Nghiên cứu định lượng đồng thời các Saponin chính trong viên nang mềm sâm Việt Nam bằng phương pháp Hplc-Cad

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 234 NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CÁC SAPONIN CHÍNH TRONG VIÊN NANG MỀM SÂM VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC-CAD Bùi Hồng Ngọc Vân Anh*, Nguyễn Trường Huy**, Huỳnh Trần Quốc Dũng***, Vũ Huỳnh Kim Long**, Nguyễn Minh Cang**, Vũ Duy Dũng****, Nguyễn Minh Đức*,** TÓM TẮT Mục tiêu: Đề tài nhằm nghiên cứu phương pháp định lượng các saponin chính trong viên nang mềm Sâm Việt Nam (SVN) bằng phương pháp HPLC với detector CAD (Charged Aerosol Detector). Phương pháp nghiên cứu: Quy trình định lượng đồng thời các saponin chính gồm ginsenosid-Rb1 (G-Rb1), ginsenosid-Rd (G-Rd), ginsenosid-Rg1 (G-Rg1) và majonosid -2 (M-R2) trong viên nang mềm SVN trải qua bước chiết xuất tinh chế các saponin bằng phân bố lỏng-lỏng với các hệ dung môi thích hợp, xử lý loại tạp bằng chiết xuất cột pha rắn (SPE) trước khi phân tích định lượng trên hệ thống HPLC-CAD sử dụng cột C-18 với hệ gradient pha động gồm CH3CN-H2O. Kết quả và bàn luận:Qua thẩm định quy trình định lượng HPLC-CAD cho thấy có sự tuyến tính theo hàm logarith giữa nồng độ các chất định lượng và diện tích đỉnh tương ứng với hệ số tương quan R2 ≥ 0,997. Khoảng tuyến tính của G-Rb1 là 0,0015 – 0,0048 mg/ml, G-Rd là 0,00125 – 0,004 mg/ml, G-Rg1 là 0,05 – 0,16 mg/ml và M-R2 là 0,075 – 0,24 mg/ml, với hệ số tương quan lần lượt là 0,998; 0,998; 0,997và 0,997. Quy trình đạt yêu cầu về độ lặp lại (RSD < 2%) và độ đúng trong khoảng 90 – 110%. Kết luận: Phương pháp định lượng HPLC-CAD đã nghiên cứu có thể ứng dụng để định lượng đồng thời các saponin chính gồm G-Rb1, G-Rd, G-Rg1, và M-R2 trong viên nang mềm SVN. Từ khóa: Sâm Việt Nam, viên nang mềm, HPLC-CAD, ginsenosid, majonosid-R2. ABSTRACT SIMULTANEOUS QUANTITATIVE ANALYSIS OF MAJOR SAPONINS IN VIETNAMESE GINSENG SOFT CAPSULES BY HPLC-CAD Bui Hong Ngoc Van Anh, Nguyen Truong Huy, Huynh Tran Quoc Dung, Vu Huynh Kim Long, Nguyen Minh Cang, Vu Duy Dung, Nguyen Minh Duc * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 2- 2019: 234-241 Objectives: This study is to develop a simultaneous quantitative analysis of majors saponin in VG soft capsules by HPLC-CAD. Methods: A quantitative procedure was developed to determine the content of major saponins in VG soft capsules including ginsenoside-Rb1 (G-Rb1), ginsenosid-Rd (G-Rd), ginsenoside-Rg1 (G-Rg1) and majonoside-R2 (M-R2). Firstly, saponins in the capsules were extracted by liquid-liquid partition with suitable solvent mixtures and then the sample was purified by SPE before introducing to an HPLC-CAD system using a C18 column with a mobile phase of CH3CN-H2O in gradient mode. *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh **Khoa Dược, Đại học Tôn Đức Thắng ***Bệnh viện Y học Cổ truyền Thành phố Hồ Chí Minh ****Trung tâm Ươm tạo và Hỗ trợ Doanh nghiệp Khoa học và Công nghệ Tác giả liên lạc: GS.TS. Nguyễn Minh Đức ĐT: 0908 988 820 Email: nguyenminhduc@tdtu.edu.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 235 Results and discussion: Upon validation using ICH guidelines, the procedure showed to be reliable with good logarithmic linearity with R2 ≥ 0.997, high reproducibility (%RSD < 2%) and the recovery of saponins in the range of 90-110%. Conclusion: The result showed the developed HPLC-CAD method can be used for simultaneous quantitative analysis of major saponins in VG soft capsules including G-Rb1, G-Rd, G-Rg1, và M-R2 Key words: Vietnamese gingseng, soft gelatin capsule, HPLC-CAD, ginsenoside, majonoside-R2. MỞ ĐẦU Sâm Việt Nam (SVN), còn gọi là Sâm Ngọc Linh, Sâm Khu 5, có tên khoa học là Panax vietnamensis Ha et Grushv, họ Araliaceae, là một loài thuộc chi Panax được tìm thấy ở Việt Nam năm 1973 ở vùng núi Ngọc Linh thuộc tỉnh Kon Tum. Trải qua hơn 40 năm, nhiều nghiên cứu về hóa học cũng như dược lý tiến hành trên SVN đã giúp khẳng định giá trị của loài sâm quý này của đất nước ta. Về thành phần hóa học, hàm lượng saponin toàn phần của SVN rất cao (10-15%) bao gồm các saponin thường gặp ở Nhân sâm thuộc nhóm protopanaxadiol (G-Rb1, G-Rb2, G-Rd ) và protopanaxatriol (G-Rg1, G-Re ). Đặc biệt, SVN chứa các saponin nhóm ocotillol trong đó có majonoside R2 với hàm lượng vượt trội (>5%) so với các loài Panax khác(4-6). Các nghiên cứu về dược lý cũng cho thấy SVN có tác dụng tăng lực, chống stress, điều hòa miễn dịch, bảo vệ gan, kháng ung thư in vitro(2,7-9). Nhân sâm (Panax ginseng CA Meyer), một vị thuốc bổ nổi tiếng của y học phương đông, hiện được sản xuất dưới nhiều dạng chế phẩm phong phú như cao lỏng, cao khô, viên nén, viên nang, sâm tẩm mật ong, trà hòa tan, nước uống bổ dưỡng, tăng lực Trong khi đó, tuy đã được xác định là một sản phẩm quốc gia có giá trị cao nhưng hiện nay SVN được lưu hành trên thị trường chủ yếu dưới dạng dược liệu tươi, dược liệu khô hoặc dùng dưới dạng bào chế truyền thống như thuốc sắc hoặc rượu thuốc. Việc này đã hạn chế giá trị làm thuốc của SVN do các dạng dùng trên khó kiểm soát được liều lượng hoạt chất, không đảm bảo chất lượng trong quá trình bảo quản lưu hành và không thuận lợi khi sử dụng, Việc nghiên cứu bào chế các dạng dùng mới từ SVN một mặt giúp nâng cao giá trị và hiệu quả của SVN nhưng mặt khác cũng đặt ra câu hỏi về vấn đề kiểm soát chất lượng. Vì vậy, mục tiêu của đề tài này là nghiên cứu một quy trình định lượng đồng thời các saponin chính trong viên nang mềm SVN đáng tin cậy để có thể kiểm tra và đảm bảo chất lượng chế phẩm. NGUYÊN VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên vật liệu: Nguyên liệu nghiên cứu Viên nang mềm SVN do Trung tâm Ươm tạo và Hỗ trợ Doanh nghiệp KH & CN, Bộ Khoa học và Công nghê sản xuất. Chất chuẩn đối chiếu Các chất chuẩn đối chiếu sử dụng gồm G- Rb1 (99,17%), G-Rd (94,48%); G-Rg1 (96,43%); và M-R2 (98,86%) do Ban Nghiên cứu Khoa học và Thư viện Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh cung cấp. Hóa chất, dung môi Methanol, acetonitril (J.T. Baker, Mỹ, HPLC-grade). Nước cất 2 lần được sản xuất từ hệ thống cất nước 2 lần Aquatron, đạt tiêu chuẩn HPLC. Các dung môi dùng trong xử lý mẫu đạt tiêu chuẩn phân tích. Trang thiết bị Hệ thống HPLC Thermo Ultimate 3000 với đầu dò CAD (Thermo Scientific, Mỹ) và cột sắc ký Shim-pack GISK C18 (150 x 4,6 mm, 5μm). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 236 Phương pháp nghiên cứu Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng saponin chính trong Sâm Việt Nam bằng phương pháp HPLC-CAD Khảo sát quy trình tách hoạt chất ra khỏi dịch đóng nang bằng phương pháp lắc phân bố với dung môi hữu cơ(3): Cân 20 viên nang mềm SVN, xác định khối lượng trung bình. Cân chính xác lượng dịch viên tương ứng với khối lượng 1 viên (400 mg) vào becher 50 ml. Thêm 10 ml dung môi I (hexan – methanol – nước, 4:3:2, lớp trên) vào becher chứa dịch nang, siêu âm từ 3 đến 5 phút ở 25 – 30 oC, gạn dịch vào bình lắn gạn. Thêm 10 ml dung môi II (hexan – methanol – nước, 4:3:2, lớp dưới) vào phần cắn còn lại trong becher, siêu âm từ 3 đến 5 phút ở 25 – 30 oC, gạn dịch vào bình lắng gạn. Lặp lại bước trên 2 lần. Lắc đều dịch trong bình lắng gạn (~ 60 ml), để yên đến khi phân tách hoàn toàn. Lấy lớp bên dưới vào chén sứ, cô đến cắn, hòa tan cắn trong 1 ml methanol 100%. Lặp lại quá trình chiết lỏng lỏng và các dịch chiết được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM) cùng với hỗn hợp các chất chuẩn để đối chiếu trên silica gel F254, khai triển với hệ dung môi CHCl3 - MeOH - H2O (65:35:10, lớp dưới), phát hiện bằng dung dịch acid sulfuric 10% trong ethanol, sấy ở 105 oC đến khi hiện màu. Tinh chế mẫu qua cột SPE (Solid Phase Extraction) Dịch chiết sau khi lắc phân bố, tách hoạt chất ra hỗn dịch dầu được gộp chung vào chén sứ, cho bay hơi ở 45 – 50 oC đến cắn. Hòa tan cắn trong 9 ml methanol 10%, siêu âm từ 3 đến 5 phút ở 25 – 30 oC. Dịch sau siêu âm được nạp lên cột SPE C18 đã hoạt hóa bằng 9 ml MeOH 100% và cân bằng với 9 ml MeOH 10%. Mẫu trên cột SPE được loại tạp với 9 ml MeOH 10% và rửa giải với 9 ml MeOH 100% vào bình định mức 10 ml. Cột SPE sau khi rửa giải được rửa với 9 ml MeOH 100%. Tiến hành thu thập các dịch sau: dịch viên nang mềm SVN trước khi qua cột SPE, dịch nang sau khi qua cột SPE, dịch loại tạp methanol 10%, dịch methanol 100% rửa giải saponin và dịch methanol rửa cột. Các dịch này sau đó được kiểm tra bằng SKLM. Định lượng hoạt chất chính bằng HPLC với đầu dò CAD 10 μl dịch chiết sau khi xử lý được bơm vào hệ thống HPLC-CAD sử dụng cột Shim- pack GISK C18 (150 x 4,6 mm, 5μm), tốc độ dòng 1 ml/phút với pha động bao gồm acetonitril (A) và nước (B) theo chương trình rửa giải gradient trong Bảng 1. Bảng 1: Chương trình rửa giải gradient định lượng trong dịch nang SVN Thời gian (phút) Acetonitril (%) Nước (%) 0 → 17 19,5 → 25 80,5 → 75 17 → 23 25 → 29 75 → 71 23 → 26 29 → 29 71 → 71 26 → 40 29 → 40 71 → 60 40 → 50 40 → 70 60 → 30 50 → 65 70 → 70 30 → 30 65 → 66 70 → 19,5 30 → 80,5 66 → 76 19,5 → 19,5 80,5 → 80,5 Thẩm định quy trình định lượng Phương pháp HPLC-CAD được đánh giá theo hướng dẫn của ICH bao gồm các chỉ tiêu tính tương thích hệ thống, độ đặc hiệu, tính tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng(1). Kiểm nghiệm viên nang mềm thành phẩm bằng phương pháp sắc ký - Định tính: Sử dụng phương pháp SKLM, yêu cầu trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết chính cùng màu và có giá trị Rf tương đương với Rf của các vết chất chuẩn. Sử dụng bản mỏng silica gel F254, với hệ dung môi CHCl3 - MeOH - H2O (65:35:10, lớp dưới), hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10% trong ethanol, sấy ở 105 oC đến khi hiện màu. Dung dịch chuẩn: Hòa 1 mg mỗi chuẩn G- Rb1, G-Rd, G-Rg1 và M-R2 trong 1 ml MeOH để làm chuẩn. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 237 Dung dịch thử: Hòa 50 mg dịch nang với 0,5 ml dung dịch butanol bão hòa hơi nước, thêm 0,5 ml nước vào hỗn hợp trên, lắc đều, để yên chờ dung dịch tách lớp hoàn toàn. Lấy lớp trong bên trên để chấm sắc ký. - Định lượng: Áp dụng quy trình HPLC- CAD đã xây dựng và thẩm định để định lượng hàm lượng saponin chính trong 1 viên nang mềm. KẾT QUẢ Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng saponin chính trong viên nang mềm SVN bằng phương pháp HPLC-CAD Kết quả khảo sát chiết xuất saponin từ dịch nang Dịch nang được chiết lỏng-lỏng với dung môi I (hexan – methanol – nước, 4 : 3 : 2, lớp trên) và dung môi II (hexan – methanol – nước, 4 : 3 : 2, lớp dưới). Kiểm tra các dịch chiết bằng SKLM cho thấy sau 4 lần lắc phân bố, các saponin chính G-Rb1, G-Rd, G-Rg1 và M-R2 đã được chiết hoàn toàn. Dịch chiết lần thứ 5 không còn hiện vết trên bản mỏng (Hình 1) và không còn pic các sapomim trên sắc ký đồ HPLC so sánh với dung dịch chuẩn (Hình 2). Do đó có thể áp dụng quy trình tách hoạt chất ra khỏi dịch đóng nang viên nang mềm Sâm Việt Nam bằng phương pháp lắc phân bố được trình bày ở trên với 4 lần lắc phân bố với dung môi II (hexan– methanol–nước, 4 : 3 : 2, lớp dưới). Hình 1: Sắc đồ SKLM kiểm tra quy trình tách saponin ra khỏi hỗn dịch nang thuốc. HHC: Hỗn hợp chuẩn. Lần 1, lần 2, lần 3, lần 4, lần 5: dịch chiết phân bố thu được trong lần chiết thứ 1, 2, 3, 4, 5. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 238 Hình 2: Sắc ký đồ HPLC kiểm tra qúa trình chiết tách hoạt chất ra khỏi hỗn dịch dầu. A. Sắc ký đồ hỗn hợp chất chuẩn. B. Sắc ký đồ dịch nang thuốc xử lý lần 5 Kết quả khảo sát xử lý mẫu qua cột SPE Kết quả khảo sát quá trình xử lý mẫu qua cột SPE được trình bày trong Hình 3. Với phương pháp đã áp dụng, các saponin G-Rb1, G-Rd, G-Rg1, và M-R2 không bị hao hụt đáng kể trong quá trình nạp mẫu, loại tạp và được rửa giải hoàn toàn ra khỏi cột. Do đó có thể áp dụng quy trình xử lý mẫu qua cột SPE đã trình bày để tinh chế mẫu trước khi định lượng bằng HPLC. Hình 3: Sắc ký lớp mỏng kiểm tra quy trình xử lý mẫu qua cột SPE. HHC: Hỗn hợp chuẩn. 1: Dịch chiết VNM trước khi qua cột. 2: Dịch VNM sau khi qua cột. 3: Dung dịch methanol 10% loại tạp. 4: Dung dịch methanol 100% rửa giải saponin. 5: Dung dịch methanol 100% rửa cột. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 239 Thẩm định quy trình định lượng HPLC-CAD Tính tương thích của hệ thống Bảng 2: Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống trên mẫu chuẩn nồng độ 100% (n = 6) Diện tích pic (RSD%) Thời gian lưu (RSD%) Hệ số bất đối trung bình (Astb) Số đĩa lý thuyết trung bình (Ntb) G- Rb1 1,47 0,14 0,91 326710.83 G-Rd 1,63 0,15 0,91 387944,33 G- Rg1 1,73 0,89 0,86 30493,50 M-R2 1,62 0,71 0,85 31407,50 Hỗn hợp chuẩn G-Rb1, G-Rd, G-Rg1 và M-R2 nồng độ 100% được bơm liên tiếp 6 lần vào hệ thống HPLC-CAD và% RSD của diện tích đỉnh, thời gian lưu, hệ số bất đối và số đĩa lý thuyết được trình bày ở Bảng 2. Giá trị RSD của các thông số khảo sát gồm diện tích pic, thời gian lưu đều < 2%, hệ số bất đối 0,8 1000 chứng tỏ quy trình có tính tương thích hệ thống (Bảng 2). Tính đặc hiệu Tiến hành sắc ký mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn. Kết quả cho thấy: mẫu thử có các pic tương ứng về thời gian lưu với mẫu chuẩn và mẫu trắng không có pic trùng với pic G-Rb1, G-Rd, G-Rg1 và M- R2 trong mẫu chuẩn. Khi thêm chất chuẩn vào mẩu thử, diện tích đỉnh tương ứng với chất chuẩn của mẫu thử tăng lên (Hình 4). Do đó, quy trình phân tích đạt tính đặc hiệu. Hình 4: Sắc ký đồ HPLC khảo sát tính đặc hiệu của phương pháp định lượng A: Mẫu trắng. B: Mẫu chuẩn. C: Mẫu thử. D: Mẫu thử thêm chuẩn Tính tuyến tính Giai mẫu gồm 6 nồng độ của mỗi chuẩn G-Rb1, G-Rd, G-Rg1 và M-R2 được bơm vào hệ thống HPLC. Bảng 3 cho thấy có sự tương quan nồng độ (x) và diện tích đỉnh (y) của các saponin theo hàm logarith thập phân với hệ số tương quan trên 0,997. Vì vậy quy trình đạt tính tuyến tính trong định lượng các saponin chính trong viên nang mềm SVN. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 240 Bảng 3: Kết quả khảo sát tính tuyến tính của phương pháp định lượng. Saponin Phương trình hồi quy R 2 Khoảng tuyến tính (mg/ml) LOD (mg/ml) LOQ (mg/ml) G-Rb1 logy = 0,9036logx + 1,3596 0,998 0,0015 – 0,048 0,00048 0,0012 G-Rd logy = 0,9135logx + 1,3135 0,998 0,00125 – 0,04 0,0004 0,0008 G-Rg1 logy = 0,8673logx + 1,1979 0,997 0,005 – 0,16 0,00128 0,0032 M-R2 logy = 0,8545logx + 1,2345 0,997 0,0075 – 0,24 0,0016 0,0032 Độ lặp lại Sáu mẫu thử được chuẩn bị và bơm vào hệ thống HPLC. Kết quả phân tích độ lặp lại 6 lần mẫu thử được trình bày ở Bảng 4 cho thấy quy trình có độ lặp lại cao với giá trị% RSD của 6 lần định lượng ≤ 3,5%, chứng tỏ quy trình có tính lặp lại và phù hợp để định lượng các hợp chất tự nhiên trong chế phẩm. Bảng 4: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng trên mẫu chuẩn (n = 6) Mẫu G-Rb1 (%) G-Rd (%) G-Rg1 (%) M-R2 (%) TB 0,31 0,23 0,90 1,65 SD 0,01 0,004 0,01 0,02 % RSD 3,23 1,74 1,11 1,21 Độ đúng Tiến hành định lượng mẫu thử đã thêm chuẩn ở nồng độ 80%, 100%, 120% nồng độ trong mẫu thử. Kết quả ở Bảng 5 cho thấy quy trình có độ phục hồi trong khoảng 90,08 – 97,35%, RSD ≤ 2,79%. Vậy quy trình đạt yêu cầu về độ đúng. Bảng 5: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng khi thêm mẫu chuẩn ở nồng độ 80%, 100%, 120% Saponin Khoảng độ đúng (%) Độ phục hồi trung bình (%) RSD (%) G-Rb1 90,19 – 95,99 93,21 2,14 G-Rd 90,81 – 93,76 92,07 1,00 G-Rg1 90,08 – 95,08 91,91 2,33 M-R2 90,30 – 97,35 93,03 2,79 Kết luận: Quy trình định lượng các saponin chính bằng HPLC-CAD đáng tin cậy để ứng dụng trong kiểm nghiệm viên nang mểm SVN. Kết quả kiểm nghiệm viên nang mềm SVN thành phẩm Định tính Tiến hành SKLM, kết quả trong Hình 5 cho thấy trên sắc ký đồ của dung dịch 4 saponin chính (G-Rb1, G-Rd, G-Rg1 và M-R2) trong viên nang mềm SVN có các vết chính cùng màu và có giá trị Rf tương đương với Rf của các vết chất chuẩn. Như vậy viên thành phẩm ở 3 lô thử nghiệm đạt chỉ tiêu về định tính. Hình 5: Sắc đồ SKLM định tính nang mềm SVN Định lượng Quy trình định lượng sau khi thẩm định đã được áp dụng để định lượng 4 saponin chính G-Rb1, G-Rd, G-Rg1 và M-R2 trong viên nang mềm SVN. Kết quả được trình bày trong Bảng 6. Mỗi viên nang mềm Sâm Việt Nam 400 mg có chứa 12,38 ± 0,134 mg tổng cộng 4 saponin chính (chiếm 3,09%/ viên), trong đó hàm lượng G-Rb1 là 1,26 ± 0,017 mg (chiếm 0,32%/ viên), G-Rd là 0,92 ± 0,010 mg (chiếm 0,23%/ viên), G-Rg1 là 3,63 ± 0,055 mg (chiếm 0,91%/ viên) và M-R2 là 6,57 ± 0,061 mg (chiếm 1,64%/ viên). RSD của các saponin định lượng và tổng 4 saponin định lượng < 2%. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 241 Bảng 6: Kết quả định lượng các saponin chính trong viên nang mềm SVN (n = 3). STT Hàm lượng trong một viên Tổng hàm lượng các saponin chính trong 1 viên G-Rb1 G-Rd G-Rg1 M-R2 % mg % mg % mg % mg % mg 1 0,31 1,24 0,23 0,92 0,9 3,6 1,64 6,56 3,08 12,32 2 0,32 1,27 0,23 0,91 0,9 3,59 1,63 6,52 3,07 12,28 3 0,32 1,27 0,23 0,93 0,92 3,69 1,66 6,64 3,13 12,53 TB 0,32 1,26 0,23 0,92 0,91 3,63 1,64 6,57 3,09 12,38 SD 0,005 0,017 0,000 0,010 0,011 0,055 0,015 0,061 0,032 0,134 %RSD 1,82 1,37 0,00 1,09 1,27 1,52 0,93 0,93 1,04 1,09 BÀN LUẬN Đề tài đã nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng 4 saponin chính (G-Rb1, G-Rd, G-Rg1 và M-R2) trong viên nang mềm SVN trải qua các bước chiết xuất phân bố saponin từ dịch nang mềm, tinh chế mẫu bằng SPE trước khi định lượng bằng phương pháp HPLC với detector CAD. Phương pháp HPLC-CAD xây dựng đã được thẩm định theo các hướng dẫn của ICH về tính tương thích hệ thống, độ đặc hiệu, tính tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng và đã chứng tỏ đáng tin cậy. Đặc biệt, detector CAD lần đầu tiên áp dụng vào định lượng saponin trong SVN đã chứng minh khả năng phát hiện và định lượng tốt các saponin nhóm occotillol không có nhóm nối đôi trong phân tử, tiêu biểu là M-R2, được xem là một hoạt chất chính của SVN. KẾT LUẬN Quy trình định lượng 4 saponin chính (G- Rb1, G-Rd, G-Rg1 và M-R2) trong viên nang mềm SVN bằng phương pháp HPLC-CAD đã chứng tỏ tính chính xác và đáng tin cậy, có thể ứng dụng để định lượng đồng thời các saponin chính trong viên naang mềm SVN. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. ICH Harmonised Tripartite Guideline (2005), Validation of analytical procedures: text and methodology Q2 (R1), International Conference on Harmonization, Geneva, Switzerland. 2. Konoshima T, Takasaki M, et al. (1998), "Anti-tumor- promoting activity of majonoside-R2 from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv, (I)", Biol Pharm Bull, 21(8): pp.834-838. 3. Li W, Fitzloff JF(2002), "HPLC determination of ginsenosides content in ginseng dietary supplements using ultraviolet detection", Journal of liquid chromatography & related technologies, 25 (16), pp.2485-2500. 4. Nguyen Minh Duc, Nguyen Thoi Nham, Kasai R, Ito A, Yamasaki K, Osamu Tanaka O (1993), "Saponins from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv, Collected in central Vietnam, I,", Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 41(11): pp.2010-2014. 5. Nguyen Minh Duc, Nguyen Thoi Nham, Kasai R, Ito A, Yamasaki K, Tanaka O (1994), "Saponins from Vietnamese Ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv, Collected in central Vietnam, II,", Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 42(1): pp.115-122. 6. Nguyen Minh Duc, Nguyen Thoi Nham, Kasai R, Ito A, Yamasaki K, Tanaka O (1994), "Saponins from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv, collected in central Vietnam, III,", Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 42(3): pp.634-640. 7. Nguyen Thi Thu Huong, Matsumoto K, Yamasaki K, Nguyen Minh Duc, Nguyen Thoi Nham, Watanabe H (1995), "Crude sponin extracted from Vietnamese ginseng and its major constituent majonoside-R2 attenuate the psychological stress-and foot-shock stress-induced antinociception in mice", Pharmacology Biochemistry and Behavior, 52(2): pp.427-432. 8. Nguyen Thi Thu Huong, Matsumoto K, Yamasaki K, Nguyen Minh Duc, Nguyen Thoi Nham Watanabe H (1996), "Effects of majonoside-R2 on pentobarbital sleep and gastric lesion in psychologically stressed mice", Pharmacology Biochemistry and Behavior, 53(4): pp.957-963. 9. Tran Le Quan, I, Ketut Adnyana, Yasuhiro Tezuka, Takema Nagaoka, Tran Kim Qui, Shigetoshi Kadota (2001), "Triterpene Saponins from Vietnamese Ginseng (Panax vietnamensis) and Their Hepatocytoprotective Activity", Journal of Natural Products, 64(4): pp.456-461. Ngày nhận bài báo: 18/10/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2018 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2019