Nghiên cứu một số đặc tính của chế phẩm enzym ngoại bào từ mùn trồng nấm và đánh giá khả năng ứng dụng của chế phẩm trong xử lý nước ô nhiễm thuốc phóng, thuốc nổ

Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Kỷ niệm 55 năm Viện KHCNQS, 10 - 2015 211 NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA CHẾ PHẨM ENZYM NGOẠI BÀO TỪ MÙN TRỒNG NẤM VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CHẾ PHẨM TRONG XỬ LÝ NƯỚC Ô NHIỄM THUỐC PHÓNG, THUỐC NỔ Trần Thị Thu Hường1*, Bùi Thị Thu Hà1, Đào Thị Hương Giang1 Tóm tắt: Chế phẩm enzym được sử dụng trong nhiều lĩnh vực phục vụ cuộc sống và đặc biệt đã được áp dụng trong các công nghệ xử lý ô nhiễm môi trường đất, nước. Các enzym ngoại bào từ mùn trồng nấm, thuộc nhóm các enzym ligninolytic, là những enzym có khả năng phân hủy nhiều loại chất ô nhiễm, trong đó có các thành phần của thuốc phóng, thuốc nổ. Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả nghiên cứu một số đặc điểm của chế phẩm enzym ngoại bào được sản xuất từ mùn trồng nấm ăn phổ biến tại Việt Nam và đánh giá khả năng ứng dụng của chế phẩm trong xử lý nước ô nhiễm thuốc phóng, thuốc nổ của một số nhà máy quốc phòng. Từ khóa: Chế phẩm enzym, Xử lý nước, Ô nhiễm thuốc phóng - thuốc nổ. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Từ thời cổ đại, enzym đã được sử dụng trong chế biến thực phẩm, để phục vụ cho cuộc sống của con người. Ngày nay, enzym được chế tạo thành dạng chế phẩm, sử dụng trong rất nhiều ngành công nghiệp như chế biến thực phẩm, dầu ăn, chế biến thức ăn chăn nuôi, giấy và bột giấy, dệt may, da giày... Và một trong những ứng dụng mới nhất của enzym đó chính là sử dụng trong công nghệ xử lý các chất gây ô nhiễm môi trường, đã giúp khắc phục được các hạn chế của việc sử dụng các sinh vật sống trong quá trình xử lý. Các enzym ngoại bào phân huỷ lignin (còn gọi là hệ enzym ligninolytic-EPL) được các loài nấm mục trắng tiết ra trong quá trình sinh trưởng, bao gồm 3 enzym chính là lignin peroxidaza (LiP), mangan peroxidaza (MnP) và laccaza (Lac) lần đầu tiên được Tien và Kirk phát hiện vào năm 1983 [1]. Đến năm 1985, Bumpus và các cộng sự [2], trong nghiên cứu của mình đã cho rằng với đặc tính đặc hiệu cơ chất tương đối của các enzym ligninolytic, có thể sử dụng các enzym này cho mục đích sinh phân huỷ các hợp chất gây ô nhiễm môi trường có cấu tạo tương tự phân tử lignin như các loại thuốc nhuộm, các loại hydrocacbon vòng thơm... [3-6]. Trong một báo cáo trước đây [7], chúng tôi đã đề cấp tới việc nghiên cứu để chế tạo các chế phẩm enzym có chứa các enzym phân hủy lignin từ mùn trồng của một số loại nấm ăn phổ biến ở Việt Nam, phụ phẩm của quá trình sản xuất nấm thương phẩm. Trong báo cáo này, chúng tôi tiếp tục trình bày kết quả nghiên cứu một số đặc điểm của chế phẩm enzym đã được chế tạo và đánh giá khả năng ứng dụng của chế phẩm trong xử lý nước ô nhiễm thuốc phóng, thuốc nổ được thu thập từ hệ thống nước thải của nhà máy Z121/TCCNQP. 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Chế phẩm enzym Các chế phẩm enzym ngoại bào từ mùn trồng của 03 loại nấm ăn phổ biến ở Việt Nam [7], cụ thể: - E1 - chế phẩm enzym được sản xuất từ mùn trồng nấm sò trắng (Pleurotus pulmonarius). - E2 - chế phẩm enzym được sản xuất từ mùn trồng nấm sò tím (Pleurotus ostreatus). - E3 - chế phẩm enzym được sản xuất từ mùn trồng nấm sò vua (Pleurotus eryngii). Hóa học & Kỹ thuật môi trường T.T.T.Hường, B.T.T.Hà, Đ.T.H.Giang, “Nghiên cứu ô nhiễm thuốc phóng, thuốc nổ.” 212 2.2. Nước thải: Nước ô nhiễm trinitrotoluen (TNT), axit styphnic (AS) được thu thập từ hệ thống nước thải thuộc nhà máy ZZ121/TCCNQP. Nước ô nhiễm TNT có nồng độ chất ô nhiễm là 118,2mg/l, pH 7,6; nước ô nhiễm AS có nồng độ chất ô nhiễm là 268,5mg/l, pH 5,2. 2.3. Phương pháp xác định hoạt tính enzym [9]: 1) phản ứng xác định hoạt tính MnP gồm: đệm axit tartaric, cơ chất phenolsulfonphthalein, MnSO4, H2O2, dịch enzym. Phản ứng được bắt đầu bằng việc bổ sung H2O2, sau đó xác định lượng cơ chất còn lại trong phản ứng bằng máy quang phổ ở bước sóng 564nm. Đối chứng là hỗn hợp phản ứng không có MnSO4. Hoạt tính MnP được tính thông qua lượng cơ chất mất đi khi có MnSO4 so với khi không có MnSO4. 2) phản ứng xác định hoạt tính LiP gồm: đệm axit tartaric, azureB, H2O2, dịch enzym. Phản ứng được bắt đầu bằng việc bổ sung H2O2, sau đó xác định lượng cơ chất còn lại trong phản ứng bằng máy quang phổ ở bước sóng 651nm. 3) phản ứng xác định hoạt tính Lac tương tự phản ứng của MnP nhưng không bổ sung MnSO4 và H2O2. Các phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ phòng (25±20C). Đối chứng của phản ứng LiP và Lac là hỗn hợp phản ứng trong đó dịch nuôi cấy được khử trùng ở 121oC trong 30 phút.1 đơn vị hoạt tính enzym là lượng enzym xúc tác để biến đổi 1M cơ chất trong 1 phút. Các mẫu được quy hoạt tính theo 1g bã nấm tươi ban đầu hoặc theo g chế phẩm khô. 2.4. Phương pháp phân tích TNT, AS trong nước: Nồng độ TNT, AS trong mẫu được xác định bằng phương pháp HPLC với điều kiện như trong tài liệu [10, 11]. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu một số đặc tính của chế phẩm enzym ngoại bào từ mùn trồng nấm 3.1.1. Xác định pH tối ưu cho phản ứng Đối với phản ứng do enzym xúc tác, pH môi trường rất quan trọng, quyết định tốc độ của phản ứng, do đó, chúng tôi khảo sát pH tối ưu cho phản ứng của chế phẩm enzym ngoại bào từ mùn trồng nấm đã thu nhận. Phản ứng được thực hiện với sự thay đổi giá trị pH của hệ đệm, bao gồm các giá trị: 3; 4; 5; 6 và 7. Tiến hành phản ứng theo 2.3. Xác định hoạt độ enzym sau phản ứng để lựa chọn pH tối thích cho phản ứng xúc tác của chế phẩm. Kết quả được thể hiện ở bảng 1. Bảng 1. Hoạt độ enzym ngoại bào phân hủy lignin trong chế phẩm ở các pH phản ứng khác nhau. STT Chế phẩm/enzym Hoạt độ enzym (U/g chế phẩm) pH phản ứng 3 4 5 6 7 1 E1 LiP 1.006 1.302 1.437 1.414 1.411 2 MnP 1,54 2,07 2,35 2,42 2,43 3 Lac 5.261 7.506 8.320 8.307 8.280 4 E2 LiP 734 1.057 1.188 1.186 1.172 5 MnP 0,64 1,18 1,78 1,78 1,72 6 Lac 4.082 6.908 7.103 7.156 7.125 7 E3 LiP 576 802 919 932 924 8 MnP 0,53 0,75 0,98 1,00 1,01 9 Lac 7.584 8.930 9.702 9.821 9.835 Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Kỷ niệm 55 năm Viện KHCNQS, 10 - 2015 213 Kết quả bảng 1 cho thấy, có sự khác nhau về hoạt độ của các enzym ngoại bào phân hủy lignin giữa các loại chế phẩm ở các giá trị pH phản ứng khác nhau. Tùy theo chế phẩm, pH phản ứng tối ưu của một loại enzym nhất định có thể khác so với của loại chế phẩm còn lại. Nhìn chung, cả ba loại chế phẩm đều có pH phản ứng tối ưu của các enzym ngoại bào phân hủy lignin trong dải pH 5-7. Đây là khoảng pH phản ứng tương đối rộng do đó điều này rất có ý nghĩa cho việc định hướng trong quá trình thử nghiệm hoạt tính của chế phẩm trong các thí nghiệm tiếp theo. 3.1.2. Xác định nồng độ H2O2 tối ưu cho phản ứng H2O2, là đồng cơ chất quan trọng trong phản ứng xúc tác của 2 trong số 3 enzym thuộc hệ enzym ngoại bào phân hủy lignin. Vì vậy, chúng tôi xác định nồng độ H2O2 tối ưu cho phản ứng của LIP và MnP trong chế phẩm (phản ứng của Lac không cần H2O2). Phản ứng được thực hiện với sự thay đổi nồng độ H2O2 trong phản ứng, bao gồm các giá trị: 20, 40, 60, 80, 100mM. Tiến hành phản ứng theo 2.3. Xác định hoạt độ enzym LiP và MnP sau phản ứng để lựa chọn nồng độ H2O2 tối ưu cho phản ứng. Kết quả được trình bày trên bảng 2. Bảng 2. Hoạt độ enzym ngoại bào phân hủy lignin trong chế phẩm ở các nồng độ H202 phản ứng khác nhau. STT Chế phẩm/enzym Hoạt độ enzym (U/g chế phẩm) Nồng độ H2O2 trong phản ứng (mM) 20 40 60 80 100 1 E1 LiP 386 894 1.386 1.384 1.371 2 MnP 0,33 0,80 2,26 2,12 2,13 3 E2 LiP 357 794 1.268 1.246 1.228 4 MnP 0,36 0,73 1,86 1,88 1,82 5 E3 LiP 376 815 957 942 944 6 MnP 0,28 0,79 1,03 1,01 1,01 Kết quả bảng trên cho thấy, nồng độ H2O2 có ảnh hưởng lớn đến phản ứng của LiP và MnP. Trong phản ứng khi chưa có đủ lượng H2O2 (nồng độ H2O2 là 20mM), hoạt độ của hai enzym trên thấp hơn rõ rệt so với khi có đủ H2O2 (nồng độ H2O2 là 60mM). Qua kết quả bảng trên cho thấy, nồng độ H2O2 là 60mM là vừa đủ cho phản ứng của LiP và MnP, khi tăng nồng độ H2O2 hoạt tính của các enzym không tăng và xét về mặt kinh tế việc tăng nồng độ H2O2 cũng không có lợi vì sẽ làm cho giá thành xử lý tăng cao. Vì vậy, chúng tôi chọn nồng độ H2O2 60mM là nồng độ tối ưu cho phản ứng. 3.2. Đánh giá khả năng ứng dụng của chế phẩm enzym ngoại bào từ mùn trồng nấm để phân hủy nước bị ô nhiễm TNT, AS 3.2.1. Khả năng phân hủy TNT, AS của các chế phẩm enzym đã thu nhận Để đánh giá khả năng phân hủy chất ô nhiễm của chế phẩm enzym ngoại bào đã thu nhận và lựa chọn được chế phẩm cho hiệu quả phân hủy TNT, AS trong nước ô nhiễm cao nhất, chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng phân hủy TNT, AS của từng chế phẩm và công thức là sự phối trộn hỗn hợp các chế phẩm enzym - H3E (tỷ lệ phối trộn E1:E2:E3 = 1:1:1). Phản ứng được tiến hành bằng cách bổ sung vào nước thải có chứa TNT, AS chế phẩm enzym ngoại bào theo tỷ lệ 0,1% cùng lúc với bổ sung H2O2 theo tỷ lệ thích hợp để nồng độ cuối cùng đạt 60mM. Đánh giá khả năng phân hủy chất ô nhiễm của chế phẩm Hóa học & Kỹ thuật môi trường T.T.T.Hường, B.T.T.Hà, Đ.T.H.Giang, “Nghiên cứu ô nhiễm thuốc phóng, thuốc nổ.” 214 thông qua xác định nồng độ TNT, AS còn lại sau 10 phút phản ứng kể từ khi H2O2 được bổ sung vào hỗn hợp phản ứng. Kết quả được thể hiện trên bảng 3. Bảng 3. Khả năng phân hủy TNT, AS trong nước ô nhiễm của chế phẩm enzym ngoại bào đã thu nhận. STT Loại chế phẩm enzym Nồng độ chất ô nhiễm (mg/l) TNT AS Trước xử lý Sau xử lý Trước xử lý Sau xử lý 1 E1 66,2 29,6 111,0 9,7 2 E2 66,2 28,9 111,0 12,6 3 E3 66,2 38,3 111,0 17,5 4 H3E 66,2 27,3 111,0 0,0 Kết quả thí nghiệm đánh giá khả năng phân hủy chất ô nhiễm của chế phẩm đã thu nhận cho thấy, việc sử dụng chế phẩm enzym ngoại bào từ mùn trồng nấm để xử lý nước ô nhiễm TNT, AS là có hiệu quả. Với mỗi loại chế phẩm, hiệu quả phân hủy TNT, AS là khác nhau, do hoạt độ của mỗi loại enzym ngoại bào phân hủy lignin có trong từng chế phẩm là khác nhau. Việc kết hợp cả ba chế phẩm (H3E) thành hỗn hợp chế phẩm để xử lý chất ô nhiễm cho hiệu quả phân hủy cao hơn rõ rệt. Theo chúng tôi, điều này có thể là do có sự khác nhau về isozym của các enzym ngoại bào phân hủy lignin giữa các loại nấm nên khi kết hợp các chế phẩm từ các loại nấm này, các isozym của các chế phẩm đặc trưng theo mùn trồng của từng loại nấm đã làm tăng hiệu quả xử lý. Vì vậy, chúng tôi sẽ tiếp tục sử dụng hỗn hợp chế phẩm này trong thí nghiệm tiếp theo. 3.2.2. Thử nghiệm khả năng phân hủy TNT, AS của chế phẩm enzym ngoại bào ở quy mô pilot Từ kết quả thí nghiệm trên chúng tôi tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng phân hủy TNT, AS của chế phẩm enzym ngoại bào đã thu nhận ở quy mô pilot với đối tượng là nước thải từ dây chuyền sản xuất thuốc nổ, thuốc gợi nổ của Nhà máy Z121. Thí nghiệm được tiến hành như sau: nước thải được kiểm tra và điều chỉnh pH sao cho trong khoảng 5-7; bể phản ứng chứa 03 lít nước thải ô nhiễm TNT, AS; hỗn hợp 3 chế phẩm enzym được bổ sung theo tỷ lệ 0,1% cùng lúc với bổ sung H2O2 theo tỷ lệ thích hợp để nồng độ cuối cùng đạt 60mM; khuấy đều. Đánh giá khả năng xử lý chất ô nhiễm thông qua xác định lượng chất ô nhiễm còn lại trong nước thải sau 60 phút phản ứng tính từ thời điểm cho chế phẩm và H2O2. Kết quả được trình bày ở bảng 4. Bảng 4. Kết quả xử lý nước thải chứa TNT, AS từ quá trình sản xuất của Nhà máy Z121 bằng chế phẩm enzym ngoại bào từ mùn trồng nấm. TT Nước ô nhiễm Nồng độ chất ô nhiễm (mg/l) Hiệu suất xử lý (%) Trước xử lý Sau xử lý 1 TNT 118,2 0,0 100 2 AS 268,5 0,0 100 Kết quả bảng 4 cho thấy, hỗn hợp chế phẩm enzym có khả năng xử lý nước thải có chứa TNT, AS của Nhà máy 121 với hiệu suất cao, trong thời gian ngắn (60 phút). Theo Lê Thị Đức (2004), sử dụng chế phẩm vi sinh vật phân hủy hiếu khí TNT, AS trong nước thải với nồng độ đầu vào TNT ≤ 35mg/l, AS ≤ 20 mg/l, tỷ lệ chế phẩm 0,1%, sục khí liên tục 3 - 5 ngày, nước thải sau xử lý có nồng độ chất ô nhiễm còn lại của TNT là 0,5mg/l, AS là 2,61mg/l. Như vậy, kết quả trên cũng cho thấy, so với việc sử dụng vi sinh vật để xử Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Kỷ niệm 55 năm Viện KHCNQS, 10 - 2015 215 lý nước thải chứa TNT, AS, việc sử dụng chế phẩm enzym ngoại bào từ mùn trồng nấm xử lý nước thải loại này có hiệu quả thể hiện qua hiệu suất xử lý là cao hơn và thời gian xử lý cũng ngắn hơn nhiều. Đây là một điều hoàn toàn phù hợp vì đối với quá trình xử lý nước thải bằng vi sinh vật, sự phân hủy chất ô nhiễm gắn liền với sự sinh trưởng của vi sinh vật, do đó cần có thời gian để các vi sinh vật phát triển đạt số lượng nhất định, thích hợp cho sinh phân hủy. Trong khi đó, đối với quá trình xử lý nước thải bằng chế phẩm enzym, sự phân hủy chất ô nhiễm là phản ứng do enzym xác tác, đây là những phản ứng có tốc độ phản ứng nhanh, tính theo từng phút, do vậy thời gian xử lý sẽ ngắn hơn. Ngoài ra, để xử lý nước thải bằng vi sinh vật, cần có mặt bằng lớn cho xử lý, nồng độ đầu vào của chất ô nhiễm cần được giới hạn do bị ảnh hưởng của khả năng chống chịu đối với nồng độ chất ô nhiễm của vi sinh vật. Nhưng đối với xử lý nước thải bằng chế phẩm enzym, nồng độ đầu vào của chất ô nhiễm có thể cao hơn, quá trình xử lý vẫn có thể thực hiện được. KẾT LUẬN Chế phẩm enzym ngoại bào từ mùn trồng nấm có một số đặc điểm phản ứng như sau: pH tối ưu cho phản ứng là pH 5-7; nồng độ H2O2 trong dung dịch tối ưu cho phản ứng là 60mM. Có thể sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp một trong các chế phẩm enzym ngoại bào từ mùn trồng: nấm sò trắng (Pleurotus pulmonarius), nấm sò tím (Pleurotus ostreatus), nấm sò vua (Pleurotus eryngii) để xử lý nước thải bị ô nhiễm TNT, AS từ quá trình sản xuất thuốc phóng thuốc nổ, hiệu quả tốt hơn khi kết hợp 3 loại chế phẩm trên với tỷ lệ 1:1:1. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Tien M. and Kirk T. K., “Lignin peroxydase of Phanerochaete chrysosporium,” Methods in Enzymo, Vol. 161(1988), pp. 238-249. [2]. Bumpus J. A., Tien M., Wright D., Aust S. D., “Oxydation of persistent environmental pollutants by a white rot fungus,” Science, Vol. 228(1985), pp. 1434-1436. [3]. Call H. P., Mucke J., “History, overview and application of mediated ligninolytic system, especially laccase-mediator-systems,” J Biotechnol, Vol. 53 (1997), pp. 163-202. [4]. Crawford R. L., “The microbiology and treatment of nitroaromatic compounds,” Current Opinion Biotechnol, Vol. 6 (1995), pp. 329-336. [5]. Đặng Thị Cẩm Hà, “Nghiên cứu công nghệ sản xuất enzym ngoại bào laccase, manganese peroxydase, lignin peroxydase (MnP, LiP) từ vi sinh vật phục vụ xử lý các chất ô nhiễm đa vòng thơm”. Báo cáo tóm tắt đề tài độc lập cấp Nhà nước (2012). [6]. FRTR, Biological Treatment Techlologies for Explosives, [7]. Trần Thị Thu Hường và cộng sự, “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm enzym ngoại bào từ mùn trồng của các loại nấm ăn phổ biến ở Việt Nam,” TC. Nghiên cứu KHCNQS, số 31(2014), tr.7-13. [8]. Lê Thị Đức, “Nghiên cứu sử dụng enzym ngoại bào của vi sinh vật để xử lý nước thải chứa (TNT) từ các cơ sở sản xuất quốc phòng,” Báo cáo đề tài cấp trung tâm KHKT- CNQS, (2005). [9] Trần Thu Hường, “Nghiên cứu đặc điểm hệ enzym phân huỷ lignin trong các loại mùn trồng nấm phổ biến ở Việt Nam và khả năng ứng dụng để xử lý các chất ô nhiễm khó phân huỷ”. Báo cáo đề tài cấp Viện KHCNQS, (2009). [10]. §ç Ngäc Khuª vµ céng sù, “Nghiªn cøu c«ng nghÖ sinh häc xö lý chÊt th¶i quèc phßng ®Æc chñng vµ sù « nhiÔm vi sinh vËt ®éc h¹i,” B¸o c¸o ®Ò tµi cÊp Nhµ n­íc, (2004). [11]. Lê Thị Đức, “Nghiên cứu áp dụng công nghệ sinh học để xử lý nước thải có chứa chất độc hại là thành phần thuốc phóng, thuốc nổ, thuốc gợi nổ, thuốc nhuộm vũ khí và nhiên liệu tên lửa”. Đề tài nhánh Đề tài cấp Nhà nước KC-04-10, (2004). Hóa học & Kỹ thuật môi trường T.T.T.Hường, B.T.T.Hà, Đ.T.H.Giang, “Nghiên cứu ô nhiễm thuốc phóng, thuốc nổ.” 216 ABSTRACT RESEARCH ON SOME CHARACTERISTICS OF EXTRACELLULAR ENZYME PRODUCT FROM HUMUS CULTIVATION OF EDIBLE MUSHROOM AND EVALUATE CAPABILITY OF THE EXTRACELLULAR ENZYME PRODUCT IN PROPELLANT, EXPLOSIVE POLLUTED WATER TREATMENT The enzyme products are used in many espects of life, especially they are applied to environmental treatment technologies to clean soil, water. The extracellular enzyme products from humus cultivation of edible mushroom are kinds of ligninolytic enzymes, capable of degrading various types of pollutants, including components of the propellant, explosive. In this paper, we present the results of research on some characteristics of the extracellular enzymes produced from humus cultivation of edible mushroom that are popular food in Vietnam and assess capability of the extracellular enzyme product in propellant, explosive-polluted- water treatment in some Military plants. Keywords: Extracellular enzym product, Propellant-explosive treatment. Nhận bài ngày 15 tháng 7 năm 2015 Hoàn thiện ngày 15 tháng 8 năm 2015 Chấp nhận đăng ngày 05 tháng 9 năm 2015 Địa chỉ: 1 Viện Công nghệ mới/Viện KHCNQS; * Email: tranhuongcnm@gmail.com.