Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly hàm lượng polysaccharide toàn phần trong nấm linh chi đỏ

Nguyễn Văn Bình và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 180(04): 3 - 8 3 NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH TRÍCH LY HÀM LƯỢNG POLYSACCHARIDE TOÀN PHẦN TRONG NẤM LINH CHI ĐỎ Nguyễn Văn Bình*, Phạm Thị Phương, Nguyễn Tá Lợi Trường Đại học Nông Lâm - ĐH Thái Nguyên TÓM TẮT Nấm Linh chi đã tồn tại ở Trung Quốc và Nhật Bản từ hàng ngàn năm nay, là loại dược liệu quý từ thiên nhiên đã được sử dụng từ hàng ngàn năm nay trong bồi bổ sức khỏe và hỗ trợ chữa bệnh. Nấm Linh chi được nghiên cứu nhiều nhất do chúng có chứa các chất có hoạt chất sinh học. Nấm Linh chi có chứa nhiều hợp chất quý trong đó phải kể đến nhóm hợp chất polysaccharide có tác dụng chống ung thư, giảm đường trong máu, ngăn ngừa thoái hóa tế bào, thiết lập hệ thống miễn dịch, giải độc cơ thể. Thành phần chủ yếu có trong nhóm hợp chất polysaccharide gồm hầu hết là beta glucan. Nghiên cứu được thực hiện trên cơ sở khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly hàm lượng polysaccharide trong nấm Linh chi gồm kích thước nguyên liệu, thời gian trích ly, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi trong đó dung môi trích ly là nước, nhiệt độ trích ly 90oC. Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng polysaccharide trong nấm Linh chi thu được là 1,1% so với tổng khối lượng nguyên liệu, kích thước nguyên liệu là 0,4 cm, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/20, thời gian trích ly là 5 giờ cho hàm lượng polysaccharide là 0,92% và hiệu suất trích ly đạt 83,64%. Quá trình trích ly hợp chất polysaccharide toàn phần được thực hiện bằng phương pháp trích ly sử dụng dung môi nước nóng ở áp suất thường. Từ khóa: Dịch chiết, hiệu suất trích ly, nấm Linh chi đỏ, polysaccharide, trích ly ĐẶT VẤN ĐỀ* Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) từ lâu được coi là thảo dược quý có nhiều tác dụng cho sức khỏe [2]. Hiện nay, trên thế giới và Việt Nam nấm Linh chi có nhiều loại như nấm Linh chi xanh, nấm Linh chi đỏ, nấm Linh chi vàng, nấm Linh chi trắng, nấm Linh chi tím, nấm Linh chi đen. Tuy nhiên, Nấm Linh chi đỏ có chứa nhiều thành phần quý, cung cấp một lượng lớn các chất có hoạt tính sinh học như polysaccharide, triterpenoid, steroid, saponin [3], [4], [6]. Trong đó hoạt chất polysaccharide được xem là nhóm chất quan trọng có tác dụng chống ung thu, giảm đường trong máu, ngăn ngừa thoái hóa tế bào, thiết lập hệ thống miễn dịch, giải độc cơ thể [5], [7], [8]. Việc trích ly các hoạt chất trong nấm Linh chi đỏ phụ thuộc vào nhiều yếu tố như dung môi, nhiệt độ trích ly, thời gian trích ly, tỷ lệ nguyên liệu và dung môi, phương pháp trích ly, Để trích ly hàm * Tel: 0977 966445, Email: Binhnguyen313@gmail.com lượng polysaccharide cho hiệu suất cao và an toàn ứng dụng trong thực phẩm, dược phẩm thì dung môi nước được xem là tốt nhất vì nước không độc, không dễ cháy, giá thành rẻ. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu Nấm Linh chi đỏ do Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên cung cấp. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp bố trí thí nghiệm Xác định thành phần của nấm Linh chi đỏ Nấm Linh chi đỏ được cắt nhỏ 0,2 cm được đưa đi sấy ở nhiệt độ 60oC đến khi độ ẩm đạt 6 - 8%, tiến hành nghiền nhỏ, sau đó cân 10 g mẫu gói vào giấy lọc và cho vào cột chiết, tiến hành chiết bằng dung môi ethanol ở 85 o C. Dịch chiết được cô chân không đến 10 ml, phân tích thành phần polysaccharide toàn phần từ dịch cô đặc. Xác định ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu Nấm Linh chi đỏ cắt nhỏ theo kích thước 0,2 cm; 0,4 cm; 0,6 cm tiến hành sấy ở nhiệt độ Nguyễn Văn Bình và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 180(04): 3 - 8 4 60 oC đến độ ẩm 6 - 8%. Cân 10 g mẫu tiến hành trích ly ở điều kiện dung môi là nước; tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/15; thời gian trích ly là 4 giờ; nhiệt độ trích ly 90oC. Dịch trích ly đem lọc chân không 3 lần, sau đó tiến hành cô đặc chân không đến 10 ml. Dịch cô đặc được phân tích hàm lượng polysaccharide toàn phần. Dựa vào hàm lượng polysaccharide xác định được kích thước nguyên liệu thích hợp cho hiệu suất trích ly cao nhất. Xác định ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi Nấm Linh chi đỏ được cắt nhỏ theo kích thước từ kết quả thí nghiệm trước; tiến hành sấy ở nhiệt độ 60oC đến độ ẩm 6-8%. Cân 10 g mẫu tiến hành trích ly ở điều kiện dung môi là nước; thời gian trích ly là 4 giờ; nhiệt độ trích ly 90 oC; tỷ lệ nguyên liệu/dung môi được thay đổi lần lượt là 1/10, 1/15, 1/20, 1/25. Dịch trích ly được đem lọc chân không 3 lần, sau đó tiến hành cô đặc chân không đến 10 ml. Dịch cô đặc được phân tích hàm lượng polysaccharide toàn phần. Dựa vào hàm lượng polysaccharide xác định được tỷ lệ nguyên liệu/dung môi thích hợp cho hiệu suất trích ly cao nhất. Xác định ảnh hưởng của thời gian trích ly Nấm Linh chi đỏ được cắt nhỏ theo kích thước từ kết quả thí nghiệm trước; tiến hành sấy ở nhiệt độ 60oC đến độ ẩm 6-8%. Cân 10 g mẫu đưa đi trích ly ở điều kiện dung môi là nước; nhiệt độ trích ly 90oC; tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi được chọn từ thí nghiệm trước; thời gian trích ly được thay đổi lần lượt là 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ. Dịch trích ly đem lọc chân không 3 lần, sau đó tiến hành cô đặc chân không đến 10 ml. Dịch cô đặc được phân tích hàm lượng polysaccharide toàn phần. Dựa vào hàm lượng polysaccharide xác định được tỷ lệ nguyên liệu/dung môi thích hợp cho hiệu suất trích ly cao nhất. Xác định hàm lượng polysaccharide toàn phần bằng phenol – sunfuric [9] Xây dựng đường chuẩn Chuẩn bị mẫu chuẩn (D – Glucose): - Cân 0,25 g D–Glucose tinh khiết, hòa tan trong bình định mức 250 ml bằng nước cất được dung dịch D–Glucose nồng độ 1 mg/ml. Từ dung dịch D – Glucose gốc tiến hành pha dãy mẫu chuẩn cho quá trình phân tích có nồng độ lần lượt là 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200 µg/ml. Mỗi mẫu chuẩn lấy 4 ml vào ống nghiệm, mỗi ống thêm 4 ml dung dịch phenol 5% vào 20 ml dung dịch H2SO4 96%, lắc đều. Sau đó đặt các ống nghiệm vào cốc nước đun sôi cách thủy trong vòng 2 phút, rồi làm lạnh ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Lấy mẫu 100 µg/ml phân tích ở UV – VIS ở chế độ toàn dải, xác định được bước sóng dung dịch hấp thụ cực đại là 486 nm. Tiếp theo đo độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn ở bước sóng 486 nm rồi dựng đường chuẩn y = ax+b. Cách tiến hành Cân một lượng chính xác cao dịch chiết (thường trong khoảng 0,01 – 0,06 g với mỗi mẫu), đưa vào bình định mức 100 ml. Định mức đến vạch bằng nước. Lấy 4ml dung dịch cao cho vào ống nghiệm, thêm vào mỗi ống 4ml dung dịch phenol 5% và 20 ml dung dịch H2SO4 96% rồi lắc đều. Sau đó đặt các ống nghiệm được đun cách thủy trong cốc nước ở nhiệt độ sôi của nước trong 2 phút, để nguội ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Các mẫu được đem đi đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 486 nm. Công thức tính Hàm lượng polysaccharide toàn phần tính theo công thức sau: F(%) = Cx10 610 10  100% Trong đó: F: Là hàm lượng polysaccharide toàn phần tính theo glucose có trong mẫu (%) Cx: Là nồng độ polysaccharide toàn phần có trong mẫu tính theo glucose (µg/ml) Nguyễn Văn Bình và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 180(04): 3 - 8 5 h: Độ ẩm của nấm Linh chi (được xác định trên cân hàm ẩm là: 10,6%) m: Là khối lượng mẫu ban đầu (g) 10 10: Là độ pha loãng Phương pháp xử lý số liệu Số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS 20. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Thành phần hóa học của nấm Kết quả xác định thành phần hóa học của nấm Linh chi được trình bày ở bảng 1. Bảng 1. Thành phần hóa học của nấm Linh chi Thành phần Nước (%) Polysaccharide (%) Chất khô hòa tan ( o Bx) Hàm lượng 7,2 1,1 0,9 Theo tác giả G-Bing thì hàm lượng polysaccharide trong nấm Linh chi từ 1– 1,2%, hàm lượng polysaccharide trong nấm Linh chi khô không được ít hơn 0,5% và xem như tiêu chuẩn để đánh giá chất lượng dược liệu nấm Linh chi (theo Dược điển Trung Quốc 2005). Qua kết quả từ bảng 1 cho thấy nấm Linh chi đủ tiêu chuẩn để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo [1], [10]. Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hiệu suất trích ly polysaccharide Kích thước nguyên liệu là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly các chất trong nấm Linh chi. Bình thường các hợp chất được giữ trong tế bào, chúng rất khó được tách ra nếu không có tác động của các yếu tố bên ngoài. Việc cắt nhỏ nguyên liệu có tác dụng làm cho tế bào bị phá vỡ, từ đó giải phóng các chất, tạo điều kiện cho quá trình trích ly dễ dàng và triệt để hơn. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hiệu suất trích ly polysaccharide trong nấm Linh chi được thể hiện trong bảng 2. Từ kết quả nghiên cứu ở bảng 2 ta thấy kích thước của nguyên liệu càng lớn thì hàm lượng polysaccharide thu được càng thấp, nguyên liệu càng nhỏ thì hiệu suất trích ly, hàm lượng polysaccharide càng cao. Nguyên liệu có kích thước d = 0,2 cm cho hàm lượng polysaccharide cao nhất đạt giá trị 0,86%, hiệu suất trích ly của quá trình đạt 78,18%. Nguyên liệu ở kích thước 0,4 cm cho hàm lượng polysaccharide đứng thứ hai với giá trị 0,85%, hiệu suất trích ly của quá trình đạt 77,27%. Nguyên liệu ở kích thước d = 0,6 cm cho hiệu suất thấp nhất, hàm lượng polysaccharide chỉ đạt 0,83%, với hiệu suất trích ly đạt 75,45%, so với ở kích thước d = 0,2 cm thì hàm lượng polysaccharide thu được thấp hơn 0,03%. Ở kích thước lớn thì mức độ phá vỡ tế bào của nguyên liệu thấp, dẫn đến dung môi khó thấm sâu vào bên trong nguyên liệu làm cho hiệu quả trích ly thấp. Nguyên liệu có kích thước nhỏ dung môi dễ dàng thấm sâu vào trong tế bào nguyên liệu giúp giải phóng các chất hòa tan trong tế bào nguyên liệu ra ngoài, dẫn đến hiệu quả trích ly cao. Tuy nhiên dựa vào bảng 2 ta thấy rằng ở hàm lượng polysaccharide ở kích thước d = 0,2 cm và d = 0,4 cm hầu như không có sự chênh lệch và hiệu suất trích ly cũng không có sự chênh lệch. Vậy nên để tối ưu quá trình trích ly cũng như tiết kiệm thời gian và năng lượng để nghiền nhỏ nguyên liệu và dễ dàng hơn cho quá trình lọc dịch trích ly, chúng tôi lựa chọn nguyên liệu ở kích thước d = 0,4 cm cho các thí nghiệm sau. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hiệu suất trích ly polysaccharide Lượng dung môi nhiều hay ít đều ảnh hưởng tới quá trình chiết tách các hợp chất trong nguyên liệu. Nếu lượng dung môi quá ít thì chỉ đủ để thấm ướt nguyên liệu vì vậy hiệu suất trích ly sẽ thấp. Ngược lại, nếu lượng dung môi quá nhiều thì gây hao phí dung môi, nhiên liệu và các chi phí khác. Vì vậy việc tìm ra tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi là rất cần thiết cho quá trình trích ly. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi được thể hiện ở bảng 3 dưới đây. Nguyễn Văn Bình và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 180(04): 3 - 8 6 Bảng 2. Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hiệu suất trích ly polysaccharide Công thức Kích thước (cm) Hàm lượng polysacharide (%) Hiệu suất trích ly (%) CT1 0,2 0,86 a 78,18 CT2 0,4 0,85 a 77,27 CT3 0,6 0,83 b 75,45 Ghi chú: Trên cùng một cột các giá trị mang cùng số mũ thì khác nhau không có ý nghĩa ở mức ý nghĩa α = 0,05 Bảng 3. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hiệu suất trích ly polysaccharide Công thức Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi Hàm lượng polysacharide (%) Hiệu suất trích ly (%) CT1 1/10 0,83 c 75,45 CT2 1/15 0,85 b 78,45 CT3 1/20 0,88 a 80,00 CT4 1/25 0,89 a 80,91 Ghi chú: Trên cùng một cột các giá trị mang cùng số mũ thì khác nhau không có ý nghĩa ở mức ý nghĩa α = 0,05 Bảng 4. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất trích ly polysaccharide Công thức Thời gian (giờ) Hàm lượng polysaccharide (%) Hiệu suất trích ly (%) CT1 3 0,83 c 75,45 CT2 4 0,88 b 80,00 CT3 5 0,92 a 83,64 CT4 6 0,93 a 84,55 Ghi chú: Trên cùng một cột các giá trị mang cùng số mũ thì khác nhau không có ý nghĩa ở mức ý nghĩa α = 0,05 Bảng 3 cho thấy tỷ lệ nguyên liệu/dung môi càng nhỏ thì hàm lượng polysaccharide thu được càng lớn. Nguyên liệu được trích ly bằng dung môi là nước với tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi là 1/25 hàm lượng polysaccharide thu được cao nhất đạt 0,89%, hiệu suất trích ly là 80,91%. Tiếp đến là tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi là 1/20 cho hiệu suất đứng thứ 2 với hàm lượng polysaccharide thu được là 0,88%. Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/15 cho hiệu suất đứng thứ 3 với hàm lượng polysaccharide đạt 0,85%. Với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/10 hàm lượng polysaccharide thu được thấp nhất chỉ đạt 0,83%. Tuy nhiên ở giới hạn nhất định nếu tiếp tục tăng lượng dung môi vào quá trình trích ly hàm lượng polysaccharide thu được có tăng nhưng rất ít và không có sự khác biệt như CT3 và CT4. Khi sử dụng tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi là 1/25 sẽ gây tốn kém về kinh tế và khó khăn cho quá trình lọc về sau mà hàm lượng polysaccharide thu được rất nhỏ, không đáng kể do được trích ly gần như hoàn toàn với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/20. Để đảm bảo hiệu suất của quá trình trích ly cũng như tối thiểu các chi phí (nguyên liệu, năng lượng) chúng tôi lựa chọn ở tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/20 làm kết quả cho các thí nghiệm tiếp theo. Ảnh hưởng của thời gian trích ly tới hiệu suất trích lypolysaccharide Thời gian trích ly có ảnh hưởng mạnh mẽ tới hiệu quả trích ly và chi phí năng lượng. Nếu thời gian trích ly ngắn thì các hoạt chất giải phóng ra ít, nhưng khi thời gian trích ly dài thì lại làm hao tổn năng lượng, quá trình sản xuất kéo dài. Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát ở các mức thời gian sau 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ và 6 giờ ở cùng một điều kiện. Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 4. Kết quả bảng 4 cho thấy thời gian trích ly càng dài thì hàm lượng polysaccharde và hiệu suất trích ly càng cao. Tuy nhiên đến một thời gian trích ly nhất định thì lượng hoạt chất tăng lên rất chậm hoặc không tăng nữa. Khi trích ly ở thời gian 3 giờ thì hàm lượng Nguyễn Văn Bình và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 180(04): 3 - 8 7 polysaccharide thu được thấp, chỉ đạt 0,83%. Hàm lượng polysaccharide tăng nhanh khi trích ly ở thời gian 4 giờ, với hàm lượng polysaccharide thi được 0,88%, đạt hiệu suất trích ly 80%. Sau 5 giờ trích ly, lượng polysaccharide thu được là 0,92% đạt hiệu suất 83,64%, nếu tiếp tục trích ly trong 6 giờ thì hàm lượng polysaccharide có tăng nhưng không có sự chênh lệch so với trích ly ở 5 giờ. Do vậy nếu trích ly trong 6 giờ thì mất nhiều thời gian thực hiện và hiệu suất trích ly không khác nhiều so với trích ly ở 5 giờ. Do đó chúng tôi chọn thời gian trích ly là 5 giờ cho hàm lượng polysaccharide là 0,92% và hiệu suất trích ly đạt 83,64%. KẾT LUẬN Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng đến quá trình trích ly hàm lượng polysaccharide trong nấm Linh chi thu được như sau: Hàm lượng polysaccharide trong nấm Linh chi là 1,1% so tổng khối lượng nguyên liệu. Một số điều kiện trích ly thích hợp với dung môi nước lần lượt là kích thước nguyên liệu là 0,4 cm, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/20, thời gian trích ly 5 giờ. Với điều kiện trích ly trên hàm lượng polysaccharide thu được 0,92% và hiệu suất trích ly đạt 83,64%. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Vũ Duy Khánh (2009), Xây dựng quy trình sản xuất sinh khối sợi (Ganoderma lucidum), Trường Cao đẳng Kinh tế và Công nghệ TP.Hồ Chí Minh, tr. 6-7. 2. Đỗ Tất Lợi (1995), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 3. Bao X., Liu C., Fang J., Li X., (2001), “Structural and immunological studies of a major polysaccharide from spores of Ganoderma lucidum (Fr.) Karst”, Carbohydr Res., 332, pp. 67–74. 4. Bao X., Wang X., Dong Q., Fang J., Li X., (2002), “Structural features of immunologically active polysaccharides from Ganoderma lucidum”, Phytochemistry, 59, pp. 175–181. 5. Benzie I. F. F, Wachtel-Galor S., ( 2009), “Biomarkers of long-term vegetarian diets”, Adv. Clin. Chem., 47, pp.169–220. 6. Boh B., Berovic M., Zhang J., Zhi-Bin L., (2007), “Ganoderma lucidum and its pharmaceutically active compounds”, Biotechnol. Annu. Rev.,13, pp. 265–301 7. Borchers A. T., Stern J. S., Hackman R. M., Keen C. L., Gershwin M. E. (1999), “Minireview: Mushrooms, tumors and immunity”, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 221, pp. 281–293. 8. Cao L. Z, Lin Z. B, (2002), “Regulation on maturation and function of dendritic cells by Ganoderma lucidum polysaccharides”, Immunol Lett, 83, pp. 163–169. 9. Foster D. S. and Cornella T. S. (1961), Colorimetric Method of Analysis, Nostrand Company Inc New Jersey, 08, pp. 162 10. Pharmacopoeia of the People's Republic of China (2005), Chinese Pharmacopoeia Commission, Vol. 1, pp. 117-118. Nguyễn Văn Bình và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 180(04): 3 - 8 8 ABSTRACT STUDY ON THE FACTORS AFFECTING THE EXTRACTION OF POLYSACCHARIDE CONTENT FROM RED LINGZHI Nguyen Van Binh * , Pham Thi Phuong, Nguyen Ta Loi TNU - University of Agricalture and Forestry Ganoderma lucidum is a precious medicine from nature that has been used for thousands of years in health and healing support. Ganoderma lucidum contains many precious compounds, including the polysaccharide compounds that have anti-cancer effects, reduce blood sugar, prevent cell degeneration, set the immune system, detoxify the body. The effects of material size, extraction time and material/solvent ratio on extraction process of polysaccharide content from red lingzhi were studied. Selection of the conditions of the extraction processis water and extraction temperature at 90 o C. The results showed that the concentration of polysaccharide in the red lingzhi was 1.1% compared to the raw material, the material size (0.4 cm), the material/ solvent ratio (1/20), the extraction time (5 hours) for the polysaccharide content of 0.92% and the extraction efficiency is 83.64%. Keywords: Extract, extraction efficiency, red lingzhi mushroom, polysaccharides, extraction Ngày nhận bài: 28/12/2017; Ngày phản biện: 22/01/2018; Ngày duyệt đăng: 27/4/2018 * Tel: 0977 966445, Email: Binhnguyen313@gmail.com