Nghiên cứu công nghệ gắn thrombin và tanic acid lên băng gạc ở điều kiện nhiệt độ thường - Lê Minh Trí

Hóa học và Kỹ thuật môi trường L.M. Trí, Đ.T. Huyền, ,“Nghiên cứu công nghệ gắn thrombin nhiệt độ thường.” 190 NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ GẮN THROMBIN VÀ TANIC ACID LÊN BĂNG GẠC Ở ĐIỀU KIỆN NHIỆT ĐỘ THƯỜNG Lê Minh Trí1, Đoàn Thanh Huyền1, Ngô Thị Thúy Phương1, Đỗ Thị Tuyên2, Lê Thị Vui3. Tóm tắt: Sau khi tinh sạch được thrombin, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tỷ lệ phối trộn bổ sung giữa tannic acid và thrombin để tăng khả năng tạo thành fibrin từ fibrinogen. Trong nghiên cứu này chúng tôi đã nghiên cứu công nghệ gắn thrombin lên băng gạc ở điều kiện nhiệt độ thường với mong muốn thay thế băng gạc truyền thống vì có tác dụng chậm, giảm được giá thành, phục vụ cho sức khỏe cộng đồng. Kết quả cho thấy, thrombin gắn tannic acid ở nồng độ 0,025% tới 0,05% lên băng gạc có khả năng chuyển hóa fibrinogen và khả năng cầm máu tốt, hiệu quả so với băng gạc truyền thống. Từ khoá: Băng gạc, Thrombin,Tannic acid. 1. MỞ ĐẦU Thrombin là một serine proteinase, đóng vai trò quan trọng trong quá trình đông máu bằng cách chuyển fibrinogen thành fibrin và hoạt hóa yếu tố XIII giúp ổn định sợi huyết. Ở người, thrombin tồn tại dưới 3 dạng -, - và -thrombin. Trong đó, -thrombin đóng vai trò chính của quá trình đông máu. -Thrombin gồm hai chuỗi polypedtide A và B được liên kết bởi cầu disulfide với khối lượng phân tử khoảng 36kDa. Trong huyết tương người, thrombin tồn tại ở dạng prothrombin không hoạt động (với khối lượng khoảng 72 kDa) và khi bị tổn thương, prothrombin được hoạt hóa thành thrombin ở dạng hoạt động bởi prothrombinase.Trong y học, thrombin được ứng dụng như một chất cầm máu nhanh. Tannic acid là một dạng cấu trúc đặc biệt của tanin, một loại polyphenol, có độ acid yếu. Công thức hoá học của tannic acid là: C76H52O46. Hàm lượng tannic acid khác nhau trong mỗi loài thực vật khác nhau, ngay cả trong các bộ phận khác nhau của thực vật cũng có hàm lượng tannic acid khác nhau. Dựa trên các cơ sở khoa học của thrombin chúng tôi tiến hành nghiên cứu công nghệ gắn thrombin và tannic acid lên băng gạc với mong muốn thay thế băng gạc truyền thống có tác dụng chậm và giảm được giá thành sản phẩm, phục vụ cho sức khỏe cộng đồng. 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu Các loại băng gạc Urgo Durable, Urgo Washproof và băng gạc thường có kích thước tương ứng 2x6 cm, 4x6 cm và 10x10 cm có gắn 0,05% tannic acid trong nước muối 0,9%. 2.2. Hóa chất Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Viện Hóa học – Vật liệu, 10 - 2015 191 Một số hóa chất và dung dịch được sử dụng như: dung môi ethanol tuyệt đối (Trung Quốc), NaCl, CaCl2 (Merk), fibrinogen (Sigma). Các cột sắc ký trao đổi ion, cột sắc ký lọc gel (Pharmacy), . 2.3. Đánh giá khả năng chuyển hóa fibrinogen của dung dịch tannic acid 0,5% Dung dịch tannic acid 0,5% được khảo sát hoạt tính có trong mẫu với phản ứng 20 l fibrinogen trong 200 l NaCl 0,9%; sau đó bổ sung 50 l 0,05% tannic acid; với mẫu đối chứng không sử dụng tannic acid. Quan sát thời gian chuyển hóa fibrinogen thành fibrin. 2.4. Điện di SDS-PAGE Khối lượng phân tử tương đối của protein tinh sạch và độ sạch của các dịch protein được đánh giá bằng điện di trên gel polyacrylamide [6]. 2.5. Xác định hàm lượng protein Hàm lượng protein được xác định theo Bradford [3]. 2.6. Nghiên cứu các điều kiện gắn thrombin và acid tannic lên gạc Thrombin sau khi tinh sạch được kiểm tra điện di và hoạt tính chuyển hóa fibrinogen thành fibrin của thrombin. Dịch thrombin được phun lên băng gạc Urgo Durable, Urgo Washproof và băng gạc thường có kích thước tương ứng 2x6 cm, 4x6 cm và 10x10 cm có gắn dung dịch tannic acid 0,5% trong nước muối 0,9%. 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Tách chiết tinh sạch thrombin từ phổi bò Thrombin thô được tinh sạch từ phổi bò qua một số bước như: nghiền đồng thể trong lạnh, tủa bằng Mg(OH)2 và dung môi ethanol, chuyển sang dạng hoạt động khi có mặt của ion Ca2+. Dịch thrombin thô tiếp tục được qua hai cột phenyl sepharose 6 FF (HIC) và cột Ni2+- probond. Kết quả điện di đồ SDS_PAGE cho thấy đã thu được một băng protein sạch có khối lượng phân tử khoảng 37 kDa (hình 1). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với nghiên cứu trên thế giới [3,4,5]. Theo các nghiên cứu công bố đã tinh sạch được thrombin có khối lượng phân tử khoảng 36 kDa với độ sạch đạt 75% [1]. kDa 35  25  1 M 2 Hình 1. (A) Điện di đồ SDS-PAGE protein tinh sạch (M: Marker; 1-2: các phân đoạn tinh sạch thu thrombin); (B): hoạt tính thrombin chuyển hóa fibrinogen thành fibrin. Hóa học và Kỹ thuật môi trường L.M. Trí, Đ.T. Huyền, ,“Nghiên cứu công nghệ gắn thrombin nhiệt độ thường.” 192 Năm 1971, các nhà khoa học đã tách được thrombin từ rắn Crotalus adamanteus với khối lượng phân tử 32,7 kDa và xác định thrombin hoạt động với pH tối ưu gần pH = 8, ổn định ở pH trung tính và kiềm nhưng mất hoạt tính với pH acid [7]. 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của tannic acid tới hoạt tính thrombin Sau khi tinh sạch được thrombin, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tỷ lệ phối trộn bổ sung giữa tannic acid và thrombin để tăng khả năng tạo thành fibrin từ fibrinogen. Tannic acid là một loại polyphenol có tính acid yếu, có công thức hóa học là C76H52O46, khối lượng phân tử là 1701,2 g/mol. Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh hàm lượng tannic acid cao trong lá trắc bách diệp, lá tơ mành, lá cây quyển bá, cỏ nhọ nồi và đã được chứng minh có tác dụng làm co thành mạch máu, làm tăng hàm lượng protrompin toàn phần của máu rõ rệt và mạnh, làm tăng khả năng đông máu, rút ngắn thời gian chảy máu Tannic acid tham gia gián tiếp vào nhiều quá trình sinh lý như: tăng hiệu quả cầm máu, giảm huyết áp, giảm lipit huyết thanh và điều hòa đáp ứng miễn dịch. Trong chiến tranh, băng có tẩm tannic acid đã được điều trị bỏng do bom, khí độc và các chất gây bỏng trong chiến tranh. Tham khảo các nghiên cứu trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu tannic acid bổ sung với thrombin ở nồng độ phần trăm khác nhau. Sau đó mẫu được đánh giá bằng việc xác định thời gian chuyển hóa fibrinogen trước khi phun lên băng gạc. Bảng 2. Đánh giá sự ảnh hưởng của tannic acid đến thời gian chuyển hóa fibrinogen. ĐC (-) ĐC (+) Tỷ lệ phần trăm tannic acid 0,025% 0,05% 0,1% 0,25% 0,5% 1% 5% 10% NG 10s 10s 30s 1 phút 5 phút NG NG NG NG Kết quả cho thấy ở nồng độ tối đa 0,05% tannic acid đã không ảnh hưởng đáng kể so với hoạt tính ban đầu của thrombin. Trong khi đó, hoạt tính thrombin giảm đáng kể khi nồng độ tannic acid đạt 0,1% trở lên. Điều đó cho thấy, tannic acid ở nồng độ cao đã ảnh hưởng mạnh tới hoạt tính thrombin. Hình 2. Sự chuyển hóa fibrinogen của thrombin với nồng độ tannic acid khác nhau (ĐC: không có thrombin; ĐC (+): có thrombin;1: thrombin với 0,025% tannic acid; 2: thrombin với 0,05% tannic acid; 3: thrombin với 0,1% tannic acid; 4: thrombin với 0,25% tannic acid; 5: thrombin với 0,5% tannic acid; 6: thrombin với 1% tannic acid; 7: thrombin với 5% tannic acid; 8: thrombin với 10% tannic acid). Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Viện Hóa học – Vật liệu, 10 - 2015 193 So sánh kết quả đánh giá thrombin của Sigma tại nồng độ 0,1% tannic acid cho thấy tannic acid ở nồng độ cao ảnh hưởng tới hoạt tính thrombin. Hình 3. Sự chuyển hóa fibrinogen của thrombin của sigma (ĐC: không có thrombin; ĐC (+): thrombin tách từ phổi bò; 1: thrombin của sigma; 2: thrombin của sigma với 0,1% tannic acid). Từ những số liệu thu được cho thấy nồng độ tannic acid càng cao càng làm giảm hoạt tính thrombin. Nồng độ tannic acid có thể được sử dụng để bổ sung với thrombin tối đa đạt 0,05% đến 0,1%. 3.3. Nghiên cứu công nghệ gắn thrombin lên băng gạc ở điều kiện nhiệt độ thường Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành gắn thrombin lên 3 loại băng gạc (hình 3). Đối với loại băng cá nhân Urgo Durable: có kích thước 2x6 cm với đặc tính: nền vải đàn hồi, thông thoáng tốt giúp vết thương mau lành; tính chất co giãn của nền vải phù hợp với mọi vị trí khác nhau của vết thương, giúp tạo cảm giác thoải mái cho người sử dụng. Urgo Durable với chất keo oxit kẽm không dùng dung môi nên không có mùi, giúp giảm nguy cơ dị ứng, có độ dính cao, đáp ứng các yêu cầu về y tế. Màng polyethylene trong suốt ngăn cách giữa vết thương và lớp gạc giúp người sử dụng vẫn có thể làm việc bình thường nhưng vẫn đảm bảo thay băng dễ dàng và không đau. Dựa trên những đặc tính có sẵn của loại băng này chúng tôi bổ sung trực tiếp 200 l dung dịch 0,05% tannic acid lên miếng gạc urgon, để ở nhiệt độ thường, cho dịch tannic acid khô một cách tự nhiên. Bảo quản băng urgon ở nhiệt độ thường để sử dụng. Cách sử dụng: Băng cá nhân vải co giãn, thông thoáng, keo oxit kẽm màu trắng đục. Băng có gạc nằm gọn trong băng và phủ lưới chống dính kết hợp với thrombin một chất chống đông máu nên băng Urgo Durable giúp cầm máu tức thì. Lưu ý: vệ sinh da và lau khô trước khi dán băng. Đối với loại băng gạc Urgo Washproof có kích thước 4x6cm: Băng cá nhân với nền polyethylene hợp màu da, lỗ thông lớn, thông thoáng tốt giúp vết thương mau lành, keo Acrylic không dùng dung môi, dung nạp tốt, độ dính cao. Urgo Washproof với lớp màng trên cùng bằng polyethylene trong suốt ngăn cách giữa vết thương và lớp gạc giúp người sử dụng vẫn có thể làm việc bình thường nhưng vẫn đảm bảo thay băng dễ dàng và không đau. Đối với loại băng này chúng tôi tiến Hóa học và Kỹ thuật môi trường L.M. Trí, Đ.T. Huyền, ,“Nghiên cứu công nghệ gắn thrombin nhiệt độ thường.” 194 hành bổ sung 300 l dung dịch 0,05% tannic acid lên miếng gạc urgon, để ở nhiệt độ thường, cho dịch tannic acid khô một cách tự nhiên. Bảo quản băng urgon ở nhiệt độ thường để sử dụng. A B C Hình 4. (A) Băng cá nhân Urgo Durable có kích thước nhỏ 2x6cm có gắn tannic acid; (B) Băng gạc urgo có kích thước nhỏ 4x6cm có gắn tannic acid (C) Băng gạc thường có kích thước 10x10cm có gắn 0,05% tannic acid. Đối với băng gạc thường: Băng thường dùng trong cấp cứu và ngoại khoa nhằm mục đích cầm máu: băng ép trong vết thương phần mềm có chảy máu; bảo vệ, che chở vết thương tránh cọ xát va chạm; chống nhiễm khuẩn thứ phát, thấm hút dịch, máu mủ; phối hợp với nẹp để cố định xương gãy tạm thời. Trong nghiên cứu này chúng tôi cũng tiến hành gắn tannic acid trên băng gạc thường với mục đích so sánh hiệu quả sử dụng giữa băng gạc urgo và băng gạc thường sau khi gắn 0,05% tannic acid. Cách gắn: Bổ sung 400 l dung dịch 0,05% tannic acid trực tiếp lên miếng gạc thường, để ở nhiệt độ thường, cho dịch 0,05% tannic acid khô một cách tự nhiên. Bảo quản băng urgon ở nhiệt độ thường để sử dụng. 4. KẾT LUẬN Từ những số liệu thu được cho thấy chúng tôi đã tìm được các điều kiện phương pháp gắn 0,05% tannic acid lên các loại gạc khác nhau. Băng gạc có kích thước 2x6cm và 4x6cm có thể bao trùm được các vết thương trên da và tận dụng được những đặc tính sẵn có của băng gạc Urgo Washproof và băng gạc Urgo Durable. Với việc bổ sung 200l và 300l 0,05% tannic acid. Chúng tôi đã tạo ra băng có khả năng cầm máu tức thì dựa vào hoạt tính sinh học của 0,05% tannic acid có khả năng chuyển hóa fibrinogen dạng hòa tan thành dạng không hòa tan fibrin. Bên cạnh đó chúng tôi cũng tiến hành bổ sung 400 l 0,05% tannic acid vào băng gạc thường để so sánh hiệu quả giữa các loại băng gạc khác nhau, nhằm tìm ra loại băng phù hợp nhất khi sử dụng trong việc tạo các băng gạc cầm máu tức thì. Tuy nhiên cần phải nghiên cứu các điều kiện bảo quản băng gạc tránh hiện tượng nhiễm khuẩn và đánh giá hiệu quả sau thời gian bảo quản khác nhau. Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Viện Hóa học – Vật liệu, 10 - 2015 195 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Aizawa P, Winge S, Karlsson G "Large-scale preparation of thrombin from human plasma". In. Elsevier 2008, pp 560-567. [2]. Bajzar L, Manuel R, Nesheim ME (1995) "Purification and characterization of TAFI, a thrombin-activable fibrinolysis inhibitor". In. ASBMB 1995, pp 14477-14484. [3]. Bradford MN "A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein- dye binding". Anal. Biochem. No72, 1976, pp248- 254. [4]. Dahlback Br "Purification of human vitamin K-dependent protein S and its limited proteolysis by thrombin". In Elsevier 1983, pp 837-846. [5]. Fenton JW, Fasco MJ, Stackrow AB "Human thrombins. Production, evaluation, and properties of alpha-thrombin". In. ASBMB 1977, pp 3587- 3598. [6]. Laemmli UK "Cleavage of structure proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4". Nature No 227,1970, pp 680- 685. [7]. Markland FS, Damus PS "Purification and properties of a thrombin-like enzyme from the venom of Crotalus adamanteus (Eastern diamondback rattlesnake)". In. ASBMB 1971, pp 6460-6473. ABSTRACT STUDUDYING IN SPRAY TECHNOLOGY THROBIN AND TANIC ACID IN GAUZE AT ROOM TEMPERATURE CONDITION Purification of thrombin from bovine lung by sepharose 6 FF (HIC) and Ni- NTA sepharose chromatography. Then, prothrombin was activated to thrombin (Mr = 36 kDa), which plays an important role in the blood coagulation system, activated by Ca2+. We studied on making additional mixing ratio between tannic acid and thrombin to make convert fibrinogen into fibrin. In this study, we had studied pray technology thrombin in dressings at room temperature condition for replacement of traditional dressings with slow effect, reduce costs and serve public health. Results showed that thrombin with tannic acid concentrations from 0.025% to 0.05% able to convert fibrinogen into fibrin and hemostasis well, efficiency compared to traditional gauze. Keywords: Gauze, Thrombin, Tannic acid. Nhận bài ngày 09 tháng 07 năm 2015 Hoàn thiện ngày 30 tháng 07 năm 2015 Chấp nhận đăng ngày 07 tháng 09 năm 2015 Địa chỉ: 1Viện Hoá học - Vật liệu/ Viện Khoa học và Công nghệ Quân sự. 2 Viện Công nghệ sinh học/ Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; 3 Học viên cao học Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật. *Email: leminhtri1975@yahoo.com.vn