Nghiên cứu chọn tạo giống ngô cho kháng thuốc trừ cỏ bằng phương pháp lai trở lại

Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 337 NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG NGÔ CHO KHÁNG THUỐC TRỪ CỎ BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAI TRỞ LẠI TS. Phan Xuân Hào Viện Nghiên cứu Ngô SUMMARY Breeding for herbicide tolerance in Maize by backcrossing The tolerance to Glyphosate has transferred into some promising inbreed lines by backcross method. The new inbred lines and hybrids are the similar to initial ones regarding to the phenotypes and yield. The presence of CP4 EPSPS gene and OPT/mepsps fragments in the donor, eight herbicide - tolerant maize lines and four hybrids derived from these have asserted by PCR and southern blot technique. In general, there are no significant difference in the degrees of damage of major diseases and the above - ground insects among initial and new developed maize lines and hybrids. Keywords: Glyphosate, backcross, inbred lines. I. ĐẶT VẤN ĐỀ* Mặc dù hiện nay vẫn còn một số quan điểm khác nhau về vấn đề cây trồng biến đổi gen (GMO), nhưng với việc mở rộng nhanh diện tích chỉ sau một thời gian ngắn đã khẳng định ý nghĩa của thành tựu này đối với nhân loại. Việc chuyển các gen kháng sâu và kháng thuốc trừ cỏ vào ngô ở Mỹ chỉ thực hiện theo công nghệ sinh học cho một số dòng, sau đó chuyển vào các dòng khác bằng phương pháp lai trở lại, kể cả nhiều tính trạng như giống ngô Smart stax [8]. Các công ty hạt giống vừa và nhỏ ở Mỹ cũng chuyển các gen được mua bản quyền vào các dòng hiện có của họ bằng phương pháp lai trở lại [7]. Có thể chuyển các gen mới vào các dòng bố hoặc mẹ, con lai sẽ có tính trạng kết hợp [8]. Đề tài “Chọn tạo giống ngô kháng thuốc trừ cỏ (KTTC) bằng phương pháp lai trở lại” được thực hiện theo định hướng trên với mục tiêu: Tạo được 2 - 3 dòng ngô biến đổi gen kháng thuốc trừ cỏ bằng kỹ thuật lai trở lại; 1 - 2 giống ngô lai triển vọng mang gen kháng thuốc trừ cỏ. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu Các dòng thuần ngô bình thường: DF1, DF2, DF4, DF5, DF7, CML161, 2A, 2B, H14, H65, Người phản biện: TS. Mai Xuân Triệu. H171, H020 và các dòng kháng thuốc trừ cỏ glyphosate cùng loại *Thí nghiệm PCR và Southern: Sử dụng 24 nguồn vật liệu ngô bao gồm: 1 nguồn cho gene (donor) và 8 dòng ngô thường, 3 giống ngô lai thường của các dòng, 08 dòng backcross, 4 giống lai giữa các dòng backcross. 2.2. Phương pháp nghiên cứu - Tạo các dòng mới bằng phương pháp lai lại và tự phối. - Đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử SSR và phần mềm NTSYSpc. - Phân tích PCR tiến hành với cặp mồi đặc hiệu cho gen KTTC. - Tách chiết ADN theo phương pháp của Saghai - Maroof (1984) [10]. - Phương pháp PCR theo phương pháp của Grohmann và cộng sự (2009) [4]. - Phân tích sự kiện chuyển gene và vật liệu thường sử dụng 03 trình tự mồi theo phương pháp nghiên cứu của Heck và cộng sự (2005) [5]. - Phân tích đoạn OPT/m - epsps sử dụng 02 trình tự mồi theo phương pháp PCR của Matsuoka và cộng sự (2000) [6]. - Thí nghiệm Southern blot thực hiện theo phương pháp của Breitler và cộng sự (2004). VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 338 Bảng 1. Danh sách và trình tự các mồi cho thí nghiệm PCR TT Tên mồi Trình tự 1 Primer D 5’ - GCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGG - 3’ 2 Primer E 5’ - CAGCATCAGCGCTCGAAAGTTTCGTCAA - 3’ 3 Primer F 5’ - GGCAGGGTGTTGTTGTCCATTTTATGG - 3’ 4 Primer OTP5 5’ - ACGGTGGAAGAGTTCAATGTATG - 3’ 5 PrimerEPS3 5’ - TCTCCTTGATGGGCTGCA - 3’ Bảng 2. Thành phần phản ứng PCR và chu trình nhiệt Thành phần Nồng độ cuối Bước Nhiệt độ - Thời gian Chu kỳ DNA 50ng DNA 1 950C - 2 phút 1 chu kỳ Primer 0,1uM Primer 2 940C - 30 giây MgCl2 1,5mM Mg+ 3 600C - 30 giây dNTP 0,2uM dNTPs 4 720C - 1 phút 36 chu kỳ Taq buffer 1 X Taq buffer 5 720C - 10 phút 1 chu kỳ Nước - 6 40C - bảo quản Taq 1,5 U Taq 7 Kết thúc - Thí nghiệm khảo sát, đánh giá các THL: Đánh giá sinh trưởng, phát triển và khả năng kháng thuốc trừ cỏ trong điều kiện hạn chế, cách ly. - Đánh giá an toàn sinh học - khảo nghiệm hạn chế: Đối với giống ngô KTTC, những sinh vật không chủ đích được chọn để đánh giá là tập hợp các loài chân khớp trong sinh quần cây ngô và các vật gây bệnh hại cây ngô. Tiến hành điều tra 5 lần vào các thời điểm: Lần 1: Vào giai đoạn khoảng V10 - V15, Lần 2: Vào giai đoạn khoảng V18 - VT, Lần 3: Vào giai đoạn khoảng R1, Lần 4: Vào giai đoạn khoảng R2, Lần 5: Vào giai đoạn khoảng R3 - R4. Một số chỉ tiêu liên quan đến đa dạng loài được tính theo Odum (1971) [9] Các bệnh đốm lá lớn (Helminthoporium turcicum), đốm lá nhỏ (Helminthoporium maydis), gỉ sắt (Puccinia maydis), đốm nâu (Physoderma maydis), khô vằn (Rhizoctonia solani) được đánh giá vào thời điểm 80 - 85 ngày sau gieo. Tỷ lệ bệnh, mức độ nhiễm bệnh đánh giá theo thang điểm từ 1 - 9. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả chọn tạo dòng ngô kháng thuốc trừ cỏ (KTTC) Duy trì, đánh giá các đặc tính nông học, khả năng KTTC glyphosate và khả năng kết hợp của 20 dòng KTTC ở thế hệ BC4S4. Kết quả cho thấy, các dòng KTTC Glyphosate ổn định; một số đặc tính nông học cơ bản đã hoàn toàn giống với các dòng bình thường cùng loại; các dòng KTTC có biểu hiện sinh trưởng và phát triển khỏe hơn, cây chắc, lá xanh bền, bông cờ to, ít nhiễm sâu bệnh. Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 339 Bảng 3. Một số đặc điểm chính của các dòng triển vọng Bệnh khô vằn (điểm) Bệnh đốm lá (điểm) Dài bắp (cm) TL hạt/bắp (%) Năng suất (tạ/ha) Dòng CG BT CG BT CG BT CG BT CG BT DF5 113 114 145,4 140,5 14,6 14,0 76,7 75,4 28,5 26,4 DF7 107 108 124,7 123,6 12,2 11,3 72,4 70,3 21,2 20,5 DF4 113 115 156,5 155,3 11,5 10,4 75,5 75,0 27,7 26,2 CML161 116 116 150,3 148,7 14,5 14,2 73,2 72,6 26,5 25,3 02A 112 113 137,8 133,6 12,0 11,6 71,6 71,2 24,6 23,5 02B 116 117 156,5 152,8 13,7 13,2 71,4 70,7 23,5 21,4 DF2 117 118 152,8 152,0 14,7 14,0 76,8 75,3 27,6 25,7 DF1 120 121 151,4 148,7 11,4 11,0 72,3 71,5 20,3 19,2 TB 24,9 23,5 CV (%) 12,2 LSD.05 2,34 Ghi chú: CG: KTTC; BT: Bình thường, KV: Khô vằn. Hình 1. Hình thái bắp của một số dòng Các dòng KTTC có hình dạng bắp gần đồng nhất so với các dòng bình thường. Tuy nhiên, do có đời tự phối ít (BC4S2 - S4) nên vẫn có xu thế bắp dài và to hơn. 3.2. Đánh giá đa dạng di truyền các vật liệu mới tạo ra bằng chỉ thị phân tử SSR Kết quả ở sơ đồ phả hệ cho thấy hệ số tương đồng di truyền của các dòng biến thiên trong khoảng từ 0.23 - 1.00. Nhìn chung, khoảng cách di truyền của các dòng tương đối lớn, cho thấy các dòng tương đối khác biệt nhau về vật chất di truyền. Hình 2 cho thấy ở hệ số tương đồng di truyền 0.24, các dòng ngô chia làm 3 nhóm chính. VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 340 Coefficient 0.24 0.43 0.62 0.81 1.00 H 171. 1 H1 H1.1 H97 Q59 H9 H14 H264 H240 H250 H226 H228 H6.1 H6.2 H63 H095 H14.1 H276 H67 H54 H1.2 H2 H2.1 H13.2 H26 H59 H82 H230 HP7 H7.1 H7.2 H21 H3.2 H901 H3A H84 H70 H093 H333 H64 D55 NS25 H65 H53 H95.2 NX18 H171 H29 H414 H17 H60 H46 H8.1 H8.2 H171. H5.1 H5.2 H4 H4.1 H80 H65.1 H603 DF9 51 H20 H3.1 H3.3 H672 H19 H866 H18 Hình 2. Sơ đồ phả hệ của 70 dòng ngô phân tích dựa trên 35 chỉ thị SSR 3.3. Kiểm tra sự có mặt của gen mới 3.3.1. Thí nghiệm PCR - Kết quả tách chiết DNA thu được các mẫu có hàm lượng DNA cao, nồng độ từ 100 ug/ml đến 300 ug/ml (hình 3). Năm 2011 Năm 2012 Hình 3. Ảnh điện di DNA genome của các mẫu ngô Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 341 - Kết quả phân tích sự kiện chuyển gene KTTC Glyphosate bằng 3 trình tự mồi D, E, F (hình 4 và 5) năm 2011 cho thấy: Ở nguồn vật liệu cho gene sản phẩm PCR được nhân bởi cặp mồi D và F có độ dài khoảng trên 600bp và 8 dòng ngô thường có sản phẩm PCR được nhân bởi cặp mồi E và F khoảng trên 200bp; 8 dòng ngô KTTC (BC4F4) thể hiện sản phẩm PCR ở cả 2 đoạn trên 600bp và trên 200bp. Đối với các giống ngô thường và các giống ngô KTTC kết quả PCR cũng thể hiện tương tự như đối với các dòng (hình 5). Hình 4. Kết quả PCR 16 dòng ngô bằng 3 trình tự mồi D, E và F. (giếng 1: Thang chuẩn 100bp; giếng 2: Đối chứng âm; giếng 3: Nguồn cho gene; giếng 4 - 11: 8 dòng ngô thường; giếng 12 - 18: 8 dòng ngô BC4F4) Hình 5. Kết quả phân tích PCR 7 giống ngô bằng 3 trình tự mồi D, E và F. (giếng 1: Thang chuẩn 100bp; giếng 2: đối chứng âm; giếng 3: Nguồn cho gene; giếng 4 - 6: 3 giống ngô thường; giếng 7 - 10: 4 giống ngô lai giữa các dòng BC4F4) Năm 2012, kết quả điện di phân tích sự có mặt của gen CP4 EPSPS bằng 3 trình tự mồi D, E, F cho kết quả tương tự như năm 2011. Điều này khẳng định chắc chắn sự có mặt của gen KTTC Glyphosate CP4 EPSPS trong các dòng mới và các tổ hợp lai có các dòng đó tham gia (bảng 6 và 7). Hình 6. Kết quả điện di sản phẩm PCR của 20 dòng ngô bằng 3 trình tự mồi D, E, F. (giếng M: Thang chuẩn 100bp; giếng 1: Đối chứng âm; giếng 2: Đối chứng dương; giếng 3 - 12: 10 dòng ngô thường; giếng 13 - 22: 10 dòng ngô BC4S4) Hình 7. Kết quả phân tích PCR 12 giống ngô bằng 3 trình tự mồi D, E, F. (giếng M : Thang chuẩn 100bp; giếng 1: Đối chứng âm; giếng 2: Nguồn vật liệu cho gen; giếng 3 - 5: LVN4; giếng 6 - 8: LVN14; giếng 9 - 11: LVN10; giếng 12 - 14: 2AB) VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 342 3.3.2. Thí nghiệm Southern blot Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,2% (hình 8). Sản phẩm PCR được nhân 1 băng duy nhất với kích thước tương đương 88bp ở 13 mẫu là: 1, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 24. Hình 8. Ảnh điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,2% (Các giếng từ 1 đến 24 tương ứng với sản phẩm PCR của 24 mẫu; Giếng M là thang chuẩn 100bp) Kết quả phân tích Southern blot 24 nguồn vật liệu ngô (hình 9) cho thấy, 13 mẫu (1, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23 và 24) có sản phẩm PCR nhuộm màu màu xanh trên màng lai, các sản phẩm PCR đều lai với đoạn dò (probe) đặc hiệu cho đoạn gen CTP2 - EPSPS. Tức là: 1 (nguồn cho); 8 dòng (từ 10 đến 17) và 4 giống lai (từ 21 đến 24) có chứa gene CP4 EPSPS KTTC Glyphosate. Hình 9. Kết quả phân tích Southern blot 24 nguồn vật liệu ngô 3.3.3. Kết quả thí nghiệm giải trình tự đoạn gen kháng thuốc trừ cỏ Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 3%. Sản phẩm PCR được nhân 1 băng duy nhất với kích thước tương đương 88bp ở 9 mẫu là: 1, 2, 3, 4, 5, 9, 10, 11,12. Hình 10. Ảnh điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 3% (Các giếng từ 1 đến 12 tương ứng với sản phẩm PCR của 12 mẫu; giếng M: Thang chuẩn 100 bp) Đoạn gen CTP2 - CP4 EPSPS được phân tích trên hệ thống GenomeLab GeXP và thu được trình tự 88bp như sau: GGGATGACGTTAATTGGCTCTGAGCTTCG TCCTCTTAAGGTCATGTCTTCTGTTCCCAC GGCGTGCATGCTTCACGGTGCAAGCAGCC Trình tự đoạn gene trên được so sánh với các trình tự được công bố trên Ngân hàng Gen, cụ thể là: Đoạn gen CTP2 - CP4 EPSPS của ngô chuyển gen có mã số FN550387.1 và EU371957.1. Kết quả so sánh tương đồng trên hai trình tự FN550387.1 và EU371957.1 cho kết quả như bảng sau: Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 343 Bảng 4. Trình tự đoạn gen Tên trình tự CTP2 - CP4 EPSPS - FN550387.1 CTP2 - CP4 EPSPS - EU371957.1 SeqCTP2 - CP4 EPSPS 99,0% 82,0% Hình 11. So sánh trình tự giữa đoạn SeqCTP2 - CP4 EPSPS bằng phần mềm Bioedit Qua hình 3.11 cho thấy trình tự đoạn CTP2 - CP4 EPSPS đọc được có số nucleotide giống với các đoạn FN550387.1 và EU371957.1 công bố trên Ngân hàng Gen lần lượt là 87/88 và 72/73 nucleotide. Đoạn gene được giải trình tự khác với trình tự các đoạn FN550387.1 và EU371957.1 ở nucleotide số 55, sự sai khác này có thể do đột biến điểm hoặc lỗi kỹ thuật trong quá trình đọc trình tự. Như vậy, với kết quả thu được có thể khẳng định rằng đoạn gen đích có mặt trong các dòng ngô đã chuyển gen. 3.4. Đánh giá đặc tính nông học, khả năng KTTC của các tổ hợp lai (THL) Khảo sát các THL của các dòng KTTC với nhau và với các dòng thường cho thấy, tất cả các THL đều KTTC tốt, không có sự khác biệt về khả năng KTTC giữa các THL, có hai dòng đều chuyển và THL chỉ chuyển một trong hai dòng; các THL mới đều có xu hướng sinh trưởng và phát triển tương đương thậm chí tốt hơn các THL giữa các dòng thường. Bảng 5. Một số đặc điểm của các THL triển vọng nhất (2011) DF5  DF7 DF1  DF2 161  DF4 SC2AB Chỉ tiêu KTTC BT KTTC BT KTTC BT KTTC BT Xuân 2011 TGST (ngày) 125 125 126 128 124 125 120 120 Cao cây (cm) 202,7 210,5 227,4 221,5 215,3 221,6 206,5 209,3 Đổ (điểm) 1 2 1 1 1 2 1 1 Sâu đục thân (điểm) 1 2 1 1 1 1 1 1 Bệnh khô vằn (đ) 1 2 1 1 2 3 1 1 Đốm lá (điểm) 2 3 1 1 1 1 1 1 Kháng TTC 100% 100% 100% 100% Dài bắp (cm) 20,2 19,6 17,6 17,2 18,4 18,0 21,5 20,2 ĐK bắp (cm) 4,5 4,4 4,1 4,1 4,5 4,4 4,5 4,5 TL hạt/bắp (%) 81,4 80,7 82,0 81,5 78,6 78,3 81,3 81,0 Năng suất (tạ/ha) 88,7 85,2 80,6 78,5 90,5 87,7 96,6 94,7 CV (%) 7,18 (So sánh trên chỉ tiêu năng suất) LSD.05 3,84 (So sánh trên chỉ tiêu năng suất) VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 344 DF5  DF7 DF1  DF2 161  DF4 SC2AB Chỉ tiêu KTTC BT KTTC BT KTTC BT KTTC BT Thu 2011 TGST (ngày) 110 112 114 115 112 112 108 110 Cao cây (cm) 192,5 190,4 210,3 208,5 196,6 195,4 178,5 180,7 Đổ (điểm) 1 2 1 1 1 2 1 1 Sâu đục thân (điểm) 1 2 1 1 1 1 1 2 Bệnh khô vằn (đ) 1 1 1 1 2 3 1 1 Đốm lá (điểm) 1 2 1 1 1 2 2 2 Kháng TTC 100% 100% 100% 100% Dài bắp (cm) 19,4 19,1 17,2 17,3 17,5 17,0 20,7 20,6 ĐK bắp (cm) 4,6 4,5 4,2 4,1 4,5 4,4 4,5 4,5 TL hạt/bắp (%) 80,0 79,8 80,9 80,5 78,5 78,3 80,6 80,2 N.suất (tạ/ha) 80,5 77,2 80,6 78,5 73,4 71,5 82,6 78,8 CV (%) 7,66 (So sánh trên chỉ tiêu năng suất) LSD.05 4,58 (So sánh trên chỉ tiêu năng suất) Hình 12. Một số hình ảnh của các giống (2011) Năm 2012, ngoài các THL được xác định từ trước như DF5  DF7, DF4  CML161, DF2  DF1, 2A  2B, xác định thêm được THL H14  H53, H41  H240, H41  H95, H13  H14, H65  IL9 có nhiều đặc điểm tốt, bắp đẹp và năng suất cao. Bảng 6. Một số đặc điểm của các THL triển vọng nhất (xuân 2012) TT THL TGST (Ngày) Cao cây (cm) Sâu ĐT (điểm 1 - 5) Bệnh ĐL (điểm 1 - 5) Năng suất (tạ/ha) 1 DF5  DF7 K 122 205,5 2 2 82,5 2 DF5  DF7 T 123 200,3 2 2 80,3 3 DF1  DF2 K 127 235,6 2 1 78,9 4 DF1  DF2 T 128 233,3 2 1 76,5 5 161  DF4 K 125 223,4 2 2 80,7 6 161  DF4 T 125 225,5 2 2 80,2 7 2A  2B K 123 215,7 1 2 83,9 8 2A  2B T 123 220,4 2 2 82,5 9 H14  H53 K 122 208,4 1 1 84,5 10 H14  H53 T 123 210,5 1 1 84,2 11 2A  H64 K 120 202,8 2 2 76,8 12 2A  H64 T 121 200,7 2 2 76,2 13 DF4  H64 K 122 224,6 2 2 78,5 14 DF4  H64 T 122 220,8 2 2 76,7 15 414  240 122 225,5 2 2 92,5 16 414  P95 125 230,2 2 1 92,7 Ghi chú: (K- KTTC; T- Thường). Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 345 Bảng 7. Một số đặc điểm của các THL triển vọng nhất (Thu 2012) TT THL TGST (ngày) Cao cây (cm) Sâu ĐT (điểm 1 - 5) Bệnh ĐL (điểm 1 - 5) Năng suất (tạ/ha) 1 DF5  DF7 K 108 185,5 2 2 80,5 2 DF5  DF7 T 107 180,3 2 2 80,3 3 DF1  DF2 K 110 195,6 2 1 78,6 4 DF1  DF2 T 111 193,3 2 1 76,8 5 161  DF4 K 110 183,4 2 2 77,9 6 161  DF4 T 110 185,5 2 2 79,5 7 2A  2B K 107 175,7 1 2 81,7 8 2A  2B T 118 173,4 2 2 82,5 9 H14  H53 K 110 178,4 1 1 80,5 10 H14  H53 T 110 178,5 1 1 79,2 11 H13  H14 T 111 182,8 2 2 76,8 12 H13  H14 K 112 180,7 2 2 76,2 13 H65  IL9 112 194,6 2 2 80,5 14 H65K  IL9 112 190,8 2 2 80,7 15 H65K  IL9K 112 190,7 1 1 81,7 Hình 13. Một số hình ảnh của thí nghiệm (Thu 2012) 3.5. Đánh giá an toàn sinh học 3.5.1. Tính đa dạng loài của tập hợp chân khớp trên các giống ngô KTTC 3.5.1.1. Thành phần loài chân khớp đã phát hiện được trên ruộng ngô thí nghiệm Các loài chân khớp và các đơn vị phân loại chính (bộ, họ, loài) đã phát hiện trong thí nghiệm thuộc các bộ, họ rất khác nhau. Nhìn chung, số lượng bộ chân khớp trên các dòng ngô KTTC và các dòng/giống ngô nền là tương tự nhau. Số họ biến động từ 13 (DF4 KTTC) đến 21 họ (ở LVN4 N, LVN4 KTTC và LVN10 N). Trên các dòng ngô KTTC khác có số lượng họ chân khớp nhiều hơn hoặc ít hơn từ 1 - 3 họ so với trên các dòng/giống ngô nền tương ứng. Trong Thu Đông 2011, số lượng các bộ, họ và loài xuất hiện nhiều hơn trong vụ Xuân nhưng không có sự chênh lệch giữa các dòng/giống KTTC so với dòng/giống nền. Số lượng các bộ của các loài chân khớp đã thu thập được bằng bẫy dính biến động từ 7 bộ đến 10 bộ. Nhìn chung, không có sự chênh lệch lớn giữa các dòng về chỉ tiêu này. 3.5.1.2. Tính đa dạng loài của tập hợp chân khớp trong ruộng ngô thí nghiệm - Tổng số cá thể bắt gặp trong mỗi kỳ điều tra: Trong vụ Xuân 2011, tổng số cá thể bắt gặp trong mỗi kỳ điều tra ở các dòng ngô KTTC biến động từ 16,0 cá thể đến 109,8 cá thể. Sự khác nhau về tổng số cá thể bắt gặp trong mỗi kỳ điều tra trên các dòng KTTC so với dòng/giống nền tương ứng đều ở mức không có ý nghĩa thống kê. Kết quả trong vụ Thu cũng có nhận xét tương tự. Tổng số loài bắt gặp trong mỗi kỳ điều tra: Tổng số loài bắt gặp trong mỗi kỳ điều tra trên các dòng ngô KTTC biến động từ 4,7 loài đến 7,8 loài và trên các dòng/giống ngô nền biến động từ 5,9 loài đến 8,7 loài. Sự khác nhau về tổng số loài bắt gặp trong mỗi kỳ điều tra trên các dòng ngô KTTC so với dòng/giống nền tương ứng đều ở mức không có ý nghĩa. Trong vụ Thu 2011, chỉ tiêu này ở các dòng ngô KTTC biến động từ 21,2 loài đến 25,1 loài và trên các dòng/giống ngô nền VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 346 biến động từ 22,3 loài đến 27,7 loài. Sự khác nhau về tổng số loài bắt gặp trong mỗi kỳ điều tra trên các dòng ngô KTTC so với dòng/giống nền trong vụ Thu cũng ở mức không có ý nghĩa. Chỉ số đa dạng Shannon H': Ccác dòng/giống ngô trong vụ Xuân 2011 có chỉ số đa dạng không cao. Sự khác nhau về chỉ số này trên các dòng ngô KTTC so với dòng/giống nền tương ứng đều ở mức không có ý nghĩa. Ngược lại, chỉ số Shannon H' trên các dòng/giống ngô vụ Thu khá cao, trên các dòng ngô KTTC biến động từ 4,58 đến 5,19 và trên các dòng/giống ngô nền biến động từ 4,78 đến 5,22. Chỉ số ưu thế Simson’D: Chỉ số ưu thế Simson’D trên các dòng/giống ngô trong vụ Xuân 2011 khá cao và tương tự nhau. Chỉ số này trên các dòng ngô KTTC biến động từ 0,33 đến 0,46 và trên các dòng/giống ngô nền biến động từ 0,31 đến 0,41. Chỉ số ưu thế Simson’D trên các dòng/giống ngô trong vụ Thu thấp và tương tự nhau. Các giá trị của chỉ số ưu thế Simson’D trong cả 2 vụ ngô cho thấy trên mỗi dòng/giống ngô thí nghiệm đều không có loài chân khớp nào phát triển với số lượng ưu thế gây mất cân bằng giữa các loài. 3.5.2. Mức độ mẫn cảm đối với các bệnh hại chủ yếu của các giống ngô Trong năm 2011 hầu hết các dòng ngô KTTC và dòng/giống ngô nền đều có tỷ lệ nhiễm bệnh đốm lá nhỏ khá cao. Tuy nhiên, không có sự khác biệt đáng kể giữa các dòng ngô KTTC so với dòng/giống nền tương ứng. 3.5.3. Tính đa dạng loài của nhóm Collembola trong đất trồng ngô Đã thu thập và phân tích tổng số 215 mẫu bẫy cốc trên các ruộng ngô thí nghiệm vụ Thu năm 2011. Đã ghi nhận được 38 loài Collembola thuộc 22 giống của 10 họ. Gần 1/2 số loài tập trung ở họ Entomobryidae (18/38 loài, chiếm 47,37% tổng số loài). Giống Lepidocyrtus có nhiều loài nhất (11/38 loài, chiếm 28,95% tổng số loài). Các giống còn lại chỉ có từ 1 - 2 loài. Trong số đó, có 4 loài (Hypogastrura manubrialis, Lepidocyrtus aseanus, Lepidocyrtus medius và Lepidocyrtus heterolepis) mới chỉ thấy trong mẫu bẫy cốc từ các ô trồng ngô KTTC. Tuy nhiên, giá trị độ phong phú của ngô KTTC vẫn chỉ tương đương với khoảng dao động về số lượng cá thể của giống ngô đối chứng và sự sai khác này không có ý nghĩa thống kê (F3,09= 0,06; P = 0,97). Điều này chứng tỏ sự biến động số lượng cá thể ở ngô KTTC so với ngô đối chứng không bắt nguồn từ nguyên nhân do ngô biến đổi gen gây ra. Kết quả này giống với nghiên cứu của Al - Deeb (2003) [2], Candolfi (2004) [3], Ahmadi (2005) [1], Bitzer (2005), tức là protein Bt không ảnh hưởng đến mức độ phong phú của động vật chân khớp bé (Collembola) ở đất. Giá trị của chỉ số đa dạng H’ và chỉ số đồng đều J’ giữa các công thức trồng ngô KTTC với các công thức trồng ngô nền tương đương nhau. 3.5.4. Tính đa dạng loài của tập hợp chân khớp trên các giống ngô (năm 2012) - Thành phần loài chân khớp đã phát hiện qua điều tra trên ruộng ngô thí nghiệm: Qua 5 kỳ điều tra, 66 loài chân khớp đã được thu thập. Trong đó, chỉ có một vài loài sâu hại xuất hiện với tần suất cao như sâu đục thân ngô, sâu xanh, rệp muội ngô, bọ trĩ và một số loài côn trùng có ích như bọ xít bắt mồi, bọ rùa Nhật Bản, nhện lưới và nhện lớn bụng nhọn. Các loài chân khớp còn lại xuất hiện với tần suất trung bình thấp (1 - 25%). 66 loài chân khớp này đều là đã được phát hiện trên các sinh quần nông nghiệp khác nhau, không có loài chân khớp nào mới. Những loài chân khớp đã phát hiện được thuộc các họ rất khác nhau. Hầu hết các cặp dòng/giống nền và dòng/giống KTTC có số họ tương tự nhau và số họ khác nhau này dao động từ 0 - 3 họ. - Phát hiện 51 loài chân khớp trên bẫy dính ở các dòng/giống ngô trong vụ xuân 2012 tương tự như năm 2011, không có loài nào mới xuất hiện. Nhìn chung, số lượng bộ chân khớp đã phát hiện được trên các dòng ngô kháng thuốc trừ cỏ tương tự như nhau hoặc hơn kém nhau 1 - 2 bộ so với các dòng/giống ngô nền tương ứng. - Tính đa dạng loài của tập hợp chân khớp trong ruộng ngô thí nghiệm Tổng số cá thể bắt gặp trong mỗi kỳ điều tra ở các dòng/giống ngô KTTC biến động từ 80 cá thể/kỳ ở dòng 2A N đến 157,3 cá thể/kỳ ở dòng DF7 N. Sự khác nhau đều ở mức không có ý nghĩa thống kê. Tại mỗi kỳ điều tra, tổng số loài bắt gặp trung bình trên các dòng/giống ngô thí nghiệm không giống nhau. Chỉ số ưu thế Simson’D trên các dòng/giống ngô trong vụ Xuân 2012 là khá cao, không có sự khác biệt đáng kể giữa các dòng/giống ngô KTTC so với dòng/giống nền. Các giá trị của chỉ số ưu thế Simson’D cho thấy trên mỗi dòng/giống ngô thí nghiệm đều Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 347 không có loài chân khớp nào phát triển với số lượng ưu thế gây mất cân bằng giữa các loài. Trong vụ Xuân 2012, chỉ số đa dạng Shannon H' trên các dòng/giống ngô thí nghiệm là khá cao. Tuy nhiên, vẫn không có sự khác nhau đáng kể giữa các dòng/giống ngô KTTC so với dòng/giống nền. 3.5.5. Mức độ mẫn cảm đối với các bệnh hại chủ yếu của các giống ngô Trong thí nghiệm, bệnh gỉ sắt (Puccinia maydis), bệnh đốm lá lớn không xuất hiện và gây hại trên tất cả các dòng/giống ngô. Như vậy các dòng/giống khảo nghiệm có phản ứng tương tự như nhau từng cặp một với bệnh đốm lá nhỏ, tức là không có sự sai khác giữa giống ngô nền và giống ngô KTTC. IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận - Đã chuyển tính kháng thuốc trừ cỏ cho 12 dòng triển vọng bằng phương pháp lai trở lại, đó là DF1, DF2, DF5, DF7, DF4, CML161, 2A, 2B, H14, H171, H65, IL9. - Lai tạo được 7 THL từ các dòng mới thể hiện tính kháng thuốc ổn định. - Xác định được gen chuyển và đoạn gene OPT/mepsps ở nguồn vật liệu cho gen, 8 dòng ngô KTTC và 4 THL giữa các dòng KTTC bằng kỹ thuật PCR. - Đã phân lập được đoạn gene OPT/mepsps, kiểm tra southern blot, nhân được sản phẩm PCR của các đoạn gene đích (88bp) và phân tích Southern blot. Kết quả đã xác định chắc chắn 13 nguồn vật liệu ngô trên bao gồm: 1 (nguồn cho); 8 dòng và 4 THL từ các dòng mới có chứa gene CP4 EPSPS KTTC Glyphosate. - Đã xác định được trình tự đoạn gen (88bp) của dòng ngô kháng thuốc trừ cỏ thể hiện độ tương đồng tương ứng là 99% so với trình tự gen mã số FN550387.1 và 82% so với trình tự có mã số EU371957.1 đã được công bố trên Ngân hàng Gen. - Những kết luận từ thí nghiệm đánh giá an toàn sinh học cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về các loại bệnh hại và tần suất xuất hiện một số chân khớp trên ô gieo trồng các dòng/giống có KTTC và ô trồng các dòng/giống ngô bình thường Từ kết quả của đề tài có thể khẳng định, phương pháp lai trở lại có thể chuyển được tính kháng thuốc trừ cỏ từ vật liệu kháng cho các dòng triển vọng 4.2. Đề nghị Có hướng sử dụng cho các sản phẩm đã có của đề tài TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ahmadi, N., Albar, L., Pressoir, G., Pinel, A., Fargette, D. & Ghesquyere, A. (2001). “Genetic basis and mapping of the resistance to rice yellow mottle virus. III. Analysis of QTL efficiency in introgressed progeny confirmed the hypoth - esis of complementary epistasis between two resistance QTLs.” Theor. Appl. Genet. 103: 1084 - 1092. 2. Al - Deeb, M. A., Wilde G.E., Higgins R.H (2001). “No effect of Bacillus thuringiensis corn and Bacillus thuringiensis on the predator Orius insidiosus.” Environmental Entomology 30: 625 - 629. 3. Candolfi, M. P., Brown, K., Grimm, C., Reber, B., Schmidli, H (2004). “A faunistic approach to assess potential side - effects of genetically modified Bt - corn om non - target arthropods under field conditions.” Biocontrol Sci. and Tech 14 (2): 129 - 170. 4. Grohmann, L., C. Brunen - Nieweler, A. Nemeth, and H. - U. Waiblinger (2009). “Collaborative Trial Validation Studies of Real - Time PCR - Based GMO Screening Methods for Detection of the bar Gene and the ctp2 - cp4epsps Construct.” J. Agric. Food Chem 57: 8913 - 8920. 5. Heck G. R., C. L., Armstrong., J. D, Astwood., C. F, Behr., J. T, Bookout., S. M, Brown., T. A, Cavato., D. L, DeBoer., M. Y, Deng., C, George., J. R, Hillyard., C. M, Hironaka., A.R, Howe., E. H, Jakse., B. E, Ledesma., T. C, Lee., R. P, Lirette., M. L, Mangano., J. N, Mutz., Y, Qi., R. E, Rodriguez., S. R, Sidhu., A, Silvanovich., M. A, Stoecker., R. A, Yingling., J, You (2005). “Development and Characterization of a CP4 EPSPS - Based, Glyphosate - Tolerant Corn Event.” Crop Sci 44: 329 - 339. 6. Matsuoka, T., H, Kuribara., K, Takubo., H, Akiyama., H, Miura., Y, Goda., Y, Kusakabe., K, Isshiki., M, Toyoda., A, Hino (2000). “A multiplex PCR method of detecting recombinant DNAs from five lines of genetically modified maize.” J Food Hyg Soc Japan 42: 24 - 32. 7. Ming, T. C. (2005). “Corn breeding Achievements in United States “ Proceedings of the Ninth Asian Regional Maize WorkshopBeijing, China: 12 - 21. 8. Narsarimham, U., W, Xu (2010). “Molecular maize breeding.” Training course. In National maize research institute 5/2010 9. Odum, E. P. (1971). “Fundamentals of ecology.” W.B. Saunders Company 3Philadelphia, London, Toronto. 10. Saghai - Maroof, M. A., K, Soliman., R.A, Jorgensen., R.W, Allard (1984). “Ribosomal DNA spacer - length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics.” PNAS 81: 8014 - 8018.