Nc 886 đánh giá tác dụng kháng viêm của dầu mù u trong quá trình làm lành vết thương

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số 5 * 2017 62 05 Nc 886 ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG VIÊM CỦA DẦU MÙ U TRONG QUÁ TRÌNH LÀM LÀNH VẾT THƯƠNG Phạm Thị Bảo Trân*, Trịnh Thị Diệu Thường** TÓM TẮT Giới thiệu: Lành vết thương mạn tính là một quá trình phức tạp do kết hợp các hình thái bệnh lý và cơ chế lành thương đặc trưng bởi 4 giai đoạn nối tiếp (cầm máu, viêm, tăng sinh và tái tạo cấu trúc). Trong y học cổ truyền, dầu Mù u (Calophyllum inophyllum L.) được sử dụng rộng rãi nhờ hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm và chống oxy hóa. Tuy nhiên, vai trò kháng viêm trong quá trình lành vết thương của dầu Mù u trên vết thương mạn tính ở da chưa được hiểu rõ. Mục tiêu: Khảo sát sự biểu hiện của cytokin IL-1, IL-6, IL-10, TNF- trong quá trình làm lành vết thương của dầu Mù u bằng phương pháp ELISA trên mô hình chuột gây đái tháo đường bằng hoá chất streptozotocin (STZ). Phương pháp: Kiểm soát đường huyết, cân nặng của chuột. Thu nhận mẫu huyết thanh (ngày 5, 7, 14) và da chuột (ngày 21) có hoặc không điều trị với dầu Mù u trên mô hình chuột đái tháo đường gây bởi STZ để định lượng TNF-α , IL-10, IL-6 và IL-1β sử dụng kháng thể đặc hiệu với bộ kit Quantikine® ELISA. Đo OD ở bước sóng 450 nm trong vòng 30 phút. Kết quả: Liều STZ gây đái tháo đường trên chuột là 100 mg/kg. Các cytokin gây viêm IL-6, IL-1β và TNF-α trong da ở nhóm điều trị bằng dầu Mù u thấp hơn nhóm thuốc đối chiếu PI và nhóm chứng bệnh. Nồng độ cytokin kháng viêm IL-10 ở nhóm dầu Mù u cao hơn nhóm đối chiếu PI và nhóm chứng bệnh. Kết luận: Kết quả này chứng minh dầu Mù u có hiệu quả giảm biểu hiện yếu tố viêm và tăng yếu tố kháng viêm trong vết thương da mạn tính, góp phần thúc đẩy sự làm lành vết thương này. Từ khóa: dầu Mù u, yếu tố viêm, yếu tố kháng viêm, vết thương mạn tính, đái tháo đường ABSTRACT STUDY ON ANTI-INFLAMMATORY EFFECT AND HEALING WOUND OF CALOPHYLLUM INOPHYLLUM L. OIL IN DIABETES MICE Pham Thi Bao Tran, Trinh Thi Dieu Thuong* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 21 - No 5 - 2017: Background: Cutaneous wound healing is a complex biological process which is achieved through important phases: hemostasis, inflammation, proliferation and remodeling. Previous report, we demonstrated that tanu oil extracted from Calophyllum inophyllum L. is widely known as a natural product having anti-bacterial, anti- inflammatory and anti-oxidant activities in acute wound. However, its role in anti-inflammation during chronic wound is not yet understood. Objectives: In this study, we design the STZ induced diabetes in mice and examined anti-inflammatory and healing wound effects of C. innophyllum oil in diabetes mice induced by STZ. Methods: Body weight and blood glucose was examined in mice. Blood samples on the day 5, 7, 14 and mice skin on the day 21 were collected in diabetes mice induced by STZ to measure the level of IL-1, IL-6, IL-10 and * Đại học Cần Thơ ** Đại học Y Dược TP. HCM Tác giả liên lạc: CN. Phạm Thị Bảo Trân ĐT: 01689428907 Email: phamtranctu@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số 5 * 2017 Nghiên cứu Y học 63 TNF-. The Quantikine® ELISA kit was used and the OD was measured at 450 nm within 30 minutes after incubation. Results: The optimal level of STZ to induce diabetes mice was 100 mg/kg. C. innophyllum oil-treated group exhibited faster wound healing compared with the vehicle- and PI-treated group. Skin levels of the proinflammatory cytokines (IL-6, IL-1β and TNF-α ) significantly reduced in C. innophyllum oil-treated group during 21 days of wound healing. By contrast, C. innophyllum oil-treatment induced level of IL-10, anti- inflammatory factor. Conclusion: There was a correlation between low expression of proinflammatory cytokines and anti- inflammatory factors in response of C. innophyllum oil-treated group. It is suggested that C. inophyllum could be a potential pharmaceutical in chronic wound healing for anti-inflammation. Key words: Tanu oil, inflammation, anti-inflammation, chronic wound, diabetes ĐẶT VẤN ĐỀ Các vết thương mạn tính ở da là một vấn đề lớn về sức khoẻ cộng đồng làm giảm chất lượng cuộc sống và tăng chi phí chăm sóc sức khoẻ(1). Không giống như các vết hoại tử cấp tính, nơi collagen bị biến đổi vẫn duy trì cấu trúc, vết thương mạn tính lâu ngày thường được bao phủ bởi các mảng da khô, da dày. Khi da bị tổn thương, tiểu cầu khởi động phản ứng kết dính ngăn ngừa sự mất máu ở khu vực bị thương. Giai đoạn này bao gồm co thắt mạch máu, tập hợp tiểu cầu, đông máu, cuối cùng hình thành cục máu đông. Sự đông máu này tiếp tục di chuyển các tế bào viêm đến vị trí bị thương. Sau giai đoạn này, quá trình điều trị vết thương xảy ra thông qua ba giai đoại chồng chéo chính bao gồm viêm, tăng sinh tế bào/hình thành mô hạt và tái tạo/sẹo với sự tham gia, tương tác của nhiều loại tế bào(5). Giai đoạn viêm bắt đầu nhờ hoạt tính kháng khuẩn của các tế bào viêm (bạch cầu trung tính và bạch cầu đơn nhân) ở nơi chấn thương. Ngoài ra, các đại thực bào tiêu diệt vi khuẩn còn lại, loại bỏ mảnh mô vỡ, làm sạch các bạch cầu trung tính và kích thích sự phát triển nguyên bào sợi và các tế bào biểu mô trên vết thương(9). Nếu phản ứng viêm kéo dài hoặc trầm trọng hơn sẽ dẫn đến sự chậm phát triển các giai đoạn tiếp theo. Các báo cáo cho thấy các cytokin gây viêm (IL-1β, IL-6, TNF-α) được phóng thích bởi các đại thực bào liên quan đến việc điều hòa phản ứng viêm và trong quá trình bệnh lý của vết thương(8) làm tăng đường huyết, tăng oxy hóa thông qua sản xuất các gốc oxy phản ứng và TNF-α. Vì vậy, các thuốc chống viêm ức chế cytokin gây viêm giúp làm giảm giai đoạn viêm. Các cytokin gây viêm do đại thực bào sản xuất(10). Do đó, với vết thương mạn tính trên bệnh nhân đái tháo đường, nghiên cứu cho thấy khắc phục rối loạn chức năng đại thực bào giúp làm lành vết thương trên da. Các đại thực bào được chia thành hai kiểu: đại thực bào kích hoạt cổ điển (đại thực bào M1 kích thích) và đại thực bào kích hoạt thay thế (đại thực bào chống viêm M2)(10). Trong giai đoạn đầu của quá trình lành vết thương, đại thực bào M1 gây tổn thương mô và gây ra các hoạt động chống viêm. Trong giai đoạn sau, đại thực bào M2 tham gia sửa chữa và tái tạo mô(10). Ngược lại, trong quá trình lành vết thương ở bệnh nhân đái tháo đường, sự tích tụ đại thực bào liên quan đến mức độ cytokin gây viêm và mức độ giảm các yếu tố tăng trưởng khác nhau(10). Sự rối loạn viêm do các đại thực bào liên quan đến vết thương đái tháo đường(2). Do đó, sự hiểu biết sâu hơn về sinh bệnh học của việc chữa lành vết thương ở bệnh nhân đái tháo đường giúp quản lý bệnh tốt hơn. Đại thực bào kích hoạt M1 tiêu diệt vi sinh vật và tạo ra cytokin gây viêm IL-1β, TNF-α, IL-6. Đại thực bào M2 tạo yếu tố chống viêm IL-10, yếu tố làm lành như insulin-growth factor-1 (IGF-1) và yếu tố Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số 5 * 2017 64 tăng trưởng chuyển hóa β (TGF- β) thúc đẩy hoạt động tái tạo vết thương(10). Calophyllum inophyllum (Mù u) đã được sử dụng rộng rãi trong y học dân gian điều trị vết thương, trong đó hoạt chất calophyllolid trong dầu Mù u có tác dụng chống viêm mạnh trên chuột nhắt gây viêm bằng carrageenin(1). Gần đây, các chất chống viêm tự nhiên, như keo ong và curcumin được chứng minh có tác dụng thúc đẩy quá trình lành thương vết thương trên mô hình chuột đái tháo đường qua cơ chế làm giảm cytokin kháng viêm, giảm sự xâm nhập của bạch cầu trung tính và làm lành vết thương(1). Từ cơ sở nêu trên, đề tài khảo sát tác dụng làm lành vết thương của dầu Mù u trên mô hình chuột chuột đái tháo đường gây bởi streptozotocin (STZ). VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP Chuột đái tháo đường gây bởi STZ Chuột Mus musculus đực, 6 tuần tuổi, nặng 25 ± 2 g do Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam cung cấp. Chuột được nuôi trong điều kiện 12 độ ánh sáng: chu kỳ bóng tối 12 giờ, độ ẩm 50-60%. Chuột được cung cấp thức ăn (PCR, Cần thơ, Việt Nam) và nước cất không giới hạn trong thời gian thử nghiệm. Tiến hành cân trọng lượng cơ thể, đo glucose huyết cho chuột ngay trước và mỗi tuần sau khi tiêm phúc mô STZ liều 100 mg/kg (pha trong đệm citrat). Tạo vết thương vết thương da Chuột đái tháo đường được chia thành 3 nhóm (5 chuột/nhóm): nhóm (1) điều trị bằng PBS liều 20-30 µL/lần, ngày 2 lần, nhóm (2) điều trị bằng iodin povidon liều 20-30 µL/lần, ngày 2 lần và nhóm (3) điều trị bằng dầu Mù u liều 20- 30 µL/lần, ngày 2 lần. Chuột được gây mê bằng ketamin (tiêm bắp, 2 mg/kg) (Solupharm, Đức) và zoletil (tiêm bắp, 50 mg/kg) (Carros, Pháp). Sau khi cạo lông và khử trùng với ethanol 70%, chuột được tạo vết thương tròn đường kính 0,5 cm và sâu 1 mm trên lưng. Tiến hành thu mẫu da vùng có vết thương và máu tĩnh mạch đuôi chuột vào ngày 1, 5, 7, 14 và 21 để định lượng cytokin và các marker của đại thực bào M1, M2. Định lượng cytokin bằng phương pháp ELISA Khảo sát nồng độ cytokin trong mẫu da sử dụng kháng thể đặc hiệu của TNF-α, IL-10 (BioLegend, San Diego, CA) và IL-6, IL-1β (Thermo Scientific, Seoul, Hàn Quốc) với kit ELISA của RnD Systems (Minneapolis, Hoa Kỳ) theo hướng dẫn. Tóm tắt, 50 µl mẫu thử hoặc mẫu chuẩn, mẫu đối chiếu hoặc mẫu chứng nội được cho vào giếng, thêm 50 µl kháng thể thứ cấp vào mỗi giếng, trộn đều, ủ 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Thêm 100 µl của liên hợp và ủ với 100 µl dung dịch chất nền. Dừng phản ứng bằng dung dịch “stop solution”. Đo OD dung dịch màu xanh ở 450 nm trên máy Spectro UV-VIS (Labomed Inc., Việt Nam) sử dụng phần mềm Image J. Biểu hiện marker của nhóm đại thực bào M1 và M2 Đề tài cũng kiểm tra khả năng các cytokin là sản phẩm tiết ra từ hai nhóm đại thực bào M1 và M2 liên hệ đến đáp ứng viêm mạn tính của đái tháo đường do STZ gây ra thông qua chỉ thị của M1 là CD14 và M2 là CD206 vào ngày 14 bằng phương pháp ELISA. Xử lý số liệu Kết quả được xử lý bằng Excel 2010 và được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của ba thí nghiệm độc lập. Student’s t-test được sử dụng để phân tích mối tương quan giữa sự biểu hiện protein và các đặc điểm lâm sàng. Sự khác biệt thống kê giữa các phương tiện khác nhau được đánh giá bằng ANOVA một chiều và kiểm tra Tukey. Mann-Whitney được dùng để đo phân tích mô bệnh học. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05. KẾT QUẢ Tác động lên trọng lượng cơ thể Với liều 100 mg/kg STZ, chuột giảm trọng lượng cơ thể và tăng đường huyết (Bảng 1). Bảng 1: Phân tích tổng thể các thông số chuột tiểu đường gây ra bởi STZ Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số 5 * 2017 Nghiên cứu Y học 65 Nhóm Thông số Đối chứng Dầu mù u PI Đường huyết đầu tiên (mg / dl) 97 ± 22 100 ± 22 102 ± 22 Đường huyết trong lần cuối (mg / dl) 331 ± 30 357 ± 30** 302 ± 32* Trọng lượng cơ thể đầu tiên (G) 25 ± 2 25 ± 2 Trọng lượng cơ thể cuối cùng (G) 23 ± 1.6 23 ± 1.7** 24 ± 0.8*** *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001: so với thời điểm ban đầu Tác dụng lên cytokin viêm và cytokin kháng viêm trong điều trị vết thương da mạn tính Khảo sát biểu hiện của các cytokin tiền viêm (IL-1β, IL-6, và TNF-α) và cytokin chống viêm (IL-10) trong protein tại vị trí vết thương da vào ngày 1, 5, 7, 14 và 21 sau khi gây vết thương. Kết quả cho thấy các cytokin tiền viêm tăng cao với ngưỡng 10 pg của TNF-α (Hình 2A) và tăng dần 14 pg, 22 pg và cao nhất là 29 pg ở ngày 14. Sau đó là giảm xuống 22 pg. Đối với mẫu đối chứng PI, nhóm cytokin tiền viêm tăng vào ngày thứ 5 và giữ mức ở ngày thứ 7 đến ngày 14. TNF-α thấp hơn nhóm không bôi thuốc ½ lần trong ngày 14. Đối với nhóm dầu mù u, sau 5 ngày bôi, cytokin tiền viêm giảm có ý nghĩa thống kê (p < 0,001), tiếp tục giảm ở ngày 14, 21. Vào ngày 21, cytokin giảm 4 lần so với nhóm không bôi thuốc và giảm 2 lần so với nhóm PI (p < 0,001). IL-1β (Hình 1B) và IL-6 (Hình 1C) cho kết quả tương tự TNF-α (Hình 1A). Day 1 Day 5 Day 7 Day 14Day 21 0 50 100 pg/mL **** **** C Hình 1: Kết quả Elisa của yếu tố cytokine viêm trong các thời điểm Ngày 1 (Day 1), Ngày 5 (Day 5), ngày 7 (Day 7), ngày 14 (Day 14) và ngày 21 (Day 21). (A). TNF alpha; (B) IL-1; (C) IL-6. Hình 2: Kết quả Elisa của yếu tố cytokine khángkháng viêm IL-10 vàocác thời điểm: Ngày 1 (Day 1), Ngày 5 (Day 5), ngày 7 (Day 7), ngày 14 (Day 14) và ngày 21 (Day 21). Ngược lại, biểu hiện của cytokin kháng viêm (IL-10) ở nhóm dầu Mù u tăng đáng kể khoảng 25 pg/ml (tăng 50%) vào ngày 14, nhưng không tăng vào ngày thứ 21 (Hình 2). So sánh với mẫu nhóm chứng và nhóm PI cho thấy kết quả có ý nghĩa thống kê (p < 0,001). Ảnh hưởng của nhóm thực bào M1 và M2 Khảo sát chỉ thị của M1 là CD14 và M2 là CD206 vào ngày 14. Kết quả cho thấy vào ngày 14, CD14 tăng ở các mẫu chứng và mẫu PI, giảm ở nhóm dầu mù u (Hình 3A). Ngược lại, CD-206 tăng ở mẫu dầu Mù u so với mẫu chứng và mẫu PI (Hình 3B). A Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số 5 * 2017 66 Hình 3: Kết quả Elisa của đại thực bào M1 (marker là CD14) hình A và M2 (marker là CD206), hình B trên sự tiết cytokine ở ngày 14. BÀN LUẬN Dầu mù u sử dụng trong nghiên cứu này được ly trích bằng dung môi ethanol, phương pháp HPLC đã được nghiên cứu ở bài báo trước đây(8). Trong đề tài này, STZ liều 100 mg/kg tạo được mô hình đái tháo đường phù hợp với các nghiên cứu trước(4) được sử dụng tạo vết thương với đường kính trung bình là 0,5 ± 0,1 cm. Vết thương mạn tính kéo dài 21 ngày trên chuột cho thấy sự lành vết thương là phức tạp. Giảm khả năng làm lành vết thương là một biến chứng phổ biến của đái tháo đường và sự hình thành mạch máu không đầy đủ liên quan đến việc chữa lành vết thương dẫn đến loét da do đái tháo đường(2). Thúc đẩy sự hình thành mạch bằng cách cung cấp các yếu tố tăng trưởng gây tạo mạch có thể đẩy nhanh quá trình lành vết thương do đái tháo đường. Đáp ứng miễn dịch bẩm sinh của các tế bào thường trú và các tế bào viêm đóng vai trò quan trọng trong việc chữa lành vết thương(3). Trong đề tài này, dầu Mù u làm tăng các cytokin ở giai đoạn đầu (ngày 1 - 14) nhưng giảm vào ngày 21. Điều này phù hợp với cơ chế điều hoà các cytokin trong điều trị vết thương mạn tính(5). Bên cạnh đó, việc chữa trị không lành của các vết thương đái tháo đường đi kèm với sự xâm nhập sớm của các tế bào viêm. Một trong những thành phần tế bào chính của mô hạt liên quan đến chữa bệnh và tạo mạch là các đại thực bào(6,7). Các đại thực bào M1 tại vị trí vết thương duy trì sự cân bằng nội mô bằng cách tái tạo và sửa chữa mô bằng cách giải phóng các cytokin ở vết thương(9). Từ đó, lôi kéo các đại thực bào M2 vào mô hạt làm giảm vết thương(7). Số lượng các đại thực bào M1 giảm dần và kích hoạt đại thực bào M2 sẽ làm tăng khả năng chữa vết thương đái tháo đường(7). Thật vậy, quá trình vết thương của thí nghiệm cho thấy có sự liên quan đến macrophage M1 đã được điều chỉnh cao trong quá trình điều trị vết thương và sau đó macrophage M2 tăng lên ở những thời điểm sau đó (sau ngày 14) (Hình 3), phù hợp với các báo cáo trước đây(3). KẾT LUẬN Chuột đái tháo đường do STZ rối loạn chức năng cytokin và các M1/M2 trong mô hạt, dẫn đến chậm lành vết thương và sự hình thành mạch. Dầu Mù u thúc đẩy điều hoà cân bằng nội mô trong viêm mạn tính bằng cách cung cấp các cytokin viêm cao ở giai đoạn đầu, sau đó làm tăng các cytokin kháng viêm ở giai đoạn ngày 14, giảm tỷ lệ M1/M2. Do đó, dầu Mù u có thể góp phần làm lành vết thương ở chuột đái tháo đường do STZ gây ra. Ngoài ra, Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số 5 * 2017 Nghiên cứu Y học 67 liệu pháp điều chỉnh sự chuyển đổi đại thực bào từ M1 sang M2 có thể có hiệu quả trong điều trị vết thương do đái tháo đường; cần nghiên cứu cơ chế này sâu hơn. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Abdollah GP, Abed KK, (2010). The Wound Healing Activity of Flower Extracts of Punica Granatum and Achillea Kellalensis in Wistar Rats. Acta Poloniae Pharmaceutica, Drug Research, 67(1), 107-10. 2. Abu-Seida AM, (2015). Effect of propolis on experimental cutaneous wound healing in dogs. Veterinary Medicine International, 1-4. 3. Bùi Chí Hiếu (1991). Y học dân tộc Cửu Long. Ủy ban Khoa học Kỹ Thuật Sóc Trăng. 4. Galiano RD, Tepper OM, Pelo CR, (2004). Topical vascular endothelial growth factor accelerates diabetic wound healing through increased angiogenesis and by mobilizing and recruiting bone marrow-derived cells. Am J Pathol, 164, 1935- 1940 5. Gosain A, DiPietro LA (2004). Aging and wound healing. World J Surg, 28, 321-326. 6. Grellner W, Georg T, Wilske J (2000). Quantitative analysis of proinflammatory cytokines (IL-1beta, IL-6, TNF-alpha) in human skin wounds. Forensic Sci Int. 11;113(1-3):251-64. 7. Mirza RE, Fang MM, Ennis WJ, KohBlocking TJ (2013). Interleukin-1 β induces a healing-associated wound macrophage phenotype and improves healing in type 2 diabetes. Diabetes, 62, 2579-2587. 8. Nguyễn Văn Linh, Võ Thành Long, Đào Trọng Thức, Trương Công Trị, Trịnh Thị Diệu Thường, Bùi Chí Bảo (2016). Khảo sát vai trò của dầu mù u trong quá trình hồi phục vết thương trên mô hình chuột. Tạp chí Y học Tp. Hồ Chí Minh, Chuyên đề Khoa học cơ bản - Y tế công cộng, trang 67-74. 9. Ochoa O, Torres FM, Shireman PK (2007). Chemokines and diabetic wound healing. Vascular, 15, 350-355. 10. Wicks K, Torbica T (2014). Myeloid cell dysfunction and the pathogenesis of the diabetic chronic wound. Semin Immunol, 26, 341-353. Ngày nhận bài báo: 12/07/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 17/07/2017 Ngày bài báo được đăng: 05/09/2017