Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa cho enzyme luciferase trong hệ biểu hiện E.coli - Nghiêm Ngọc Hoa

Hóa học & Kỹ thuật môi trường N. N. Hoa, , P. K. Cường, “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa hệ biểu hiện E.coli.” 120 NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO ENZYME LUCIFERASE TRONG HỆ BIỂU HIỆN E.coli Nghiêm Ngọc Hoa*, Nguyễn Hà Trung, Tô Lan Anh, Trần Thị Thanh Quỳnh, Phạm Kiên Cường Tóm tắt: Luciferase (Luc) là một enzyme quan trọng tham gia vào việc xúc tác cho phản ứng phát quang sinh học. Cơ chế phản ứng phát quang sinh học liên quan đến enzyme luciferase là một quá trình gồm nhiều bước với sự tham gia của ATP, cơ chất luciferin, enzyme luciferase, oxy, ion Magie. Đây cũng là cơ chế phản ứng phát quang sinh học ở đom đóm. Trong nghiên cứu này, gen mã hóa cho luciferase đom đóm trong vector pGEMT đã được nhân bản bằng PCR và được chuyển vào vector biểu hiện pET43a,để tạo ra vector biểu hiện pET43a-Luc. Vector này được biến nạp vào chủng E.coli BL21-DE3 tạo nên dạng tái tổ hợp BL21-DE3-pET43a- Luc. Sự biểu hiện của gen mã hóa enzyme Luciferase đã được kiểm tra bằng phương pháp điện di SDS PAGE và thẩm tách miễn dịch. Từ khóa: Luciferase; Đom đóm; Tái tổ hợp. 1. MỞ ĐẦU Từ phản ứng phát sáng được quan sát ở một số sinh vật như nấm, đom đóm, sứa, vi khuẩn...các nhà hóa sinh học đã tách chiết thành công chất có khả năng thúc đẩy quá trình phát sáng trong các tế bào sinh vật và thống nhất gọi chúng là luciferase. Luciferase là một thuật ngữ thường được sử dụng để mô tả các enzyme có khả năng xúc tác cho phản ứng phát quang sinh học, thuộc họ protein dạng aldelynate và có một nhóm oxy-4- oxidoreductase để thực hiện các hoạt động chính là khử carboxyl hóa và thủy phân ATP. Bước sóng phát sáng cũng như thành phần tham gia vào phản ứng phát quang ở mỗi loài là khác nhau. Hiện nay đã có trên 20 loại luciferase khác nhau đã được xác định dựa vào nguồn gốc và cơ chế tác dụng của chúng. Trong đó, luciferase của đom đóm được tập trung nghiên cứu nhiều nhất [3,4]. Các gen luciferase đã được phân lập từ một số loài đom đóm [8]. Cùng với lợi ích thương mại lớn, các gen luciferase đom đóm đang ngày càng được sử dụng như một gen chỉ thị trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử. Trong thực tế các gen luciferase đã được sử dụng như một gen chỉ thị hiệu quả cao trong nhiều sinh vật như amip, vi khuẩn, nấm mốc, thực vật, tằm và chuột. Ở Việt Nam, đã có một số nghiên cứu về luciferase tuy nhiên các công bố về ứng dụng của phương pháp phát quang sinh học nói chung và luciferase nói riêng còn hạn chế và chưa có nhiều nghiên cứu chuyên sâu về enzyme này [1,2]. Đặc biệt là việc ứng dụng enzyme luciferase trong các lĩnh vực phục vụ cho quân đội như trong trinh sát phát hiện chất độc hóa học còn chưa được quan tâm nghiên cứu. Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện enzyme luciferase bằng phương pháp tái tổ hợp ở các hệ thống biểu hiện khác nhau như: vi khuẩn E.coli, tế bào động vật, cây cà rốt và thuốc lá, cá ngựa vằn, ruồi giấm... [6,7,9]. Tuy nhiên, hệ thống biểu hiện ở vi khuẩn E.coli vẫn là sự lựa chọn chủ yếu của các nghiên cứu vì sự đơn giản và hiệu quả. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nhân dòng gen mã hóa enzyme luciferase vào vector pET 43a và biểu hiện ở E.coli. 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu và hóa chất Chủng E. coli DH5α , BL21 DE3 được mua từ hãng Invitrogen. Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 60, 4 - 2019 121 Hỗn hợp dNTP, thang chuẩn DNA được mua từ hãng Fermentas; Taq DNA polymerase, enzyme giới của hãng Enzynomics, T4 DNA ligase của hãng Promega, bộ kit tinh sạch plasmid của hãng Anabio R&D JSC. Các hóa chất còn lại đều đạt độ tinh sạch dành cho phân tích và được mua từ các hãng tin cậy (Sigma, Merk). 2.2. Thiết bị Máy PCR (Bio-Rad, Singapore), máy điện di (Cleaver-Anh), hệ thống phân tích hình ảnh (Biorad-Italia), máy Deltatox (Mỹ), máy ly tâm lạnh (Sigma- Đức), máy đo quang phổ Halo RB (RB-10), tủ ấm (Memer-Đức), máy đo pH (Mette toledo), máy lắc (Big bill, Mỹ). 2.3. Phương pháp, kĩ thuật nghiên cứu 2.3.1. Nhân dòng đoạn gen mã hóa enzyme luciferase Gen mã hóa cho enzyme luciferase được nhân bản trực tiếp bằng phương pháp PCR. Đoạn mồi được sử dụng có chứa trình tự nhận biết của enzyme NdeI (Luc-Fw:5’- GATATACATATGGAAAACATGGAGAACGATGAAAAT -3’) và enzyme XhoI (Luc- Rv:5’- GTGCTCGAGCATCTTAGCAACTGG -3’) PCR chứa 1xTaq polymerase buffer, 2 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs và 2,5 đơn vị Taq polymerase với tổng thể tích cuối là 25 µl. Quá trình nhân bản được tiến hành bởi máy GeneAmp PCR System 9700 với 1 vòng ở 94oC trong 5 phút để khởi động nóng, tiếp theo là 35 chu kì gồm 30s ở 94oC, 45s ở 53oC, và 2 phút ở 72oC, tiếp theo là kéo dài ở 72oC trong 7 phút và bảo quản ở 4oC cho đến khi sử dụng. Sản phẩm PCR sau khi được tạo thành và vector pET 43a được xử lý bằng enzym giới hạn NdeI XhoI, sau đó được gắn vào vector pET 43a nhờ kit ligase và được biến nạp vào E.coli DH5α. Chủng vi khuẩn được cấy gạt trên đĩa thạch LB, có bổ sung Ampicilin đến nồng độ 50μg/ml qua đêm ở 37ºC. Các khuẩn lạc dương tính mang vector tái tổ hợp được phát hiện bằng phương pháp PCR sử dụng trực tiếp khuẩn lạc làm nguồn cho DNA khuôn với cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gen Luciferase (Luc Fw/Rv) và cặp mồi vector (T7 Fw/ Rv). Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. 2.3.2. Tách plasmid chứa vector tái tổ hợp pET43a- Luc Plasmid tái tổ hợp pET43a-Luc được tinh sạch theo kit Anapure plasmid mini kit của hãng Anabio R&D JSC với các dung dịch đệm kèm theo: Resuspension Buffer, Lysis Buffer, Binding Buffer, Washing Buffer, Elution Buffer. 2.3.3. Biểu hiện gen mã hóa enzyme luciferase ở E.coli Vector tái tổ hợp pET43a-Luc được biến nạp vào chủng vi khuẩn biểu hiện E.coli BL21- DE3 và được nuôi cấy trong môi trường LB có chứa ampicillin 50 µg/ml, chloramphenicol 34 µg/ml. Sinh tổng hợp enzyme luciferase được cảm ứng bằng IPTG 1mM. 2.3.4. Kiểm tra sự biểu hiện của enzyme luciferase ở E.coli Lấy một khuẩn lạc dương tính chứa vector tái tổ hợp pET43a-Luc trên đĩa LB đặc cho vào 50ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh Amp 50 µg/ml và Cm 34 µg/ml, nuôi lắc qua đêm với tốc độ 200 vòng/phút tại 37oC. 10ml dịch nuôi đem trẻ hóa 50 lần trong 500ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh amp 50 µg/ml và Cm 34 µg/ml. Vi khuẩn được nuôi cho đến khi OD600 đạt 0,6 – 0,8, bổ sung IPTG đến nồng độ cuối 1mM rồi đem nuôi ở 20oC, 200 vòng/phút, 4 giờ. Sau 4 giờ nuôi cấy, thu sinh khối tế bào bằng cách li tâm ở 8000 vòng/phút, trong 5 phút ở 4oC. Tủa được hòa lại trong đệm PBS, pH=7,8 thu được dịch sau hòa tủa. Bảo quản dịch sau hòa tủa tại -20oC. Dịch sau hòa tủa được đem đi phá vỡ tế bào bằng siêu âm 4 lần trên đá, mỗi lần 30 giây. Dịch sau phá tế bào được đem đi li tâm 13000 vòng/phút, trong 20 phút ở 4oC, thu dịch. Dịch chứa enzyme được bảo quản ở -20oC cho các bước tiếp theo. Hóa học & Kỹ thuật môi trường N. N. Hoa, , P. K. Cường, “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa hệ biểu hiện E.coli.” 122 Sự có mặt của protein Luc (khối lượng phân tử khoảng 61kDa) trong dịch chiết tế bào BL21 được kiểm tra bằng điện di trên gel polyacrylamide 12% có SDS và khẳng định bằng thẩm tách miễn dịch. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nhân bản đoạn gen mã hóa enzyme luciferase Đoạn gen mã hóa Luciferase được nhân bản bằng PCR với cặp mồi Luc- Fw/Rv, sử dụng plasmid pGEMT-Luc làm khuôn. Kết quả thu được (hình 1) cho thấy sự có mặt băng ADN nhân bản kích thước khoảng 1,6kb, tương ứng với kích thước của đoạn gen Luciferase (đường chạy 1,2), chứng tỏ chúng tôi đã nhân bản thành công đoạn gen Luciferase. Hình 1. Điện di sản phẩm PCR nhân bản gen Luciferase trên gel agarose 1%. M: Thang chuẩn ADN 1kb; (-) Sản phẩm PCR từ đối chứng âm ( không có ADN); 1,2: Sản phẩm PCR sử dụng pGEMT-Luc làm khuôn 3.2. Biểu hiện gen mã hóa enzyme luciferase trong pET43a Để thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa Luciferase, chúng tôi đã sử dụng vector pET43a. Chúng tôi đã tiến hành xử lý vector pET43a và sản phẩm PCR của đoạn gen Luciferase bằng cặp enzyme cắt giới hạn XhoI và NdeI. Sản phẩm cắt sau khi điện di kiểm tra (hình 2) được tinh sạch nhằm thu được gen Luciferase và vector pET 43a. Sản phẩm sau tinh sạch được đem đi ligase bằng T4 ligase, để 4ºC qua đêm. Sau đó sản phẩm ligase được đem biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α. Các khuẩn lạc được lựa chọn ngẫu nhiên để làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi Luc Fw/ Rv và cặp mồi vector T7 promoter, T7 terminator để kiểm tra sự có mặt của gen Luciferase ở mỗi khuẩn lạc. Kết quả thu được (hình 3) cho thấy khi sử dụng cặp mồi T7 của vector pET43a, sản phẩm PCR cho băng ADN có kích thước khoảng 1,9 kb (tương ứng với tổng kích thước của đoạn gen luciferase cộng với đoạn 300 bp của vector), còn khi sử dụng cặp mồi Luc Fw/Rv cho băng DNA có kích thước khoảng 1,6 kb, tương ứng với kích thước đoạn gen luciferase. Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 60, 4 - 2019 123 Kết quả này chứng tỏ chúng tôi đã gắn thành công đoạn gen mã hóa Luciferase vào vector pET43a, kí hiệu pET43a-luc. Hình 2. Ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid pET 43a và gen Luciferase với enzyme giới hạn XhoI và NdeI. M: 1 kb DNA marker 1: Sản phẩm PCR gen luciferase 2: Sản phẩm cắt gen luciferase 3: Plasmid pET 43a cắt với enzyme giới hạn NdeI và XhoI 4: plasmid pET 43a nguyên bản Hình 3. Kết quả PCR kiểm tra plasmid pET 43a-Luc. 5: 1 kb DNA marker 1,2,3: Sản phẩm PCR với mồi T7 Fw/Rv 4,6: Đối chứng âm 7,8,9: Sản phẩm PCR với mồi Luc Fw/Rv Để kiểm tra biểu hiện gen mã hóa cho Luciferase, vector pET43a-Luc được biến nạp vào tế bào E.coli BL21 DE3 và cấy trải trên môi trường LB có kháng sinh Amp 50µg/ml và chloramphenicol 34 µg/ml. Để khẳng định pET43a-Luc có thực sự biểu hiện hay không, dịch chiết sinh khối tế bào E.coli DH5α đã được cho kiểm tra bằng điện di trên gel poyacrylamide 12% có chứa SDS- PAGE. Hình 4. Điện di gel polyacrylamide có SDS (A) và thẩm tách miễn dịch kiểm tra sự biểu hiện của pET43a-Luc ở E.coli BL21 DE3 (B). M: Thang chuẩn protein; 1,2: dịch chiết E.coli không chứa protein biểu hiện.; 3,4: dịch chiết E.coli có sự biểu hiện của enzyme Luciferase. Hóa học & Kỹ thuật môi trường N. N. Hoa, , P. K. Cường, “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa hệ biểu hiện E.coli.” 124 Kết quả điện di protein (hình 4A) cho thấy sự xuất hiện của một băng protein khoảng 61 kDa ở dịch chiết tổng số tế bào E.coli BL21 DE3 tương ứng với kích thước Luciferase tái tổ hợp tính toán lý thuyết, trong khi đó dịch chiết tổng sổ tế bào E.coli không mang vector pET 43a- Luc không xuất hiện băng protein có kích thước 61 kDa. Do đó, chúng tôi bước đầu khẳng định vi khuẩn E.coli BL21 DE3 đã biểu hiện được enzyme luciferase tái tổ hợp. Kết quả xác định hoạt tính Luciferase tái tổ hợp thu được trong dịch chiết protein tổng số có hoạt độ là 2,1x104 RLU/ml. Kết quả này tương đồng với kết quả của Haoran và cộng sự (2013) cũng đã biểu hiện thành công gen mã hóa cho luciferase đom đóm Photinus pyralis trên E.coli BL21-DE3 dưới dạng plasmid tái tổ hợp pET28a-luc với kích thước 1652bp, protein tái tổ hợp có khối lượng phân từ 60024Da [5].. 4. KẾT LUẬN Chúng tôi đã nhân dòng thành công đoạn ADN 1.6 kb của gen mã hóa cho luciferase vào hệ thống vector biểu hiện pET43a và chuyển thành công vào hệ thống sinh vật biểu hiện E.coli BL21 DE3. Luciferase tái tổ hợp có kích thước khoảng 61 kDa có hoạt độ là 2,1x104 RLU/ml. Lời cảm ơn: Công trình này được hoàn thành với sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài nghiên cứu khoa học và công nghệ: “ Nghiên cứu khả năng tạo chủng E.coli biểu hiện enzyme luciferase định hướng để phát hiện TNT (trinitrotoluene) trong đất”. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Trần Linh Phước và tập thể (2002), “Tạo dòng sản xuất luciferase tái tổ hợp dùng cho phản ứng phát sáng sinh học invitro”, tạp chí phát triển khoa học và công nghệ Đại học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh, tập 5, số 7. [2]. Phạm Hồ Trương và tập thể (2006), “Nghiên cứu sản xuất bộ Kit vi sinh xác định Arsen bằng máy đo huỳnh quang ABOATOX 1253, đề tài cấp Trung tâm KHKT&CNQS [3]. Conti E., Franks N. & Brick P. (1996), “Crystal structure of firefly luciferase throws light on a superfamily of adenylate-forming enzymes”, Structure, 4, 287–298. [1]. Fraga H. (February 2008), “Firefly luminescence: a historical perspective and recent developments”, Photochem. Photobiol. Sci. 7 (2): 146–58. [2]. Haoran Y., Yanjie L., Liujie H., Xinya L., Guangbo K., He H. (2013), “ Soluble expression of Active Recombinant Firefly Luciferase in Escherichia coli”. Journal of pure and applied microbiology. 7, 679-685. [3]. Jeffrey R.D., Keith V.W, Donald R.H. and Marlene D. (1985), “Cloning of firefly luciferase cDNA and the expression of active luciferase in Escherichia coli”, Biochemistry, Vol. 82, pp. 7870-7873. [4]. Jeffrey R.D., Keith V.W, Marlene D., Donald R.H., and Suresh S. (1987), Firefly Luciferase Gene: Structure and Expression in Mammalian Cells, Molecular and cellular biology, p. 725-737. [5]. Tatsumi H., Kajiyama M., Nakano E., “Molecular cloning and expression in Escherichia coli of a cDNA clone encoding luciferase of a firefly, Luiciola lateralis”, Biochim Biophys Acta. (1992 Jun) 15;1131(2):161-5. [6]. Tatsumi H1, Masuda T, Kajiyama N, Nakano E, “Luciferase cDNA from Japanese firefly Luciola cruciata: cloning, structure and expession in E.coli”, J Biolumin Chemilumin. (1989 Apr-Jun);3(2):75-8. Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 60, 4 - 2019 125 ABSTRACT STUDY ON EXPRESSION OF ENZYME LUCIFERASE IN E. coli Luciferase (Luc) is an important enzyme, catalysated bioluminescent reaction The photoluminescent reaction involving is a multi-step process involving ATP, luciferin, luciferase, oxygen, magnesium ion. This is also the mechanism of photoluminescent reaction in fireflies. In this study, the gene encoding for luciferase in the vector pGEMT was cloned by PCR and transferred into the expression vector pET43a, to generate the expression vector pET43a-Luc. This vector is transformed into the E.coli BL21-DE3 strain that forms the recombinant BL21-DE3 -pET43a- Luc. The expression of the gene encoding enzyme Luc has been tested by electrophoresis SDS PAGE and Western blot. Keywords: Acetylcholinesterase; Firefly; Recombinant. Nhận bài ngày 16 tháng 8 năm 2018 Hoàn thiện ngày 05 tháng 12 năm 2018 Chấp nhận đăng ngày 16 tháng 4 năm 2019 Địa chỉ: Viện Công nghệ mới/Viện Khoa học và Công nghệ quân sự. * Email: nghiemngochoa@gmail.com.