Nghiên cứu bào chế viên ngậm ức chế vi khuẩn chứa cao dược liệu

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 104 NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VIÊN NGẬM ỨC CHẾ VI KHUẨN CHỨA CAO DƯỢC LIỆU Phạm Đình Duy*, Trương Thị Thu Trang**, Trần Văn Thành*, Trịnh Thị Thu Loan* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Hiện nay, với xu hướng trở về thiên nhiên, nhiều dạng thuốc được bào chế từ những nguyên liệu có nguồn gốc thực vật ngày càng phong phú. Từ xưa, trong y học cổ truyền đã có các bài thuốc từ dược liệu điều trị viêm họng hiệu quả, an toàn, kinh tế. Trong số các dược liệu đó, có thể kể đến Cam thảo bắc, Cát cánh, Rẻ quạt, Sâm đại hành. Tuy nhiên, các bài thuốc này thường được sử dụng riêng lẻ, bào chế theo các phương pháp truyền thống (ngâm, hầm, hãm, sắc), không tiện cho việc sử dụng, không che được mùi vị khó chịu. Vì vậy, việc phối hợp các dược liệu dưới dạng cao chiết đã được tiêu chuẩn hóa trong cùng một dạng bào chế phân liều sẵn, dễ sử dụng là một vấn đề đang được quan tâm. Viên ngậm là dạng bào chế rất thích hợp cho việc điều trị những bệnh vùng miệng, họng vì thuốc tiếp xúc trực tiếp vị trí bệnh cho hiệu quả nhanh, không bị ảnh hưởng bởi dịch và men tiêu hóa trước khi đến nơi cần tác động. Do đó, đề tài được thực hiện với mục tiêu là bào chế được viên nén ngậm chứa cao dược liệu đạt tiêu chuẩn đề ra và có tác dụng kháng khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 29213 và MRSA ATCC 43300 in vitro. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Viên nén ngậm chứa cao chiết của hỗn hợp dược liệu (gọi tắt là cao chiết dược liệu) có tác động ức chế vi khuẩn Staphylococcus aureus và MRSA nhằm điều trị viêm họng. Phương pháp nghiên cứu: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của hỗn hợp cao dược liệu nghiên cứu bằng phương pháp cấy trên đĩa thạch. Từ nồng độ MIC đã xác định, tiến hành đánh giá tác động kháng khuẩn của cốm bán thành phẩm chứa cao dược liệu ở các hàm lượng khác nhau. Sau khi xác định được hàm lượng cao dược liệu cần sử dụng, tiến hành xây dựng công thức viên ngậm dựa trên phương pháp nghiên cứu thay đổi tỉ lệ thành phần công thức bào chế và tối ưu hoá bằng phần mềm BC Pharmsoft. Kết quả: Đã xây dựng được công thức bào chế viên nén ngậm có tác động kháng khuẩn Staphylococcus aureus và MRSA. Kết luận: Viên nén ngậm rã nhanh, có tác động kháng khuẩn. Công thức viên nén đã xây dựng có thể dùng để nghiên cứu nâng cấp cỡ lô và sản xuất thực tế. Từ khoá: viên ngậm, cao dược liệu, viêm họng ABSTRACT RESEARCH AND FORMULATION OF TABLET CONTAINING PLANT EXTRACTS FOR SORE THROAT TREATMENT Pham Dinh Duy, Trương Thi Thu Trang, Tran Van Thanh, Trinh Thi Thu Loan * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 – No. 4 - 2019: 104 - 111 Objectives: Currently, with the trend of back to nature, many types of drugs are made from plant extracts increasingly tremendously. From ancient times, in traditional medicine, there were remedies from medicinal herbs to treat sore throat effectively, safely and economically. Among those herbs, it is possible to mention Glycyrrhiza uralensis, Platycodon grandiflorum, Belamcanda chinensis, Eleutherine bulbosa. However, these remedies are often used separately, prepared according to traditional methods, inconvenient for use, and it has unpleasant flavors. Therefore, the combination of standardized plant extracts in the conventional dosage form, easy to use is *Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh **Công ty Huỳnh Tấn Tác giả liên lạc: PGS.TS. Trần Văn Thành ĐT: 0919000008 Email: tranvanthanh@ump.edu.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 105 an issue of concern. The lozenges are dosage forms that are suitable for the treatment of oral and throat diseases because of direct contact with the location resulting fast effect, avoiding the unaffected by digestive enzymes. Therefore, this research is carried out with the aim of making high-quality tablets containing plant extracts that meet the proposed standards and have in vitro antibacterial effects. Materials and methods: Tablets containing plant extracts with anti-microbial activity to treat sore throats. Research method: Determining the minimum inhibitory concentration (MIC) of plant extracts by method of implantation on agar plates. From the determined MIC, the inhibitory effect on bacteria of various concentrations of plant extracts in the granule were studied. After determining the effective concentration of plant extracts, the formulation of lozenges were prepared based on changing ratio of excipients and the optimization of formula, which was obtained by the support of BC Pharmsoft programme. Results: A formula for lozenges possessing an antibacterial effect was achieved. Conclusion: Fast-release lonzenges have antibacterial effects. The lonzenges formulations can be used to scale-up to produce commercially Keywords: sore throat, lonzenge, plant extracts ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, với xu hướng trở về thiên nhiên, nhiều dạng thuốc được bào chế từ những nguyên liệu có nguồn gốc thực vật ngày càng phong phú. Từ xưa, trong y học cổ truyền đã có các bài thuốc từ dược liệu điều trị viêm họng hiệu quả, an toàn, kinh tế. Trong số các dược liệu đó, có thể kể đến Cam thảo bắc, Cát cánh, Rẻ quạt, Sâm đại hành(4,5,6,7). Tuy nhiên, các bài thuốc này thường được sử dụng riêng lẻ, bào chế theo các phương pháp truyền thống (ngâm, hầm, hãm, sắc), không tiện cho việc sử dụng, không che được mùi vị khó chịu. Vì vậy, việc phối hợp các dược liệu dưới dạng cao chiết đã được tiêu chuẩn hóa trong cùng một dạng bào chế phân liều sẵn, dễ sử dụng là một vấn đề đang được quan tâm. Viên ngậm là dạng bào chế rất thích hợp cho việc điều trị những bệnh vùng miệng, họng vì thuốc tiếp xúc trực tiếp vị trí bệnh cho hiệu quả nhanh, không bị ảnh hưởng bởi dịch và men tiêu hóa trước khi đến nơi cần tác động. Do đó, đề tài được thực hiện với mục tiêu là bào chế được viên nén ngậm chứa cao dược liệu đạt tiêu chuẩn đề ra và có tác dụng kháng khuẩn Staphylococcus aureus và MRSA in vitro. Các vi khuẩn này có thể tồn tại trong không khí, da và mũi. Khi người bệnh viêm họng, các vi khuẩn cơ hội này sẽ gây nặng thêm tình trạng bệnh và gây khó điều trị. Việc điều chế viên nén ngậm có tác dụng kháng khuẩn sẽ hỗ trợ giúp người bệnh khi viêm họng. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu thí nghiệm. Nguyên liệu, thiết bị Cao dược liệu được chiết từ sự phối hợp của 4 loại dược liệu gồm Cam thảo bắc, Cát cánh, Rẻ quạt, Sâm đại hành. Cao chiết dược liệu đạt tiêu chuẩn về cảm quan, định tính, định lượng acid glycyrrhizic, tro toàn phần, tro không tan trong acid dựa trên chuyên luận của Dược điển Việt Nam V (kết quả được trình bày trong một công bố khác). Nguồn gốc: Bộ môn Dược học cổ truyền, khoa Y học Cổ truyền, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh. Acid glycyrrhizic chuẩn (Tinh khiết 97,3%, Ban NCKH - ĐHYD), Tinh bột biến tính (Đức, TC USP 30), mannitol (Cargill-Mỹ ), gôm (Willy Benecke-Đức, TC USP 30), tá dược hút (Đức, TC USP 30), aspartam, bột mùi chocola, Aerosil, magnesi stearat (Singapore), methanol (Merck-Đức, TK cho HPLC), Acetonitril (Merck-Đức, TK cho HPLC), acid acetic (Merck-Đức, TK cho HPLC). Chủng vi sinh vật: MRSA ATCC 43300, Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 106 Staphylococcus aureus ATCC 29213. Chủng vi khuẩn được nuôi cấy và bảo quản tại Bộ môn Vi sinh, khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh. Môi trường thử nghiệm: Tryptic Soy Agar (TSA), Mueller Hinton Agar (MHA), Tryptic Soy Broth (TSB). Cân phân tích Precisa (Thụy Sĩ), cân xác định độ ẩm Ohaus (Thụy Sĩ), máy xát hạt (Erweka, Đức), máy dập viên Korsh (Đức), máy đo độ cứng (Erweka, Đức), máy đo độ rã (Erweka, Đức), máy đo độ mài mòn (Erweka, Đức), máy HPLC Shimadzu (Nhật), máy quang phổ UV Viber (Pháp). Phương pháp nghiên cứu Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao dược liệu Nguyên tắc Chất thử nghiệm được pha loãng ở các nồng độ giảm dần trong môi trường thạch Mueller - Hinton (MHA) đã được hấp tiệt trùng. Tiến hành cấy một lượng vi khuẩn qui định lên đĩa thạch ở những vị trí đã được đánh dấu sẵn. Kiểm tra sự tăng sinh của vi khuẩn trên thạch sau một thời gian ủ nhất định ở nhiệt độ qui định. MIC là nồng độ tối thiểu ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn quan sát được bằng mắt thường(1,2,3). Môi trường thử nghiệm Thạch Mueller - Hinton (MHA). Chủng vi sinh vật Staphylococcus aureus ATCC 29213, MRSA ATCC 43300 Chuẩn bị mẫu Cân chính xác khoảng 10 g cao dược liệu cho vào 10 ml nước cất trong bình nón. Lắc đều thu được dung dịch có nồng độ 1 g cao/ml. Từ dung dịch trên tiến hành pha loãng 8 lần với hệ số pha loãng 1/2, thu được 9 dung dịch có nồng độ cao giảm dần được trình bày trong Bảng 1. Bảng 1. Nồng độ các mẫu thử MIC pha loãng từ cao dược liệu Mẫu M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 Nồng độ trung gian (mg/ml) 1000 500 250 125 62,5 32 16 8 4 Nồng độ thử nghiệm mg/ml) 100 50 25 12,5 6,25 3,2 1,6 0,8 0,4 Chuẩn bị môi trường Cân và hòa tan thạch MHA theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hấp tiệt trùng ở 121°C/1 giờ. Để nguội đến khoảng 40-45°C. Đối với mỗi nồng độ: đong 22,5 ml thạch cho vào bình nón có sẵn 2,5 ml dung dịch cao dược liệu, lắc kĩ. Cho vào đĩa petri (đường kính 90 mm, dày 3-4mm). Để đông ở nhiệt độ phòng trên mặt phẳng nằm ngang. Bảo quản trong tủ lạnh ở 4-8°C. Chuẩn bị đĩa môi trường MHA không chứa cao dược liệu: thay thế cao bằng 2,5 ml nước cất để làm mẫu chứng. Chuẩn bị vi khuẩn bằng phương pháp tăng sinh Cấy ria vi khuẩn thử nghiệm trong môi trường TSA, ủ ở 37oC trong 24 giờ. Lấy 3-5 khóm vi khuẩn tinh khiết chuyển vào nuôi cấy trong ống nghiệm chứa 4-5 ml môi trường TSB, ủ ở 35°C trong 2-6 giờ hoặc cho đến khi độ đục lớn hơn hay bằng McFacland 0,5. Hiệu chỉnh dịch treo vi khuẩn đến mật độ vào khoảng 1-2.108 CFU/ml. Xác định mật độ bằng cách đo độ hấp thu quang học ở bước sóng 625 nm, độ hấp thu A phải nằm trong khoảng 0,08-0,12 hay soi trực tiếp trên nền trắng với vạch đen với dung dịch chuẩn McFacland 0,5 (khoảng 1,5 x 108 CFU/ml). Cách tiến hành Đĩa thạch được đánh số cho vị trí các chủng vi khuẩn. Làm khô đĩa thạch có chất thử và đĩa chứng. Cho 1-2 ml huyền dịch vi khuẩn mỗi loại lên đĩa để đạt được mật độ vi khuẩn trên đĩa là 104 CFU/ml. Để yên 15 phút để vết chấm khô. Lật ngược đĩa thạch đã cấy và ủ trong tủ ấm ở Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 107 37oC trong 16-18 giờ. Đối với MRSA phải ủ trong 24 giờ. Đọc kết quả Kết quả chỉ có giá trị khi vi khuẩn trong mẫu chứng mọc bình thường. Đặt đĩa thạch trên một bề mặt sẫm màu, không phản xạ ánh sáng, quan sát sự tạo thành khóm của vi khuẩn thử nghiệm. Tìm đĩa có nồng độ thấp nhất ức chế hoàn toàn sự tạo khóm, nồng độ ở đĩa thạch này là MIC của chất thử đối với vi khuẩn thử nghiệm. Xây dựng công thức và phương pháp bào chế viên nén ngậm Xác định tỉ lệ cao trong đơn vị phân liều Nguyên tắc Để chọn được tỉ lệ cao cần dùng trong một đơn vị phân liều phải căn cứ vào MIC của cao dược liệu và cả khả năng diệt khuẩn của cao trong cốm bán thành phẩm. Phương pháp Đánh giá khả năng diệt khuẩn in vitro của cốm bán thành phẩm bằng phương pháp khuếch tán qua giếng. Vi khuẩn thử nghiệm Staphylococcus aureus ATCC 29213. Đây là chủng vi khuẩn thường xuất hiện trong cơ thể và trong trường hợp viêm nhiễm, chúng có thể xâm nhập vào cơ thể gây suy đa tạng và thậm chí tử vong. Mẫu thử nghiệm Cốm bán thành phẩm chứa cao dược liệu được bào chế với tỉ lệ cao trong mỗi đơn vị phân liều lần lượt là 100, 150 và 200 mg. Chuẩn bị mẫu Nghiền mịn riêng từng mẫu cốm, cân khối lượng mẫu bột cốm tương đương với 100, 150 hoặc 200 mg cao. Cho vào eppendorf, thêm 1 ml nước cất, vortex cho đến khi đồng nhất, thu được hỗn hợp với nồng độ C1. Mỗi mẫu được tiếp tục pha loãng 4 lần với hệ số pha loãng 1/2 thu được các hỗn hợp C2, C3, C4, C5. Chuẩn bị môi trường Cân và hòa tan thạch theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hấp tiệt trùng ở 121°C/1 giờ, để nguội. Đổ thạch vào đĩa petri (đường kính 90mm, dày 4mm). Để thạch đông ở nhiệt độ phòng trên mặt phẳng nằm ngang. Bảo quản trong tủ lạnh ở 4-8°C. Chuẩn bị vi khuẩn bằng phương pháp tăng sinh Thực hiện tương tự như chuẩn bị vi khuẩn đã được đề cập ở trên. Tiến hành Dùng que bông vô trùng nhúng vào hỗn dịch vi khuẩn đã chuẩn bị, ép que trên thành ống cho ráo nước, sau đó trãi đều trên mặt thạch. Để hộp mở nắp trong tủ ấm 3-5 phút cho ráo mặt. Đục lỗ đĩa thạch bằng một ống đồng, vô trùng, đường kính 6 mm đục lỗ trên môi trường đã trải vi khuẩn. Dùng micropipet hút 100 µl mẫu cho vào mỗi giếng. Để yên khoảng 15 phút cho các chất thử nghiệm khuếch tán vào lớp thạch. Ủ hộp thạch trong tủ ấm ở nhiệt độ 37°C trong 16-18 giờ. Đọc kết quả Lỗ chứng không ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Chất thử có khả năng kháng khuẩn khi xung quanh lỗ có vòng vô khuẩn. Xây dựng công thức căn bản cho viên nén ngậm Thành phần tá dược được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: tinh bột biến tính, gôm, tá dược hút, aspartam, bột mùi chocola, aerosil, magnesi, mannitol. Tiến hành thăm dò trên 6 công thức, mỗi công thức với cỡ lô 200 viên, được bào chế trong cùng một qui trình. Việc chọn lựa loại và lượng tá dược dựa theo nguyên tắc là có khả năng kết dính, chịu nén, không gây cảm giác nhám lưỡi và khó chịu khi ngậm. Trong đó, khả năng kết dính và chịu nén được đánh giá dựa trên khả năng tạo thành viên nén. Cảm giác khi ngậm được đánh Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 108 giá dựa trên cảm giác của các thành viên tham gia nghiên cứu đề tài. Từ những công thức thăm dò, lựa chọn đề nghị công thức cơ bản. Từ công thức cơ bản sẽ xác định những biến độc lập và biến phụ thuộc được dùng cho việc thiết kế và tối ưu hóa công thức. Các bước tiến hành bào chế viên nén ngậm Với những thành phần tá dược nêu trên, viên thành phẩm được bào chế qua các bước: a/ Rây tinh bột biến tính, gôm, tá dược hút, mannitol qua rây 0,5 mm. Trộn đều. b/ Thêm cao dược liệu vào khối bột khô, nhồi trộn để tạo thành khối ẩm đồng nhất. c/ Xát hạt qua rây 2 mm. d/ Sấy cốm ở 60°C đến khi độ ẩm dưới 3%. e/ Sửa hạt, rây lại qua rây 1,2 mm. f/ Trộn hoàn tất: thêm aerosil, magnesi stearat, bột mùi chocola, aspartam vào cốm đã sấy khô, trộn đến đồng nhất. g/ Dập viên, khối lượng trung bình khoảng 570 mg, độ cứng 140-170N. h/ Đóng gói. Đánh giá thành phẩm. Thiết kế và tối ưu hóa công thức Quá trình thiết kế và tối ưu hóa gồm các giai đoạn chính như sau: Thiết kế mô hình thực nghiệm Mô hình thực nghiệm 14 công thức được thiết kế bởi phần mềm DesignExpert. Bào chế viên theo mô hình thiết kế Các công thức viên theo thiết kế được bào chế trong cùng điều kiện và qui trình. Đánh giá các thông số của thành phẩm Các thông số đánh giá viên nén gồm: cảm quan, độ đồng đều khối lượng, độ cứng, độ mài mòn, định tính và định lượng hàm lượng acid glycyrrhizic theo chuyên luận về viên nén trong Dược điển Việt Nam V(3). Tối ưu hóa công thức bằng phần mềm BC-Pharsoft Đầu vào là dữ liệu bào chế và giá trị thông số yi của 14 công thức. Kiểm chứng công thức tối ưu Bào chế 3 lô thành phẩm theo công thức tối ưu. Thành phẩm được kiểm nghiệm tương tự như trong giai đoạn thiết kế công thức. KẾT QUẢ Kết quả xác định MIC của cao Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao trên 2 chủng vi khuẩn thử nghiệm MRSA và S.aureus đều là 6,25 mg/ml (Hình 1). Hình 1. Tác động ức chế sự phát triển S.aureus và MRSA của cao với các đĩa thạch có nồng độ cao dược liệu lần lượt từ trái sang phải và từ trên xuống là 100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,2; 1,6; 0,8 và 0,4 mg/ml. 1:S.aureus 2: MRSA 1 2 2 1 2 1 2 1 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 109 Kết quả xây dựng công thức và phương pháp bào chế viên nén ngậm Kết quả xác định tỉ lệ cao trong đơn vị phân liều Bảng 2. Kết quả đường kính vòng vô khuẩn (mm) của 3 mẫu cốm M1 M2 M3 M4 (chứng) C1 16,67 18,00 18,17 0 C2 14,50 16,33 17,50 0 C3 11,33 13,17 14,67 0 Ở cả 3 mẫu, nồng độ thấp nhất còn thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đều là nồng độ C3. Ở các mức nồng độ C4, C5, vòng kháng khuẩn gần như không có. Kết quả đường kính vòng kháng khuẩn (mm) của các mẫu ở 3 mức nồng độ C1, C2, C3 được thể hiện trong Bảng 2 và Hình 2 cho thấy đường kính vòng vô khuẩn của mẫu cốm M2 (150 mg cao/đơn vị phân liều) cao hơn đáng kể so với mẫu cốm M1 (100 mg cao/đơn vị phân liều). Trong khi đó, so sánh mẫu cốm M3 (200 mg cao/đơn vị phân liều) với mẫu cốm M2 thấy đường kính vòng vô khuẩn cũng có tăng nhưng không đáng kể. Vì vậy tỉ lệ cao 150 mg/đơn vị phân liều được chọn để nghiên cứu. Hình 2. Tác động kháng vi khuẩn S.aureus của các mẫu cốm với nồng độ cao giảm dần (C1 - C5) 1: mẫu cốm 1, 2: mẫu cốm 2, 3: mẫu cốm 3, 4: mẫu cốm 4 (không chứa cao) Kết quả xây dựng công thức và phương pháp bào chế viên nén ngậm Thành phần công thức thăm dò (Bảng 3), những công thức này được bào chế với cỡ lô 200 viên. Kết quả như sau: CT1: tạo khối dẻo, dễ xát cốm nhưng vị chưa ngon, cảm giác nhiều bột trên lưỡi khi ngậm. CT2: thay tinh bột bằng β-cyclodextrin, mục đích cải thiện vị nhưng không hiệu quả. CT3: giảm lượng tinh bột, hỗn hợp hơi nhão, khó xát cốm, vị chưa chấp nhận được. CT4: thêm tá dược hút, dễ xát cốm nhưng vẫn có cảm giác nhiều bột trên lưỡi khi ngậm. CT5 và CT6 thêm gôm vào thành phần công thức, cả hai công thức đều dễ xát cốm và dập viên nhưng CT5 vị vẫn chưa tốt, còn cảm giác nhiều bột trên lưỡi, CT6 khó dập viên do dính chày cối. Từ những công thức trên cho thấy tinh bột, tá dược hút và gôm có ảnh hưởng đến việc xát hạt và vị của thuốc khi sử dụng. Do đó, tỉ lệ tinh bột, tá dược hút và gôm được chọn làm thông số độc lập trong quá trình thiết kế và tối ưu hóa công thức. Bảng 3. Thành phần những công thức thăm dò Thành phần 1 viên (mg) CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 Cao dược liệu 150,0 150,0 150,0 150,0 150,0 150,0 β-cyclodextrin - 300,0 - - - - Tinh bột biến tính 200,0 - 100,0 100,0 200,0 50,0 Gôm - - - - 40,0 40,0 Tá dược hút - - - 2,0 - 2,0 Aspartam 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 Bột mùi chocola 75,0 75,0 75,0 75,0 75,0 75,0 Aerosil 3,9 3,9 3,9 3,9 3,9 3,9 Magnesi stearat 5,6 5,6 5,6 5,6 5,6 5,6 Mannitol vđ 570,0 570,0 570,0 570,0 570,0 570,0 Thiết kế và tối ưu hóa công thức Thiết kế mô hình thực nghiệm Mô hình thực nghiệm 14 công thức với x1 và x2 được khảo sát ở 3 mức; x3 hai mức. Dữ liệu bào chế và kiểm nghiệm trong Bảng 4 được dùng làm đầu vào cho phần mềm BC-Pharsoft để xác định mối liên quan nhân-quả và tối ưu hóa thành phần công thức. C1 1 2 4 3 1 2 3 4 C5 1m1 2 3 4 C3 4 1 2 3 C4 1 2 4 3 C2 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 110 Tối ưu hóa công thức Nhập dữ liệu và khai báo Biến độc lập: x1, x2, x3, Biến phụ thuộc: y1, y2, y3. Điều kiện tối ưu hóa cho biến phụ thuộc y1: càng nhỏ càng tốt, y2: từ 20-30 (phút), y3: 1. Bảng 4. Dữ liệu bào chế và kiểm nghiệm của 14 công thức x1 x2 x3 y1 y2 y3 1 100 39,2 1 0,276 35,56 1 2 150 39,2 1 0,260 36,56 0 3 100 28 3 0,322 28,65 0 4 150 28 3 0,310 29,45 0 5 100 16,8 3 0,385 27,12 0 6 100 28 1 0,319 28,41 1 7 50 16,8 3 0,412 18,12 0 8 50 39,2 1 0,242 30,16 1 9 50 28 3 0,356 22,46 1 10 50 28 1 0,362 22,47 1 11 150 16,8 1 0,332 27,12 0 12 50 16,8 1 0,398 18,82 1 13 100 39,2 3 0,284 35,42 1 14 150 16,8 3 0,335 31,25 0 x1: lượng tinh bột (mg) y1: độ mài mòn (%), x2: lượng gôm (mg) y2: thời gian rã (phút), x3: lượng tá dược hút (mg) y3: vị (chấp nhận được = 1, không chấp nhận = 0). Kết quả luyện mạng Bảng 5. Kết quả luyện mạng R 2 luyện R 2 thử Thuật toán y1 0,95 0,95 Backpropagation y2 0,98 0,97 Backpropagation y3 0,98 1,00 Backpropagation Kết quả R2 luyện và R2 thử cho thấy có sự liên quan nhân quả giữa thành phần công thức (X) với tính chất sản phẩm (Y). Khả năng dự đoán của mô hình tốt với R2 lớn hơn 0,9 (Bảng 5). Kết quả tối ưu hóa Kết quả tối ưu hóa bằng phần mềm BC - Pharsoft bao gồm các thông số tối ưu của thành phần công thức và giá trị dự đoán của các tính chất sản phẩm được trình bày trong Bảng 6. Bảng 6. Kết quả tối ưu hóa bằng phần mềm BC - Pharsoft Thành phần công thức Tính chất sản phẩm xi Giá trị tìm được yi Giá trị dự đoán x1 50,00 y1 0,162 x2 39,16 y2 29,50 x3 2,00 y3 0,995 Công thức tối ưu Thành phần 1 viên (mg) 2000 viên (g). Cao dược liệu 150,00 300,00. Tinh bột biến tính 50,18 100,36. Gôm 39,16 78,36. Tá dược hút 2,00 4,00. Aspartam 3,00 6,00. Bột mùi chocola 75,00 150,00. Aerosil 3,90 7,80. Magnesi stearat 5,60 11,20. Mannitol vđ 570,00 vđ 1140,00. Kiểm chứng công thức tối ưu Thành phẩm từ công thức tối ưu được điều chế 3 lô, cỡ lô 2000 viên với cùng điều kiện và qui trình. Sản phẩm được kiểm nghiệm tương tự giai đoạn thiết kế, kết quả (Bảng 7) cho thấy tính chất sản phẩm của 3 lô thực nghiệm không khác nhau có ý nghĩa và đạt yêu cầu đề ra. Vậy công thức và qui trình bào chế viên có tính lặp lại. Bảng 7. Kết quả thực nghiệm và dự đoán Tính chất sản phẩm KQ thực nghiệm KQ dự đoán Lô 1 Lô 2 Lô 3 TB y1 0,15 0,16 0,16 0,157 0,162 y2 25,2 25,8 25,2 25,40 29,50 y3 1 1 1 1 0,995 Đánh giá các chỉ tiêu của thành phẩm Kết quả ở Bảng 8 cho thấy thành phẩm từ 3 lô, cỡ lô 2000 viên đều đạt yêu cầu chất lượng. Bảng 8. Kết quả kiểm nghiệm 3 lô thành phẩm từ công thức tối ưu cỡ lô 2000 viên Chỉ tiêu Mức chất lượng Kết quả Lô 1 Lô 2 Lô 3 Cảm quan Viên nén ngậm hình tròn, màu nâu nhạt, hương chocola, vị ngọt. Đạt Đạt Đạt Độ ĐĐKL ± 5% so với khối lượng trung bình Đạt Đạt Đạt Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 111 Chỉ tiêu Mức chất lượng Kết quả Lô 1 Lô 2 Lô 3 Độ rã 30-40 phút Đạt (27,3 phút) Đạt (25,8 phút) Đạt (26,5 phút) Độ mài mòn Không quá 0,3% Đạt (0,157%) Đạt (0,137%) Đạt (0,161%) Độ cứng 140-170 N Đạt (165 N) Đạt (158 N) Đạt (163 N) Giới hạn nhiễm khuẩn -Tổng số vi khuẩn hiếu khí: ≤ 5.10 4 cfu/g (ml) -Tổng số Enterobacteria: ≤ 500 cfu/g (ml) -Tổng số nấm mốc và men: ≤ 500 cfu/g (ml) - Không được có Samonella trong 10 g (ml), Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, S. aureus trong 1g (ml). Sẽ được thực hiện khi triển khai sản xuất Định tính Định lượng Thời gian lưu của pic AG trên sắc ký đồ mẫu thử tương ứng với thời gian lưu trên sắc ký đồ AG chuẩn. Hàm lượng acid glycyrhizic trong viên phải đạt từ 0,112-0,136 mg. Đúng Đạt (0,125 mg) Đúng Đạt (0,130 mg) Đúng Đạt (0,128 mg) BÀN LUẬN Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn trên đĩa thạch cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao trên 2 chủng vi khuẩn thử nghiệm MRSA và S.aureus đều là 6,25 mg/ml. Đây là nồng độ ức chế tối thiểu có thể đưa vào nghiên cứu bào chế dạng rắn phân liều. Hàm lượng cao chiết sử dụng trong điều chế viên nén được đánh giá ở các mức 100 mg, 150 mg và 200 mg. Hàm lượng ở mức 150 mg được chọn để đưa vào viên nén vì có tác động ức chế vi khuẩn và hàm lượng tương đối nhỏ, có thể phối hợp tá dược để điều chế viên ngậm. Công thức bào chế được xây dựng dựa trên sự thay đổi thành phần tá dược nhằm đánh giá về cảm giác của người ngậm, khả năng tạo hạt có tính kết dính, che giấu mùi vị của cao dược liệu và không để lại cảm giác khó chịu khi ngậm. Khảo sát 6 công thức để xây dựng công thức cơ bản. Từ đó, tiến hành tối ưu hoá công thức bằng phần mềm thông minh. Công thức tối ưu đạt được mục tiêu đề ra là thời gian rã nhanh, không mài mòn nhiều và che giấu tốt vị của cao dược liệu. Hàm lượng cao trong viên nén đã được khảo sát để có tác động ức chế S. aureus và MRSA. KẾT LUẬN Công thức và qui trình bào chế viên ngậm nghiên cứu chứa cao dược liệu đã được xác định. Thành phẩm đạt yêu cầu đề ra của viên ngậm như cảm quan, độ đồng đều khối lượng, độ cứng, độ mài mòn, định tính và định lượng và có tính kháng khuẩn in vitro trên chủng vi khuẩn S.aureus. Lời cảm ơn: Nhóm nghiên cứu chân thành cảm ơn ThS. Phạm Thị Hóa đã cung cấp cao dược liệu để thực hiện đề tài này; PGS.TS. Đỗ Quang Dương đã hỗ trợ việc tối ưu hóa thành phần công thức bằng phần mềm BC-PharSoft. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ môn Vi sinh (2013). Giáo trình thực tập Vi sinh học. Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh, tr. 39-43. 2. Bộ Y tế (2005). Kiểm nghiệm dược phẩm. NXB Y học Hà Nội, pp.131-137. 3. Bộ Y tế (2019). Dược điển Việt Nam V. NXB Y học Hà Nội, PL- 1.20, PL-6.5, PL-9.6, PL-9.7, PL-9.8, PL-9.9, PL-11.3, PL-11.6, PL- 13.6. 4. He J, Chen L, Heber D, et al (2006). “Antibacterial compounds from Glycyrrhiza uralensis”. Journal of Natural Products, 69:121- 124. 5. Maiti B, Singh R, Kumar P, et al (2011). “Recent trends in herbal drugs: a review”. International Journal of Drug Research and Technology, 1(1):17-25. 6. Ngô Văn Thu, Trần Hùng (2011). Dược liệu học. NXB Y học Hà Nội, 1: 205-211, 215-221, 227-231, 256, 424-425. 7. Ren P, Sun G (2008). “HPLC determination of glycyrrhizic acid and glycyrrhetic acid in Fuzilizhong Pills”. Asian Journal of Traditional Medicines, 3(3): 110-116. Ngày nhận bài báo: 28/07/2019 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20/08/2019 Ngày bài báo được đăng: 14/09/2019