Tài liệu Nghiên cứu chuyển gen kháng sâu cryiab vào cây cà chua (lycopersicon esculentum mill.) bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn agrobacterium tumefaciens - Lê Tấn Đức: TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 205-211
205
NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN KHÁNG SÂU cryIAb VÀO CÂY CÀ CHUA
(Lycopersicon esculentum Mill.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG VI KHUẨN
Agrobacterium tumefaciens
Lê Tấn Đức1*, Phạm Đức Trí1, Nguyễn Hữu Hổ1, Hà Trần Minh Dũng1, Dương Thị Ngọc Thi2
(1)Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)tanduc2007@gmail.com
(2)Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Nông nghiệp công nghệ cao tp Hồ Chí Minh
TÓM TẮT: Mục đích của nghiên cứu này là chuyển gen kháng sâu cryIAb vào cây cà chua (Lycopersicon
esculentum Mill.) bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium. Kháng sinh Kanamycin được dùng
như một chất chọn lọc. Chủng Agrobacterium tumefaciens EHA105 mang plasmid CAMBIA2301cryIAb
chứa gen kháng kanamycin (nptII), gen GusA và gen kháng sâu cryIAb. Chúng tôi nghiên cứu một vài yếu
tố ảnh hưởng đến khả năng chuyển gen cà chua như nồng độ của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và
nồng độ acetosyringone trong quá trình xâ...
7 trang |
Chia sẻ: quangot475 | Lượt xem: 727 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem nội dung tài liệu Nghiên cứu chuyển gen kháng sâu cryiab vào cây cà chua (lycopersicon esculentum mill.) bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn agrobacterium tumefaciens - Lê Tấn Đức, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 205-211
205
NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN KHÁNG SÂU cryIAb VÀO CÂY CÀ CHUA
(Lycopersicon esculentum Mill.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG VI KHUẨN
Agrobacterium tumefaciens
Lê Tấn Đức1*, Phạm Đức Trí1, Nguyễn Hữu Hổ1, Hà Trần Minh Dũng1, Dương Thị Ngọc Thi2
(1)Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)tanduc2007@gmail.com
(2)Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Nông nghiệp công nghệ cao tp Hồ Chí Minh
TÓM TẮT: Mục đích của nghiên cứu này là chuyển gen kháng sâu cryIAb vào cây cà chua (Lycopersicon
esculentum Mill.) bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium. Kháng sinh Kanamycin được dùng
như một chất chọn lọc. Chủng Agrobacterium tumefaciens EHA105 mang plasmid CAMBIA2301cryIAb
chứa gen kháng kanamycin (nptII), gen GusA và gen kháng sâu cryIAb. Chúng tôi nghiên cứu một vài yếu
tố ảnh hưởng đến khả năng chuyển gen cà chua như nồng độ của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và
nồng độ acetosyringone trong quá trình xâm nhiễm. Để phục vụ cho việc chuyển gen, lá mầm 10 ngày tuổi
được dùng làm nguyên liệu. Sau 2 ngày xử lí chuyển gen lá mầm được rửa và cấy trên môi trường tái sinh
MS có chứa chất sinh trưởng IAA (0,5 mg/l), BA (2 mg/l), chất chọn lọc kanamycin (100 mg/l) và 500
mg/l kháng sinh cefotaxime để diệt vi khuẩn. Sau vài tuần chọn lọc trong môi trường trên, các chồi kháng
chất chọn lọc kanamycin sẽ được chuyển sang môi trường MS để phát triển và tạo rễ. Sự biểu hiện của
gen GusA được kiểm tra bởi chất chỉ thị X-Glu. Sự hiện diện của gen nptII và gen cryIAb trong cây cà
chua giả định chuyển gen đã được khẳng định bằng kỹ thuật PCR. Sự biểu hiện của độc tố tạo bởi gen
kháng sâu cryIAb trong lá cây cà chua giả định chuyển gen đã được kiểm tra bởi Kit Quickstix strip của
công ty Envirologix (Mỹ).
Từ khóa: Agrobacterium tumefaciens, Lycopersicon esculentum, chuyển gen, plasmid, lá mầm, gen cryIA,
PCR.
MỞ ĐẦU
Cà chua là một loại rau ăn quả được trồng
rất phổ biến ở nhiều nước. Đây là loại rau quả
được ưa thích vì phẩm chất ngon và dễ chế biến.
Tính đa dụng và nhu cầu tiêu thụ cà chua tươi
ngày càng lớn đã thúc đẩy sự phát triển cây cà
chua như một trong những loại cây trồng chính.
Ngoài ra, trồng cà chua đã mang lại hiệu quả
kinh tế khá cao.
Ở Việt Nam, việc phát triển trồng cà chua
còn có ý nghĩa quan trọng về mặt luân canh,
tăng vụ và tăng năng suất trên đơn vị diện tích,
do đó cà chua là loại rau quả được khuyến khích
phát triển. Tuy nhiên, cà chua thường bị hại bởi
sâu ăn lá, đục quả (Heliothis armigera và
Spodoptera litura). Một số loại thuốc hóa học
bảo vệ thực vật được áp dụng vào các giai đoạn
khác nhau của cà chua để bảo vệ cây trồng
chống lại dịch hại. Tuy nhiên, dư lượng chất
hóa học của các loại thuốc này có thể tác hại
đến người tiêu dùng.
Có nhiều báo cáo về nghiên cứu chuyển
gen trên cây cà chua như các tác giả Cortina et
al. (2004) [2], Park et al. (2003) [11], Sarker et
al. (2009) [12]. Trong những nghiên cứu này, lá
mầm và lá thật được dùng làm nguyên liệu cho
việc chuyển gen cà chua thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens. Theo hướng nghiên
cứu này, chúng tôi tiến hành chuyển gen kháng
sâu cryIAb vào cây cà chua (Lycopersicon
esculentum Mill.) với hy vọng sự biểu hiện của
gen chuyển cryIA sẽ có tác dụng góp phần làm
giảm tác hại của sâu hại cà chua.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
Sử dụng giống cà chua vô hạn TN386,
TN148 của Công ty Trang Nông và giống Hồng
Châu của Công ty Sygenta.
Phương pháp
Môi trường nuôi cấy mô và điều kiện nuôi cấy
Môi trường gieo hạt là 1/2MS [10] không
chất điều hòa sinh trưởng.
Môi trường tiền tái sinh là MS với vitamin
B5 [7] có các chất điều hòa sinh trưởng 0,1 mg/l
NAA, 1 mg/l BA.
Môi trường tái sinh chồi từ lá mầm là MS với
Le Tan Duc, Pham Duc Tri, Nguyen Huu Ho, Ha Tran Minh Dung, Duong Thi Ngoc Thi
206
vitamin B5 có bổ sung các chất điều hòa sinh
trưởng 1 mg/l IAA, 2 mg/l BA.
Môi trường chọn lọc như môi trường tái
sinh có 100 mg/L kanamycin và 500 mg/l
cefotaxime.
Môi trường ra rễ là MS.
Điều kiện nuôi cấy trong 9 giờ chiếu
sáng/ngày, nhiệt độ 25-28oC.
Dòng vi khuẩn, môi trường và điều kiện
nuôi cấy
Sử dụng dòng vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens EHA 105 mang plasmid
pCAMBIA2301 chứa gen cryIAb, gen gusA (có
intron, promoter CaMV35S) và gen nptII (kháng
kanamycin) với promoter CaMV35S. Môi trường
giữ giống vi khuẩn là môi trường LB có 50 mg/l
kanamycin. Để nhân giống cho nghiên cứu
chuyển gen, vi khuẩn được nuôi lắc qua đêm
trong môi trường AB [3] cũng có nồng độ
kanamycin như trên và 50 mg/l rifamycin. Nhiệt
độ nuôi cấy ở 28oC.
Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch nuôi vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens với các nồng độ
khác nhau đến khả năng chuyển gen
Sử dụng dịch vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens với nồng độ OD ở bước sóng 600
nm là 0,5; 1 và 1,5 trong quá trình chuyển gen
với giống cà chua TN386. Sau 4 ngày xử lí
chuyển gen, các mẫu lá mầm được nhuộm với
dung dịch X-Gluc để kiểm tra khả năng chuyển
gen thông qua biểu hiện của gen gusA.
Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ
acetosyringone trong dịch nuôi vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens đến khả năng
chuyển gen
Để nâng cao tần số chuyển gen
acetosyringone được sử dụng với các nồng độ 50,
100 và 150 µM trong quá trình chuyển gen với
giống cà chua TN386. Sau 4 ngày xử lí chuyển
gen các mẫu lá mầm được nhuộm với dung dịch
X-Gluc để kiểm tra khả năng chuyển gen.
Quy trình chuyển gen
Các mẫu lá mầm 10 ngày tuổi từ cây in vitro
được sử dụng làm vật liệu chuyển gen.
Các bước chuyển gen: 1. Nuôi cấy lá mầm
trên môi trường MS có 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l
BA trong thời gian 2 ngày; 2. Gây nhiễm các
mẫu lá mầm với vi khuẩn trong thời gian 20
phút; vớt mẫu ra, thấm bớt dịch vi khuẩn thừa
bằng giấy lọc; 3. Nuôi chung mẫu lá mầm với vi
khuẩn trong 2 ngày; sử dụng môi trường như
trên nhưng có 100 µM acetosyringone; 4. Rửa
thật sạch vi khuẩn bằng nước cất và dung dịch
kháng sinh 500 mg/l cefotaxime (kết hợp lắc
nhẹ); 5. Vớt mẫu ra, thấm ráo nước và cấy các
mẫu lá mầm trên môi trường tái sinh có chọn
lọc. Thời gian nuôi 15 ngày/chu kỳ chọn lọc; 6.
Khi xuất hiện chồi tái sinh (cao khoảng 1-2 cm)
cấy truyền sang môi trường MS không chất sinh
trưởng đến khi vươn chồi tạo cây, thời gian nuôi
khoảng 1 tháng.
Kiểm tra cây chuyển gen
Thử GUS [6]: Dùng để kiểm tra sự biểu
hiện của gen chỉ thị gusA mã hóa enzyme β-
glucoronidase trong mô tế bào thực vật chuyển
gen. Lá mầm sau khi chuyển gen 4 ngày và chồi
con tái sinh được ngâm trong dung dịch X-Gluc
(5-bromo-4-cloro-3-indolyl-β-D-glucuronide) ở
nhiệt độ 37oC trong 20 giờ thì loại bỏ dung dịch
và thay bằng cồn 70% cho đến khi các điểm
xanh xuất hiện rõ ràng.
Phân tích bằng phương pháp sinh học phân
tử PCR: Cây con sau khi tái sinh chọn lọc được
tách chiết DNA nhiễm sắc thể từ lá theo phương
pháp của Dellaporta et al. (1983) [4].
Sự hiện diện của gen nptII và gen cryIAb
được kiểm tra dùng các cặp mồi đặc hiệu. Gen
nptII: Mồi 1 (F): 5’-GCACA ACAGA CAATC -
3’, Mồi 2 (R): 5’-CCGCC AAGCT CTTCA - 3’;
chương trình nhiệt: 94C: 5 phút; 35 chu kỳ
(94C: 1 phút, 58C: 1 phút, 72C: 1 phút); 72C:
5 phút; khuếch đại đoạn DNA 600 bp. Gen
cryIA(b) : Mồi 1 (F): 5’ - TTC CT T GGA CGA
AAT CCC ACC - 3’, Mồi 2 (R): 5’ - GCC AGA
ATT GAA CAC ATG AGC GC - 3’; chương
trình nhiệt: 94C: 4 phút; 35 chu kỳ (94C: 30
giây, 54C: 60 giây, 72C: 1 phút 30 giây); 72C:
10 phút; khuếch đại đoạn DNA 559 bp.
Kiểm tra biểu hiện của gen cryIAb: Kit của
Công ty Envirologix Quickstix (Hoa Kỳ) được
sử dụng để phát hiện protein độc tố tạo ra bởi
gen cry1Ab trong lá của cây cà chua chuyển
gen. Lá tươi của cây cà chua được nghiền trong
TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 205-211
207
tube
1,5 ml đến khi lá bị vỡ nát cho thêm dung dịch
tách chiết protein được cung cấp bởi công ty.
Tiếp tục nghiền. Que thử được nhúng vào trong
tube khoảng 5 phút sẽ cho kết quả nếu có mặt
của độc tố tạo bởi gen cryIAb sẽ xuất hiện hai
vạch (dương tính) trên que thử nếu chỉ có môt
vạch là âm tính.
Các thí nghiệm được bố trí theo khối hoàn toàn
ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Phần mềm MSTAT-C
được dùng để phân tích kết quả thí nghiệm.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Giống cà chua TN 386 được dùng trong thí
nghiệm các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng
chuyển gen. Theo tác giả Abida Yasmeen et al.
(2009) [1] nếu trước khi chuyển gen đặt lá mầm
vào môi trường MS có 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l
BA trong thời gian 2 ngày sẽ giúp tăng khả
năng tái sinh và tần số chuyển gen nên trước khi
cho xử lí chuyển gen chúng tôi đặt lá mầm 10
ngày tuổi được dùng làm nguyên liệu và nuôi
cấy trong môi trường này. Lá mầm đã được cắt
ở phần đầu lá và phần cuống lá để tạo vết
thương giúp vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens dễ dàng xâm nhiễm. Khoảng 80%
lá mầm có phát triển bằng cách phình to ra sau 2
ngày, các lá mầm này được sử dụng làm nguyên
liệu chuyển gen.
Nghiên cứu ảnh hưởng OD600nm của dịch nuôi
vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đến khả
năng chuyển gen
Sau khi lá mầm giống cà chua TN 386
được tạo vết thương và xâm nhiễm bởi vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens mang
plasmidCAMBIA2301cryIAb và plasmid này
có mang gen gusA (gen chỉ thị) nên chúng tôi
sử dụng biểu hiện của gen này để đánh giá kết
quả chuyển gen của thí nghiệm. Kết quả sau khi
chuyển gen 4 ngày chúng tôi nhuộm các lá mần
để xem biểu hiện của gen GusA cho thấy mức
độ chuyển gen thông qua biểu hiện của gen
gusA gia tăng hay giảm tùy thuộc nồng độ của
dịch nuôi vi khuẩn phù hợp với miêu tả trước
đây của tác giả Fillatti et al (1987) [5]. Biểu
hiện tạm thời cao nhất của gen gusA (hình 1)
khi OD600nm là 1,0 với tần suất là 40,55%, khi
OD600nm là 0,5 thì biểu hiện của gen gusA cũng
giảm và khi OD600nm tăng là 1,5 thì biểu hiện
của gen gusA cũng không tăng theo chỉ số OD
(bảng 1).
Hình 1. Biểu hiện của gen gusA trên lá mầm
Bảng 1. Ảnh hưởng của dịch nuôi vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đến khả năng biểu hiện tạm
thời của gen gusA
OD600nm
Số lượng lá mầm xử lí
chuyển gen
Số lượng lá mầm biểu
hiện gen gusA
% lá mầm biểu hiện
gen gusA
0,5 30 6 19,17 6,29b*
1,0 30 12 40,56 10,05a
1,5 30 8 26,67 2,89ab
Le Tan Duc, Pham Duc Tri, Nguyen Huu Ho, Ha Tran Minh Dung, Duong Thi Ngoc Thi
208
* Các số trung bình trong các cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có nghĩa với p = 0,05.
Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ
acetosyringone trong dịch nuôi vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens đến khả năng
chuyển gen
Sự có mặt của acetosyringone làm tăng khả
năng chuyển gen trên nhiều loại cây trồng trong
đó có cà chua. Vì vậy, acetosyringone đã được
cho vào trong giai đoạn xử lý ngâm dung dịch
vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens với lá
mầm của giống cà chua TN386 ở các nồng độ
50, 100 và 150 µM. Kết quả cho thấy khi nồng
độ acetosyringone 100 µM sẽ cho tần số chuyển
gen cao nhất và khi tăng lên 150 µM sẽ làm
giảm tần số chuyển gen (bảng 2).
Bảng 2. Ảnh hưởng của nồng độ acetosyringone đến khả năng biểu hiện tạm thời của gen gusA
Nồng độ Acetosyringone Số lượng lá mầm xử lí chuyển gen
Số lượng lá mầm biểu
hiện gen gusA
% lá mầm biểu
hiện gen gusA
50 25 6 24,07 1,61b*
100 25 9 36,11 2,41a
150 25 4 15,74 5,61b
* Các số trung bình trong các cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có nghĩa với p = 0,01.
Hình 2. Biểu hiện của gen gusA
trên chồi cà chua
Hình 3. Tái sinh chồi cà chua
trên môi trường chọn lọc
Nghiên cứu chuyển gen
Lá mầm của các giống cà chua TN 386,
148 và Hồng Châu sau khi xử lí chuyển gen
được đặt vào môi trường tái sinh chồi có bổ
sung chất chọn lọc 100 mg/l kanamycin, kết quả
sau hai tuần một số lá mầm có mô sẹo phát triển
và tái sinh chồi sau 4-6 tuần trong khi các lá
mầm đối chứng (không xử lí chuyển gen) hoàn
toàn không phát triển mô sẹo và chồi sau 4 tuần
trong môi trường chọn lọc. Các chồi đã tái sinh
trên môi trường chọn lọc được chọn ngẫu nhiên
để kiểm tra biểu hiện của gen gusA đồng thời
quan sát trên chồi không chuyển gen. Kết quả
cho thấy, khoảng 60% mẫu chồi giả định
chuyển gen được kiểm tra gen gusA có những
đốm xanh chàm ở những mức độ đậm nhạt khác
nhau cho thấy, việc biểu hiện của gen gusA
(hình 2) không đồng nhất trong các chồi chuyển
gen, trong khi đó, các mẫu không chuyển gen
thì không có vệt xanh nào. Đồng thời, tần số
chuyển gen dựa trên khả năng tái sinh trong môi
trường chọn lọc 100 mg/l kanamycin cho thấy
rất phụ thuộc vào giống, các giống TN 386 và
TN148 khả năng tái sinh chồi tạo dòng kháng
kanamycin (hình 3) là 5,22% và 4,11% theo thứ
tự, riêng với Hồng Châu, tỷ lệ tái sinh khá thấp
2,45% (bảng 3). Các chồi kháng kanamycin và
TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 205-211
209
có biểu hiện gen gusA được cấy chuyền vào môi trường MS để chồi phát triển thành cây và ra rễ.
Bảng 3. Tần số chuyển gen của lá mầm thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ở một số
giống cà chua
Giống
cà chua
Số lượng lá mầm
xử lí chuyển gen
Số lượng chồi tái sinh
trên môi trường chọn lọc
Phần trăm chồi tái sinh trên
môi trường chọn lọc (%)
TN 386 350 18 5,22 0,69a*
TN148 350 14 4,11 0,84ab
Hồng Châu 250 6 2,45 0,43b
* Các số trung bình trong các cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có nghĩa với p = 0,01.
Phân tích PCR các gen nptII và cryIAb
Các dòng chồi tái sinh và phát triển tốt trên
môi trường tái sinh có chất chọn lọc kanamycin
được tách chiết nhiễm sắc thể để kiểm tra sự
hiện diện của gen chuyển bằng phản ứng PCR.
Kết quả PCR các gen cryIAb và nptII với các
cặp mồi đặc hiệu cho thấy có sự hiện diện của
các băng DNA được khuếch đại tương ứng là
559 bp (hình 4) và 600 bp (hình 5) trong các
dòng cà chua giả định chuyển gen.
Hình 4. PCR gen cryIAb dương tính với băng
DNA 559 bp. M. Thang DNA chuẩn 1 kb; PC.
ĐC dương (plasmid); 3. NC âm (cây không
chuyển gen); 1, 2, 3, 4, 5. Cây chuyển gen.
Hình 5. PCR gen nptII dương tính với băng DNA
600 bp. M. Thang DNA chuẩn 1 kb; PC. Đối
chứng dương (plasmid); 3. NC âm (cây không
chuyển gen); 1, 2, 3, 4, 5: Cây chuyển gen.
Kiểm tra biểu hiện của gen cryIAb
Chọn một ít dòng cây cà chua giả định
chuyển gen phát triển tốt trên môi trường chọn
lọc 100 mg/l kanamycin để kiểm tra biểu hiện
của gen cryIAb thông qua bộ Kit của Công ty
Envirologix Quickstix (Mỹ) bằng cách phát
hiện protein độc tố tạo ra bởi gen cry1Ab trong
lá của cây cà chua chuyển gen. Lá của cây giả
định chuyển gen và đối chứng được nghiền
trong dung dịch tách chiết protein, que thử được
nhúng vào trong tube khoảng 5 phút cho kết quả
sự có mặt của độc tố Bt (Bacillus thuringiensis)
đã được khẳng định bằng sự xuất hiện hai vạch
(dương tính) trên que thử cây cà chua chuyển
gen trong khi mẫu đối chứng chỉ
Le Tan Duc, Pham Duc Tri, Nguyen Huu Ho, Ha Tran Minh Dung, Duong Thi Ngoc Thi
210
có một vạch (âm tính) (hình 6).
Hình 6. Kiểm tra biểu hiện của gen cryIAb
bằng que thử của Envirologix Quickstix
KẾT LUẬN
Qua nghiên cứu chuyển nạp gen nhờ vi
khuẩn Agrobacterium tumefaciens trên các
giống cà chua, chúng tôi nhận thấy, nồng độ
thích hợp cho vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens trong quá trình xử lí chuyển gen là
OD600nm bằng 1 và nồng độ acetosyringone cho
hiệu quả chuyển gen cao là 100 µM. Đã nhận
được nhiều dòng cây cà chua mang gen nptII và
cryIAb và sự có mặt của gen chuyển trong cây
đã được kiểm tra dương tính bằng phân tích
PCR. Đồng thời biểu hiện của độc tố Bt đã được
kiểm tra bằng que thử của công ty Envirologix
Quickstix (Hoa Kỳ).
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Abida Yasmeen, 2009. An improved
protocol for the regeneration and
transformation of tomato (cv Rio Grand),
Acta. Physiol. Plant, 31: 1271-1277.
2. Cortina C., Culiánez-Macià F. A., 2004.
Tomato transformation and transgenic plant
production. Plant Cell, Tissue and Organ
Culture, 76: 269-275.
3. Chilton M. D., Currier T. C., Farrand S. K.,
Bendich A. J., Gordon M. P., Nester E. W.,
1974. Agrobacterium tumefaciens DNA and
P58 bacteriophage DNA not detected in
crown gall tumours. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 71: 3672-3676.
4. Dellaporta S., Wood J., Hicks J. B., 1983. A
plant DNA minipreparation: version II. Plant
Molecular Biology Reporter, 1(4): 19-21.
5. Fillatti, JoAnne J., Kiser John, Rose Ronald,
Comai Luca, 1987. Efficient transfer of a
glyphosate tolerance gene into tomato using
a binary Agrobacterium tumefaciens vector.
Nature Biotechnology, 5(7): 726-730.
6. Jefferson R. A., Kavanagh T. A., Bevan B.
W., 1987. GUS fusion: -glucuronidase as a
sensitive and versatile gene fusion marker in
higher plants. EMBO, 6: 3901-3907.
7. Gamborg O., Miller R., Ojima K., 1968.
Nutrient requirement suspensions cultures
of soybean root cells. Experimental Cell
Research, 50(1): 151-158.
8. Murashige T., Skoog F., 1962. A revised
medium for rapid growth and bioassay with
tobacco tissue culture. Physiol. Plant, 15:
473-497.
9. Park S. H., Morris J. L., Park J. E., Hirschi
K. D., Smith R. H., 2003. Efficient and
genotype-independent Agrobacterium-
mediated tomato transformation. J. Plant
Physiol., 160: 1253-1257.
10. Sarker R. H., Islam K., Hoque M. I., 2009.
In vitro regeneration and Agrobacterium-
mediated genetic transformation of tomato.
Plant Tissue Cult., 19(1): 101-111.
TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 205-211
211
A STUDY ON GENETIC TRANSFORMATION
OF TOMATO (Lycopersicon esculentum Mill.) WITH AN INSECT
RESISTANCE GENE CRY1AB BY Agrobacterium tumefaciens
Le Tan Duc1, Pham Duc Tri1, Nguyen Huu Ho1, Ha Tran Minh Dung1, Duong Thi Ngoc Thi2
(1)Institute of Tropical Biology, VAST
(2)Research and Development Center for Hi-tech Agriculture
SUMMARY
Damage caused by insects to crops is a major problem for the agricultural economy in the tropics. The
main objective of this study was to transfer the gene cryIAb into tomato by using an Agrobacterium-mediated
transformation method. Kanamycin was used as the transformant selectable agent. Agrobacterium tumefaciens
strain EHA105, containing plasmidCAMBIA2301cryIAb that consists of kanamycin resistance gene, gusA
gene and cry1Ab gene encoding for delta endotoxin of Bacillus thuringiensis, was used. Conditions such as
bacterial concentration and concentration of acetosyringone were studied. For genetic transformation, the
cotylendons were infected and co-cultivated with the Agrobacterium tumefaciens. After the 2 day co-
cultivation, the cotylendons were washed by the cefotaxime solution and transferred to the MS medium
containing IAA (0.5 mg/l), BA (2 mg/l) and kanamycin (100 mg/l) for selection. After a few weeks, putative
transformed explants, able to grow on the kanamycin-containing medium, were transferred to MS medium for
root development. Expression of GusA was detected by the X-glu substrate in the GUS assay. The presence of
nptII and cry1Ab in the putative transformed tomatoes was confirmed by polymerase chain reaction analysis.
Transgenic tomatoes were able to produce Bt endotoxin in the leaf tissue, revealed by the Envirologix
Quickstix strip test.
Keywords: Agrobacterium tumefaciens, Bacillus thuringiensis, Lycopersicon essculentum, genetic
transformation.
Ngày nhận bài: 21-6-2012
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- 1771_5657_1_pb_8488_2180537.pdf