Nghiên cứu chế tạo Oligochitosan bằng phương pháp chiếu xạ Gamma Co-60 dung dịch Chitosan/H2O2 và khảo sát hiệu ứng gia tăng số lượng hoa trên cây dâu tây (Fragaria Vesca L.)

TAÏP CHÍ KHOA HOÏC ÑAÏI HOÏC SAØI GOØN Soá 32 (57) - Thaùng 9/2017 49 Nghiên cứu chế tạo Oligochitosan bằng phương pháp chiếu xạ Gamma Co-60 dung dịch Chitosan/H2O2 và khảo sát hiệu ứng gia tăng số lượng hoa trên cây dâu tây (Fragaria Vesca L.) A study on preparation of Oligochitosan by Gamma irradiation onto Chitosan/H2O2 solution and examining effects of increase in the number of flowers on strawberry (Fragaria Vesca L.) TS. Đặng Xuân Dự, Trường Đại học Sài Gòn Dang Xuan Du, Ph.D., Saigon University Tóm tắt Trong nghiên cứu này, chitosan đã được cắt mạch trong dung dịch chitosan/H2O2 bằng phương pháp chiếu xạ gamma Co-60. Khối lượng phân tử (Mw) và độ đề axetyl (ĐĐA) của chitosan lần lượt được xác định bằng phương pháp sắc ký gel thấm qua (GPC) và phương pháp phổ hồng ngoại (IR). Kết quả cho thấy oligochitosan khối lượng phân tử Mw < 10 kDa đã được chế tạo một cách hiệu quả bằng phương pháp chiếu xạ gamma Co-60 dung dịch chitosan/H2O2 ở liều xạ thấp, khoảng 8 kGy. Oligochitosan chế tạo được có hiệu ứng gia tăng số lượng hoa của cây dâu tây. Nồng độ phù hợp của oligochitosan để phun lên cây dâu tây là khoảng 50 ppm. Từ khóa: Oligochitosan, bức xạ Gamma, dâu tây. Abstract In this study, the degradation of chitosan in the presence of H2O2 solution by gamma irradiation was investigated. The molecular weight and the degree of deacetylation of chitosan were determined by gel permeation chromatography (GPC) and infrared spectra (IR), respectively. Results showed that oligochitosan with molecular weight Mw < 10 kDa were preparared efficiently by gamma irradiation in small doses, ~8 kGy. The obtained oligochitosan imposes effects of increase in the size of leaves of fracaria vesca L. The appropriate concentration of oligochitosan used to spray onto fracaria vesca L. trees was 50 ppm. Keywords: Oligochitosan, Gamma irradiation, fracaria vesca L. 1. Mở đầu Chitosan là polyme có nguốn gốc tự nhiên, là sản phẩm biến tính từ chitin bằng cách loại các nhóm axetyl. Oligochitosan là dẫn xuất của chitosan được chế tạo bằng phản ứng cắt mạch. Oligochitosan tự phân hủy sinh học, là prebiotic có độc tính thấp, có khả năng kháng khuẩn [8], [7] và kháng nấm [6]. Ngoài ra, oligochitosan còn làm tăng sinh tế bào, tăng cường miễn dịch của NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO OLIGOCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ GAMMA CO-60 50 cơ thể động vật bằng cách kích thích sản sinh bạch cầu, giảm cholesterol trong máu và có tác dụng làm lành các vết thương, vết bỏng [11]. Hoạt tính của oligochitosan thường được quyết định bởi khối lượng phân tử (KLPT, Mw) và độ đề axetyl (ĐĐA). Do có nhiều hoạt tính sinh học độc đáo, oligochitosan được ứng dụng khá đa dạng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như làm chất điều hòa sinh trưởng, phòng trị nấm bệnh thực vật và gia tăng khả năng miễn dịch trên động vật... Các phương pháp cắt mạch chitosan để chế tạo oligochitosan đã được phổ biến bao gồm: phương pháp hóa học, phương pháp enzym và phương pháp chiếu xạ. Ưu điểm của phương pháp hóa học là dễ dàng tiến hành với quy mô lớn do điều kiện phản ứng đơn giản. Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp này là cho hiệu suất thấp và có nguy cơ gây ô nhiễm môi trường. Phương pháp enzym cho hiệu suất cao nhưng chi phí đắt. Trong khi đó, phương pháp chiếu xạ có lợi thế là có thể tiến hành dễ dàng với quy mô lớn nhưng để chế tạo được oligochitosan đòi hỏi phải sử dụng liều xạ cao [2]. Điều này dẫn đến khả năng sản phẩm tạo thành dễ bị cắt mạch nhóm amin và phá vỡ vòng glucopyranose [5], làm giảm hoạt tính của oligochitosan. Trong nghiên cứu này, chúng tôi trình bày kết quả chế tạo oligochitosan dựa trên sự kết hợp đồng thời giữa bức xạ gamma Co-60 và H2O2. Ưu điểm của phương pháp là có thể tiến hành ở nhiệt độ phòng, giảm thời gian và liều xạ, có thể chế tạo được sản phẩm với quy mô lớn ở dạng lỏng hay dạng rắn đáp ứng yêu cầu sử dụng. Ngoài ra, tác nhân cắt mạch là H2O2 và bức xạ gamma Co-60 là những tác nhân được cho là khá thân thiện với môi trường. Sản phẩm cắt mạch được nghiên cứu ứng dụng làm chất gia tăng số lượng hoa của cây dâu tây (Fragaria vesca L), loại cây cho hiệu quả kinh tế cao, được trồng phổ biến ở cao nguyên Lâm Đồng. Kết quả nghiên cứu hướng đến cung cấp các chất kích thích tăng trưởng trong nông nghiệp có nguồn gốc tự nhiên góp phần phát triển nền nông nghiệp sinh thái bền vững. 2. Thực nghiệm 2.1. Nguyên vật liệu, hóa chất α - chitosan được chế tạo từ vỏ tôm có ĐĐA khoảng 90%, Mw khoảng 50 kDa. Dâu tây Labiang (Fragaria vesca L.) được mua ở tại vườn giống Dâu tây xã An Phú, thành phố Pleiku, Gia Lai. Hydro peroxit (H2O2) là sản phẩm tinh khiết của Merck, Đức. Các hóa chất axit lactic, etanol, amoniac được dùng ở dạng tinh khiết phân tích. Nước cất một lần được sử dụng cho toàn bộ thí nghiệm. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp chế tạo oligochitosan Trong nghiên cứu này, oligochitosan được chế tạo bằng cách hòa tan 5 g chitosan trong dung dịch axit lactic 3%, thêm một lượng H2O2 30% và định mức đến 100 mL để thu được dung dịch chiếu xạ chứa 5% chitosan và 1% H2O2. Tiến hành chiếu xạ trên nguồn SVST Co-60/B tại trung tâm Nghiên cứu và Triển khai Công nghệ Bức xạ VINAGAMMA, Viện Năng lượng Nguyên tử Việt Nam với suất liều 1,33 kGy/h, khoảng liều đến 15 kGy [5]. Dung dịch sau khi chiếu xạ được trung hòa bằng NH4OH 5%, thêm một lượng cồn bằng 6 lần thể tích dung dịch mẫu, khuấy đều, sau đó lọc kết tủa và rửa sạch bằng cồn [1]. Mẫu sau khi rửa sạch, để khô tự nhiên rồi sấy ở nhiệt độ 60°C trong 2 giờ. 2.2.2. Xác định khối lượng phân tử và độ đề axetyl của chitosan Khối lượng phân tử của các mẫu chitosan được xác định bằng phương pháp sắc kí gel (GPC), trên máy LC-20AB ĐẶNG XUÂN DỰ 51 Shimadzu, Nhật, sử dụng detector RID - 10A và cột Ultrahydrogel 250 của hãng Water, Mỹ, nhiệt độ vận hành cột là 40°C, pha động là đệm axetat CH3COOH 0,25M/CH3COONa 0,25M, tốc độ dòng là 1mL/phút. Chất chuẩn được sử dụng là polysacarit Pullulan có khối lượng phân tử khác nhau từ 738 đến 380 000 Da [1]. Mẫu chitosan được chuẩn bị bằng cách hòa tan trong axit axetic 0,25M với nồng độ 0,3% đến khi tan hoàn toàn, thêm muối CH3COONa 0,25M sau đó lọc dung dịch qua màng 0,45μm (Millipore filters). Mẫu chitosan được tiêm vào cột sắc kí với thể tích khoảng 50 μl. Dựa vào thời gian lưu và so sánh với đường chuẩn xác định được KLPT chitosan. Độ đề axetyl của chitosan được xác định bằng phương pháp hồng ngoại trên máy FT – IR 8400S, Shimadzu, Nhật. ĐĐA được tính dựa theo phương trình [3]: ĐĐA,% = 100 – ([31,92 × (A1320/A1420)] -12,00). Trong đó, A1320 và A1420 lần lượt là mật độ quang tương ứng tại các đỉnh 1320 và 1420 cm-1. 2.2.3. Khảo sát hiệu ứng gia tăng số lượng hoa của oligochitosan đối với dâu tây Chuẩn bị 4 lô thí nghiệm được đánh số từ 1 đến 4 mỗi lô gồm có 40 cây. Tiến hành phun oligochitosan có KLPT khoảng 7,5 kDa với các nồng độ 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm từ lô 2 đến lô 4. Lô 1 không phun oligochitosan để làm đối chứng. Thời điểm bắt đầu phun oligochitosan là sau khi cây giống được trồng khoảng 1 tuần. Sau đó, oligochitosan được phun bổ sung vào ngày thứ 30 và 60 kể từ lần phun đầu tiên. Cây được chăm sóc theo quy trình thông thường được canh tác tại địa phương, xã An Phú, thành phố Pleiku, Gia Lai. Số hoa dâu tây được đếm vào các ngày thứ 120, 130 và 140 kể từ khi trồng. Kết quả được tính trung bình cho một cây trên mỗi lô. Sau 140 ngày tuổi, mỗi lô thí nghiệm được chia làm 5 nhóm, mỗi nhóm 8 cây được đếm số hoa lặp lại để phân tích thống kê, đánh giá sự khác biệt giữa các lô nghiên cứu. 3. Kết quả và thảo luận Sự thay đổi KLPT của chitosan theo liều xạ được thể hiện trên hình 1. Kết quả cho thấy KLPT giảm nhanh trong khoảng thời gian đầu chiếu xạ, khoảng liều từ 0 đến 5 kGy. Sau khoảng liều trên, KLPT của chitosan suy giảm khá chậm theo liều xạ. Điều này là do nồng độ H2O2 trong khoảng thời gian đầu chiếu xạ còn ở mức cao. Ngoài ra, quá trình chiếu xạ hình thành nên gốc tự do hydroxyl đã làm phân hủy nhanh H2O2 [4]. Do đó, gần như quá trình cắt mạch chủ yếu xảy ra ở giai đoạn đầu của quá trình chiếu xạ. Khi liều xạ lớn hơn 5 kGy, phần lớn H2O2 đã bị phân hủy, nồng độ giảm mạnh nên hiệu quả cắt mạch cũng giảm theo. Hình 1. Sự thay đổi KLPT của chitosan theo liều xạ NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO OLIGOCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ GAMMA CO-60 52 Cơ chế cắt mạch khi có mặt đồng thời H2O2 và tia γ đã được Ulanski và các cộng sự đề nghị [12]. Theo đó, gốc tự do hydroxyl ( •OH) được hình thành nhờ quá trình phân ly bức xạ nước và H2O2 đã đóng vai trò như là tác nhân oxy hóa mạnh cắt mạch chitosan: γ ray - • • + 2 aq 2 2 2 3 γ ray • 2 2 H O e , H , OH, H O , H , H O (1) H O 2 OH (2)   Hơn nữa, sản phẩm của quá trình phân ly bức xạ là e-aq và H • có thể phản ứng với H2O2 để gia tăng gốc hydroxyl • OH [9]: - • - aq 2 2 • • 2 2 2 e + H O OH + OH H + H O OH + H O   Theo Ulanski và cộng sự [12], gốc • OH bắt hydro, làm đứt liên kết C – H hình thành gốc cacbohydrat R•, dẫn đến quá trình chuyển vị và cuối cùng liên kết glycoside bị cắt, tạo thành phân tử CTS có KLPT thấp hơn. Hằng số tốc độ của phản ứng (3) và (4) lần lượt là k3 = 1,1×1010 l.mol -1 .s -1 và k4 = 9×107 l.mol -1 .s -1 [4]. Điều này giải thích tại sao nồng độ H2O2 giảm nhanh và quá trình cắt mạch chitosan xảy ra có hiệu quả trong khoảng thời gian đầu chiếu xạ. Hình 1 cũng cho thấy oligochitosan, KLPT < 10 kDa, có thể chế tạo được ở liều xạ khá thấp, khoảng 8 kGy, tương ứng với độ suy giảm KLPT khoảng 80%. Giá trị này được nội suy từ bảng 1. Nguyễn Quốc Hiến và cộng sự đã chế tạo oligochitosan bằng kỹ thuật chiếu xạ. Kết quả cho thấy để chế tạo được oligochitosan có KLPT < 10 kDa phải sử dụng liều xạ cao hơn 100 kGy [2]. Điều này cho thấy sự có mặt H2O2 chỉ ở nồng độ thấp khoảng 1% trong nghiên cứu của chúng tôi cũng làm giảm đáng kể liều xạ cần thiết để chế tạo oligochitosan. Nguyên nhân của hiện tượng này được giải thích bằng hiệu ứng đồng vận (synergistic effect) của các tác nhân cắt mạch. Hiệu ứng đồng vận được định nghĩa là sự tương tác đồng thời của hai tác nhân phản ứng lớn hơn tổng tương tác của các thành phần riêng lẻ [5]. Duy và cộng sự đã nghiên cứu hiệu ứng đồng vận của tia γ và H2O2 để chế tạo oligochitsan trong dung dịch. Kết quả cho thấy để chế tạo oligochitosan có KLPT < 10 kDa thì liều xạ cần thiết cũng chỉ khoảng 10 kGy [5]. Tuy nhiên, nghiên cứu của Duy và cộng sự được thực hiện trên β – chitosan, loại chitosan dễ cắt mạch hơn α – chitosan, nồng độ áp dụng là 3%, thấp hơn so với nghiên cứu của chúng tôi. Như vậy, việc áp dụng hiệu ứng đồng vận của bức xạ γ và H2O2 cho phép giảm đáng kể năng lượng chiếu xạ, tăng hiệu quả chế tạo oligochitosan. Bảng 1: Sự thay đổi KLPT và ĐĐA của chitosan theo liều xạ Liều xạ(*), kGy 0 2,7 6,7 11,0 15 Thời gian, giờ 0 2 5 8 11 KLPT, kDa 50 20,5 12,5 7,5 5,5 Độ giảm KLPT, % 0 59 75 85 89 ĐĐA, % 90 87 87 86 83 (*) Suất liều 1,33 kGy/h (3) (4) ĐẶNG XUÂN DỰ 53 Hình 2. Phổ FT - IR của chitosan ban đầu (a) và chitosan được chiếu xạ ở liều 6,7 kGy (b); 11 kGy (c); 15 kGy (d) Phổ FT- IR của mẫu chitosan ban đầu và các mẫu chitosan sau khi chiếu xạ ở các liều khác nhau được thể hiện trên hình 2. Kết quả cho thấy cấu trúc chính của oligochitosan thu được (hình 2b, c, d) hầu như không thay đổi so với chitosan ban đầu (hình 2a). Các đỉnh đặc trưng tiêu biểu cho các nhóm liên kết trong chitosan đều xuất hiện trong các mẫu oligochitosan. Đỉnh phổ nằm trong vùng 3200 – 3500 cm-1 đặc trưng cho dao động kéo giãn của liên kết N–H trong nhóm amine và liên kết O–H. Đỉnh ở 1655 và 1595 cm-1 đặc trưng cho dao động kéo giãn của liên kết C=O trong nhóm –CONH– (amide I) và dao động uốn của –NH trong nhóm –CONH– (amide II). Các đỉnh ở 1072, 1028, 1153 và 893 cm-1 lần lượt đặc trưng cho dao động kéo giãn của liên kết C–O, dao động kéo giãn của C–O–C trong vòng glucopyranose và các dao động của liên kết β – 1,4 glycoside [10]. Các đỉnh ở 1320 và 1420 cm-1 tương ứng đặc trưng cho dao động kéo giãn của liên kết C–N trong nhóm CH3CONH– (amide III) và dao động biến dạng của liên kết C–H, đây là hai đỉnh đặc trưng được sử dụng để tính toán sự thay đổi ĐĐA của chitosan [3]. Kết quả xác định cho thấy oligochitosan KLPT khoảng 5,5 kDa, thu được tại liều xạ 15 kGy, có ĐĐA giảm khoảng 8% so với chitosan ban đầu (bảng 1). Kết quả này khá phù hợp với nghiên cứu của Duy và cộng sự khi cắt mạch chitosan trong dung dịch chứa 3% chitosan bằng tia γ và H2O2 với độ giảm ĐĐA khoảng 10% [5]. Như vậy, sử dụng H2O2 ở nồng độ thấp khoảng 1% kết hợp đồng thời với tia γ cho phép chế tạo hiệu quả oligochitosan ở liều xạ khá thấp khoảng 8 kGy. Oligochitosan thu được có cấu trúc hầu như không thay đổi so với chitosan ban đầu. NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO OLIGOCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ GAMMA CO-60 54 Hình 3. Cây dâu tây 140 ngày tuổi ở lô đối chứng 1 (a) và lô 2, được phun oligochitosan nồng độ 50 ppm (b) Hình 3 cho thấy sự khác nhau về số lượng cuống hoa và quả của dâu tây sau 140 ngày tuổi. Ở lô đối chứng (hình 3a) số lượng cuống hoa thu được tương đối ít hơn so với lô có phun oligochitosan ở nồng độ 50 ppm (hình 3b). Trong quá trình theo dõi, chúng tôi nhận thấy dâu tây bắt đầu ra hoa ở 120 ngày tuổi trên các lô 1, 2, 3, riêng lô 4 thì vẫn chưa quan sát thấy hoa sau thời gian trên. Nguyên nhân của vấn đề này vẫn chưa rõ cần được nghiên cứu thêm. Tuy nhiên, theo nhận định của chúng tôi có thể do oligochitosan là kháng sinh thực vật [9] khi được sử dụng ở liều cao (150 ppm) có thể gây ngộ độc cho cây dẫn đến ức chế khả năng ra hoa. Ảnh hưởng của oligochitosan đến khả năng cho hoa của cây dâu tây theo ngày tuổi được thể hiện trên hình 4. Kết quả cho thấy số lượng hoa thu được sau 120, 130 và 140 ngày trên các lô 2 và 3 có phun oligochitosan tương đối lớn hơn so với lô đối chứng 1. Hình 4. Ảnh hưởng của oligochitosan đến khả năng cho hoa của dâu tây ĐẶNG XUÂN DỰ 55 Bảng 2. Số lượng hoa trung bình của cây dâu tây sau 140 ngày tuổi ở các lô khác nhau Nhóm (8 cây/nhóm) Lô đối chứng 1 (0 ppm) Lô 2 (50 ppm) Lô 3 (100 ppm) 1 42,8 43,8 43,7 2 42,7 43,5 43,6 3 42,7 43,7 43,7 4 42,9 43,9 43,5 5 42,7 43,6 43,5 Trung bình 42,8 ± 0,1 43,7 ± 0,2 43,6 ± 0,1 Kết quả phân tích ANOVA một chiều và kiểm định LSD bằng chương trình SPSS 16.0 đối với 5 nhóm lặp lại trên các lô thí nghiệm ở 140 ngày tuổi (Bảng 2) cho thấy nồng độ 50 và 100 ppm của oligochitosan phun lên dâu tây đều cho hiệu quả gia tăng số lượng hoa cao hơn so với lô đối chứng (p = 0,00). Ngoài ra, số lượng hoa trên các lô 2 và 3 tương ứng với nồng độ của oligochitosan được phun là 50 và 100 ppm cũng khác nhau có ý nghĩa thống kê (p = 0,002). Điều này chứng tỏ oligochitosan ở nồng độ thấp khoảng 50 ppm có khả năng kích thích gia tăng số lượng hoa tốt hơn so với ở nồng độ 100 ppm. Đối với lô 4, nồng độ oligochitosan 150 ppm, cây chỉ cho hoa sau 133 ngày tuổi, những quan sát ban đầu cho thấy số lượng hoa ít hơn và không đồng đều so với các lô 1, 2 và 3. Cơ chế kích thích và ức chế khả năng cho hoa của oligochitosan lên dâu tây vẫn cần được nghiên cứu thêm. Tuy nhiên, việc sử dụng oligochitosan phun cho dâu tây theo chúng tôi nên tiến hành ở liều thấp, với nồng độ nhỏ hơn 100 ppm. 4. Kết luận Oligochitosan có KLPT < 10 kDa đã được chế tạo hiệu quả bằng phương pháp chiếu xạ dung dịch chitosan 5%, H2O2 1% ở liều xạ khá thấp, khoảng 8 kGy. Cấu trúc chính của oligochitosan thu được hầu như không khác biệt so với chitosan ban đầu. ĐĐA của oligochitosan KLPT 5,5 kDa giảm khoảng 8%. Oligochitosan KLPT khoảng 7,5 kDa có hiệu ứng gia tăng số lượng hoa đối với dâu tây. Nồng độ phù hợp của oligochitosan để phun lên cây dâu tây là khoảng 50 ppm. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Đặng Xuân Dự, Đinh Quang Khiếu, Diệp Khanh, Nguyễn Quốc Hiến. “Nghiên cứu hiệu ứng đồng vận dung Co – 60 và H2O2 cắt mạch chitosan chế tạo oligochitosan”, Tạp chí Hóa Học, 51(2C), 627-631 (2003). 2. Nguyễn Quốc Hiến, Lê Hải, Lê Quang Luân, Trương Thị Hạnh, Phạm Thị Lệ Hà. “Nghiên cứu chế tạo oligochitosan bằng kỹ thuật bức xạ”, Tạp chí Hóa học, 38(2), 22-44 (2000). 3. J. Brugnerotto, J. Lizardi, F. M. Goycoolea, W. Arguelles – Monal, J. Desbrieres, M. Rinaudo. “An infrared investigation in relation with chitin and chitosan characterization”, Polymer, 42, 3569-3580 (2001). 4. G. V. Buxton, C. L. Greenstock, W. P. Helman, A. B. Ross. “Critical review of rate constants for hydrated electron, hydrogen atoms and hydroxyl radical (OH/O-) in aqueous”, Journal of Physical and Chemical Reference Data, 17(2), 513-886 (1988). NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO OLIGOCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ GAMMA CO-60 56 5. N. N. Duy, D. V. Phu, N. T. Anh, N. Q. Hien. “Synergistic degradation to prepare oligochitosan by  - irradiation of chitosan solution in the presence of hydrogen peroxide”, Radiation Physical Chemistry, 80, 848-853 (2011). 6. S. Hirano, N. Nagao. “Effects of chitosan, pectic acid, lysozyme and chitinase on the growth of several phytopathogens”. Agricultural and Biological Chemistry, 53, 3065-3066 (1989). 7. Y. J Jeon, S. K. Kim. “Effect of antimicrobial activity by chitosan oligosaccharides N- conjugated with asparagines”, Journal of Microbiology and Biotechnology, 11, 281-286 (2001). 8. Y. J. Jeon, P. J. Park, S. K. Kim. “Antimicrobial effect of chitooligosaccharides produced by bioreactor”, Carbohydrate Polymers, 44, 71-76 (2001). 9. S. K. Kim, N. Rajapakse. “Enzymatic production and biological activities of chitosan oligosaccharides (COS): A review”, Carbohydrate Polymers, 62, 357-368 (2005). 10. 10.J. Kumirstra, M. Czerwicka, Z. Kaczynski, A. Bychowska, K. Brozowski, J. Thoming, P. Stepnowski. “Application of spectroscopic methods for structural analysis of chitin and chitosan”, Marine Drugs, 8, 1567-1636 (2010). 11. J. Shao, Y. Yang, Q. Zhong. “Study on preparation of oligoglucosamine by oxidative degradation under microwave”, Polymer Degradation and Stability, 82, 395- 398 (2003). 12. P. Ulanski, C. von Sontag. “OH – radical induced chain scission of chitosan in the absence and present of dioxygen”, Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions, 2, 2022-2028 (2000). Ngày nhận bài: 28/7/2017 Biên tập xong: 15/9/2017 Duyệt đăng: 20/9/2017