tin đa hình (PIC) trong khoảng 0,2149 đến 0,3750; hệ số đa dạng về gen (gen diversity) dao động trong khoảng 0,1327 đến 0,5000 và các mẫu giống trong nghiên cứu được phân thành 2 nhóm chính. Trong các tiêu bản chỉ thị ScoT thu được, 9 tiêu bản khuếch đại được 12 alen hiếm giúp nhận dạng được 8 nguồn gen vải khác nhau. Các kết quả thu được có ý nghĩa trong công tác nhận dạng mẫu giống phục vụ công tác bảo tồn cũng như chọn tạo giống vải ở Việt Nam. Từ khóa: Cây vải, tiêu bản ADN, chỉ thị ScoT, đa dạng di truyền Bảng 1. Danh sách 14 giống vải bản địa trong nghiên cứu Ghi chú: * NHG: Ngân hàng gen Việt Nam (GBVN) Tên giống Ký hiệu Mã NHG* Tên giống Ký hiệu Mã NHG* Sớm Hùng Long L1 ML 1.104 Yên Hưng chín sớm L8 ML 1.98  Thiều Thanh Hà L2 ML 1.89 Yên Phú L9 ML 1.99  Thạch Bình L3 ML 1.91 U hồng lá vặn L10 ML 2.0  Phú Động Chua chín sớm L4 ML 1.93 Nguyên Hồng L11 ML 1.122 Lục Ngạn 2 chính vụ L5 ML 1.96  Xuân Đỉnh L12 ML 1.95 Lục Ngạn 1 chín sớm L6 ML 1.97  Hoài Chi L13 ML 1.116 Bình Khê chín sớm L7 ML 1.121 Thiều Khải xuân L14 ML 1.94 15 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 4(77)/2017 2.2. Phương pháp nghiên cứu ADN lá non của các giống vải được tách chiết và tinh sạch theo phương pháp CTAB (Doyle, 1987). Phản ứng PCR với mồi ScoT được thực hiện với thành phần:10x buffer, 25mM dNTPs, 10µM mồi, 0,5unit Taq và 25ng ADN tổng số; thể tích phản ứng PCR là 20µl; ở điều kiện nhiệt: biến tính ở 94oC trong 4 phút, 1 chu trình: 94oC trong 1 phút, 38oC trong 1 phút, 72oC trong 2 phút, 10 chu trình; 50oC trong 1 phút, 72oC trong 2 phút, 25 chu trình; tổng hợp tiếp ở 72oC trong 10 phút, bảo quản tại 16oC. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5% trong đệm TBE, nhuộm bằng EtBr và được soi dưới đèn UV. Xử lý số liệu: số liệu phân tích ScoT bằng phần mềm Power Marker v3.25 (Liu & Muse, 2005), sơ đồ hình cây biểu diễn quan hệ di truyền giữa các mẫu giống nghiên cứu được xây dựng dựa trên tương đồng di truyền (Nei 1972), theo phương pháp UPGMA. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Trên tổng số 46 chỉ thị được sử dụng, 22 chỉ thị cho đa hình ở các mẫu giống. Tổng số 178 alen đã được phát hiện trên tổng số 22 locut, đạt trung bình 8,09 alen/locut. Như vậy, với 22 chỉ thị ScoT cho đa hình và rõ nét, 22 tiêu bản ADN của bộ 14 mẫu giống vải của Việt Nam đối với từng vị trí ScoT đã được thiết lập. Bảng 2. Tổng số alen xuất hiện trong từng chỉ thị ScoT Trong tổng số 178 alen thu được từ 22 locut, nhận thấy tại locut ScoT2, ScoT12, ScoT17, ScoT24, ScoT27, ScoT33, ScoT34, ScoT38, ScoT39 xuất hiện các alen khác biệt giúp nhận dạng lần lượt các nguồn gen vải sớm Hùng Long, thiều Thanh Hà, Phú Đông chua chín sớm, Lục Ngạn 2 chính vụ (Hình 1), Lục Ngạn 1 chín sớm (Hình 2), Yên Phú (Hình 1), Hoài Chi (Hình 2) và thiều Khải Xuân (Bảng 3). Hình 1. Tiêu bản của 14 giống vải bằng chỉ thị ScoT27 và ScoT33 Giống vải Lục Ngạn 2 chính vụ - L5 và giống vải Yên Phú - L9 được nhận dạng bởi 1 alen hiếm bằng chỉ thị ScoT27 và ScoT 33 Chỉ thị Số alen Mẫu có alen hiếm Chỉ thị Số alen Mẫu có alen hiếm ScoT2 7 L4 ScoT21 6 ScoT6 4 ScoT23 5 ScoT7 7 ScoT24 9 L2 ScoT9 5 ScoT27 8 L5 ScoT11 7 ScoT28 7 ScoT12 9 L1 ScoT33 12 L9 ScoT13 7 ScoT34 14 L6, L13 ScoT14 4 ScoT35 8 ScoT15 7 ScoT38 11 L14 ScoT17 12 L9, L14 ScoT39 8 L1 ScoT20 9 ScoT40 12 Hình 2. Tiêu bản của 14 giống vải bằng chỉ thị ScoT34 Giống Vải Lục Ngạn 1 chín sớm - L6 và vải Hoài Chi - L13 được nhận dạng bởi 2 alen hiếm khác nhau bằng chỉ thị ScoT34 Đặc biệt, có ba nguồn gen vải được nhận biết bởi 2 locut ScoT: Vải sớm Hùng Long, Yên Phú và Thiều Khải xuân (Bảng 3). So sánh alen giữa 14 giống vải trong tập đoàn nghiên cứu, locut SCoT 34 cho nhiều alen nhất đạt 14 alen, và ScoT6 khuếch đại được ít nhất đạt 4 alen. Trong đó, ScoT 34 khuếch đại được 2 alen khác biệt giúp nhận dạng hai nguồn gen Vải Lục Ngạn 1 chín sớm và Vải Hoài Chi. Đặc biệt, hai nguồn gen Vải Lục Ngạn 1 chín sớm (L6) và Vải Lục Ngạn chính vụ (L5) được phân biệt rõ ràng về kiểu gen tại 2 locut 3000 1500 1000 750 3000 1500 1000 750 Scot33 3000 1500 1000 750 16 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 4(77)/2017 ScoT 34 và ScoT 27. Hai alen khác biệt được khuếch đại tại locut ScoT 34 và ScoT27 giúp nhận dạng lần lượt nguồn gen Vải Lục Ngạn 1 chín sớm (L6) và Vải Lục Ngạn 2 chính vụ (L5) (Hình 1, 2). Do chỉ thị ScoT chỉ khuếch đại những vị trí xung quanh vùng trình tự mã hóa của các gen, nên những alen khác biệt giữa hai locut giữa hai giống vải này có thể có ý nghĩa trong nghiên cứu kiểu gen về đặc tính chín sớm của nguồn gen Vải Lục Ngạn. Bảng 3. Các nguồn gen được nhận biết bởi các alen hiếm tại các locut ScoT Quan hệ di truyền giữa các giống vải được phân tích UPGMA bằng phần mềm Power Marker (v.3.25). Các giống vải trong nghiên cứu được chia thành 2 nhóm lớn. Tương đồng di truyền giữa từng cặp giống biến động từ 0,1113 (Vải Nguyên Hồng/ Vải Hoài Chi) đến 0,5007 (Vải Thiều Thanh Hà/Phú Động chua chín sớm). Sơ đồ hình cây giữa các giống nghiên cứu (Hình 3) cho thấy hầu như không có phân biệt theo nhóm địa lý được xác lập. Tuy nhiên, những nguồn gen có cùng xuất xứ có quan hệ di truyền được phân bố rất gần nhau như Vải Lục Ngạn 1 và 2, với tương đồng di truyền là 0,25. Dựa vào hệ số tương đồng di truyền và cây phân loại, 14 giống vải địa phương nghiên cứu là hoàn toàn khác biệt về mặt di truyền. Hình 3. Sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền của 14 giống vải trong nghiên cứu TT Ký hiệu Tên giống Chỉ thị 1 L1 Vải sớm Hùng Long ScoT12; ScoT39 2 L2 Vải Thiều Thanh Hà ScoT24 3 L4 Vải Phú Động Chua chín sớm ScoT2 4 L5 Vải Lục Ngạn 2 chính vụ ScoT27 5 L6 Vải Lục Ngạn 1 chín sớm ScoT34 6 L9 Vải Yên Phú ScoT17; ScoT33 7 L13 Vải Hoài Chi ScoT34 8 L14 Vải Thiều Khải xuân ScoT17, ScoT38 Bảng 4. Thông số đa dạng di truyền của các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu Marker Tần số alen chính Đa dạng gen Mức dị hợp PIC Marker Tần số alen chính Đa dạng gen Mức dị hợp PIC ScoT2 0.6429 0.4592 0.0000 0.3538 ScoT21 0.8571 0.2449 0.0000 0.2149 ScoT6 0.7857 0.3367 0.0000 0.2800 ScoT24 0.9286 0.1327 0.0000 0.1239 ScoT7 0.6429 0.4592 0.0000 0.3538 ScoT27 0.7857 0.3367 0.0000 0.2800 ScoT9 0.5714 0.4898 0.0000 0.3698 ScoT28 0.8571 0.2449 0.0000 0.2149 ScoT11 0.5714 0.4898 0.0000 0.3698 ScoT33 0.8571 0.2449 0.0000 0.2149 ScoT12 0.7857 0.3367 0.0000 0.2800 ScoT34 0.7857 0.3367 0.0000 0.2800 ScoT13 0.7143 0.4082 0.0000 0.3249 ScoT35 0.7143 0.4082 0.0000 0.3249 ScoT14 1.0000 0.0000 0.0000 0.0000 ScoT38 0.8571 0.2449 0.0000 0.2149 ScoT15 0.5714 0.4898 0.0000 0.3698 ScoT39 0.8571 0.2449 0.0000 0.2149 ScoT17 0.8571 0.2449 0.0000 0.2149 ScoT40 0.5000 0.5000 0.0000 0.3750 IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Tổng số 22 tiêu bản SCoT đã được thiết lập cho 14 giống vải địa phương với 178 alen đa hình. Trong đó, 9 tiêu bản ScoT cho 12 alen hiếm giúp nhận dạng được 8 nguồn gen vải Việt Nam. Các alen hiếm ScoT