Nghiên cứu In Silico sàng lọc các chất có khả năng ức chế hoạt tính Enzym Mcr-1

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 724 NGHIÊN CỨU IN SILICO SÀNG LỌC CÁC CHẤT CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ HOẠT TÍNH ENZYM MCR-1 Lê Minh Trí*, Trần Thành Đạo*, Huỳnh Phương Mai*, Thái Khắc Minh* TÓM TẮT Mở đầu: The mobilized colistin resistance – 1 (MCR-1) là gen gây đề kháng với colistin có thể truyền qua plasmid trung gian. Gen MCR-1 mã hóa enzym thuộc họ phosphoethanolamin transferase. Enzym MCR-1 mang phosphoethanolamin đến gắn vào lipid A làm thay đổi điện tích lipid A dẫn đến thay đổi ái lực với colistin và các polymicin khác. Mặc khác, colistin được xem là một trong những lựa chọn cuối cùng để điều trị các bệnh do vi khuẩn gram âm đa kháng thuốc gây ra. Vì vậy, hướng nghiên cứu chủ yếu tập trung phát triển chất ức chế enzym MCR-1 để khôi phục hoạt tính kháng sinh. Đề tài tiến hành xây dựng mô hình 3D-pharmacophore và mô hình mô tả phân tử docking để tìm kiếm các chất có khả năng ức chế enzym MCR-1. Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Cấu trúc tinh thể phức hợp của enzym MCR-1 được tải về từ ngân hàng cơ sở dữ liệu protein. Phương pháp pharmacophore và docking được sử dụng để xây dựng mô hình in silico cho việc sàng lọc ảo các chất có khả năng ức chế enzym MCR-1. Cơ sở dữ liệu để sàng lọc được lấy từ ngân hàng thuốc DrugBank. Kết quả: Mô hình pharmacophore được xây dựng trong khoang gắn kết giữa MCR-1 và ethanolamin gồm 4 yếu tố. Hai mô hình docking được xây dựng trên khoang gắn kết giữa MCR-1 với ETA (khoang A) và giữa MCR-1 với D-glucose (khoang B). Kết quả sàng lọc qua mô hình pharmacophore: 408 chất trên tập 7.616 chất thỏa mô hình, 401 chất dock thành công khoang A và 402 chất dock thành công khoang B. Thông qua khảo sát vai trò sinh học của 19 chất trên, nghiên cứu tìm ra được 4 chất có triển vọng nhất có thể phát triển thành thuốc kháng sinh đồng thời có tác dụng ức chế enzym MCR-1. Kết luận: Các mô hình in silico được xây dựng thành công và sàng lọc được 4 chất tiềm năng. Bên cạnh đó, việc sử dụng mô hình pharmacophore để sàng lọc các tập cơ sở dữ liệu lớn hơn nên được thực hiện và thử hoạt tính sinh học in vitro nhằm xác định khả năng ức chế MCR-1 thực tế của 4 chất tiềm năng. Từ khóa: MCR-1, colistin, 3D-pharmacophore, docking, sàng lọc ảo. ABSTRACT IN SILICO VIRTUAL SCREENING FOR THE POTENTIAL MOBILIZED COLISTIN RESISTANCE-1 INHIBITORS Le Minh Tri, Tran Thanh Dao, Huynh Phuong Mai, Thai Khac Minh * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 2- 2019: 724-729 Introducion: The mobilized colistin resistance (mcr-1) gene confers plasmid-mediated resistance to colistin. MCR-1 is a phosphoethanolamine transferase. MCR-1 enzyme plays role in transfer of phosphoethanolamine to lipid A and in change the electrical charge of lipid A and reduce the affinity to colistin and related polymyxins, which leads to colistin resistance. Colistin is considered the antibiotic against most gram-negative bacteria. Therefore, developing an MCR-1 inhibitor to restore the efficacy of these drug against MCR-1 is in progess. In this study, the 3D-pharmacophore and docking models were *Khoa Dược - Đại Học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS. TS. Thái Khắc Minh ĐT: 09096 80385 Email: thaikhacminh@uphcm.edu.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 725 generated to develop the potential MCR-1 inhibitors. Materials and Methods: Target protein structure of this study is the crystal structure of the MCR-1. Pharmacophore approach and molecular docking were applied to build in silico models for virtual screening of MCR-1 inhibitor. The virtual sreening database is DrugBank Database. Result and Discussion: The 3D-pharmacophore model was built based on the ETA-binding pocket with 4 features. The docking modelling were performed on the ETA-binding pocket (pocket A) and D- glucose binding pocket (pocket B) of MCR-1. DrugBank database containing of 7.616 compounds was virtually screened through developed models. After screening via pharmacophore and molecular docking models, 401 compounds were successfully docked on pocket A, 402 compounds were successfully docked on pocket B. The analysis of biological activities of 19 hits, there are 4 potential compounds could be developed as antibiotics having the effect of inhibiting MCR-1. Conclusion: The in silico models for the MCR-1 inhibitors were successfully built and 4 hits were found by virtual screening. The developed 3D pharmacophore model could used to virtual screening of larger databases. In vitro experiments should also be conducted to demonstrate the activity of hit compounds. Keywords: MCR-1, colistin, 3D-pharmacophore, docking, virtual screening. ĐẶT VẤN ĐỀ Đề kháng kháng sinh là một hệ quả của việc lạm dụng thuốc kháng sinh và biến đổi hoặc thu nhận gen đề kháng của vi sinh vật (www.cdc.gov)(7). Nhiều chủng vi khuẩn như Staphylococcus aureus (SA) đã đề kháng với vancomycin và kháng sinh thế hệ mới daptomycin hay thậm chí đề kháng với cả linezolid. Polymyxin được xem là kháng sinh cuối cùng có hiệu quả trị liệu các bệnh do vi khuẩn gram âm đa kháng gây ra(2). Tuy nhiên, những năm gần đây sự đề kháng polymyxin bắt đầu diễn ra với sự xuất hiện của gen kháng thuốc truyền qua plasmid trung gian (MCR-1) càng làm vấn đề đề kháng kháng sinh trở nên nghiêm trọng(3,6,7,9). Trước tình hình đó, việc tìm ra kháng sinh mới hoặc khôi phục lại hiệu quả kháng sinh là hết sức cần thiết. Tuy nhiên, phát triển thuốc mới là một quá trình lâu dài và tốn kém. Bên cạnh việc xác định chất khởi nguồn, tổng hợp dẫn chất có hoạt tính, thử nghiệm in vitro, in vivo; các dẫn chất còn phải thử nghiệm lâm sàng kéo dài nhiều năm và khả năng thất bại ở bước này là rất cao. Vì vậy, các phương pháp sàng lọc ảo ra đời như là một công cụ đắc lực cho quá trình khám phá thuốc mới, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí. Hiện nay vẫn chưa có thuốc phân tử nhỏ nào có khả năng ức chế enzym MCR-1(1,2). Vì vậy, việc nghiên cứu để tìm ra những thuốc phân tử nhỏ có khả năng ức chế enzym này là cần thiết và mở ra cơ hội điều trị hiệu quả các trường hợp đề kháng kháng sinh. Nghiên cứu in silico sàng lọc các chất có khả năng ức chế enzym MCR-1 được tiến hành thực hiện với mục đích xây dựng mô hình 3D-pharmacophore và mô hình mô tả phân tử docking trên cấu trúc của enzym MCR-1 tìm kiếm các chất có khả năng ức chế được enzym này từ tập cơ sở dữ liệu ngân hàng thuốc DrugBank (www.drugbank.ca). ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu là cấu trúc protein phức hợp giữa MCR-1 với ethanolamin (ETA) mã pdb 5YLE và D-Glucose mã pdb 5YLF và tải về từ ngân hàng cơ sở dữ liệu protein (www.rcsb.org)(8). Khoang gắn kết giữa MCR- 1 với ETA và D-Glucose gồm các acid amin được liệt kê trong bảng 1. Đột biến các acid amin này làm MIC của polymyxin E tác động trên dòng vi khuẩn chứa MCR-1 bị đột biến hạ thấp gần như bằng với giá trị MIC của polymyxin E tác động trên dòng vi khuẩn không chứa MCR-1(1,5,6,8). Những acid amin Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 726 này được gọi là acid amin quan trọng. Trong đó, khi đột biến His466 thành Ala thì MIC của polymyxin E tác động trên dòng vi khuẩn chứa MCR-1 bị đột biến hạ thấp gần như bằng với giá trị MIC của polymyxin E tác động trên dòng vi khuẩn không chứa MCR-1(5,8). Một phân tử nhỏ liên kết các acid amin này có khả năng ức chế được hoạt tính của enzym MCR-1. Bảng 1: Giá trị MIC của polymyxin E trên các dòng vi khuẩn chứa gen MCR-1 Khoang gắn kết MCR-1 với ETA Khoang gắn kết MCR-1 với D-glucose Dòng không chứa gen MCR-1 Dòng chứa gen MCR- 1 tự nhiên Dòng vi khuẩn chứa gen MCR-1 bị đột biến Glu 246 Thr 285 Asn 329 Lys 333 His 395 Asp 465 His 466 His 478 Thr 283 Ser 284 Thr 287 Pro 481 Asn 482 1-2 8-16 2-4 2-4 2-4 4-8 2-4 4-8 1-2 2-4 8-16 8-16 2-4 4-8 8-16 Mô hình 3D-pharmacophore được xây dựng dựa vào cấu trúc mục tiêu tác động bằng công cụ Pharmacophore Editor trong phần mềm MOE 2015.10 (www.chemcomp.com), sử dụng cấu trúc MCR-1 có mã pdb 5YLE. Công cụ FlexX/ LeadIT 2.1.8 (www.capterra.com) được sử dụng để thực hiện phương pháp docking dựa vào 2 cấu trúc MCR-1 có mã pdb 5YLE và 5YLF. Ứng dụng các mô hình trên để sàng lọc ảo các chất có khả năng ức chế MCR- 1 trên thư viện DrugBank với tổng cộng 7.616 chất. KẾT QUẢ Mô hình 3D-pharmacophore Dựa vào các acid amin quan trọng trong khoang gắn kết giữa MCR-1 với ETA, mô hình pharmacophore 4 điểm được xây dựng gồm 1 nhóm kỵ nước, 2 nhóm cho liên kết hydro và 1 nhóm nhận liên kết hydro và kết quả trình bày ở Hình 1. Hình 1: Mô hình pharmacophore cho các chất có khả năng gắn kết với MCR-1 với Acc: nhóm nhận liên kết hydro, Don: nhóm cho liên kết hydro, Hyd: nhóm kỵ nước. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 727 Các mô hình mô tả phân tử docking Mô hình docking được xây dựng trên hai cấu trúc protein có mã pdb 5YLE và 5YLF. Kết quả thu được hai khoang gắn kết D-E và D-F (hình 2) với kết quả docking lặp lại RMSD lần lượt là 0,36 và 1,07 Å. Hai mô hình docking được xây dựng trên khoang gắn kết giữa MCR-1 với ETA (khoang A) và giữa MCR-1 với D-glucose (khoang B). (1) (2) Hình 2. Mô hình docking D-E (1) và D-F (2). Kết quả sàng lọc ảo Cơ sở dữ liệu gồm 7.616 chất tập DrugBank được sàng lọc đầu tiên qua mô hình pharmacophore. Các chất thỏa mô hình pharmacophore tiếp tục được đánh giá bằng hai mô hình docking. Quá trình được trình bày ở Hình 3 và kết quả 4 chất có kết quả tốt nhất khi sàng lọc ảo được trình bày ở Bảng 2. Kết quả sàng lọc qua mô hình pharmacophore: 408 chất trên tập 7.616 chất thỏa mô hình, 401 chất dock thành công khoang A (4 chất có điểm số docking <-20 kJ/mol) và 402 chất dock thành công khoang B (36 chất tương tác với Tyr287). Phân tích tương tác với acid amin trong khoang gắn kết, có 19 chất có điểm số docking tốt, vừa tương tác với acid amin His466 vừa tương tác với Tyr287. Thông qua khảo sát vai trò sinh học của 19 chất trên, nghiên cứu tìm ra được 4 chất có triển vọng nhất có thể phát triển thành thuốc kháng sinh đồng thời có tác dụng ức chế enzym MCR-1. Hình 3. Sơ đồ mô tả tổng quát quá trình sàng lọc ảo các chất có khả năng ức chế MCR-1 Mô hình 3D-pharmacophore Mô hình docking Hoạt tính sinh học khác Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 728 Bảng 2: Kết quả 4 chất thu được sau khi sàng lọc ảo STT Tên chất Cấu trúc 1 DB07463 2 DB07649 3 DB08606 4 DB01883 BÀN LUẬN Các mô hình pharmacophore đã cho hiệu năng sàng lọc ban đầu tốt, với trên 90% số chất thỏa pharmacophore đã được docking thành công. Từ kết quả sàng lọc thu được, phần lớn các chất tạo tương tác tốt trong khoang thường là những chất mang các nhóm thế như amid, amin, sulfonyl được gắn vào dị vòng thơm 4 hoặc 5 cạnh. Trong đó, các nhóm thế đóng vai trò là nhận hydro từ Thr285, His478 hoặc đóng vai trò cho hydro với các acid amin Thr285, Asn329, His466; các dị vòng bên cạnh việc tạo liên kết hydro còn tham gia tạo tương tác Van der Waals với các acid amin khác trong khoang góp phần làm tăng khả năng gắn kết của các chất. Từ 7.616 chất trong cơ sở dữ liệu ban đầu, nghiên cứu đã sàng lọc qua các mô hình pharmacophore và mô hình phân tử docking thu được kết quả 19 chất có tiềm năng ức chế hoạt tính enzym MCR-1. Thông qua kết quả khảo sát hoạt tính sinh học đang sử dụng và hoạt tính sinh học khác của 19 chất, nghiên cứu tìm ra được 4 chất có triển vọng nhất có thể phát triển thành thuốc kháng sinh đồng thời có tác dụng ức chế enzym MCR-1 khôi phục hiệu quả colistin. Nghiên cứu sẽ tiếp tục hướng tới việc sử dụng mô hình pharmacophore để tiến hành sàng lọc các tập cơ sở dữ liệu lớn hơn như ngân hàng thuốc cổ truyền Trung hoa (TCM tcm.cmu.edu.tw), bộ sưu tập các mảnh cấu trúc của Maybride (www.maybridge.com), thư viện các mảnh cấu trúc của ChemDiv (www.chemdiv.com) nhằm tìm ra những cấu trúc khung mới, những chất ức chế mới có hiệu quả chọn lọc cao. Với 4 chất tiềm năng tìm được, nghiên cứu sẽ tiến hành thử hoạt tính sinh học in vitro nhằm xác định khả năng ức chế thực tế của các chất. KẾT LUẬN Mô hình sàng lọc chất ức chế hoạt tính enzym MCR-1 gồm 2 phương pháp: phương pháp 3D-pharmacophore và phương pháp mô tả phân tử docking được xây dựng thành công với việc sử dụng thông tin về cấu trúc của MCR-1 và các acid amin quan trọng trong cấu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 729 trúc enzym. Mô hình pharmacophore được xây dựng gồm 2 nhóm cho liên kết hydro, 1 nhóm nhận liên kết hydro và 1 nhóm kỵ nước. Mô hình 3D-pharmacophore này là những điều kiện trước hết cần phải thỏa đối với một chất muốn ức chế enzym MCR-1. Mô hình mô tả phân tử docking đề xuất các liên kết cần thiết cho các chất có hoạt tính ức chế hoạt tính enzym, đồng thời đánh giá khả năng gắn kết, khẳng định lại tiềm năng ức chế enzym của các chất khi đã thỏa mô hình 3D- pharmacophore trên. Lời cảm ơn: Nghiên cứu này được tài trợ bởi Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 108.05-2017.12 (Lê Minh Trí). TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Feng Y (2018). Transferability of MCR-1/2 Polymyxin Resistance: Complex Dissemination and Genetic Mechanism. ACS Infect Dis, 4(3), 291-300. 2. Garg SK, Singh O, Juneja D, Tyagi N, Khurana AS, Qamra A, Motlekar S, Barkate H (2017). Resurgence of Polymyxin B for MDR/XDR Gram-Negative Infections: An Overview of Current Evidence. Crit Care Res Pract, 3635609. 3. Liu Y, Wang Y, Walsh T, Yi L, Zhang R, Spencer J (2016). Emergence of plasmid-mediated colistin resistance mechanism MCR-1 in animals and human beings in China: a microbiological and molecular biological study. Lancet Infect Dis, 8:16-161. 4. Luo Q, Yu W, Zhou K, Guo L, Shen P, Lu H, Huang C, Xu H, Xu S, Xiao Y, Li L (2017). Molecular Epidemiology and Colistin Resistant Mechanism of mcr-Positive and mcr- Negative Clinical Isolated Escherichia coli. Front Microbiol, 2017 8:2262. 5. Ma G, Zhu Y, Yu Z, Ahmad A, Zhang H (2016). High resolution crystal structure of the catalytic domain of MCR-1. Sci Rep, 6: 39540. 6. Sun J, Zhang H, Liu Y, Feng Y (2018). Towards Understanding MCR-like Colistin Resistance. Trends Microbiol, 18, 1-15. 7. Wang R, van Dorp L, Shaw LP, Bradley P, Wang Q, Wang X, Jin L, Zhang Q, Liu Y, Rieux A, Dorai-Schneiders T, Weinert LA, Iqbal Z, Didelot X, Wang H, Balloux F (2018). The global distribution and spread of the mobilized colistin resistance gene mcr-1, Nat Commun, 9: 1179. 8. Wei P, Song G, Shi M, Zhou Y, Liu Y, Lei J, Chen P, Yin L (2018). Substrate analog interaction with MCR-1 offers insight into the rising threat of the plasmid-mediated transferable colistin resistance. FASEB J, 32(2):1085-1098. 9. Ye H, Li Y, Li Z, Gao R, Zhang H, Wen R (2016). Diversified mcr-1–harbouring plasmid reservoirs confer resistance to colistin in human gut microbiota. Mbio, 7(2):e 00177. Ngày nhận bài báo: 18/10/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2018 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2019