Nghiên cứu gen caga và vaca trên các chủng helicobacter pylori kháng kháng sinh phân lập từ bệnh nhi tại Việt Nam

TCNCYH 96 (4) - 2015 41 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 2015 ðịa chỉ liên hệ: Nguyễn Thị Út, Bệnh viện Nhi Trung ương, 18/879 La Thành, ðống ða, Hà Nội Email: nguyenvuthuyduong2003@yahoo.com Ngày nhận: 01/7/2015 Ngày được chấp thuận: 9/9/2015 NGHIÊN CỨU GEN cagA VÀ vacA TRÊN CÁC CHỦNG HELICOBACTER PYLORI KHÁNG KHÁNG SINH PHÂN LẬP TỪ BỆNH NHI TẠI VIỆT NAM Nguyễn Thị Út1, Phạm Diệu Quỳnh2,3, Lê Thanh Hải1, Hồng Thị Thu Hà2 1Bệnh viện Nhi Trung ương; 2Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương; 3Trường ðại học Khoa học Tự nhiên Helicobacter pylori (H. pylori) kháng kháng sinh là nguyên nhân chính gây thất bại trong việc điều trị diệt H. pylori. Nhiều nghiên cứu trên người lớn đã tìm thấy mối liên quan giữa kháng kháng sinh và yếu tố độc lực vi khuẩn (gen cagA và VacA). Tuy nhiên, vấn đề này chưa cĩ bằng chứng khoa học đối với bệnh nhân nhi nhiễm chủng H. pylori kháng kháng sinh. Nghiên cứu này nhằm tìm hiểu mối liên quan giữa sự kháng kháng sinh và gen cagA và vacA trên bệnh nhi nhiễm chủng H. pylori kháng kháng sinh. Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 1/2012 đến tháng 9/2013, tại Bệnh viện Nhi Trung ương trên 150 bệnh nhi được chẩn đốn nhiễm chủng H. pylori kháng kháng sinh. Các bệnh nhi được xác định kiểu gen cagA, vacA bằng kỹ thuật PCR đa mồi. Kết quả cho thấy 34% chủng H. pylori cĩ gen cagA dương tính. Tỉ lệ vacAs1, vacAs2, vacAm1, vacAm2, vacAs1/m1, vacAs1/m2 và vacAs2/m2 lần lượt là 39,3%, 14,7%, 37,3%, 23,3%, 16,7%, 11,3% và 6,6%. Chủng H. pylori độc lực cao mang cả 3 gen, cagA, vacAm1 và vacAs1 được tìm thấy ở 8% bệnh nhi. Tỉ lệ chủng vi khuẩn mang gen cagA và vacA khơng cĩ sự khác b iệt giữa nhĩm kháng amoxicillin, clarithromycin, và metronidazole. Do vậy, việc lựa chọn phác đồ điều trị khác nhau cho bệnh nhi nhiễm chủng H. pylori kháng kháng sinh cĩ cagA, vacA dương tính là khơng cần thiết. Từ khĩa: Helicobacter pylori, kháng kháng sinh, gen cagA, vagA, trẻ em I. ðẶT VẤN ðỀ H. pylori là nguyên nhân chính gây viêm loét dạ dày tá tràng, viêm teo tuyến dạ dày, u lympho dạ dày (MALT, mucosa - associated lymphoide tissue) và ung thư dạ dày. Ở trẻ em, tỉ lệ nhiễm H. pylori chiếm trên 70% bệnh nhân viêm dạ dày, 90% loét hành tá tràng [1] . ðộc lực vi khuẩn H. pylori biểu hiện các yếu tố độc mà tạo thành nguy cơ đối với kết quả điều trị lâm sàng. ðộc tố cagA, protein mã hĩa bởi gen A cĩ liên quan đến cytotoxin (cagA) được quan tâm nhất. Ảnh hưởng trong tế bào của protein cagA cĩ thể làm rõ tại sao bệnh nhân nhiễm chủng cĩ gen cagA thường đáp ứng viêm nặng hơn và cĩ lượng cao hơn các cyto- kine tiền viêm. Vì thế, những đáp ứng viêm của niêm mạc dạ dày này gây bệnh loét dạ dày, tổn thương tiền ung thư và ung thư ở người trưởng thành. Khoảng 60% chủng H. pylori phân lập ở các nước phương Tây cĩ mang gen cagA, trong khi hầu hết các chủng ở khu vực ðơng Á dương tính với gen này. Gen cagA (cytotoxin-associated gene) và gen vacA (vacuolating toxin gene) được coi là những gen cĩ liên quan tới yếu tố độc lực chủ yếu gây bệnh và đặc trưng của vi khuẩn H. pylori. Sự kết hợp các gen cagA và các týp gen vacA cĩ thể liên quan đến nguy cơ với các mức độ biểu hiện lâm sàng khác nhau. Protein cagA, cĩ kích thước phân tử từ 128 đến 140 kDa, cĩ khả năng kích thích phản ứng phosphoryl hĩa tyrosin trong tế bào ký 42 TCNCYH 96 (4) - 2015 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC chủ dẫn đến tăng sinh bất thường của các tế bào biểu mơ dạ dày. Gen vacA cĩ chứa ít nhất 2 vùng biến đổi gồm vùng tín hiệu và vùng giữa. Vùng giữa (middle) của gen vacA cĩ các typ gen là m1/m2 và vùng tín hiệu (signal) cĩ thể cĩ các týp gen là s1/s2. Mức độ độc tố cao hay thấp của gen vacA phụ thuộc vào các typ gen của hai vùng này. Chủng H. pylori với typ gen vacA s1/m1 cĩ độc tố trên tế bào mạnh hơn typ gen vacA s1/m2, trong khi đĩ chủng H. pylori với typ gen vacA s2/m2 khơng gây độc tố [2; 3]. Sự kháng thuốc của H. pylori ngày càng gia tăng, nghiên cứu của Nguyễn Thị Việt Hà (2006) trên trẻ em viêm loét dạ dày tá tràng tại bệnh viện Nhi Trung ương cho thấy tỉ lệ kháng thuốc của H. pylori với clarithromycin, metroni- dazole và amoxicillin tương ứng là 50,9%, 65,3% và 0,5% dẫn đến hiệu quả của các phác đồ điều trị diệt H. pylori hiện nay thấp, đều dưới 80% [4]. Mặt khác, kết quả từ một số nghiên cứu chỉ ra rằng tỉ lệ diệt vi khuẩn ở bệnh nhân viêm dạ dày thấp hơn so với bệnh nhân loét dạ dày [5]. Do tỷ lệ kháng thuốc tăng cao trên tồn thế giới đặt ra nhiều vấn đề liên quan, một số nhà nghiên cứu đã tiến hành t ìm hiểu mối liên hệ giữa tính kháng thuốc và các nhân tố di t ruyền của vi khuẩn. Nghiên cứu trên người lớn Ireland thấy tỉ lệ kháng metroni- dazole ở nhĩm cagA(-) cao hơn cĩ ý nghĩa thống kê so với nhĩm cagA(+) [6]. Nghiên cứu Agudo 2010 thấy chủng kháng clarithromycin cĩ biểu hiện gen vacA s2/m2 (-) và cagA (-) hơn những chủng nhạy cảm [7]. Trên trẻ em, Việt Nam chưa cĩ cơng trình nào nghiên cứu về độc lực của vi khuẩn H. pylori. Liệu vi khuẩn cĩ gen cagA, vacA cĩ ảnh hưởng đến đáp ứng điều trị khơng và cĩ thể tham gia vào tỷ lệ loại bỏ vi khuẩn khơng? Xuất phát từ tình hình thực tế đĩ, chúng tơi tiến hành đề tài nghiên cứu này nhằm mục tiêu tìm hiểu mối liên quan giữa sự kháng kháng sinh và những gen cagA và vacA của những chủng H. pylori trên bệnh nhi nhiễm H. pylori, tại bệnh viện Nhi Trung ương từ tháng 1/2012 - 9/2013. II. ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. ðịa điểm và thời gian Nghiên cứu được tiến hành tại phịng khám Tiêu hĩa, phịng nội soi dạ dày, Khoa Tiêu hĩa, Bệnh viện Nhi Trung ương và Khoa Vi khuẩn, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương từ tháng 1/2012 đến tháng 9/2013. 2. Phương pháp: sử dụng phương pháp nghiên cứu mơ tả cắt ngang. 3. ðối tượng Bệnh nhi được chọn lựa vào nghiên cứu đáp ứng các tiêu chuẩn sau: - Tuổi từ 2 - 14 tuổi cĩ các triệu chứng lâm sàng của bệnh lý dạ dày tá tràng bao gồm: đau bụng tái diễn, nơn, buồn nơn, chướng bụng, khĩ tiêu, nĩng rát vùng thượng vị hoặc xuất huyết tiêu hĩa, thiếu máu chưa rõ nguyên nhân và được chỉ định nội soi tiêu hĩa. - Chưa điều trị kháng sinh và các thuốc ức chế bơm proton, antacid trong vịng 1 tháng trước khi làm nội soi. - Cĩ bố/mẹ được giải thích và đồng ý tham gia nghiên cứu. - Bệnh nhân cĩ kết quả nuơi cấy (+) và kháng sinh đồ bị nhiễm chủng H. pylori cĩ kháng ít nhất 1 trong 3 kháng sinh amoxicillin, clarithromycin, metronidazole. Tiêu chu?n loAi trB bCnh nhân nghiên cEu Bệnh nhân cĩ các tiền sử bệnh ác tính và/ hoặc đã sử dụng kháng sinh, thuốc chống bài tiết acid trong vịng 4 tuần trước khi đến khám. TCNCYH 96 (4) - 2015 43 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 2015 4. Vật liệu nghiên cứu - Mẫu mảnh sinh thiết được lấy từ bệnh nhân được nội soi dạ dày - Mẫu DNA chứng dương (HP133) do viện Karolinska, Thụy ðiển cung cấp 5. Tiến hành nghiên cứu 5.1. LIy mKu bCnh ph?m Bệnh nhân được nội soi, lấy 2 mảnh sinh thiết ở vùng hang vị và thân vị. Ngay tại phịng nội soi, 1 mảnh sinh thiết được xác định sự cĩ mặt của vi khuẩn H. pylori bằng xét nghiệm urea (Rapid Urea Test - RUT). Các mảnh sinh thiết được cho vào týp 2 ml cĩ chứa mơi trường vận chuyển H. pylori [8]. Sau đĩ, các týp này được chuyển ngay đến khoa Vi khuẩn, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương ở điều kiện lạnh 4oC, trong 2 - 4 giờ, và cất ở tủ âm 80oC cho đến khi tiến hành phân tích. 5.2. Nuơi cIy và phân lPp vi khu?n Mảnh sinh thiết được nghiền thành huyền dịch trong điều kiện vơ trùng và nuơi cấy trên mơi trường thạch Helicobacter và thạch máu ngựa 10% cĩ bổ sung các vi chất và kháng sinh [9]. ðĩa thạch nuơi cấy được ủ ở 37oC, trong điều kiện vi hiếu khí (5% O2, 10% CO2, 85% N2- Campygen™ Oxoid, Anh), theo dõi trong thời gian từ 3 – 7 ngày. Các khuẩn lạc điển hình được nhuộm soi, xác định tính chất sinh vật hĩa học như sinh oxidase, catalase, urease và làm thử nghiệm kháng sinh đồ. 5.3. Phương pháp kháng sinh đX Sử dụng phương pháp kháng sinh khuyếch tán trên thạch của Kirby - Bauer và xác định mức độ nhạy cảm với các loại kháng sinh theo tiêu chuẩn NCCLS (National Com- mittee for Clinical Laboratory Standards) [9]. Dùng mơi trường Muller - Hinton cĩ 5% máu ngựa và các khoanh giấy kháng sinh amoxicillin (AMX) 25µg, clarithromycin (CLA) 15µg, metronidazol (MTZ) 4 µg, của hãng Bio- Rad. Các đĩa thạch đã láng huyền dịch vi khuẩn và đặt các khoanh giấy kháng sinh được ủ ở 37oC, trong điều kiện vi hiếu khí (5% O2, 10% CO2, 85% N2), theo dõi trong 3 ngày. Trong trường hợp trung gian giữa kháng và khơng kháng chúng tơi tiến hành xác định lại chủng vi khuẩn cĩ kháng hay khơng bằng phương pháp Etest. Chủng H. pylori được xác định kháng clarithromycin khi nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) > 1 µg⁄mL, kháng amoxicillin nếu MIC ≥ 1 µg⁄mL, và kháng metronidazole khi MIC > 4 µg/mL [4]. 5.4. Phương pháp xác đ[nh các týp gen cagA, vacA Qui trình tách chiết DNA từ mảnh sinh thiết dạ dày được thực hiện theo hướng dẫn của DNA Mini Kit, hãng Quiagen (ðức, Cat No.51304). Xác định các týp gen cagA, vacA của H. pylori DNA của H. pylori được xác định dựa vào kỹ thuật PCR đa mồi bằng sử dụng các cặp mồi đặc hiệu cho việc khuếch đại DNA mã hĩa các gen cagA, vacA của H. pylori (chi tiết ở bảng 1) [10]. Mỗi 25 µl hỗn hợp phản ứng bao gồm 5 µl của khuơn DNA, 1 µl của từng loại mồi (50 µM/L) và 12,5 µl Taq PCR master mix (QIAgen), và một lượng vừa đủ nước để cĩ thể tích cuối cùng là 25 µl. Quá trình khuếch đại được thực hiện tại máy PCR - MyCycle™ (Bio Rad). Các chu t rình PCR được thực hiện như sau: 94oC 3 phút 94oC 1 phút 55oC 1phút 72oC 1 phút 72oC 10 phút 35 chu kỳ 44 TCNCYH 96 (4) - 2015 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Bảng 1. Các mồi sử dụng cho phản ứng H. pylori - PCR đa mồi Gen đích Mồi Trình tự ðộ dài (bp) 16S rDNA 16S rARN - F 16S rARN - R 5’ – TAAGAGATCAGCCTATGTCC – 3’ 5’ – TCCCACGCTTTAAGCGCAAT – 3’ 534 vacA s1/vacA s2 VAI - F VAI -R 5’ – ATGGAAATACAACAAACACAC – 3’ 5’ – CTGCTTGAATGCGCCAAAC – 3’ 259/286 vacA m1/vacA m2 VAG - F VAG - R 5’ – CAATCTGTCCAATCAAGCGAG – 3’ 5’ – GCGTCAAAATAATTCCAAGG – 3’ 567/642 cagA cag5c - F cag3c - R 5’ – GTTGATAACGCTGTCGCTTC – 3’ 5’ – GGGTTGTATGATATTTTCCATAA – 3’ 350 10 µl của sản phẩm PCR được nhỏ vào thạch điện di nồng độ 1,5% (w/v) để phát hiện sản phẩm PCR và các mảnh ADN được phân chia riêng rẽ bằng điện di ở điều kiện 100 V trong 45 phút sau khi được nhuộm bằng dung dịch SYBR safe DNA (Invitrogen). Mẫu chứng dương HP133 được cung cấp bởi khoa Vi sinh lâm sàng, Viện Karolinska, Thụy ðiển. 6. Xử lý số liệu Các dữ liệu được phân tích bằng phần mềm thống kê SPSS 16.0. 7. ðạo đức nghiên cứu Nghiên cứu đã được thơng qua hội đồng y đức của Bệnh viện Nhi Trung ương (chấp thuận số 940B ngày 24/12/2012). III. KẾT QUẢ Tổng số mẫu thu thập là 150 bệnh nhi được xác định (+) với H. pylori cĩ kết quả kháng sinh đồ kháng với ít nhất 1 loại: amox- icillin, clarithromycin, metronidazole. 1. ðặc điểm chung 1.1. Tu]i Tuổi bệnh nhân trung bình 7,37 ± 2,69 tuổi, nhỏ nhất là 2 tuổi, lớn nhất là 14 tuổi. 1. 2. Phân b^ theo gi_i Tỉ lệ nam/nữ là 78/72 = 1,08; khơng cĩ sự khác biệt về giới tính với p > 0,05. 1.3. T` lC kháng tBng loAi kháng sinh caa H. pylori Bảng 2. Tỉ lệ kháng từng loại kháng sinh chung Kháng sinh n % Clarithromycin 91 60,7 Metronidazole 65 43,3 Amoxicillin 56 37,3 Kháng clarithromycin chiếm tỉ lệ cao nhất 60,7% kháng metronidazole chiếm tỉ lệ 43,3 % và tỉ lệ kháng amoxicillin chiếm tỉ lệ 37,7%. TCNCYH 96 (4) - 2015 45 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 2015 1.4. Phân b^ các type cagA, vacA caa H. pylori Bảng 3. Tỷ lệ và phân bố các type cagA, vacA của các chủng H. pylori Các gen Dương tính (= n/150) % cagA 51 34 vacA s1 59 39,3 vacA s2 22 14,7 vacA m1 56 37,3 vacA m2 35 23,3 vacA s1/m1 25 16,66 vacA s1/m2 17 11,33 vacA s2/m2 10 6,6 34% chủng H. pylori cĩ gen cagA dương t ính, gen vacAs1 dương tính chiếm tỉ lệ cao nhất 39,3% và gen vacAm1 dương tính với 37,3 % số chủng H. pylori kháng kháng sinh. Trong số đĩ 8% (12/150) bệnh nhi được phát hiện cĩ nhiễm chủng H. pylori cĩ cả 3 gen cagA, vacAm1 và vacAs1. 2. Liên quan giữa gen cagA, vacA và kháng kháng sinh 2.1. Liên quan gica gen cagA, vacA và kháng amoxicillin Bảng 4. Liên quan giữa gen cagA, vacA và kháng amoxicillin Gen Kháng amoxicillin (n,%) Khơng kháng amoxicillin (n,%) p cagA 17 (30,4) 34 (36,2) > 0,05 vacA s1 21 (37,5) 38 (40,4) > 0,05 vacA s2 10 (17,9) 12 (12,8) > 0,05 vacA m1 19 (33,9) 37 (39,4) > 0,05 vacA m2 16 (28,6) 19 (20,2) > 0,05 vacA s1/m1 7 (12,5) 18 (19,1) > 0,05 vacA s1/m2 9 (16) 8 (8,5) > 0,05 vacA s2/m2 3 (5,3) 7 (7,4) > 0,05 Tỉ lệ cagA dương tính chiếm 30,4% ở nhĩm kháng amoxicillin, nhĩm khơng kháng cĩ 36,2% chủng dương tính với cagA. Tỉ lệ vacAs1, vacAs2, vacAm1, vacAm2 của 56 chủng kháng amoxicillin lần lượt là 37,5%, 17,9%, 33,9% và 28,6%, khơng cĩ sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê 46 TCNCYH 96 (4) - 2015 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC về tỉ lệ cagA, vacA giữa 2 nhĩm kháng và khơng kháng amoxicillin (p > 0,05). Tỉ lệ gen vacAs1/ m1 chiếm 12,5%, vacAs1/m2 chiếm 16% và vacAs2/m2 chiếm 5,3% ở nhĩm kháng amoxicillin. 2.2. Liên quan gica gen cagA, vacA và kháng clari thromycin Bảng 5. Liên quan giữa gen cagA, vacA và kháng clarithromycin Gen Kháng clarithromycin (n,%) Khơng kháng clarithromycin (n,%) p cagA 31 (34,1) 20 (33,9) > 0,05 vacA s1 32 (35,2) 27 (45,8) > 0,05 vacA s2 12 (13,2) 10 (16,9) > 0,05 vacA m1 36 (39,6) 20 (33,9) > 0,05 vacA m2 17 (18,7) 18 (30,5) > 0,05 vacA s1/m1 15 (16,48) 10 (14,49) > 0,05 vacA s1/m2 6 (6,6) 11 (18,64) < 0,05 vacA s2/m2 5 (5,5) 5 (8,47) > 0,05 Nhĩm kháng clarithromycin cĩ tỉ lệ cagA dương tính chiếm 34,1% và nhĩm khơng kháng chiếm 33,9%. Tỉ lệ vacAs1, vacAs2, vacAm1, vacAm2 của 91 chủng kháng clarithromycin lần lượt là 35,2%, 13,2%, 39,6% và 18,7%, khơng cĩ sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê về tỉ lệ cagA, vacA giữa 2 nhĩm kháng và khơng kháng clarithromycin, (p > 0,05). Tỉ lệ gen vacAs1/m1 chiếm 16,48%, vacAs1/m2 chiếm 6,6% và vacAs2/m2 chiếm 5,5% ở nhĩm kháng clarithromycin. 2.3. Liên quan gica gen cagA, vacA và kháng metronidazole Bảng 6. Liên quan giữa gen cagA, vacA và kháng metronidazole Gen Kháng metronidazole (n,%) Khơng kháng metronidazole (n,%) p cagA 22 (33,8) 29 (34,1) > 0,05 vacA s1 28 (43,1) 31 (36,5) > 0,05 vacA s2 8 (12,3) 14 (16,5) > 0,05 vacA m1 25 (38,3) 31 (36,5) > 0,05 vacA m2 15 (23,1) 20 (23,5) > 0,05 vacA s1/m1 13 (20) 12 (14,1) > 0,05 vacA s1/m2 8 (12,3) 9 (10,58) > 0,05 vacA s2/m2 5 (7,7) 5 (5,88) > 0,05 Tỉ lệ cagA dương t ính chiếm 33,8% ở nhĩm kháng metronidazole, tuy nhiên khơng cĩ sự khác biệt (p > 0,05) khi nhĩm khơng kháng chiếm 34,1%. Tỉ lệ vacAs1, vacAs2, vacAm1, vacAm2 của TCNCYH 96 (4) - 2015 47 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 2015 65 chủng kháng metronidazole lần lượt là 43,1%, 12,3%, 38,3% và 23,1%, khơng cĩ sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê về tỉ lệ cagA, vacA giữa 2 nhĩm kháng và khơng kháng metronidazole (p > 0,05). Tỉ lệ gen vacAs1/m1 chiếm 20%, vacAs1/m2 chiếm 12,3% và vacAs2/m2 chiếm 7,7% ở nhĩm kháng metronidazole. 2.4. Liên quan gica gen cagA, vacA m1, vacA s1(+) và kháng kháng sinh Bảng 7. Tỷ lệ mang gen và các chủng kháng kháng sinh cagA(+), vacA m1(+), vacA s1(+) (n) % Kháng amoxcixillin 1/56 1,8 Kháng clarithromycin 8/91 8,8 Kháng metronidzole 7/65 10,76 Chủng kháng kháng metronidazole cĩ tỉ lệ mang gen cagA dương tính vacAs1/m1 dương t ính chiếm tỉ lệ cao nhất 10,76 % và kháng amoxcixillin chiếm tỉ lệ thấp nhất 1,8%. IV. BÀN LUẬN Tuổi trung bình của bệnh nhân tham gia nghiên cứu là 7,37 ± 2,69 tuổi, tuổi nhỏ nhất 2 tuổi, tuổi lớn nhất 14 tuổi, trong đĩ tỉ lệ nam nữ gần tương đương. Trong 150 chủng H. pylori kháng kháng sinh phân lập được, kháng clarithromycin chiếm tỉ lệ cao nhất 60,7%, kháng amoxicillin, metronidazol chiếm tỉ lệ lần lượt là 37,3%, 43,3% . Gen vacA s1 dương tính chiếm tỉ lệ cao nhất 39,3%, 34% chủng H. pylori cĩ gen cagA dương tính và gen vacA m1 dương t ính với 37,3% số chủng H. pylori kháng kháng sinh. Trong số đĩ 8% (12/150) bệnh nhi được phát hiện cĩ nhiễm chủng H. pylori cĩ cả 3 gen, cagA, vacAm1 và vacAs1. Nghiên cứu trên người lớn tại thành phố Hồ Chí Minh và Hà Nội của Trần Thiện Trung và cộng sự thấy tỉ lệ cagA trên bệnh nhân viêm dạ dày người lớn chiếm 92,3 % cao hơn nhiều so với nghiên cứu này [11]. So với nghiên cứu của Homan trên trẻ em Slovenia viêm dạ dày tá tràng thấy tỉ lệ cagA chiếm 56,4% cao hơn của chúng tơi [12], tuy nhiên so sánh với nghiên cứu trên t rẻ em Pháp thì tỉ lệ cagA cũng chiếm 40% tương đương với kết quả của chúng tơi [13]. Cũng theo Trần Thiện Trung, tỉ lệ vacAs1, vacAs2, vacAm1, vacAm2, vacAs1/m1, vacAs1/m2 và vacAs2/m2 lần lượt là 96,7%, 3,3%, 40,7%, 59,3%, 41,8%, 54,9% và 3,3% [11]. So với kết quả của chúng tơi lần lượt là 39,3%, 14,7%, 37,3%, 23,3%, 16,7%, 11,3% và 6,6 %. Tỉ lệ vacAs1 của chúng tơi thấp hơn nhiều so với nghiên cứu t rên người lớn và vacAm1 cĩ kết quả tương đương với người lớn [11]. Tuy nhiên, khi so với tỉ lệ vacAs1 73,5%, vacAs2 26,5%, vacAm1 41,3%, vacAm2 58,7% của trẻ em Slovenia chỉ cĩ vacAm1 cĩ kết quả tương tự cịn lại tỉ lệ của chúng tơi thấp hơn. Tỉ lệ vacAs1/m1 chiếm 41,8% tương đương với kết quả nghiên cứu trên trẻ Slovenia (42%), tuy nhiên tỉ lệ vacAs1/m2 (54,9%) và vacAs2/m2 (3,3%) so với trẻ Slovenia lại thấp hơn [12]. Liên quan giữa gen cagA, vacA và kháng amoxicillin: Tỉ lệ cagA dương tính chiếm 30,4% nhĩm kháng amoxicillin, nhĩm khơng kháng cĩ 36,2% chủng dương tính với cagA. 48 TCNCYH 96 (4) - 2015 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Tỉ lệ vacAs1, vacAs2, vacAm1, vacAm2 của 56 chủng kháng amocixillin lần lượt là 37,5%, 17,9%, 33,9% và 28,6%, khơng cĩ sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê về tỉ lệ cagA, vacA giữa 2 nhĩm kháng và khơng kháng amoxcixil- lin (p > 0,05). Tỉ lệ gen vacAs1/m1 chiếm 12,5%, vacAs1/m2 chiếm 16% và vacAs2/m2 chiếm 5,3% ở nhĩm kháng amoxcixillin. Kết quả của chúng tơi cũng giống như nghiên cứu của Gotaslou trên người lớn khơng tìm thấy sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê giữa tỉ lệ kháng amoxicillin và gen cagA [14]. Liên quan giữa gen cagA, vacA và kháng clarithromycin: Nhĩm kháng và khơng kháng clarithromycin cĩ tỉ lệ cagA(+) là 34,1% và 33,9%, kết quả của chúng tơi tương tự như kết quả của Karabiber (2014) trên trẻ Thổ Nhĩ Kì là 33,3% và 31,3%[15]. So với nghiên cứu Francesco tại Italia thấy tỉ lệ cagA ở trên bệnh nhân kháng clarithromycin chiếm 69,3%, cao hơn so với nghiên cứu của chúng tơi. Tỉ lệ vacAs1 ở nhĩm kháng clarithromycin trong nghiên cứu của Karabiber chiếm 91,7% cao hơn so với nhĩm nhạy cảm cĩ ý nghĩa (46,9%), cao hơn so với kết quả của chúng tơi là 43,1% và 36,5%. Tuy nhiên giống như nghiên cứu của Francesco trên người lớn chúng tơi cũng khơng tìm thấy sự liên quan về tỉ lệ các gen cagA, vacA với kháng clarithromycin [16]. Liên quan giữa gen cagA, vacA và kháng metronidazole: Trong nghiên cứu của chúng tơi, tỉ lệ cagA (+) ở nhĩm kháng metronidazole chiếm 33,8%, nhĩm khơng kháng chiếm 34,1%. Trong nghiên cứu của Taneike tại Ire- land thấy tỉ lệ kháng metronidazole ở nhĩm cagA(-) cao hơn nhĩm cagA (+) [6], tuy nhiên nghiên cứu của chúng tơi khơng tìm thấy sự khác biệt giữa 2 nhĩm. Tương tự như kết quả của Karabiber (2014) khơng tìm thấy sự khác biệt giữa 2 nhĩm với tỉ lệ là 50% ở nhĩm kháng và 30,7% ở nhĩm khơng kháng [15]. Tỉ lệ gen vacA s1 ở nhĩm kháng metronidazole trong nghiên cứu của Karabiber rất cao 100% cao hơn cĩ ý nghĩa so với nhĩm nhạy cảm, so với kết quả của chúng tơi tỉ lệ 43,1% thấp hơn rất nhiều và chúng tơi khơng t ìm thấy sự khác biệt cĩ ý nghĩa giữa hai nhĩm kháng và khơng kháng. Tương tự như tỉ lệ vacA m1 của chúng tơi ở nhĩm kháng và khơng kháng metronidazole là 38,3% và 36,5% so với kết quả của Karabiber và 33,3% và 23,5% tỉ lệ của chúng tơi cao hơn [15]. Liên quan giữa gen cagA, vacA m1, vacA s1(+) và kháng kháng sinh: Nghiên cứu chủng H. pylori nhiều tác giả đã phát hiện rằng những chủng H. pylori mang gen cagA gây độc tế bào thường chiếm tỷ lệ rất cao trong các thể bệnh nặng như loét dạ dày tá tràng, ung thư dạ dày (70 - 100%). Nếu các chủng H. pylori cĩ cả gen cagA và gen vacA, thì khả năng gây bệnh cịn cao hơn. Các cơng t rình ở Việt Nam nghiên cứu định týp H. pylori theo kiểu này đã cho biết: khi nhiễm H.pylori cĩ kiểu gene vacA s1/m1 kết hợp với cagA (+) thì nguy cơ ung thư dạ dày sẽ tăng lên 7,1 lần (khoảng tin cậy 95% = 1,4 - 36,1) so với nhiễm H. pylori cĩ vacA s1/m1 nhưng cagA (-) [17]. Tác giả Trần Thiện Trung cũng cĩ nhận định chủng H. pylori cĩ mang gen cagA và gen vacA s1/m1 thì cĩ nguy cơ cao liên quan đến bệnh ung thư dạ dày với OR = 2,118 (khoảng tin cậy 95% = 1,094 - 4,1) so với chủng H. pylori mang gen cagA và vacA s1/m2 [11]. Trong nghiên cứu của chúng tơi tỉ lệ chủng vi khuẩn cĩ gen cagA , vacAs1/m1 ở nhĩm kháng metronidazole chiếm 10,76% và kháng amoxicillin chiếm tỉ lệ 1,8%. Trong nghiên cứu Trần Thiện Trung thấy tỉ lệ cagA, vacAs1/m1 dương tính ở nhĩm bệnh nhân viêm dạ dày chiếm 42% cao hơn so với nghiên cứu này [11]. TCNCYH 96 (4) - 2015 49 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 2015 V. KẾT LUẬN Qua nghiên cứu 150 chủng H. pylori kháng kháng sinh, 34% chủng H. pylori cĩ gen cagA dương tính, tỉ lệ vacAs1, vacAs2, vacAm1, vacAm2, vacAs1/m1, vacAs1/m2 và vacAs2/ m2 lần lượt là 39,3%, 14,7%, 37,3%, 23,3%, 16,7%, 11,3% và 6,6%. Trong số đĩ, 8% bệnh nhi được phát hiện cĩ nhiễm chủng H. pylori độc lực cao cĩ cả 3 gen, cagA, vacAm1 và vacAs1. Khơng thấy sự khác biệt về tỉ lệ gen cagA, vacA giữa các nhĩm kháng kháng sinh và khơng kháng kháng sinh. Việc lựa chọn phác đồ điều trị khác nhau cho bệnh nhi nhiễm chủng H. pylori kháng kháng sinh cĩ gen cagA, vacA dương tính là khơng cần thiết. Cần đánh giá độc lực của vi khuẩn trên nhĩm bệnh nhi viêm loét dạ dày tá tràng do chủng H. pylori kháng thuốc để cĩ hướng theo dõi và điều trị cho bệnh nhi. Cần nghiên cứu thêm về mối liên quan gen kháng thuốc và độc lực vi khuẩn. Lời cảm ơn Chúng tơi chân thành cảm ơn Tiến sĩ Hồng Thị Thu Hà (viện Vệ sinh Dich tễ Trung ương) và Phạm Diệu Quỳnh (Trường ðại học Khoa học Tự Nhiên) trong việc giúp đỡ triển khai nghiên cứu này. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Phạm Hồng Hưng (2003). Nhận xét về mối liên quan giữa nhiễm Helicobacter pylori và bệnh lý dạ dày tá tràng ở trẻ em bị đau bụng tái diễn. Tạp chí Y học thực hành, 449, 128 - 129. 2. Basso D, Zambon CF, Letley DP et al (2008). Clinical relevance of Helicobacter pylori cagA and vacA gen polymorphisms. Gastroenterology, 135, 91 - 99. 3. Sicheng Wenand Steven F. Moss (2009). Helicobacter pylorivirulence factors in gastric carcinogenesis. Cancer Lett, 282(1), 1 – 8. 4. Nguyen, H.T. V (2009). Diagnosis and treatment of Helicobacter pylori infection in Vietnamese children. Thesis for doctoral degree, paper III, 9 - 19. 5. Van Doorn LJ, Schneeberger PM, Nouhan N et al (2000). Importance of Helicobacter pylori cagA and vacA sta-tus for the efficacy of antibiotic treatment. Gut, 46(3), 321 – 326. 6. TANEIKE* I (2009). Analysis of drug resistance and virulence-factor genotype of Irish Helicobacter pylori strains: is there any relationship between resistance to metronida- zole and cagA status? Aliment Pharmacol Ther, 30, 784 – 790. 7. Agudo S, Perez-Perez G, Alarcon T, Lopez-Brea M (2010). High prevalence of clarithromycin-resistant Helicobacter pylori strains and risk factors associated with resistance in Madrid, Spain. J Clin Micro-biol. 48(10), 3703 – 3707. 8. Antibiotic Susceptibility., Resistance. Francis Megraud et al. http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/boofself. 9. McNulty C, Owen R, Tompkins D et al (2002). Helicobacter pylori susceptibility test- ing by disc diffusion. J Antimicrob Chemother. 49(4), 601 – 609. 10. Sushil Kumar (2008). Direct detection and analysis of vacA gene of Helicobacter pylori from gastric biopsies by a novel multi- plex polymerase chain reaction assay. Diag- nostic Microbiology and Infectious Disease, 62, 366 - 373.limentarhar 11. Trần Thiện Trung, Lê Châu Hồng Quốc Chương, Trần Anh Minh và cộng sự (2010). Kết quả nghiên cứu các túyp gen cagA và vacA của Helicobacter pylori trong ung thư dạ dày. Y học thành phố Hồ Chí Minh, 14(4), 25 - 34. 50 TCNCYH 96 (4) - 2015 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 12. Homan M (2014). Prevalence of the Helicobacter pylori babA2 gene and correla- tion with the degree of gastritis in infected Slovenian children. Antonie van Leeuwen- hoek . 106, 637 – 645. 13. HUSSON M (1995). Importance in Di- agnosis of Gastritis of Detection by PCR of the cagA Gene in Helicobacter pylori Strains Iso- lated from Children. Journal of clinical microbi- ology, 33, 3300 – 3303.A 14. Ghotaslou R (2013). Relationship Be- tween Drug Resistance and cagA Gene in Helicobacter pylori. Jundishapur J Microbiol, 6 (10), 8480. 15. Karabiber H (2014). Virulence Factors and Antibiotic resistance in children with Helicobacter pylori Gastritis. JPGN, 58(5), 608 - 612. 16. Francesco V (2006). Claritromycin Resistance and Helicobacter pylori Genotypes in Italy. The Journal of Microbiology, 44( 6), 660 - 664. 17. Lê Quý Hưng, Hà Thị Minh Thi (2013). Nghiên cứu xác định kiểu gene cagA VÀ vacA của helicobacter pylori ở bệnh nhân ung thư dạ dày. Tạp chí Y Dược học - Trường ðại học Y Dược Huế, 14, 118 - 125.A Summary STUDY ON cagA and vacA GENES OF HELICOBACTER PYLORI ANTIBIOTIC RESISTANCE ISOLATED FROM PEDIATRIC PATIENTS IN VIETNAM Helicobacter pylori (H. pylori) resistance antibiotic is major cause of failure to eradicate H. pylori. Recently, a number of studies has showed that virulence genes associated with H. pylori antibiotics resistance can be isolated from adult peptic ulcer patients. Up to now, however, there is a lack of evidene about this relevance in children patient. This study aimed to evaluate the association between H. pylori antibiotic resistance and the presence of cagA and vacA genes in pediatric patients. Between Jan 2012 to Sep 2013, 150 pediatric patients of the National Hospital of Pediatrics were identified to be infected with H. pylori antibiotic resistance strains, and cagA and vacA gene was detected by using multiplex PCR. The result showed that the cagA gene was detected in 34% H. pylori strains. The rate of vacAs1, vacAs2, vacAm1, vacAm2, vacAs1/m1, vacAs1/m2 and vacAs2/m2 were 39.3%, 14.7%, 37.3%, 23.3%, 16.7%, 11.3% and 6.6%, respectiverly. 8% strains harboured three virulence genes cagA, vacAm1 and vacAs1. The prevalence of cagA and the vacA alleles distribution did not show a significantly difference between susceptible and antibiotics resistance groups. Therefore, it may not be necessary to administrate diffirent treatment regimens for children who are infected by antibiotic resistance H. pylori with cagA, vacA positive. Key words: Helicobacter pylori, resistance antibiotic, children, cagA, vacA gene