Nghiên cứu nấm neocosmospora vasinfecta smith gây hại lạc (arachis hypogaea l) tại Nghệ An

Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai 935 NGHIÊN CỨU NẤM Neocosmospora vasinfecta Smith GÂY HẠI LẠC (Arachis hypogaea L) TẠI NGHỆ AN Thị Vinh1, Trần Ngọc Lân2 1 Chi cục Trồng trọt & BVTV Nghệ An 2 Viện Nghiên cứu và Phát triển Vùng I. ĐẶT VẤN ĐỀ Lạc (Arachis hypogaea L) là cây công nghiệp cho dầu ngắn ngày hàng đầu ở Việt Nam. Lạc là một trong 10 loại cây trồng chính, có giá trị kinh tế cao ở Nghệ An, phù hợp với các vùng đất cát ven biển, đất phù sa ven sông và đất đồi. Hàng năm tỉnh Nghệ An gieo trồng khoảng trên 25.000 ha lạc (vụ xuân, vụ hè thu và vụ đông) với sản lượng khoảng 48.000 tấn Việt Nam nói chung và Nghệ An nói riêng có khí hậu nóng ẩm là điều kiện thuận lợi cho dịch hại cây trồng phát sinh phát triển, đặc biệt là các loài nấm bệnh có nguồn gốc từ đất. Trong những năm gần đây, sự gia tăng về diện tích trồng lạc và việc áp dụng các biện pháp kỹ thuật thâm canh đã làm phát sinh ngày càng nhiều dịch hại nguy hiểm. Gần đây tại Nghệ An ghi nhận thêm loài nấm bệnh mới gây hại trên lạc với các triệu chứng đặc trưng là thân và gốc rễ có màu đen thối. Cấy lên môi trường PDA nấm hình thành nhiều quả thể màu cam. Cùng thời điểm đó nấm bệnh cũng được tìm thấy ở Thừa Thiên Huế, quả thể nấm hình thành ngay trên vết bệnh ở ngoài đồng ruộng. Mẫu nấm thuần ở Nghệ An đã được gửi đến Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) và đã được xác định có tên khoa học là Neocosmospora vasinfecta Smith (Dau.T.V et al 2010). Năm 2007, loài nấm này xuất hiện gây bệnh với tỷ lệ cao trên cây lạc, đậu tương, đậu xanh ở nhiều vùng của một số nước trong khu vực châu Á, như là một loài nấm bệnh mới có nguy cơ gây dịch hại nghiêm trọng cho cây trồng cạn, nhất là cây lạc (Fuhlbohm M.F et al., 2007). Để giảm thiểu tác hại của nấm bệnh và nâng cao năng suất lạc, cần phải có những nghiên cứu cụ thể nhằm xác định đâu là nguyên nhân chính gây thiệt hại đến năng suất, trên cơ sở nghiên cứu tìm ra biện pháp phòng trừ hữu hiệu để nâng cao năng suất lạc, góp một phần vào việc đẩy mạnh sản xuất lạc ở Nghệ An và Việt Nam. Bài báo này trình bày kết quả về đặc điểm sinh học của nấm, quá trình phân lập mẫu bệnh, lây bệnh nhân tạo và tái phân lập lại tác nhân lây nhiễm ban đầu tại Nghệ An. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Mẫu bệnh được thu thập tại các ruộng lạc thuộc huyện Nghi Lộc, Diễn Châu thời kỳ phân cành, ra hoa. * Các vật liệu nghiên cứu trong phòng: - Môi trường nuôi cấy: + Môi trường PDA: Khoai tây (250g), Đường Glucose (20g), Agar (20g), Nước cất (1.000ml). + Môi trường CLA: Agar (20gr), Lá cẩm chướng sấy khô, cắt nhỏ (2x2cm), Nước cất (1.000ml) + Môi trường WA có kháng sinh: Agar (20gr), Nước cất (1000ml), Steptomycin sulfate (1.0g/L) và Neomycin sulfate (0,12g/L). - Các trang thiết bị và dụng cụ: Tủ sấy dụng cụ, buồng cấy, nồi hấp khử trùng, kính hiển vi quang học, kính lúp soi nổi, dụng cụ nuôi cấy nấm. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp xác định tác nhân gây bệnh được tiến hành theo phương pháp Koch's Postulates: theo 4 bước Bước 1. Mô tả triệu chứng và nhận dạng chi tiết. Ví dụ: Triệu chứng héo vàng, thối thân, rễ, còi cọc... Bước 2. Phân lập tác nhân gây bệnh và thông qua đó mô tả và giám định. Bước 3. Lây bệnh nhân tạo tác nhân gây bệnh lên cây khỏe, quan sát triệu chứng bệnh biểu hiện so với mô tả ban đầu. VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 936 Bước 4. Tái phân lập tác nhân lây nhiễm ban đầu. 2.2.2. Phương pháp phân lập mẫu bệnh - Phương pháp phân lập dựa theo Burgess và cộng sự. (2009): Đoạn thân được cắt ra từ thân cây bệnh bao gồm có cả phần mô bệnh và mô khỏe, được rửa sạch dưới vòi nước máy, sau đó rửa sạch bằng nước vô trùng, khử trùng bề mặt bằng cồn 70% trong 5 giây, rửa sạch lại bằng nước vô trùng và để khô trên giấy thấm vô trùng. Một phân miếng mẫu nhỏ được cắt ra từ đoạn mẫu đã được vô trùng ranh giữa ranh giới mô bệnh và mô khỏe và cấy lên môi trường WA có các chất kháng sinh và để ở nhiệt độ phòng. Tản nấm mọc ra từ đoạn mẫu cấy được cấy chuyền lên môi trường lá cây hoa cẩm chướng (CLA), nuôi trong điều kiện phòng (250C) trước khi làm thuần bằng cách cắt đỉnh sinh trưởng và cấy lên môi trường PDA. - Phương pháp cấy đơn bào tử dựa theo Trần Nguyễn Hà và cộng sự 2005: Bào tử từ ổ bào tử bằng que cấy nấm, hòa bào tử vào ống nghiệm chứa 10 mL nước cất vô trùng, lắc đều tay sau đó đổ dung dịch bào tử vào đĩa môi trường WA và lắc nhẹ cho dịch tràn đều trên toàn bộ bề mặt môi trường. Đặt đĩa môi trường nghiêng khoảng 30-400 cho ráo nước trong điều kiện tối khoảng 18-20 giờ, quan sát dưới kính lúp điện để tìm bào tử nảy mầm, dùng que cấy nấm sắc, dẹt cắt xung quanh bào tử và chuyển miếng môi trường có bào tử sang môi trường PDA 2.2.3. Phương pháp lây bệnh nhân tạo a) Lây bệnh trực tiếp lên cây ký chủ: Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo với cây lạc thời kỳ phân cành dựa trên kỹ thuật lây nhiễm vào thân được mô tả bởi Đậu Thị Vinh và cộng sự năm 2008: Cây lạc được trồng trong nhà lưới. Một mảnh của tản nấm được các định là Neocosmospora vasinfecta được nuối cấy trên môi trường PDA sau 7 ngày. Các thân cây được tạo vết thương, cắt một miếng thạch từ viền của tản nấm khoảng 5x5mm, áp lên vết thương đã tạo dọc theo thân cây khoảng 2mm. Dùng Parafilm quấn chặt miếng thạch với vết thương. Sử dụng các cây ở ô thí nghiệm khác làm đối chứng và tiến hành tương tự như tạo vết thương, dùng miếng thạch từ PDA không có nấm bệnh áp vào vết thương và quấn chặt Parafilm. Các cây thí nghiệm được chăm sóc dưới ánh sáng mặt trời, nhiệt độ hàng ngày trong khoảng 20-280C. Triệu chứng bệnh điển hình như trên đồng ruộng đã xuất hiện tại điểm cắt tạo vết thương của các cây thí nghiệm với Neocosmospora vasinfecta sau 20 ngày trên tất cả các cây đã lây nhiễm (Hình 2). Các cây làm đối chứng không xuất hiện triêu chứng bệnh. Nấm Neocosmospora vasinfecta đã được phân lập từ cây làm thí nghiệm tại vị trí cách vết thương 5cm, hoàn thành quy tắc Koch’s. b) Phương pháp lây bệnh qua đất: Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo qua đất cũng được thực hiện dựa trên kỹ thuật lây nhiễm vào thân được mô tả bởi Đậu Thị Vinh và cộng sự năm 2008: Hạt kê và vỏ trấu được ngâm trong nước và để qua đêm trong tủ lạnh, chắt bỏ phần nước, cho 150ml giá thể vào một bình thủy tinh dung tích 250ml, cuộn thật chặt một nút bông gòn, bọc ngoài bằng vải màn để nút chặt miệng bình. Dùng giấy nhôm phủ lên miệng bình và hấp khử trùng, sau đó cấy các miếng thạch có sợi nấm vào giá thể, chú ý để nút bình vẫn trong điều kiện vô trùng, thao tác này được thực hiện trong buồng cấy. Lắc bình tam giác 2-3 ngày sau khi cấy để đảm bảo nguồn bệnh được phân bố đều trong giá thể. Nấm nhân nuôi trong bình tam giác khoảng 15 ngày, lấy ra trộn vào đất vào bốn phía của cây. Thí nghiệm được tiến hành trong nhà lưới (Hình 2). III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Triệu chứng bệnh trên đồng ruộng Đối với nấm Neocosmospora vasinfecta gây bệnh trên cây lạc, triệu chứng bệnh thường quan sát rõ nét và điển hình nhất vào thời kỳ cây lạc ra hoa, phát triển tia quả. Ban đầu gốc thân có những vết màu nâu sau đó đen dần, cây héo vàng, bệnh nặng cây sẽ bị thối chết. Triệu chứng bệnh ở bộ phận dưới mặt đất: Hệ thống rễ cây phát triển chậm. Ban đầu các chóp rễ bị biến màu có màu nâu nhạt rồi chuyển sang màu nâu đen, rễ chính bị thối, vỏ rễ bị thối tạo thành một lớp hoại tử màu đen. Bộ rễ bị hư hỏng nặng và không cung cấp đủ nước, lá cây bị biến vàng và cuối cùng chết toàn bộ cây. Khi chẻ dọc thân và rễ chính cây lạc, vết bệnh trong thân hóa màu nân đen, khô Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai 937 ráo, ranh giới giữa mô bệnh và mô khoẻ rõ ràng. Trên lớp hoại tử của vết bệnh và trong phần đất xung quanh cây bệnh thỉnh thoảng bắt gặp quả thể nấm màu đỏ cam. 3.2. Đặc điểm hình thái (Đặc điểm sợi nấm, tản nấm, bào tử) Bảng 1: Kết quả giám định nấm Neocosmospora vasinfecta gây bệnh thối thân, rễ cây lạc TT Chỉ tiêu Đặc điểm 1 Sợi nấm (Hyphea) Sợi nấm mọc thẳng, mọc nhanh trên môi trường PDA, ít phân nhánh, màu trắng xốp. 2 Tản nấm (Colony) Trên môi trường PDA tản nấm có màu trắng nhạt, bông và hình thành nhiều quả thể 3 Bào tử túi (Ascospores Hình cầu đến elip, thành mỏng, trong suốt. 4 Bào tử phân sinh (Conidia) Kích thước nhỏ, hình trụ đến hình chữ nhật, elip, trong suốt, được xếp thành cụm ở đỉnh đầu của cành bào tử phân sinh 5 Túi bào tử (Asci) Hình trụ, thuôn, mỏng. Bên trong chứa 8 bào tử được sắp xếp riêng lẻ. 6 Quả thể (Perithecia) Có màu đỏ đến da cam, bên ngoài nhẵn, có hình cầu hơi elip được mọc ra từ cành bào tử phân sinh. Bên trong chứa nhiều túi bào tử. Ghi chú: Kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái nấm Neocosmospora vasinfecta Smith của chúng tôi tương ứng với mô tả của Cannon và Hawksworth (1988). a b c d Hình 1: Đặc điểm hình thái nấm N. vassinfecta (a) quả thể (b) tản nấm (c) quả thể hình thành trên lá cẩm chướng (d) túi bào tử Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai 938 3.3. Kết quả lây bệnh nhân tạo Chúng tôi tiến hành thí nghiệm lây bệnh nhân tạo cho cây lạc bằng nguồn nấm đã được phân lập và nhân trên môi trường PDA. Đồng thời tìm hiểu ảnh hưởng của phương pháp lây khác nhau đến khả năng nhiễm nấm Neocosmospora vassinfecta Smith trên cây lạc. Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo bằng nguồn nấm Neocosmospora vassinfecta Smith đã phân lập từ mẫu cây bị nhiễm nặng bệnh thối gốc do nấm N.vassinfecta theo 2 phương pháp khác nhau, theo dõi khả năng tiềm dục và biểu hiện triệu chứng của bệnh sau lây nhiễm. a b c d e Hình 2: Kết quả lây bệnh nhân tạo nấm N. vassinfecta (a) Tạo vết thương ở thân; (b) Cây bệnh sau lây nhiễm vào thân (c) Nhân sinh khối nấm; (d) Cây bệnh sau lây nhiễm vào đất (e) Quả thể nấm hình thành trên cây bệnh 938 VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai 939 Bảng 2: Kết quả lây bệnh nhân tạo nấm N. vassinfecta trên cây lạc TT Phương pháp lây Cây TN (P) Mức độ nhiễm bệnh 10 ngày 15 ngày 20 ngày 1 Lây nhiễm nguồn bệnh vào gốc thân P1 - + +++ P2 - + ++ P3 - + + P4 - - ++ P5 - + ++ P6 - + +++ P7 - + ++ P8 - + ++ P9 - - + P10 - + + 2 Lây nguồn bệnh vào đất P1 - - - P2 - - ++ P3 - - - P4 - - + P5 - - - P6 - - - P7 - - ++ P8 - - + P9 - - - P10 - - + 4 Đối chứng 10 cây - - - Ký hiệu: (- ) Không biểu hiện bệnh (+) Cây ốm yếu, bộ lá biến vàng (++) Bộ lá vàng úa, gốc thân có màu nâu đen (+++) Bộ rễ và gốc thối mục, cây chết Qua kết quả thí nghiệm trên cho thấy với thời gian ủ bệnh từ 15 đến 20 ngày, cây lạc được lây nhiễm xuất hiện triệu chứng giống ngoài đồng ruộng. Tuy nhiên số cây thể hiện triệu chứng ở 2 phương pháp có sự khác nhau, phương pháp cắt vào thân có tỷ lệ nhiễm bệnh cao hơn (100%) sau 20 ngày lây nhiễm và thời gian tiềm dục ngắn hơn. Chỉ sau 15 ngày hầu hết các cây đã có biểu hiện bệnh. Còn sử dụng nguồn nấm nhân trên hạt kê trộn vào đất cho tỷ lệ nhiễm bệnh thấp hơn (50%) sau 20 ngày lây nhiễm và thời gian tiềm dục dài hơn (20 ngày). Sau khi cây bị nhiễm bệnh do lây bệnh nhân tạo, các mẫu tái phân lập trở lại, kết quả cũng thu được nguồn nấm Neocosmospora vasinfecta Smith ban đầu. IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận - Việc hoàn thành Quy tắc Koch's Postulates đã khẳng định nấm Neocosmospora vasinfecta Smith gây bệnh thối thân rễ cây lạc. 4.2. Đề nghị - Tiếp tục nghiên cứu riêng lẻ về quy luật phát sinh, mức độ gây hại của nấm Neocosmospora vasinfecta Smith để làm rõ vai trò của nấm bệnh trong phức hợp bệnh thối thân rễ cây lạc. - Cần đi sâu nghiên cứu để xác định phổ ký chủ của nấm Neocosmospora vasinfecta Smith tại Việt Nam. - Đề xuất đưa nấm bệnh Neocosmospora vasinfecta Smith vào danh mục bệnh hại cây lạc ở Việt Nam. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Burgess Lester W., Timothy E. Knight, Len Tesoriero, Phan Thúy Hiền (2009), Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam. ACIAR. VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 940 2. Trần Nguyễn Hà, Nguyễn Kim Vân, Ngô Bích Hảo, Đặng Lưu Hoa (2005), Nấm bệnh hại cây trồng, đặc điểm sinh học và phương pháp nghiên cứu. 3. Dau V. T., L.T. Pham, T. M. Luong, L. M. T. Huynh, N. T. Tran, T. D. Ho, H. M. T. Hoang, H. T. Phan, L. W. Burgess (2010), First report of Neocosmospora vasinfecta associated with the root rot complex of peanuts in Vietnam. 4. Dau V.T, Tran VC, Pham TL, Phan TH, D.LH and Burgess LW (2008), Stem and root rot of Telosma cordata caused by Phytophthora palmivora in Vietnam - a newly recognised disease. 5. Fuhlbohm M.F., J.R. Tatnell, M.J. Ryley (2007), Neocosmospora vasinfecta is pathogenic on peanut in Queensland. Australasian Plant Disease Notes. 6. Cannon & Hawksworth 1988, Against Soil- borne Fungi. Journal of Phytopathology. ABSTRACT Study on Neocosmospora vasinfecta Smith root and stem rot of Peanut (Arachis hypogaea L) in Nghe An Dau Thi Vinh1; Tran Ngoc Lan2 1Nghean Plant Protection and Cultivation sub Department 2 Institute of Regional Research and Development The occurrence of Neocosmospora vasinfecta Smith is reported for the first time from Vietnam where it was found in association with peanut roots affected by root rot. The pathogen was isolated from diseased roots from peanut crops in Nghe An Province in March 2007 but perithecia were not observed on the diseased roots. However, characteristic perithecia were produced abundantly in pure cultures on potato dextrose agar and canation leaf-piece agar. Subsequenly, perithecia were observed on diseased peanut roots in Thua Thien Hue Province. Representative cultures from Nghe An were confirmed as Neocosmospora vasinfecta by the Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS). The former culture proved pathogenic in stem inoculations and soil inoculations. Neocosmospora vasinfecta was reisolated fulfilling Koch’s postulates Keywords: Neocosmospora vasinfecta, Arachis hypogaea L, First report, perithecia, pathogenicity Người phản biện: TS. Nguyễn Văn Tuất