Nấm đảm sinh tổng hợp laccase có khả năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính được sử dụng để nhuộm vải may quân trang - Phùng Khác Huy Chú

Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 52, 12 - 2017 169 NẤM ĐẢM SINH TỔNG HỢP LACCASE CÓ KHẢ NĂNG LOẠI MÀU THUỐC NHUỘM HOẠT TÍNH ĐƯỢC SỬ DỤNG ĐỂ NHUỘM VẢI MAY QUÂN TRANG Phùng Khắc Huy Chú1,3*, Đào Thị Ngọc Ánh2, Đặng Thị Cẩm Hà2 Tóm tắt: Từ 6 trong số 45 mẫu nấm đảm được thu thập, phân lập từ rừng Quốc gia Ba Vì, Hà Nội, đã lựa chọn được chủng FBV40 có khả năng sinh tổng hợp laccase thô cao nhất. Dựa theo các đặc điểm hình thái và trình tự vùng ITS1-5,8S- ITS2 chủng FBV40 được xác định thuộc chi Rigidoporus và được đặt tên là Rigidoporus sp. FBV40. Hoạt tính laccase thô cao nhất của chủng này đạt 107.708 U/l trên môi trường TSH1 sau 8 ngày nuôi cấy và có khả năng loại 8 màu thuốc nhuộm hoạt tính thương mại sử dụng để nhuộm vải may quân trang ở mức độ khác nhau, hiệu suất loại màu MN.FBN với nồng độ 100 mg/L đạt cao nhất 88,11% khi có mặt 200 µM ViO sau 24 h. Ở nồng độ màu MN.FBN là 10 mg/L thì hiệu suất loại màu đạt 92,72%. Từ các minh chứng thu được cho thấy laccase sinh tổng hợp bởi chủng nấm đảm FVB40 có khả năng ứng dụng trong xử lý nước thải nhà máy dệt nhuộm vải may quân trang cho quân đội. Từ khóa: Laccase, Rigidoporus, Loại màu, Thuốc nhuộm hoạt tính, Vải quân trang. 1. MỞ ĐẦU Laccase là enzyme ngoại bào thuộc nhóm oxidoreductase là một trong số ít các enzyme đã được nghiên cứu từ thế kỷ thứ 19. Sự quan tâm đối với các loại laccase đã được gia tăng trong những năm gần đây do tiềm năng ứng dụng chúng trong việc khử độc các chất ô nhiễm và trong xử lý sinh học các hợp chất phenol [7, 4]. Chúng chỉ cần oxy nguyên tử trong phản ứng xúc tác, vì vậy chúng phù hợp đối với các ứng dụng công nghệ sinh học trong xử lý hỗn hợp các chất ô nhiễm khi được cố định trên các chất mang phù hợp [13]. Vai trò của laccase đã được xác định khi ứng dụng trong loại màu thuốc nhuộm, phân hủy sinh học các hóa chất thải có độc tính như các hợp chất hữu cơ clo, các hydrocarbon thơm mạch vòng, các chất vòng thơm có nitro và thuốc chất trừ sâu và chế tạo sensor sinh học [11, 6]. Hiện nay, công nghiệp dệt nhuộm sử dụng khoảng 2/3 tổng lượng thuốc nhuộm và tiêu thụ một lượng lớn nước và hoá chất [5]. Các hoá chất được sử dụng đa dạng về thành phần hoá học, chủng loại từ các hợp chất vô cơ để tổng hợp đến các sản phẩm hữu cơ. Có khoảng 100.000 loại thuốc nhuộm thương mại với trên 7.105 tấn thuốc nhuộm được sản xuất hàng năm. Các vấn đề nảy sinh đối với ô nhiễm bởi thuốc nhuộm là khả năng sinh ra các chất gây ung thư như benzidine và các hợp chất vòng thơm khác [4]. Hầu hết các phương pháp hiện tại để xử lý nước thải dệt nhuộm không đạt hiệu quả và không kinh tế như mong muốn. Do đó, việc nghiên cứu và phát triển phương pháp mới dựa trên laccase chuyên hoạt động như là chất xúc tác là giải pháp có tiềm năng cao trong loại màu thuốc nhuộm có các cấu trúc hoá học đa dạng như vậy [15]. Hiện tại, chưa có công bố nào về việc nghiên cứu loại màu thuốc nhuộm trong công nghiệp quốc phòng khi sử dụng laccase hay hỗn hợp của nhiều laccase để xử lý loại hình ô nhiễm này. Nhiều loài nấm đảm đã được phân lập từ đất, lá chè mục, lá keo mục và đặc biệt là gốc các loại cây mục thuộc địa bàn rừng Quốc gia Ba Vì, khi xác định sơ bộ hoạt tính các enzyme ngoại bào thuộc họ oxidoreductase, peroxidase mà đại diện là laccase, mangan peroxidase (MnP) và lignin peroxidase (LiP) đã cho ta thấy có đến 50% tổng số mẫu nấm thu được có khả năng sinh tổng hợp 1 trong 3 loại enzyme ngoại bào trên, trong đó, rất ít nấm có hoạt tính MnP và LiP. Việc phát hiện, sàng lọc các laccase mới có hoạt tính cao Hóa học & Kỹ thuật môi trường P.K.H. Chú, Đ.T.N. Ánh, Đ.T.C. Hà, “Nấm đảm sinh tổng hợp vải may quân trang.” 170 với các phổ cơ chất đặc biệt và nghiên cứu nâng cao tính ổn định là rất quan trọng để triển khai ứng dụng ở quy mô công nghiệp. Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả thông báo kết quả nghiên cứu phân lập, phân loại chủng nấm đảm có khả năng sinh tổng hợp laccase, lựa chọn môi trường nuôi cấy để sinh tổng hợp laccase cao và so sánh khả năng loại một số màu thuốc nhuộm hoạt tính thương mại được sử dụng trong công đoạn nhuộm vải may quân trang của nhà máy X20/Bộ Quốc phòng. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu Các chủng nấm đảm được thu thập từ đất và gỗ mục ở độ cao trên 600m rừng Quốc gia Ba vì, thành phố Hà Nội. 2.2. Hóa chất và môi trường nuôi cấy Tám loại màu tổng hợp hoạt tính được cung cấp bởi nhà máy X20, Tổng Cục công nghiệp Quốc phòng, Bộ Quốc phòng. Sử dụng các môi trường nuôi cấy TSH1 (100 ml dịch chiết khoai tây, 10 g/L glucose, 1 g/L cám gạo, 5 g/L bột đậu tương, 100 µM Cu2+); PDB (Dịch chiết khoai tây 200g/l, 10g/l glucose); PDB + 1%BDT (Dịch chiết khoai tây 200g/l, 10g/l glucose, 10g/l bột đậu tương); Czapeck (Saccharose 30 g/l, MgSO4 0,5 g/l, KH2PO4 1 g/l, NaCl 1 g/l, NaNO3 2 g/l, KCl 0,5 g/l, FeSO4 0,01 g/l, pH 7); Dịch chiết khoai tây (Khoai tây 200g/l, pH 7); MEG (KH2PO4 1 g/l, Na2HPO4 4 g/l, NaCl 0,2 g/l, MgSO4 0,2 g/l, CaCO3 0,5 g/l, cao men 4 g/l, cao malt 2 g/l, glucose 4 g/l, pH 6,5) và Vis (pepton 3 g/l, glucose 10 g/l, KH2PO4 0,6 g/l, ZnSO4 0,001 g/l, K2HPO4 0,4 g/l, FeSO4 0,0005 g/l, MnSO4 0,05 g/l, MgSO4 0,5 g/l, pH 6). 2.3. Phân lập chủng nấm Các mẫu nấm và đất có gỗ mục được thu thập tươi từ rừng Quốc gia Ba Vì, mang về phòng thí nghiệm chụp ảnh. Sau đó, tiến hành đo hoạt tính laccase của các mẫu tươi (gọi là hoạt tính in-situ). Tiến hành phân lập, làm sạch trên môi trường thạch chứa dịch chiết khoai tây, agar 18g/l và bổ sung guaniacol 1 % để song song nhận biết khả năng sinh tổng hợp oxydoreductase (laccase, LiP và MnP) thông qua vòng màu nâu đỏ là sản phẩm oxy hóa guaniacol. 2.4. Phương pháp xác định hoạt tính laccase Để phân biệt chính xác laccase, LiP hay MnP được sinh tổng hợp bởi chủng nấm nghiên cứu, hoạt tính laccase đã được xác định dựa trên sự oxy hóa ABTS (2,2'-azino- bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) của laccase theo phương pháp của Eggert [1]. 2.5. Phân loại chủng nấm DNA tổng số của nấm được tách chiết theo mô tả của Eric và Boehm. Sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA tổng số với cặp mồi ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ và ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATG-3’) [18]. Trình tự các đoạn gene được xử lý bằng phần mềm FinchTV và so sánh với các chủng được công bố trên GenBank (NCBI database). Cây phát sinh chủng loại được xây dựng bằng phần mềm MEGA 6.06. 2.6. Sàng lọc khả năng loại các màu hoạt tính bằng laccase thô Dịch enzyme thô có nồng độ cuối 1.000 U/l được sử dụng để đánh giá khả năng loại màu với sự tham gia của chất gắn kết (CGK) Violuric acid (ViO). Các thuốc nhuộm hoạt tính thương mại của Nhà máy X20 được sử dụng để đánh giá hiệu quả loại màu bằng laccase thô. Tổng thể tích phản ứng loại màu là 5 ml gồm đệm 20 mM natri acetate pH 4, màu thuốc nhuộm (nồng độ 100 mg/L), dịch laccase thô (nồng độ cuối 1.000 U/l) và CGK (nồng độ cuối 200 µM). Mẫu đối chứng có chứa màu, enzyme bị biến tính nhiệt ở 100oC Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 52, 12 - 2017 171 trong 10 phút và đệm natri acetate 20 mM pH4. Hiệu quả loại màu thuốc nhuộm được đánh giá trong vòng 24 giờ và được tính bằng công thức: D = 100*(Ai - At)/Ai Trong đó: D: Phần trăm loại màu thuốc nhuộm (%); Ai: Độ hấp thụ ban đầu; At: Độ hấp thụ tại thời gian t. 2.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ CGK ViO lên khả năng loại màu thuốc nhuộm MN.FBN Tổng thể tích phản ứng loại màu MN.FBN là 5 ml gồm đệm 20 mM natri acetate pH 4, màu thuốc nhuộm (nồng độ 100 mg/L), dịch laccase thô (nồng độ cuối 1.000 U/l) và nồng độ CGK ViO với các nồng độ 0; 100; 200; 400; 600; 800 và 1000 µM. Mẫu đối chứng có chứa màu, enzyme bị biến tính nhiệt ở 100oC trong 10 phút và đệm natri acetate 20 mM pH4. Hiệu suất loại màu được tính toán ở các khoảng thời gian khác nhau trong vòng 24 giờ. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 2.8. Nghiên cứu khả năng loại màu ở các nồng độ khác nhau bởi laccase thô chủng FBV 40 Tổng thể tích loại màu MN.FBN là 5ml gồm đệm 20 mM natri acetate pH 4, màu thuốc nhuộm ở các nồng độ màu 5; 10; 15; 20; 30; 40 và 50 mg/L, dịch laccase thô nồng độ cuối 1000 U/L và nồng độ CGK là 600 µM. Mẫu đối chứng có chứa màu ở các nồng độ khác nhau, enzyme bị biến tính nhiệt ở 100oC trong 10 phút và đệm natri acetate 20 mM pH4. Hiệu suất loại màu được tính toán ở các khoảng thời gian khác nhau trong vòng 24 giờ. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Các chủng nấm đã được phân lập Từ 45 mẫu nấm và đất có gỗ mục được thu thập tại khu vực lấy mẫu, sau khi xử lý bề mặt được lắc và gạt trên môi trường PDA bổ sung chất chỉ thị guaiacol 0,01%. Sau 4 ngày nuôi cấy, 6 chủng nấm có hệ sợi phát triển tốt, lan rộng trên bề mặt môi trường, hệ sợi nấm bông xốp có màu trắng, không mịn và tạo vòng nâu đỏ trên môi trường có chứa chất chỉ thị guaiacol. Hoạt tính laccase insitu hiện trường cũng đã được tiến hành. Kết quả thu được chứng tỏ các chủng này có khả năng sinh tổng hợp các enzyme ngoại bào thuộc nhóm peroxidase (MnP, LiP) hoặc oxidoreductase (laccase). Các kết quả được thể hiện ở bảng 1. Bảng 1. Các chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp laccase. Tên mẫu Mặt trước (B) Mặt sau (C) Hoạt tính in situ (U/L) A46 35 BT4 25 Hóa học & Kỹ thuật môi trường P.K.H. Chú, Đ.T.N. Ánh, Đ.T.C. Hà, “Nấm đảm sinh tổng hợp vải may quân trang.” 172 BT5 50 BT8 23 BT9 25 FBV40 150 Chú thích: Hình thái khuẩn lạc (mặt trước - B và mặt sau - C) và hoạt tính laccase in situ (là hoạt tính của mẫu ngay trước khi phân lập) của các chủng nấm được nuôi cấy trên môi trường PDA bổ sung 0,01% guaiacol làm chất chỉ thị. Dựa vào kết quả đo hoạt tính enzyme laccase tại bảng 1, cho thấy chủng FBV40 có hoạt tính cao nhất, khả năng phát triển nhanh nên được lựa chọn để nghiên cứu phân loại, khả năng sinh tổng hợp laccase và khả năng loại màu thuốc nhuộm. Chủng nấm được phân loại bằng sự kết hợp cả hai phương pháp truyền thống và so sánh độ tương đồng giữa trình tự vùng ITS1-5,8S-ITS2 của chủng với các chủng đại diện trên GenBank. Hình 1. Hình thái sợi và bào tử của chủng FBV40 dưới kính hiển vị điện tử quét JOLE với độ phân giải x 1.500. Quan sát các đặc điểm hình thái, khuẩn lạc trên đĩa thạch và hệ sợi nấm dưới kính hiển vi điện tử, dựa vào khóa phân loại Robert A. Samson chủng FBV40 thuộc nấm đảm. Tuy nhiên để làm rõ các kết quả phân loại truyền thống, việc xác định và so sánh so sánh độ tương đồng giữa trình tự vùng ITS1-5,8S-ITS2 của chủng này đại diện trên với các đại diện trên GenBank đã được tiến hành. Trình tự vùng ITS1-5,8S-ITS2 được khuếch đại bởi Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 52, 12 - 2017 173 cặp mồi ITS1-ITS4 của chủng nấm FBV40. Sử dụng các phần mềm đã được mô tả ở phần phương pháp, cây phát sinh chủng loại đã được xây dựng ở hình 2. Từ cây phát sinh chủng loài cho thấy chủng FBV40 gần gũi nhất với các đại diện thuộc chi Basidiomycetes với mức độ tương đồng 96 đến 99% tương ứng với các chủng là B. sp. HKC4 được thu thập từ vùng biển Hawai (Mỹ) [10] và chủng B. sp. C2-14 được thu thập từ rặng san hồ ở Phúc Kiến (Trung Quốc) và 93 đến 99% với chi đại diện của Rigidoporus lần lượt là R. Vinctus C1-9 được phân lập từ vùng biển san hô của vùng biển Phúc Kiến và R. Vinctus FRIM 142 được phân lập từ rừng nhiệt đới ở Malaysia ( Hiện chưa có nhiều nghiên cứu về đặc điểm hình thái cũng như khả năng sinh tổng hợp laccase của các chủng nấm trên. Từ cây phát sinh chủng loại, đặc điểm hình thái, chủng nấm FBV40 thuộc chi Rigidoporus và được đặt tên là Rigidoporus sp. FBV40. Hình 2. Cây phát sinh chủng loại chủng FBV40. Hình 3. Sinh tổng hợp laccase thô chủng FBV 40 trên các môi trường. Hóa học & Kỹ thuật môi trường P.K.H. Chú, Đ.T.N. Ánh, Đ.T.C. Hà, “Nấm đảm sinh tổng hợp vải may quân trang.” 174 Môi trường phù hợp để sinh tổng hợp laccase Bảy môi trường nuôi cấy đã được lựa chọn để khảo sát khả năng sinh tổng hợp laccase thô của chủng FBV40, kết quả được mô tả ở hình 3. Từ kết quả ở hình 3, trên môi trường TSH1 chủng FBV40 có khả năng sinh tổng hợp laccase thô cao nhất lên tới 107.708 U/L sau 8 ngày nuôi cấy. Tiếp đến là ở môi trường PDB có bổ sung 1% bột đậu tương đạt 41.343 U/L sau 6 ngày nuôi cấy và ở các môi trường Czapeck, Vis và MEG với hoạt tính lần lượt thu được là 5; 13; 12 và 68,7 U/L mặc dù đây đều là các môi trường cơ bản để nuôi cấy nấm nhưng hoạt tính laccase thô thu được lại rất thấp. Theo nghiên cứu của Cambria và cs về chủng nấm R. lignosus có hoạt tính lần lượt là 120.000 U/L và 75.000 U/L khi bổ sung chất cảm ứng là phenylhydrazine, guaniancol trong môi trường nuôi cấy có bổ sung 25mM Nito và 500 µg/L CuSO4 trong môi trường sau 21-24 ngày nuôi cấy [8]. Ở Việt Nam, khi nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp laccase của chủng nấm Trichoderma sp. FCP3 phân lập từ gỗ mục ở rừng Quốc gia Cúc Phương hoạt tính đạt cao nhất khi bổ sung NaNO3 và KNO3 (tỷ lệ 3:7) với nồng độ 3 g/l vào môi trường và có hoạt tính là 132 U/l. Như vậy, có thể thấy rằng thành phần môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn tới khả năng sinh tổng hợp laccase của chủng FBV40. Môi trường TSH1 là môi trường phù hợp nhất trong số các môi trường khảo sát để FBV40 có khả năng sinh tổng hợp laccase có hoạt tính cao nhất. Hiệu suất loại màu thuốc nhuộm hoạt tính bởi laccase thô Với mục đích sử dụng enzyme thô để phục vụ khảo sát khả năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính để nhuộm vài may quân trang, chủng nấm FBV40 được nuôi lắc trên môi trường TSH1 và hoạt tính laccase cao nhất thu được sau 8 ngày nuôi cấy là 107.708U/L. Kết quả chứng minh rằng laccase thô từ chủng FBV40 trên có khả năng loại được các màu hoạt tính ở mức độ khác nhau, khi sử dụng phương pháp đánh giá khả năng loại màu trên thiết bị UV-VIS. Kết quả loại màu được trình bày ở bảng 2. Bảng 2. Khả năng loại màu một số thuốc nhuộm hoạt tính sử dụng trong quân đội bằng laccase thô chủng FBV40. C T MT BES T C NY S3R C T MY BES C T MY EG Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 52, 12 - 2017 175 Chú thích: C- Đường biểu diễn màu đối chứng; T- Đường biểu diễn màu thí nghiệm. Đối với các màu thuốc nhuộm hoạt tính khi không sử dụng CGK, laccase của chủng nấm FBV40 có ít khả năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính được sử dụng trong nghiên cứu này. Hiệu suất loại các màu này bởi laccase thô chủng FBV40 khi không có CGK dao động trong khoảng từ 1 đến 5,56% sau 24 giờ thí nghiệm, cao nhất chỉ đạt 5,56% đối với màu MR.EBR. Hiệu suất loại màu thuốc nhuộm hoạt tính bởi laccase thô khi sử dụng CGK là ViO sau 24 giờ khá cao. Với hiệu suất loại màu hoạt tính thương mại nằm trong khoảng rất rộng từ 4,22% đến 88,11%, trong đó, hiệu suất loại màu thấp nhất là màu MY-BES chỉ đạt 4,22% và cao nhất đối với màu MN. FBN lên tới 88,11% sau 24h phản ứng. Kết quả thu được cho thấy vai trò của CGK trong phản ứng loại màu của laccase bởi chủng FBV40 đối với các màu thuốc nhuộm hoạt tính từ nhà máy X20, trong đó, đặc biệt là khả năng loại màu MN.FBN với hiệu suất tăng từ 0,22% đến 88,11% và màu NN.SG từ 0,11% đến 77,05%. Đặc biệt, hiệu suất loại màu không có sự biến động lớn sau 24 giờ khi có mặt của CGK. Từ kết quả này cho thấy vai trò của CGK rất quan trọng trong việc loại màu thuốc nhuộm bởi laccase thô chủng FBV40. Số liệu thực nghiệm cho thấy, enzyme thô chủng FBV40 có hiệu quả cao trong việc loại các màu thuốc nhuộm thuộc nhóm màu có 2 gốc azo và có màu xanh lá cây hoặc xanh đen (đây là những màu được sử dụng chính để nhuộm vải may quân trang cho quân đội hiện nay), còn những màu mang nhóm màu có gốc azo đơn và có màu vàng, đỏ hoặc xanh da trời, laccase thô từ chủng FBV40 loại màu kém hơn rất nhiều. Theo nghiên cứu khi sử dụng 09 chủng trong tập đoàn HN1 đã loại màu được 83,89% đối với màu 100 mg/L Reactive Blue 222 (MN.FBN) sau 15 h nuôi lắc [2]. Khi loại màu RB 222 bằng phản ứng phenton thì loại màu được gần 90% và tăng lên đạt 96,88% và đạt 95,23% sau khi xử lý hiếu khí bằng 2 chủng nấm đảm trắng P.ostreatus IBL-02 và P. chrysosporium IBL-03 [14]. Chủng Pseudomonas sp. D4 được phân lập từ nước thải nhà máy nhuộm có khả năng loại màu cao nhất đối với màu 100 mg/l RB 222 sau 24 h đạt 70% ở pH 7 và nhiệt độ nuôi cấy 350C [18]. Hiện chưa có nhiều công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế về sử dụng laccase thô để loại màu RB 222. Khi nghiên cứu khả năng loại màu của laccase tinh sạch với hoạt tính 20 U/L rLac15 thu từ chủng vi khuẩn nước biển khi có T C MR EBR C T MN FBN NY FN2R C T T C NN SG Hóa học & Kỹ thuật môi trường P.K.H. Chú, Đ.T.N. Ánh, Đ.T.C. Hà, “Nấm đảm sinh tổng hợp vải may quân trang.” 176 mặt methylsyringate làm CGK, phản ứng ở nhiệt độ 450C, pH 8,5 trong 1 h thì 93% màu RB 194 (NN.SG) bị loại [17]. Bên cạnh việc nghiên cứu khả năng loại màu, hoạt tính laccase cũng được đánh giá trong quá trình loại màu. Kết quả, sau 24 giờ, hoạt tính laccase thô còn lại không có sự khác nhau giữa các công thức thí nghiệm và giữa các màu, hoạt tính còn từ 2,5% đến 13,9,5%. Đặc biệt, khả năng loại các màu MY-BES, MT-BES, MY-EG, NY-FN2R, NY- S3R và MR-EBR của laccase bởi chủng nghiên cứu không lớn dao động không lớn nằm trong khoảng 2,56% (MY-BES) đến 55,76% (MR.EBR) sau 24 h thí nghiệm. Như vậy, có thể laccase từ chủng FBV40 đã tham gia vào quá trình phân hủy một trong số các tác nhân khác trong cấu trúc phân tử của các màu này và không có khả năng loại được gốc mang màu. Một nghiên cứu chỉ ra rằng 65% hoạt tính laccase vẫn còn trong quá trình loại màu RBBR và Indigo carmine sau 12 h thí nghiệm, trong khi đó, hoạt tính laccase vẫn còn 35% khi loại màu Azure A và Acid red. Khi có mặt CGK thymol và ViO thì hoạt tính laccase mất hoạt tính ít hơn [9]. Từ những kết quả trên thấy rằng với các loại thuốc nhuộm, CGK và chủng vi sinh vật sinh tổng hợp khác nhau thì có những ảnh hưởng khác nhau lên hoạt tính laccas trong quá trình loại màu. Tuy nhiên, để làm sáng tỏ khả năng loại màu với từng loai thuốc nhuộm hoạt tính được sử dụng nhuộm vải quân trang thì cần có phải có thêm nhiều nghiên cứu hơn nữa, có thể phải sử dụng tổ hợp của laccase được cố định lên chất mang phù hợp. Kết quả Bảng 4 trên cho thấy, laccase thô chủng FBV40 được phân lập từ Ba Vì có khả năng loại màu cao nhất đối với màu MN.FBN khi có mặt CGK ViO. Để đánh giá chi tiết hơn về khả năng của laccase thô cũng như ảnh hưởng của nồng độ ViO và nồng độ màu thuốc nhuộm đối với chủng này, màu MN.FBN và CGK ViO được lựa chọn để nghiên cứu các thí nghiệm tiếp theo. Ảnh hưởng của nồng độ CGK lên khả năng loại màu của laccase chủng FBV40 đối với màu MN. FBN được thể hiện ở hình 4. Hình 4. Khả năng loại màu MN.FBN ở các nồng độ CGK Vio khác nhau. Tử kết quả trên thấy rằng, khả năng loại màu MN. FBN tỷ lệ với nồng độ CGK ViO, tuy nhiên ở các nồng độ ViO 600, 800 và 1000µM sau thời gian phản ứng 3,5h thì phần trăm loại màu tăng lên không đáng kể tương ứng lần lượt là 90,58%, 91,52% và 92,17%. Như vậy, chọn nồng độ 600µM ViO để tiến hành thí nghiệm nghiên cứu khả năng loại màu ở các nồng độ màu thuốc nhuộm khác nhau. Theo một số nghiên cứu chỉ ra rằng khi có mặt ViO với nồng độ 200µM thì làm tăng 70% khả năng loại màu Indigo carmine bởi Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 52, 12 - 2017 177 laccase chủng Pichia pastoris GS115. Kết quả ViO là CGK hiệu quả nhất trong loại các màu RBBR, acid red và CBB. Loại màu thuốc nhuộm trong hệ laccases-CGK có liên quan đến loại CGK và cấu trúc phân tử của thuốc nhuộm [9]. Khi nghiên cứu ảnh hưởng của các CGK lên khả năng khả năng loại màu thuốc nhuộm của laccase loài P.cinnabarinus, khi có mặt acetosyringone và syringaldehyde thì hiệu suất loại màu đạt trên 80%, tuy nhiên, nếu sử dụng CGK là HBT và nồng độ ViO cao đến 250 μM để đạt được hiệu suất tương tự [12]. Khi có mặt ViO, 4 màu thuốc nhuộm RBBR, anthraquinoid, Coomassie brilliant blue G-250, triphenylmethane đã bị loại tới 70% bởi laccase [9]. Từ những dữ liệu trình bày trên cho thấy khả năng loại màu của nhiều loại laccase liên quan đến loại CGK, cấu trúc phân tử của thuốc nhuộm và điều kiện cho phản ứng loại màu. Hiệu suất loại màu của laccase thô đối với màu MN.FBN ở các nồng độ khác nhau được trình bày ở hình 5. Hình 5. Loại màu MN.FBN bởi laccase thô chủng FBV40 ở các nồng độ màu khác nhau. Số liệu thu được ở hình 5 cho thấy đã không có sự khác biệt lớn ở hiệu suất loại màu ở các nồng độ thuốc nhuộm từ 10 đến 50mg/L. Khả năng loại màu cao nhất đạt 92,72% ở nồng độ thuốc nhuộm là 10mg/L sau 1h phản ứng. Như vậy, laccase thô từ chủng FBV40 có khả năng loại màu tốt nhất ở nồng độ màu là 10mg/L. 4. KẾT LUẬN Từ 45 chủng nấm đảm được thu thập, phân lập từ rừng Quốc gia Ba Vì, Hà Nội, đã lựa chọn đượng chủng FBV40, dựa theo các đặc điểm hình thái và trình tự vùng ITS1-5,8S- ITS2, chủng FBV40 thuộc nấm đảm thuộc chi Rigidoporus và được đặt tên là Rigidoporus sp. FBV40. Hoạt tính laccase thô cao nhất của chủng này là 107.708U/l trên môi trường TSH1 sau 8 ngày nuôi cấy. Trong số 8 màu hoạt tính của nhà máy X20/Bộ Quốc phòng thì hiệu suất loại màu bởi laccase thô dao động trong khoảng từ 4,22% đến 92,17% (khi loại màu thuốc nhuộm MN.FBN có mặt CGK ViO sau 24h thí nghiệm). Ở nồng độ 600µM ViO, laccase thô chủng FBV40 có khả năng loại màu cao nhất đối với thuốc nhuộm MN.FBN. Thời gian loại màu diễn ra nhanh, mạnh trong khoảng thời gian từ 1 đến 3,5h. Laccase thô chủng FBV40 có khả năng cao trong loại các màu thuốc nhuộm có 2 gốc azo và có phần từ mang màu xanh lá cây hoặc xanh đen (đây là những màu được sử dụng chính để nhuộm màu quần áo cho bộ đội hiện nay). Ngược lại, nhóm màu có gốc azo đơn và mang màu vàng, đỏ hoặc xanh da trời thì bị loại màu kém hơn. Từ các minh chứng thu được cho thấy laccase sinh tổng hợp bởi chủng nấm đảm FVB40 có khả năng là ứng cử viên đầy tiềm năng để phát triển công nghệ nhằm xử lý nước thải nhà máy nhuộm X20/Bộ Quốc phòng. Hóa học & Kỹ thuật môi trường P.K.H. Chú, Đ.T.N. Ánh, Đ.T.C. Hà, “Nấm đảm sinh tổng hợp vải may quân trang.” 178 Lời cảm ơn: Bài báo được thực hiện với sự tài trọ về kinh phí của Đề tài độc lập cấp Nhà nước "Nghiên cứu metagenome của vi sinh vật vùng đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin nhằm tìm kiếm các gene, các enzyme mới có khả năng phân hủy dioxin", Mã số DTDLCN. 13/14. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. C.Eggert, U.Temp and K.E.Eriksson, "The ligninolytic system of the white rot fungus Pycnoporus cinnabarinus: purification and characterization of the laccase", Appl Environ Microbiol 62(4) (1996), 1151-1158. [2]. D.M.Srinivas, S.Rakesh and B.Nikhil, "Biodegradation study on Reactive Blue 222 by Bacterial Consortium", Chem Environl 2(4)(2012), 69-79. [3]. G.Singh, P.Kaur, N.Capalash and P.Sharma, "Laccase from prokaryotes: a newsource for an old enzyme", Reviews in Environmental Science and Biotechnology 10(4) (2011), 309-326. [4]. H.Hou, J.Wang, C.Du, and B.Yan "Enhancement of laccase production by Pleurotus ostreatus and its use for the decolorization of anthraquinone dye", Process Biochemistry 39(11) (2004), 1415-1419. [5]. I.M.Banat, D.Singh, and R.Marchant, "Microbial decolorization of textile-dye- containing effluents: a review", Bioresource Technology 58(1996), 217-227. [6]. J.C.Gonzalez, A.Rodriguez, J.F.Osma and C.J.Almeciga-Diaz, "Production of Trametes pubescens laccase under submerged and semi-Solid culture conditions on agro-Industrial wastes", PLoS ONE 8(9) (2013). [7]. J.M.Bollag, K.L.S and D.H.Anderson, "Laccase mediated detoxification of phenolic compounds", Applied and Environmental Microbiology 54(12) (1988), 3086 - 3091. [8]. M.T.Cambria, V.Calabrese, A.Cambria, "Enhanced Laccase Production in White- Rot Fungus Rigidoporus lignosus by the Addition of Selected Phenolic and Aromatic Compounds", Appl Biochem Biotechnol 163 (2011), 415 - 422. [9]. M.R.Hu, G.Q.Zhang, Z.Q.Xue, S.Qian, "Laccase-mediator system in the decolorization of different types of recalcitrant dyes", Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 36(1)(2009), 45-51. [10]. Q.Li, "Diversity of fungal isolates from three Hawaiian marine sponges" Microbiological Research 164(2009), 233-241. [11]. R.S´anchez, L.Serrano, A.Toledano, J.Labidi and A.Rodr´ıguez, "Hesperaloe funifera as a raw material for integral utilization of its components", BioResources 6(1)(2011), 3-21. [12]. S.Camarero, M.J.Martínez, Á.T.Martínez, "Lignin-Derived Compounds as Efficient Laccase Mediators for Decolorization of Different Types of Recalcitrant Dyes", Appl. Environ. Microbiol 71(4)(2005), 1775-1784. [13]. S.Herrera, "Industrial and biotechnological applications of laccases:a review" Biotechnology Advances 24(5) (2006), 500 - 513. [14]. S.Kiran, M.Asgher, "Degradation and Mineralization of Azo Dye Reactive Blue 222 by Sequential Photo-Fenton’s Oxidation Followed by Aerobic Biological Treatment Using White Rot Fungi", Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology 90(2)(2013), 208-215. [15]. S.Rodriıguez Couto and G.M.G´ubitz, "Influence of redox mediators and metal ions on synthetic acid dye decolourization by crude laccase from Trametes hirsuta" Chemosphere 58(4)(2005), 417-422. [16]. T.White, T.Bruns, S.Lee and J.Taylor, "Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: PCR Protocols: a guide to methods and applications. (Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ, eds)", Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 52, 12 - 2017 179 Academic Press, New York, USA (1990), 315-322. [17]. W.Fang, F.Chang, H.Peng, X.Zhang, Y.Xiao, "Dye decolorization by bacterial laccase Lac15", Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao 28(8) (2012), 973-980. [18]. W.Mohamed, "Isolation and Screening of Reactive Dye Decolorizing Bacterial Isolates from Textile Industry Effluent" International Journal of Microbiological Research 7(1)(2016), 1-8. ABSTRACT BASIDIOMYCETES FUNGUS SYNTHESIS LACCASE THAT HAS DECOLOURATION ABITILY OF ACTIVE DYES USED TO DYE FABRIC SEWING AMMUNITION UNIFORM From strains of fungus to be isolated for screening enzyme laccase from Ba Vi National Park, FBV40 strain was chosen, being capable of biosynthesis with the highest crude laccase. The strains FBV40 were identified to belong to the genus Rigidoporus and named Rigidoporus sp. FBV40. The highest crude laccase activity of this strain reached 107,708 U/L when being cutivated in TSH1 medium after 8 days. Crude laccase of FBV40 is capable of decolouration of 8-commercial reactive dyes used to dye the military uniform sewing fabric in varying degrees. The decolouration efficiency of MN.FBN at 100 mg /L concentrations was the highest at 88.11% in the presence of mediator 200 µM ViO after 24 h experiment. Especially, crude laccase decolouration of FBV40 strain was of the higher capability in decolouring with blue dyes than red and yellow ones. Time for decolouration of FBV40 strain take place at high speed within a period from 1 to 3.5 hours. Through obtained evidences, laccase synthesized by Rigidoporus sp. FBV40 is of high potential for application in wastewater treatment of textile plants in particular as well dye plant used to ammunition military in general. Keywords: Laccase, Rigidoporus, Decolouration, Active dyes, Ammunition. Nhận bài ngày 17 tháng 10 năm 2017 Hoàn thiện ngày 13 tháng 11 năm 2017 Chấp nhận đăng ngày 20 tháng 12 năm 2017 Địa chỉ: 1 Bộ Tư lệnh Hóa học/Bộ Quốc phòng; 2 Viện Công nghệ Sinh học/Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; 3 Học viện Khoa học và Công nghệ/Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. * E-mail: Phunghuychu@gmail.com.