Nghiên cứu cấu trúc và sàng lọc dòng nấm men pichia pastoris tái tổ hợp đa bản sao biểu hiện nhân tố tăng trưởng từ tiểu cầu (Bb-Pdgf-Bb) mức độ cao - Vương Cát Khánh

TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 77-83 77 NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC VÀ SÀNG LỌC DÒNG NẤM MEN Pichia pastoris TÁI TỔ HỢP ĐA BẢN SAO BIỂU HIỆN NHÂN TỐ TĂNG TRƯỞNG TỪ TIỂU CẦU (BB-PDGF-BB) MỨC ĐỘ CAO Vương Cát Khánh, Ngô Thị Huyền Trang, Nguyễn Phạm Phương Thanh, Đặng Thị Phương Thảo*, Trần Linh Thước Trường Đại học Khoa học tự nhiên tp Hồ Chí Minh, *thaodp@hcmus.edu.vn TÓM TẮT: Nhân tố tăng trưởng từ tiểu cầu PDGF-BB (Platelet derived growth factor) đã được tổ chức FDA-Hoa Kỳ (Food and Drug Administration) phê chuẩn là sản phẩm sử dụng trong điều trị chứng loét chân do đái tháo đường. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tạo dòng thành công các chủng nấm men tái tổ hợp mang gen pdgf và sàng lọc được 2 dòng Pichia pastoris tái tổ hợp mang nhiều bản sao gen pdgf. Các dòng tái tổ hợp đa bản sao gen pdgf sau khi sàng lọc đã được kiểm tra và so sánh khả năng biểu hiện PDGF với dòng đơn bản sao. Kết quả cho thấy khả năng biểu hiện PDGF tăng theo số lượng bản sao gen mục tiêu sát nhập vào trong bộ gen. Chủng đa bản sao thu nhận được có khả năng sản xuất lượng PDGF chiếm trên 50% tổng lượng protein tiết ra môi trường. Từ khóa: Pichia pastoris, dòng đa bản sao, đái tháo đường, PDGF-BB tái tổ hợp. MỞ ĐẦU PDGF (Platelet derived growth factor) là một yếu tố phân bào chủ yếu của nguyên bào sợi, tế bào cơ trơn và nhiều tế bào khác, được sản xuất từ tiểu cầu. PDGF giữ nhiều chức năng trong cơ thể, đặc biệt là chức năng tham gia điều hòa và thúc đẩy quá trình làm lành vết thương [6]. Protein này tác động đến nhiều tế bào liên quan đến quá trình hàn gắn vết thương như: kích thích sự phân bào và hướng hóa của nguyên bào sợi và tế bào cơ trơn, kích thích đại thực bào sản xuất và tiết những nhân tố tăng trưởng quan trọng, kích thích sự sản sinh những phân tử fibronectin, collagen, proteoglycan và hyaluronic acid. Trong giai đoạn tái tạo, PDGF có vai trò kích thích sản xuất và tiết collagenase bởi nguyên bào sợi cũng như sự co các sợi collagen [1]. Với sự gia tăng bệnh đái tháo đường như hiện nay, tỷ lệ bệnh nhân mắc chứng loét chân ngày càng tăng. Tuy nhiên, tại Việt Nam, nguồn cung cấp PDGF chủ yếu là từ nước ngoài với giá thành cao. Điều này đặt ra yêu cầu cấp thiết trong việc nghiên cứu công nghệ sản xuất PDGF nhằm phát triển sản phẩm thuốc điều trị có hiệu quả với giá thành hợp lý. Trong số các hệ thống biểu hiện protein người tái tổ hợp, Pichia pastoris được xem như một hệ thống nổi bật với nhiều ưu điểm như dễ nuôi cấy, tăng trưởng nhanh, protein được biến đổi sau dịch mã. Bên cạnh các ưu điểm trên, hệ thống này có tính bền vững di truyền qua nhiều thế hệ tế bào do vector tái tổ hợp mang gen mục tiêu có thể được sát nhập vào bộ gen nấm men theo cơ chế tái tổ hợp tương đồng giữa DNA plasmid và vùng trình tự tương đồng trên bộ gen theo 2 cách: (1) gắn chèn vector vào bộ gen nấm men hoặc (2) thay thế gen, loại bỏ hoàn toàn gen AOX1 trong bộ gen nấm men. Số lượng bản sao của gen mục tiêu sát nhập vào bộ gen chủng chủ nấm men có thể là một trong các yếu tố giúp gia tăng mức độ biểu hiện protein mục tiêu. Hơn nữa, protein ngoại lai được tiết ra ngoài môi trường ở dạng có hoạt tính, vì thế, quá trình thu nhận, tinh chế protein dễ dàng hơn so với protein được biểu hiện ở dạng nội bào. Ngoài ra so với Saccharomyces cerevisiae protein được biểu hiện ở Pichia pastoris không bị đường hóa quá mức và không hình thành liên kết α-1,3 glycan, liên kết này được cho là gây ra đáp ứng miễn dịch khi dùng trong trị liệu [2, 4, 5]. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu plasmid pPICZαA (V195-20, Invitrogen); chủng E. coli DH5α [F-, 80lacZM15, recA1, endA1, hsdR17(rk-, mk+), phoA, supE44, -, thi-1, gyrA96, relA1] (Invitrogen) được cung cấp bởi Bộ môn Công nghệ sinh học phân tử và Môi trường, Trường Vuong Cat Khanh et al. 78 Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh; chủng Pichia pastoris X33 (C180-00, Invitrogen). Tạo dòng tế bào E. coli DH5α mang plasmid biểu hiện PDGF-BB (PDGF) Gen pdgf được thu nhận bằng phương pháp PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu FXhoI và RnotI. Sản phẩm PCR (357 bp, mã hóa cho chuỗi polypeptide dài 119 acid amin với khối lượng phân tử là 17 KDa) sau khi tinh sạch được xử lý với enzyme XhoI và NotI, sau đó nối vào vector pPICZαA cũng đã được cắt mở vòng bằng 2 enzyme trên. Plasmid tái tổ hợp pPICZαA/pdgf được biến nạp vào tế bào E. coli DH5α bằng phương pháp hóa biến nạp, sử dụng yếu tố chọn lọc là khả năng kháng kháng sinh zeocine. Plasmid tái tổ hợp pPICZαA/pdgf được kiểm tra sự chèn gen pdgf bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi FXhoI và 3’AOX, enzyme cắt giới hạn XhoI và NotI, giải trình tự. Tạo dòng tế bào Pichia pastoris X33 mang gen mã hóa PDGF Plasmid tái tổ hợp pPICZαA/pdgf được thu nhận từ chủng E. coli DH5α bằng phương pháp SDS kiềm, sau đó xử lý bằng enzyme SacI để cắt mở vòng, điện biến nạp vào tế bào Pichia pastoris (P. pastoris) X33 và được nuôi cấy trên môi trường YPD (có thành phần gồm cao nấm men 1%, peptone 2%, dextrose 2%, agar 2% [7]) có nhân tố chọn lọc là zeocine 100 g/ml, ở 25oC, 3-5 ngày. Kiểm tra kiểu hình, kiểu gen của các thể biến nạp Kiểm tra kiểu hình: các thể biến nạp được cấy đồng thời lên hai môi trường MM (môi trường tối thiểu chứa methanol có thành phần YNB 1,34%, biotin 4.10-5%, methanol 0,5%) và MD (môi trường tối thiểu có chứa dextrose có thành phần YNB 1,34%, biotin 4×10-5%, glucose 2%), sau đó đem ủ ở 25oC trong 3-4 ngày và quan sát. Kiểm tra kiểu gen: bộ gen của các thể biến nạp được tách chiết và kiểm tra kiểu gen bằng phản ứng PCR với cặp mồi 5’AOX1 và 3’AOX1. Xác định số bản sao của vector mang gen trong bộ gen của P. pastoris bằng phương pháp PCR bán định lượng Bộ gen của các thể biến nạp sau khi pha loãng trong khoảng 6.255 ng - 800 ng được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi 5’AOX1 và 3’AOX1 trong 20 chu kỳ. Kết quả khuếch đại được điện di trên gel agarose 1% và phân tích bằng phần mềm ImageJ nhằm xác định số bản sao gen pdgf trong bộ gen nấm men. Số bản sao gen pdgf trong bộ gen nấm men được tính thông qua tỷ lệ sản phẩm khuếch đại chứa gen pdgf so với sản phẩm khuếch đại gen AOX1, một gen nội sinh của nấm men. Các kết quả phân tích được xử lý bằng phầm mềm ImageJ ( Đánh giá khả năng tăng trưởng và biểu hiện của các thể biến nạp chứa nhiều bản sao Một khuẩn lạc đơn X33, X33 chứa pPICZαA và các thể biến nạp mang gen pdgf được hoạt hóa trong môi trường BMGY lỏng (có thành phần gồm cao nấm men 1%, peptone 2%, YNB 1,34%, 10% citrate buffer 1 M pH 4,0; biotin 4×10-5%, glycerol 1% [7]), nuôi cấy lắc qua đêm 250 vòng/phút, ở 300C đến khi OD600 của dịch nuôi cấy đạt 2-6. Sau đó sinh khối được chuyển vào môi trường BMMY (có thành phần như môi trường BMGY nhưng glycerol được thay thế bằng methanol có nồng độ cuối là 0,5% (v/v)) và tiếp tục nuôi cấy lắc. Sau mỗi 24 giờ, bổ sung methanol đạt nồng độ cuối 0,5%, đồng thời dịch nuôi cấy được thu nhận, đo OD600 để đánh giá khả năng tăng trưởng. Quá trình cảm ứng biểu hiện các thể biến nạp trên môi trường BMMY pH 4,0 được thực hiện tương tự như trên, 72 giờ sau cảm ứng, dịch nuôi cấy được ly tâm 13000 vòng/phút, trong 5 phút, sau đó loại sinh khối, thu nhận dịch môi trường. Sự biểu hiện protein PDGF được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE, phân tích bằng phần mềm Quantity One ((Biorad, rad.com/en-us/product/quantity-one-1-d- analysis-software) và lai Western KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tạo dòng tế bào E. coli DH5α mang plasmid biểu hiện PDGF Plasmid tái tổ hợp pPICZαA/pdgf sau khi tạo thành được biến nạp vào tế bào E. coli DH5α. Các thể biến nạp sau khi sàng lọc trên môi TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 77-83 79 trường kháng sinh zeocine được tiếp tục kiểm tra bằng phương pháp PCR khuẩn lạc sử dụng cặp mồi 5’AOX1 và 3’AOX1. Các thể biến nạp cho kết quả PCR khuẩn lạc dương tính (xuất hiện 1 vạch có kích thước vào khoảng 870 bp trên bản điện di) được tiếp tục tách chiết thu nhận plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp SDS-kiềm (kết quả không được trình bày ở đây). Hình 1. Sàng lọc vector tái tổ hợp mang gen pdgf a. Sàng lọc vector tái tổ hợp bằng phản ứng PCR; a1. Vị trí mồi AOX1 trên bộ gen nấm men tái tổ hợp; a2. Kiểm tra vector tái tổ hợp bằng PCR; b. Kiểm tra vector tái tổ hợp mang gen pdgf bằng phương pháp cắt giới hạn; b1. Vị trí enzyme cắt giới hạn trong vector; b2. Xử lý vector tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn. Nhằm phát hiện gen pdgf trên plasmid pPICZαA/pdgf, plasmid tái tổ hợp được phân tích bằng phương pháp sử dụng cặp mồi đặc hiệu FXhoI (mồi xuôi) trên gen và 3’AOX1 (mồi ngược) trên plasmid. Những plasmid pPICZαA có chèn gen pdgf sẽ cho vạch DNA với kích thước khoảng 540 bp, tương ứng với với kích thước vạch gen pdgf cộng với một đoạn DNA trên plasmid pPICZαA. Trong khi đó, với khuôn là plasmid pPICZαA không mang gen pdgf nên không có sản phẩm PCR (hình 1a). Kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp pPICZαA/pdgf bằng enzyme XhoI và NotI cho 2 vạch đúng như dự kiến: một vạch có kích thước tương ứng với kích thước của plasmid pPICZαA, và một vạch có kích thước tương ứng với gen pdgf (hình 1b). Đồng thời, kết quả giải trình tự gen pdgf trên plasmid pPICZαA/pdgf bằng cặp mồi 5’AOX1 và 3’AOX1 sau khi so sánh với trình tự lý thuyết do chúng tôi thiết kế và cải biên cho gen pdgf biểu hiện trong nấm men bằng phần mềm Jellyfish ( software/jellyfish/) cho độ tương đồng 100%. Điều này cho phép kết luận chúng tôi đã tạo dòng hóa thành công gen pdgf vào vector biểu hiện pPICZαA trong tế bào E. coli DH5α. Tạo dòng tế bào P. pastoris X33 mang gen mã hóa PDGF Plasmid pPICZα/pdgf được đưa về dạng thẳng bằng cách xử lý với enzyme SacI và điện biến nạp vào tế bào chủ P. pastoris X33. Các thể biến nạp sau khi sàng lọc dựa trên khả năng kháng kháng sinh zeocine được kiểm tra kiểu hình và kiểu gen. Hình 2. Kết quả kiểm tra kiểu hình nấm men mang gen pdgf a b MM MD Vuong Cat Khanh et al. 80 Khi DNA plasmid được sát nhập vào bộ gen của tế bào chủ P. pastoris trong quá trình tái tổ hợp tương đồng, gen AOX1 (mã hóa cho enzyme alcohol oxidase, enzyme chính quy định khả năng sử dụng methanol của P. pastoris) có thể giữ lại hoặc bị loại bỏ, vì vậy kiểu hình của thể biến nạp sẽ thay đổi. Nếu gen AOX1 không bị mất đi, kiểu hình các thể biến nạp thu được là Mut+, có khả năng tăng trưởng tốt trên môi trường methanol. Nếu gen AOX1 bị loại bỏ, thể biến nạp sẽ có kiểu hình MutS sinh trưởng kém trên môi trường có methanol. Kết quả so sánh sự phát triển của thể biến nạp trên hai môi trường MD và MM, cho thấy tất cả các thể biến nạp đều tăng trưởng tốt trên cả hai môi trường (hình 2). Do đó, tất cả các thể biến nạp đều có kiểu hình Mut+ (còn giữ lại gen AOX1 trong bộ gen). Để xác nhận kết quả kiểm tra kiểu hình (hình 2), DNA bộ gen của các thể biến nạp được tách chiết và thực hiện phản ứng PCR kiểm tra kiểu gen bằng cặp mồi 5’AOX1 và 3’AOX1. Sản phẩm PCR từ các chủng Mut+ khi điện di sẽ thu được 2 vạch. Một vạch có kích thước 875 bp tương đương kích thước tổng của gen pdgf và vùng gen AOX1 nằm trên plasmid. Vạch còn lại có kích thước khoảng 2,2 kb, tương ứng với gen AOX1 có sẵn trong bộ gen của X33. Ở các chủng MutS thì không có vạch 2,2 kb này. Kết quả PCR cho thấy ở tất các các dòng đều xuất hiện 2 vạch trên bản điện di (hình 3), điều này chứng tỏ tất cả các thể biến nạp đều có kiểu hình Mut+, phù hợp với kết quả kiểm tra kiểu hình. Các dòng này tiếp tục được phân tích nhằm xác định số lượng pPICZα/pdgf được sát nhập vào bộ gen bằng phương pháp PCR bán định lượng. Xác định số lượng bản sao của gen pdgf trong bộ gen các thể biến nạp Hình 3. PCR kiểm tra kiểu gen các thể biến nạp. (a) Vị trí bám của mồi AOX1 và các kết quả PCR dự kiến tương ứng với kiểu hình Mut+ và Muts; (b) Kết quả PCR kiểm tra kiểu gen các thể nấm men mang gen pdgf Đối với các thể biến nạp nấm men kiểu hình Mut+, khi thực hiện phản ứng với mồi AOX1 (hình 3) bên cạnh sản phẩm PCR là gen AOX1 có kích thước 2,2 kb, phản ứng còn cho sản phẩm DNA dung hợp chứa gen mục tiêu pdgf dài khoảng 875 bp có nguồn gốc từ plasmid tái tổ hợp và được sát nhập vào bộ gen của tế bào nấm men trong quá trình biến nạp. Số lượng các bản sao DNA chèn vào bộ gen là hoàn toàn ngẫu nhiên. Nếu bộ gen thể nấm men biến nạp chứa 1 bản sao DNA dung hợp, lượng sản phẩm DNA 875 bp chứa gen pdgf sẽ tương tương với lượng sản phẩm khuếch đại từ gen AOX1 nội sinh (2,2 kb). Bộ gen thể biến nạp nấm men chứa càng nhiều bản sao của gen pdgf thì tỷ lệ sản phẩm khuếch đại càng tăng so với gen AOX1 nội sinh. Bằng cách tính tỉ lệ sản phẩm khuếch đại, chúng tôi xác định tương đối số lượng bản sao pdgf trong thể nấm men biến nạp (hình 4). Kết quả cho thấy, trong 20 thể nấm men mang gen pdgf thu được, có 2 chủng mang nhiều bản sao gen pdgf hơn so với các chủng còn lại (1 chủng mang 16 bản sao và 1 chủng mang 4 bản sao gen pdgf so với các chủng còn lại chỉ mang 1 bản sao của gen pdgf). Chúng tôi tiến hành ghi nhận kết quả và khảo sát khả năng tăng trưởng cũng như khả năng sinh tổng hợp PDGF của các chủng nấm men này. TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 77-83 81 Hình 4. PCR bán định lượng xác định số lượng bản sao của các thể biến nạp a. Vị trí mồi AOX1 trên bộ gen Mut+; b. Kết quả điện di sản phẩm PCR bán định lượng; c. Số lượng bản sao tương đối của các thể biến nạp Hình 5. Đường cong tăng trưởng của chủng X33 hoang dại và các thể biến nạp Đánh giá khả năng tăng trưởng của các thể biến nạp nấm men đa bản sao pdgf Việc chứa nhiều bản sao của vector trong bộ gen có thể sẽ ảnh hưởng tới sức sống của các thể biến nạp. Kết quả khảo sát tăng trưởng cho thấy khả năng tăng trưởng của các thể biến nạp không khác biệt nhiều so với chủng X33 hoang dại, giá trị OD600 cao nhất đều đạt khoảng 10-15 sau 48 giờ cảm ứng (hình 5). Điều này chứng tỏ các thể biến nạp đa bản sao thu nhận được không bị giảm sức sống do hiện tượng sát nhập gen gây ra. Kiểm tra khả năng biểu hiện PDGF của các thể biến nạp Để đánh giá sự ảnh hưởng của số lượng bản sao gen sát nhập đến khả năng biểu hiện protein mục tiêu, chúng tôi tiến hành cảm ứng biểu hiện PDGF từ các thể biến nạp thu nhận được. Hình 6. Khả năng biểu hiện PDGF của các thể biến nạp a. SDS-PAGE điều kiện biến tính; b. PAGEđiều kiện không biến tính; c. %PDGF/tổng protein tiết. Kết quả kiểm tra protein bằng SDS-PAGE cho thấy, dịch nuôi cấy của các thể biến nạp (hình 6) xuất hiện 1 vạch protein có kích thước trong khoảng 17 kDa trong điều kiện biến tính tương ứng với kích thước PDGF monomer và 31 kDa trong điều kiện không biến tính tương ứng với PDGF cấu hình dimer, trong khi nấm men P. pastoris không chèn gen pdgf không sản xuất được protein này. Phân tích bằng phần mềm Quantity One chúng tôi nhận thấy vạch protein này đậm và nhiều hơn hẳn ở thể biến nạp đa bản sao (thể 1 và 4) và nhiều nhất ở thể biến nạp 1, chiếm 44,5% so với tổng lượng protein tiết của tế bào (hình 6c). Kết quả này Vuong Cat Khanh et al. 82 cũng phù hợp với dự đoán từ kết quả kiểm tra số lượng bản sao pPICZαA/pdgf trước đó. Dòng tái tổ hợp 1 với số lượng bản sao pdgf sát nhập nhiều nhất (16 bản sao) có khả năng biểu hiện protein mục tiêu mức độ cao nhất. Thú vị hơn nữa, khi chúng tôi tiến hành điện di protein thu được từ nấm men trên gel polyacrylamide không bổ sung tác nhân biến tính (hình 6b), chúng tôi nhận thấy protein tiết thu được ở các chủng nấm men có kích thước khoảng 31 kDa. Theo các nghiên cứu của Raines (1982) [8] và Wang (2008) [9] đây có thể là trạng thái dimer của protein PDGF. Điều này cho thấy khả năng thu nhận protein PDGF ở trạng thái dimer (là trạng thái có hoạt tính sinh học) từ các chủng nẩm men tái tổ hợp. Dòng tái tổ hợp 1 được tiếp tục sử dụng để phân tích khả năng biểu hiện protein PDGF theo thời gian. Dịch cảm ứng được thu nhận sau 24, 48 và 72 giờ, sau đó điện di SDS-PAGE và lai western với kháng thể đặc hiệu kháng PDGF (AB20NA, R&D) (hình 7). Hình 7. Khả năng biểu hiện PDGF theo thời gian của thể biến nạp 1 a. SDS-PAGE; b. lai Western với kháng thể kháng PDGF; c. % PDGF trên tổng protein tiết. Kết quả trên bản phim cho thấy, dịch nuôi cấy của các thể biến nạp 1 sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ cảm ứng đều xuất hiện một băng sáng duy nhất tương ứng với vị trí của băng protein kích thước khoảng 31 kDa trên hình PAGE. Điều này giúp khẳng định vạch 31 kDa quan sát trên bản điện di chính là protein PDGF dạng dimer. Phân tích các vạch protein mục tiêu bằng phần mềm Quantity One, chúng tôi nhận thấy trong 72 giờ nuôi cấy, hiệu quả biểu hiện và tiết PDGF của thể biến nạp 1 ngày càng tăng. Tại thời điểm 72 giờ, protein PDGF được tiết ra chiếm tới 55,6% so với tổng protein tiết của tế bào. KẾT LUẬN Với các kết quả thu được, chúng tôi kết luận đã thu nhận được 2 dòng nấm men tái tổ hợp đa bản sao gen pdgf. Các dòng nấm men mang nhiều gen chèn này có khả năng sinh trưởng bình thường như chủng chủ nấm men X33 ban đầu và có khả năng biểu hiện protein PDGF. Trong đó, dòng Pichia pastoris X33: pdgf mang 16 bản sao gen pdgf có khả năng biểu hiện và tiết PDGF cao, chiếm 55,6% tổng lượng protein tiết. Các kết quả này là tiền đề cho các nghiên cứu phát triển sản phẩm protein PDGF tái tổ hợp tiếp theo. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Berlanga-Acosta J., Gavilondo-Cowley J., Barco-Herrera D. G., Martín Machado J., Guillen-Nieto G., 2011. Epidermal growth factor (EGF) and platelet-derived growth factor (PDGF) as tissue healing agents: clarifying concerns about their possible role in malignant transformation and tumor progression. Journal of Carcinogenesis & Mutagenesis, 1:115. doi:10.4172/2157- 2518.1000115 2. Darby R. A., Cartwright S. P., Dilworth M. V., Bill R. M., 2012. Which yeast species shall I choose? Saccharomyces cerevisiae versus Pichia pastoris (review). Springer, 866: 11-23. 3. Embil J. M., Papp K., Sibbald G., Tousignant J., Smiell J. M., Wong B., Lau C. Y., 2000. Recombinant human platelet- TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 77-83 83 derived growth factor-BB (becaplermin) for healing chronic lower extremity diabetic ulcers: an open-label clinical evaluation of efficacy. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society, 8(3): 162-8 4. Grinna L. S., Tschopp J. F., 1989. Size distribution and general structural features of N-linked oligosaccharides from the methylotrophic yeast, Pichia pastoris. Yeast, 5: 107-115. 5. Hamilton S. R., Davidson R. C., Sethuraman N., Nett J. H., Jiang Y., Rios S., Bobrowicz P., Stadheim T. A., Li H., Choi B-K., Hopkins D., Wischnewski H., Roser J., Mitchel T., Strawbridge R. R., Hoopes J., Wildt S., Gerngross T. U., 2006. Humanization of yeast to produce complex terminally sialylated glycoproteins. Science, 313: 1441-1443. 6. Heldin C. H., Westermark B., 1999. Mechanism of action and in vivo role of platelet-derived growth factor. Physiol. Rev., 79(4): 1283-316. 7. Pichia expression kit, Invitrogen, 2010, Catalog no. K1710-01. 8. Raines E. W., Ross R., 1982. Platelet- derived growth factor. J. Bio. Chem., 257(9): 5154-5160. 9. Wang Y., Xue, L., Li Y., Zhu Y., Yang B., Wang X., 2009. High-level secretory production of recombinant human platelet- derived growth factor-BB by Saccharomyces cerevisiae under the non- selective conditions. Appl. Biochem. Microbiol., 45(2): 154-161. A STUDY ON CONSTRUCTING AND SCREENING OF MULTI-COPY pdgf RECOMBINANT Pichia pastoris CLONES PRODUCING HIGH YIELD OF PDGF-BB (Platelet derived growth factor BB) Vuong Cat Khanh, Ngo Thi Huyen Trang, Nguyen Pham Phuong Thanh, Dang Thi Phuong Thao, Tran Linh Thuoc Vietnam National University, Ho Chi Minh city, University of Science SUMMARY Platelet-derived growth factor-BB has been approved by US Food and Drug Administration- FDA for the treatment of neuropathic ulcers. Since the number of diabetic patients has increased rapidly, it is necessary to study the production of PDGF-BB with low cost for treatment. Among the expression systems used for human recombinant protein expression, Pichia pastoris is the remarkable one with many advantages. Multiple integrated copies of target gene may give advance in driving up expression level of target protein. In this study, we succeeded in constructing and screening two yeast clones, which carry multi-copy of pdgf target gene. The two multi-copy yeast clones were subjected indetermination of PDGF expression level and compared to single-copy yeast clones. Our results showed that multi-copy pdgf yeast clones have higher level expression of target protein. PDGF produced by the multi-copy pdgf yeast clones accounted for over 50% of total secretory protein, and was folded in dimer form, which is necessary for performing biofunction in wound healing. Keywords: Pichia pastoris, multi-copy clone, platelet-derived growth factor BB, yeast. Ngày nhận bài: 15-7-2013