Nghiên cứu khả năng đối kháng của nấm trichoderma với phytophthora gây bệnh tiêu chết nhanh

136 Tạp chí Kinh tế - Kỹ thuật NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA NẤM TRICHODERMA VỚI PHYTOPHTHORA GÂY BỆNH TIÊU CHẾT NHANH Trần Ngọc Hùng*, Lê Thành Đạt*, Lê Văn Thường*, Nguyễn Trần Ái Nhung*, Trương Thị Hường*, Lư Thị Thu Thảo* TÓM TẮT Từ các mẫu tiêu bị bệnh chết nhanh thu thập ở Bà Rịa – Vũng Tàu và Bình Dương, chúng tôi đã phân lập được 2 chủng Phytophthora sp.. Trên môi trường PGA, các chủng Phytophthora có khuẩn ty màu trắng, dạng bông xốp, bào tử hậu hình cầu xuất hiện sau khoảng 3 ngày nuôi cấy. Bào tử túi hình cầu hoặc hình quả chanh, chỉ hình thành trong điều kiện ngập nước sau 2-3 ngày. Trong số 10 chủng Trichoderma dùng trong nghiên cứu, trên môi trường thạch đĩa, hầu hết các chủng Trichoderma đều có khả năng đối kháng tốt với 2 chủng Phytophthora. Trong điều kiện ngập nước, dịch nuôi cấy chủng Trichoderma T13 ức chế sự hình thành bào tử túi của Phytophthora BD1 ở nồng độ 100%. Dịch nuôi cấy chủng Trichoderma T15 ức chế sự hình thành bào tử hậu và bào tử túi của cả hai chủng Phytophthora ở nồng độ 50%. Kết quả này là cơ sở cho những nghiên cứu sâu hơn nhằm kiểm soát sự lây lan của nấm Phytophthora trong mùa mưa. Từ khóa: Trichoderma, đối kháng Phytophthora, ức chế hình thành bào tử túi A STUDY ON CAPABLE OF ANTAGONISM OF TRICHODERMA AGAINST PHYTOPHTHORA SP. THAT CAUSE QUICK DEATH DISEAE ON BLACK PEPPER ABTRACT We isolated two strains Phytophthora sp. that cause the quick death diseae from two specimen of pepper diseae in Ba Ria – Vung Tau and Binh Duong Province. On PGA medium, mylecium of Phytophthora strains are white, like-cotton. Chlamydospore which are spherical, are formed after the cultivation about three day. Their oothecae are spherical or like-lemon shape. They just appear in water medium after 2-3 days. On PGA medium, all ten strains of Trichoderma sp. have a capable of antagonism against two Phytophthora strains. The Trichoderma T13-free medium inhibits the forming of oothecae of Phytophthora BD1 at the concentration of 100 percent. Whereas, the Trichoderma T15-free medium is capable of preventing the forming both chlamydospore and ootheae of Phytophthora BD1 and Phytophthora BR1 at concentration of 50 percent. This result is basal to conduce the further study that control the spread of Phytophthora in rainy season. Key word: Trichoderma, antagonism Phytophthora, inhibiting forming ootheae * GV. Khoa Khoa học tự nhiên, trường Đại học Thủ Dầu Một 137 Nghiên cứu khả năng . . . 1. MỞ ĐẦU Từ năm 2001, Việt Nam đã trở thành nước đứng đầu về xuất khẩu hồ tiêu với sản lượng bình quân ước đạt 95.000 tấn mỗi năm. Diện tích tiêu trồng mới trong giai đoạn 2011-2013 đạt khoảng 2.500 ha/năm, nhiều nhất là tại các tỉnh Tây Nguyên, Đông Nam Bộ. Đến năm 2013, diện tích tiêu cả nước đã đạt 60.000 ha, vượt 17% theo quy hoạch đến năm 2020 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn[1,2]. Với giá tiêu cao như thời điểm hiện nay, việc người dân đang chuyển sang trồng tiêu một cách đại trà mà chưa quan tâm đầy đủ đến các biện pháp kỹ thuật đã tạo điều kiện cho một số dịch hại phát triển. Gây thiệt hại nặng cho hồ tiêu phải kể đến bệnh chết nhanh do nấm Phytophthora palmivora gây ra. Bệnh phát triển, lây lan mạnh trong mùa mưa, nhiệt độ không khí thấp và độ ẩm cao. Hiện nay việc phòng trừ bệnh tiêu chết nhanh chủ yếu là sử dụng thuốc hóa học. Biện pháp này làm thay đổi các điều kiện sinh thái và môi trường sống theo hướng tiêu cực. Trong khi đó, việc sử dụng nấm đối kháng Trichoderma sp. là biện pháp an toàn và hiệu quả, thu hút được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học trong những năm gần đây. Nghiên cứu cho thấy Trichoderma sp. đối kháng với nhiều loại nấm gây bệnh trên thực vật khác nhau như: Rhizoctonia, Sclerotonium, Phytophthora, Fusarium, Colletotrichum... Bên cạnh đó, Trichoderma còn sinh trưởng và phát triển mạnh trên các phế phụ liệu nông nghiệp như: rơm rạ, bã mía, xác bã thực vật..., nấm tồn tại lâu trong đất nhờ khả năng hình thành bào tử và phát triển nhanh. Những năm gần đây, nhiều đề tài đã nghiên cứu và sản xuất thành công phế phẩm chứa Trichoderma nhưng chưa được áp dụng rộng rãi do hiệu quả mang lại chưa cao, phế phẩm chỉ phù hợp với phổ nhưỡng và khí hậu của từng vùng và tập quán canh tác của người dân. Bên cạnh đó, việc Phytophthora phát tán bào tử mạnh trong điều kiện ngập nước, còn Trichoderma lại phát triển tốt ở môi trường cạn cũng là một trở ngại cho sự thành công của chế phẩm. Từ thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng đối kháng của nấm Trichoderma với Phytophthora gây bệnh tiêu chết nhanh”. 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Phương pháp phân lập nấm bệnh[4,5] Cho khoảng 100 ml nước vào cốc thủy tinh có sẵn 50g đất có khả năng chứa nấm bệnh. Đặt lên trên bề mặt nước cốc một lá tiêu trưởng thành. Quan sát vết bệnh phát triển trên lá tiêu sau 2–5 ngày. Mô bệnh trên lá được cắt thành từng miếng kích thước khoảng 0,5 x 0,5 cm, cho vào đĩa petri có chứa môi trường PGA. Ủ ở nhiệt độ phòng cho đến khi tơ nấm phát triển. Làm thuần trên môi trường PGA. Chọn lọc các chủng có đặc điểm tơ nấm và bào tử giống Phytophthora. 2.2. Phương pháp kích thích bào tử nang các chủng Phytophthora sp.[5,6] Cắt một miếng thạch 1×1 cm chứa nấm Phytophthora trên môi trường PGA đặt vào một đĩa petri, đổ nước cất ngập mặt thạch và tiến hành sốc ở nhiệt độ 40oC trong 10 phút. Quan sát sự hình thành bào tử túi sau các khoảng thời gian từ 1 – 5 ngày ở độ phân giải 1000 lần. 2.3. Phương pháp xác định hiệu quả đối kháng của Trichoderma với nấm bệnh trên môi trường PGA[3] Cắt những miếng thạch có diện tích bằng nhau (0,5 x 0,5cm) có chứa nấm bệnh và Trichoderma trên các đĩa giống trung gian. Đặt các khối thạch lên đĩa petri có chứa môi trường PGA để tiến hành đối kháng. Hằng ngày, xác định hiệu quả đối kháng Colletotrichum của 138 Tạp chí Kinh tế - Kỹ thuật các chủng Trichoderma. Hiệu quả đối kháng được tính theo công thức: H = (Dđc – Dtt)/ Dđc x 100 (%). Với Dđc là bán kính khuẩn lạc nấm bệnh trên đĩa đối chứng; Dtt là bán kính khuẩn lạc nấm bệnh trên đĩa thử thật. 2.4. Phương pháp xác định hiệu quả đối kháng bằng dịch chiết của Trichoderma với Phytophthora. Cấy các chủng Trichoderma được nuôi cấy lắc trong các erlen chứa môi trường PGA. Sau 7 ngày, thu dịch lọc và bổ sung vào các đĩa petri có đặt sẳn các miếng thạch chứa Phytophthora. Quan sát sự hình thành bào tử túi sau các khoảng thời gian từ 1 – 5 ngày ở độ phân giải 1000 lần. 3. KẾT QUẢ 3.1. Phân lập nấm bệnh Phytophthora Bằng phương pháp bẫy trên lá tiêu, chúng tôi đã phân lập được 2 chủng Phytophthora sp. Hình thái cấu tạo và đặc điểm phát triển được mô tả trong bảng 1. Bảng 1: Đặc điểm các chủng Phytophthora sp. gây bệnh tiêu chết nhanh phân lập được Nguồn lấy mẫu tiêu bệnh Kí hiệu chủng Đặc điểm hệ sợi Đặc điểm bào tử, túi bào tử Bà Rịa - Vũng Tàu Phytophthora BR1 Tơ màu trắng, dạng bông xốp, đường kính vòng tăng trưởng khoảng 4,5 cm sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường PGA. Khuẩn ty không có vách ngăn, ít phân nhánh. Bào tử hậu hình cầu. Bào tử túi hình quả lê, có núm, chỉ hình thành trong điều kiện ngập nước sau 3 ngày. Bình Dương Phytophthora BD1 Tơ màu trắng, dạng bông xốp, phát triển chậm, đường kính vòng tăng trưởng khoảng 1,5 cm sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường PGA. Khuẩn ty không có vách ngăn, ít phân nhánh. Bào tử hậu hình cầu. Bào tử túi hình trứng, hình cầu hoặc hình quả lê, có núm, chỉ hình thành trong điều kiện ngập nước sau 2 ngày. Hình 1. Khuẩn lạc Phytophthora BR1 trên môi trường PGA sau 5 ngày nuôi cấy Hình 2. Bào tử túi của nấm Phytophthora BD1 trong môi điều kiện ngập nước 3.2. Hiệu quả đối kháng của Trichoderma và Phytophthora sp. 3.2.1. Đối kháng trên môi trường thạch đĩa Cắt những miếng thạch có kích thước bằng nhau có chứa nấm bệnh và Trichoderma sp. trên các đĩa petri trung gian. Đặt hai khối thạch vừa cắt lên đĩa petri có chứa môi trường PGA để tiến hành đối kháng. Vị trí đặt thạch cách mép đĩa khoảng 1cm và hai khối thạch phải đối xứng qua tâm đĩa. Sau 3 và 5 ngày, xác định hiệu quả đối kháng. kết quả được thể hiện trong bảng 1: 139 Nghiên cứu khả năng . . . Bảng 1. Hiệu quả đối kháng của Trichoderma với Phytophthora sp. Chủng Trichoderma sp. Hiệu quả đối kháng (%) Phytophthora BR1 Phytophthora BD1 3 ngày 5 ngày 3 ngày 5 ngày T7.2 74.2 ± 1.4 66.7 ± 0.6 22.1 ± 1,4 65 ± 1.5 T8.1 60.7 ± 1.5 75.2 ± 3.8 22.1 ± 1.4 55.9 ± 1 T8.2 56.7 ± 1.5 74.5 ± 0.7 31.3 ± 1.6 100 ± 1 T9 76.3 ± 1.4 71.0 ± 0.8 20 ± 1.6 93.3 ± 1.5 T10 44.4 ± 1.5 73.3 ± 1.8 55.1 ± 1 100 ± 1.5 T11 55.3 ± 1.4 74.3 ± 0.8 29.2 ± 1 100 ± 1.4 T12 35.5 ± 1.9 61.0 ± 1 15.1 ± 0.8 57.7 ± 1.4 T13 51.9 ± 1.9 81.8 ± 1 21.2 ± 1.4 95.9 ± 1.5 T14 50.0 ± 1.9 81.3 ± 1 22.1 ± 1.4 90.8 ± 1 T15 36.4 ± 1.5 84.5 ± 0.7 20 ± 1.5 100 ± 1 Biểu đồ 1. Hiệu quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma sp. với Phytophthora BR1 Biểu đồ 2. Hiệu quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma sp. với Phytophthora BD1 140 Tạp chí Kinh tế - Kỹ thuật Hình 2. Khả năng đối kháng giữa các chủng Trichoderma sp. với chủng Phytophthora BR1 sau 5 ngày. a) Trichoderma T11; b) Trichoderma T14; c) Trichoderma T8.1. d.) Trichoderma T8.2; e) Trichoderma T9. f) Trichoderma T12. Chúng tôi đã sử dụng 10 chủng nấm Trichoderma sp. do Phòng thí nghiệm Sinh học trường đại học Thủ Dầu Một cung cấp để tiến hành đối kháng với các chủng Phytophthora sp. phân lập được. Tất cả các chủng Trichoderma đều có khả năng đối kháng với nấm Phytophthora. Sau 3 ngày khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma đối với Phytophthora tương đối thấp (20 - 56,7%), riêng các chủng Trichoderma T9, Trichoderma T7.2 và Trichoderma T8.1 có khả năng đối kháng cao hơn, đạt từ 60,7 đến 76,3%. Sau 5 ngày, hiệu quả đối kháng của các chủng Trichoderma T13, Trichoderma T14 và Trichoderma T15 lại tăng lên từ 81,3% đến 84,5%. Trong khi đó, hiệu quả đối kháng của cac chủng Trichoderma còn lại tương đối thấp (61 – 75%). Khả năng đối kháng của Trichoderma với Phytophthora BD1 tốt hơn. Sau 5 ngày, có 5 chủng đạt hiệu quả đối kháng từ 95 – 100% (Trichoderma T8.2; Trichoderma T10; Trichoderma T11; Trichoderma T13; Trichoderma T15). Kết quả trên phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan Hương, (2011) khi đánh giá khả năng đối kháng của chủng nấm Trichoderma sp. với nấm Phytophthora sp. đã chỉ ra rằng hầu hết các chủng Trichoderma sp. nghiên cứu đều đối kháng tốt với nấm bệnh sau 4 ngày[3]. Do đó, chúng tôi chọn các chủng Trichoderma T13 và Trichoderma T15 để làm các thí nghiệm tiếp theo. 3.2.2. Đối kháng trên môi trường lỏng Từ các chủng Trichoderma đã chọn ở các thí nghiệm trước, cấy vào môi trường lỏng thu được dịch nuôi cấy, cho vào đĩa petri đã chứa nấm Phytophthora. Sau 7 ngày, chúng tôi quan sát sự hình thành bào tử Phytophthora. Kết quả thí nghiệm được thể hiện qua bảng 2: 141 Nghiên cứu khả năng . . . Bảng 2. Hiệu quả đối kháng dịch nuôi cấy Trichoderma đối với Phytophthora Chủng Trichoderma sp. Nồng độ dịch nuôi cấy (%) Khả năng hình thành bào tử Phytophthora BR1 Khả năng hình thành bào tử Phytophthora BD1 Bào tử hậu Túi bào tử Bào tử hậu Túi bào tử Đối chứng 0 + + + + T13 100 ++ + ++ - 50 + + ++ + T15 100 - - - - 50 - - - - Ghi chú: +: có xuất hiện bào tử; ++: xuất hiện nhiều bào tử; -: không xuất hiện bào tử. Hình 3. Khả năng đối kháng dịch nuôi cấy Trichoderma với Phytophthora. a). Phytophthora BR1 tạo bào tử hậu và bào tử túi trên môi trường chứa dịch nuôi cấy Trichoderma T13. b). Phytophthora BD1 tạo bào tử hậu trên môi trường chứa dịch nuôi cấy Trichoderma T13. c). Phytophthora BD1 không tạo bào tử trong môi trường chứa dịch nuôi cấy Trichoderma T15. c Qua thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy dịch nuôi cấy của các chủng Trichoderma có khả năng ức chế sự hình thành bào tử của chủng Phytophthora với các mức độ khác nhau. Chủng Trichoderma T13 không có khả năng ức chế sự hình thành bào tử túi và bào tử hậu. Ở cả hai nồng độ 50% và 100%, Phytophthora tạo bào tử hậu và bào tử túi nhiều hơn cả đĩa đối chứng. Nguyên nhân có thể là do chủng Trichoderma T13 không có khả năng ức chế, kết hợp với môi trường trong dịch nuôi cấy chứa nhiều chất dinh dưỡng hơn so với môi trường nước. Ở nồng độ dịch nuôi cấy 100%, chủng Trichoderma T13 có khả năng ức chế hình thành bào tử túi, nhưng không ức chế khả năng hình thành bào tử hậu đối với chủng Phytophthora BD1. Ở nồng độ dịch nuôi cấy 50%, chủng Trichoderma T15 có khả năng ức chế sự hình thành cả hai bào tử túi và bào tử hậu của cả 2 chủng Phytophthora nghiên cứu. Chúng tôi nhận thấy chủng Trichoderma T15 có tiềm năng đối kháng tốt trên môi trường thạch, dịch nuôi cấy chủng Trichoderma T15 có chứa những hoạt chất có khả năng ức chế khả năng hình thành bào tử túi và bào tử hậu của các chủng Phytophthora ngay cả trong điều kiện môi trường giàu chất dinh dưỡng. Trong tương lai, chúng tôi sẽ nghiên cứu điều kiện tích lũy các hoạt chất này nhiều hơn, tiến tới cô lập và sử dụng hoạt chất này để kiểm soát sự lây lan của nấm Phytophthora gây bệnh chết nhanh trên cây tiêu. 142 Tạp chí Kinh tế - Kỹ thuật 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Sử dụng phương pháp bẫy lá tiêu, chúng tôi đã phân lập được hai chủng nấm bệnh Phytophthora sp. trên mẫu tiêu bệnh chết nhanh thu nhận ở Bà Rịa-Vũng Tàu và Bình Dương. Sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường PGA, đường kính vòng tăng trưởng chủng Phytophthora BR1 đạt khoảng 4,5 cm, chủng Phytophthora BD1 có đường kính vòng tăng trưởng khoảng 1,5 cm. Nấm có hệ sợi màu trắng, dạng bông, viền không đều. Bào tử hậu hình cầu, bào tử túi hình cầu hoặc hình quả chanh. Trong môi trường nước, bào tử túi được hình thành sau 2 - 3 ngày. Trong số 10 chủng Trichoderma dùng trong nghiên cứu. Trên môi trường thạch đĩa, sau 5 ngày nuôi cấy, các chủng Trichoderma T13, Trichoderma T14 và Trichoderma T15 có khả năng đối kháng tốt với Phytophthora BR1, đạt hiệu quả từ 81,3 - 84,5%. Các chủng Trichoderma T8.2, T10, T11, T13 và T15 đối kháng tốt với Phytophthora BD1, hiệu quả đối kháng từ 95 – 100%. Trong điều kiện ngập nước, dịch nuôi cấy chủng Trichoderma T15 có khả năng ức chế hình thành cả bào tử hậu lẫn bào tử túi của các chủng Phytophthora. 4.2. Kiến nghị Phân lập thêm nhiều chủng Phytophthora gây bệnh tiêu chết nhanh ở các địa phương khác. Xác định hoạt chất chính trong dịch nuôi cấy có khả năng ức chế sự hình thành bào tử của nấm Phytophthora sp. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (2013), Phòng trừ một số bệnh gây hại trên cây tiêu. 2. Thái Bình (2012), Sử dụng nấm đối kháng Trichoderma asperellum trong phòng trừ nấm Phytophthora spp. gây hại trên cây cao su, Trang thông tin điện tử UBND Thị xã Bình Long. 3. Nguyễn Thị Lan Hương, (2011), Nghiên cứu tạo chế phẩm Trichoderma đối kháng với một số chủng nấm bệnh Phytophthora gây bệnh trên cây tiêu, Khóa luận tốt nghiệp, ĐH Tôn Đức Thắng. 4. Lester W. Burgess,Timothy E. Knight, Len Tesoriero. Phan Thuy Hien (2009), Cẩm nang chuẩn đoán cây bệnh ở Việt Nam, Trung tâm nghiên cứu nông nghiệp quốc tế Ustralia. 5. Nguyễn Vĩnh Tường (2008), Kỹ thuật bẫy và theo dõi nguồn bệnh Phytophthora gây bệnh thối gốc rễ hồ tiêu ở trong đất, Tạp chí BVTV số 4. 6. Tô Thị Nhã Trầm (2007), Khảo sát ảnh hưởng của dịch nấm Phytophthora capsici và các tác nhân hóa lý đến sự sinh trưởng và khả năng tạo đột biến của cây tiêu (Piper nigrum L.) nuôi cấy mô, Khóa luận tốt nghiệp, ĐH Nông Lâm TP.HCM. 7. Nguyễn Vĩnh Trường, Edward C.Y. Liew và Lester W. Burgess (2006). Hình thức sinh sản hữu tính của Phtophthora capsici Leonian, tác nhân gây bệnh chết héo hồ tiêu. Tạp chí BVTV, Số 3, Tr. 14-18.