Luận văn Xây dựng quy trình phát hiện đột biến rta181v/t và rtn236t kháng adefovir của virus viêm gan b (hepatitisb virus) bằng kỹ thuật real-Time pcr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH ٭٭٭٭    ٭٭٭٭ LÊ THỊ DUNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN rtA181V/T VÀ rtN236T KHÁNG ADEFOVIR CỦA VIRUS VIÊM GAN B (Hepatitis B Virus) BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR Chuyên ngành: Vi Sinh Vật Học Mã số: 60 40 60 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS. TS. CAO MINH NGA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2010 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài: Viêm gan (VG) còn gọi là sưng gan, là một tình trạng bệnh lý phổ biến do thương tổn ở tế bào gan. Có nhiều nguyên nhân gây ra VG như: vi khuẩn, rượu, hóa chất và một vài loại thuốc cũng như vô số loại virus, trong đó có virus viêm gan B (VRVGB) [20]. VRVGB hay Hepatitis B virus (HBV) là một trong những virus tiêu biểu của họ Hepadnaviridae, một họ gây VG cho nhiều loài động vật. HBV lây truyền qua đường máu, đường tình dục, từ mẹ sang con, qua tiếp xúc,… Quá trình nhiễm bệnh của HBV kéo dài, diễn tiến nặng, tỷ lệ tử vong cao. Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế Giới (WHO) có hơn 2 tỷ người trên thế giới nhiễm HBV trong thời điểm nào đó của cuộc đời, hơn 350 triệu người mang HBV mạn, trong đó 60 triệu người chết vì ung thư tế bào gan và 45 triệu người chết vì xơ gan [6]. Đến năm 2004, số người nhiễm HBV trên toàn cầu đã tăng lên 400 triệu người [28]. Vì vậy, nhiễm VRVGB mạn tính được xem như một vấn đề y tế mang tính chất toàn cầu. Việt Nam là một quốc gia thuộc vùng nội dịch của bệnh với tỷ lệ nhiễm VRVGB mạn tính vào khoảng 15-20% dân số, nghĩa là có trên 10 triệu trong tổng số khoảng 80 triệu người bị nhiễm VRVGB [8]. Các thuốc đặc hiệu dùng để điều trị cho người mang HBV mạn tính gồm hai loại là thuốc uống và thuốc tiêm. Thuốc tiêm gồm Interferon alfa-2b và PEG Interferon alfa-2a, đây là loại thuốc vừa ức chế siêu vi vừa tăng cường miễn dịch nhưng đắt tiền và nhiều tác dụng phụ. Còn thuốc uống gồm Lamivudine (LAM), Adefovir dipivoxil (ADV), Entecavir (ETV) và Tenofovir (TDF)... được Cơ quan Quản lý Thực – Dược Hoa Kỳ (FDA) chấp thuận cho sử dụng. Ở Việt Nam hiện nay, ADV và LAM được sử dụng chủ yếu trong điều trị cho bệnh nhân viêm gan B mãn tính. ADV có tác dụng ức chế VRVGB chậm hơn, song vẫn hiệu quả với siêu vi đã kháng LAM. Do vậy, trong điều trị người ta thường kết hợp ADV khi bắt đầu có hiện tượng virus kháng LAM. Hiện tượng kháng ADV, mặc dù xuất hiện muộn và ít thường xuyên hơn nhưng cũng có thể tìm thấy khoảng trên 28% ở những bệnh nhân được điều trị sau 5 năm [26,29,39]. Asparagine (N) được thay bởi Threonine (T) tại codon 236 trên vùng RT (rtN236T) và alanine (A) được thay bằng Valine (V) hoặc Threonine (T) tại codon 181 trên vùng RT (rtA181V/T) được nhận biết là kháng ADV [38]. Trên thực tế, có nhiều phương pháp khác nhau để phát hiện đột biến như phương pháp dựa vào kiểu hình, phương pháp dựa vào kiểu gen. Phương pháp dựa vào kiểu gen bao gồm phương pháp lai mẫu dò Southern blot (Southern, 1975), giải trình tự trực tiếp, tạo dòng, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism - Tính đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn), Oligonucleotide Microarrays, PCR (Polymerase Chain Reaction - Phản ứng tổng hợp chuỗi bằng polymerase; Karl Mullis và cộng sự, 1985), phương pháp real-time PCR,… và mỗi phương pháp đều có ưu, nhược điểm riêng. Tuy nhiên, do tính ưu việt của phương pháp real-time PCR là một kỹ thuật hoàn toàn mở, nhanh, nhạy, chính xác, không lệ thuộc vào các hãng sản xuất kít ở nước ngoài, giá thành rẻ hơn,… nên chúng tôi chọn real- time PCR để phát hiện các đột biến kháng ADV ở HBV trong huyết thanh của những bệnh nhân viêm gan B mãn. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, chúng tôi chọn đề tài “Xây dựng quy trình phát hiện đột biến rtA181V/T và rtN236T kháng Adefovir của virus viêm gan B (Hepatitis B Virus) bằng kỹ thuật real- time PCR”, nhằm phát hiện nhanh các đột biến kháng thuốc, với giá thành thấp sẽ có ý nghĩa trong công tác theo dõi và điều trị bệnh viêm gan siêu vi B. Mục đích của đề tài: Xây dựng quy trình xác định các đột biến kháng thuốc Adefovir của HBV tại rtA181V/T và rtN236T bằng kỹ thuật real-time PCR sử dụng TaqMan probe, chi phí thấp để phát triển thành kit phục vụ quá trình điều trị viêm gan siêu vi B trong tương lai. Đối tượng nghiên cứu: Những bệnh nhân VGB mạn đã và đang được điều trị bằng ADV. Phạm vi nghiên cứu: Các phòng thí nghiệm, các trung tâm xét nghiệm và các bệnh viện thuộc địa bàn thành phố Hồ Chí Minh (Bệnh viện Đại học Y Dược, Trung tâm Y khoa Medic, Phòng thí nghiệm Công ty Việt Á...). Ý nghĩa và tính mới về khoa học và thực tiễn của đề tài: Trong những năm gần đây, ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu của các bệnh viện và cơ sở y tế ứng dụng phương pháp giải trình tự và PCR để phát hiện các đột biến kháng thuốc của HBV ở những bệnh nhân viêm gan B mãn đã và đang được điều trị, trong đó có đột biến kháng ADV tại vị trí rtA181T/V và rtN236T. Tuy nhiên, giá thành cho mỗi mẫu xét nghiệm bằng giải trình tự là khá cao. Do vậy, có một quy trình xác định kháng Adefovir tại rtA181T/V và rtN236T đơn giản, chính xác, giá thành thấp là rất cần thiết. Để đáp ứng nhu cầu đó, chúng tôi xây dựng kỹ thuật real-time PCR nhằm phát hiện đột biến kháng Adefovir và đây là công trình chưa từng được công bố trước đây tại Việt Nam. Bố cục của đề tài: Mở đầu Chương 1 – Tổng quan tài liệu Chương 2 – Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu Chương 3 – Kết quả và thảo luận Chương 4 – Kết luận và kiến nghị Tài liệu tham khảo Phụ lục. CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 1.1.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước Bệnh VGB (VG huyết thanh) là một bệnh nhiễm trùng phổ biến trên toàn thế giới với nhiều con đường lây truyền khác nhau. Châu Á và châu Phi là những khu vực có tỷ lệ nhiễm bệnh cao nhất (khoảng 180 triệu dân châu Á và châu Phi đang mang mầm bệnh, chiếm 80% trong tổng số 220 triệu người mang mầm bệnh trên toàn thế giới) [20]. Một số bệnh nhân đã nhiễm HBV sau khi lành bệnh vẫn còn mang mầm bệnh trong một thời gian dài, một số khác trở thành VG mạn tính kéo dài nhiều năm hay suốt đời, dẫn đến xơ gan, ung thư tế bào gan. Do vậy, nhiễm HBV được xem là một vấn đề sức khỏe toàn cầu. Theo Dieter Glebe và cộng sự [26,44], HBV được xếp vào 8 kiểu gen A, B, C, D, E, F, G, H phân bố tùy theo vùng địa dư. Kiểu gen B và C chủ yếu ở khu vực Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam. Theo Perrillo và cộng sự [34], ADV là chất tương tự nucleoside/tide, được FDA chấp thuận sử dụng trong điều trị những bệnh nhân mang HBV mạn tính từ năm 2005. Nó đóng vai trò như chất ức chế lên vùng reverse transcriptase (RT) của gen HBV polymerase, và trong tất cả các trường hợp đã hoàn toàn làm giảm nồng độ của virus. Tuy nhiên, chất ức chế này chủ yếu tác động vào sự nhân lên của virus làm cho virus không thể tăng lên được chứ không tiêu diệt virus bằng cách phá hủy cấu trúc của virus đã được hình thành theo Pawlotsky và cộng sự [33]. Đây là nguyên nhân của sự xuất hiện các đột biến kháng thuốc của HBV dẫn đến điều trị thất bại và diễn tiến xấu của bệnh. Hiện tượng kháng ADV, mặc dù xuất hiện muộn và ít thường xuyên hơn nhưng cũng có thể tìm thấy khoảng trên 28% ở những bệnh nhân được điều trị sau 5 năm trong các nghiên cứu của Hadziyannis và cộng sự (2005) [27], Lok và cộng sự (2007) [30], Westland và cộng sự (2003) [40]. Theo Villet và cộng sự (2008) [39], Lok và cộng sự (2007) [30], Pawlotsky và cộng sự (2008) [33], các đột biến chính dẫn đến hiện tượng kháng ADV của HBV trong điều trị tại vị trí rt181 và rt236 thuộc dạng đột biến điểm thay thế nucleotide này thành nucleotide khác, làm biến đổi acide amine này thành acide amine khác. Hiện nay, có nhiều phương pháp phát hiện đột biến kháng ADV của HBV như giải trình tự, lai mẫu dò (line probe assay – LiPA), PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism – Tính đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn), PCR (có thể kết hợp với giải trình tự), real-time PCR (PCR định lượng)… Tuy nhiên, mỗi phương pháp đều có ưu, nhược điểm riêng. PCR kết hợp với giải trình tự có công trình của Yan J. và cộng sự (2006) [39] với độ nhạy là 103 bản sao/l. Chen J.J. và cộng sự (2008) [25] sử dụng phương pháp PCR-RFLP phát hiện được virus mang đột biến rtN236T trong thời gian điều trị bằng ADV từ 0-8 tháng. Bộ kit INNO-LiPA HBV DR v2 (Innogenetics, 2006) sử dụng mẫu dò đặc hiệu với nhiều vị trí đột biến kháng ADV và LAM. Theo Carla Osiowy và cộng sự (2006) [24], Munira Hussain và cộng sự (2006) [31], bộ kit này có độ đặc hiệu cao, phát hiện sớm các đột biến và có độ nhạy cao hơn so với phương pháp giải trình tự chuỗi. Ưu điểm là cùng lúc có thể phát hiện được nhiều đột biến, thao tác kỹ thuật dễ thực hiện nhưng giá thành quá đắt không phù hợp trong phát hiện và chẩn đoán, phục vụ cho quá trình theo dõi và điều trị nhiễm HBV mạn tính ở Việt Nam. Trong công trình nghiên cứu của mình, Julien Lupo và cộng sự (2009) [28] đã chứng tỏ rằng việc phát hiện đột biến kháng ADV và LAM bằng phương pháp real-time PCR có độ nhạy cao hơn cả so với phản ứng lai mẫu dò (sử dụng bộ kit INNO-LiPA DR v2, Innogenetics) và giải trình tự. Bằng cách pha trộn chủng đột biến và chủng hoang dại, real-time PCR với mẫu dò phát huỳnh quang có khả năng phát hiện 0,1% bản sao mang đột biến trong tổng số 105 bản sao. Phương pháp này có ưu điểm là định lượng được nồng độ virus mang đột biến trong quần thể nên giúp hiểu rõ hơn sự phát triển tự nhiên của các dạng virus kháng thuốc trong suốt quá trình điều trị. 1.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước Việt Nam nằm trong vùng dịch lưu hành cao với tỷ lệ nhiễm HBV trong cộng đồng từ 10-20% dân số [6,20]. Trong một số nghiên cứu y học [1,9], ở Việt Nam, HBV có 3 kiểu gen A, B và C. Trong đó, hai kiểu gen B và C là chủ yếu. Hiện nay, ở Việt Nam, ADV và LAM được sử dụng chủ yếu trong điều trị cho bệnh nhân viêm gan B mãn tính. ADV có tác dụng ức chế VRVGB chậm hơn, song vẫn hiệu quả với siêu vi đã kháng LAM. Do vậy, trong điều trị người ta thường kết hợp ADV khi bắt đầu có hiện tượng virus kháng LAM. Hiệu quả điều trị bằng ADV là không thay đổi với các kiểu gen (genotype) của HBV. Hiện tượng kháng ADV của HBV ở những bệnh nhân mạn tính trong thời gian điều trị thường xuất hiện chậm với tỷ lệ thấp. Thế nhưng một khi đột biến mới xuất hiện, nó sẽ nhân lên trong quần thể và ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình chẩn đoán và chi phí điều trị. Các phương pháp áp dụng phát hiện các dạng đột biến kháng thuốc của HBV hiện nay là PCR, giải trình tự, PCR-RFLP, real-time PCR… Một số cơ sở y tế hiện đang sử dụng một số bộ kit của nước ngoài kết hợp với giải trình tự bằng hệ thống máy tự động. LAM (1998) được FDA chấp thuận đưa vào sử dụng điều trị sớm hơn so với ADV (2002), do vậy ở Việt Nam có nhiều công trình nghiên cứu và phát hiện tính kháng LAM của HBV trong điều trị. Công ty Nam Khoa (Tp. Hồ Chí Minh) sử dụng phương pháp giải trình tự trên máy CEQ8000 (Beckman Coulter) để phát hiện kiểu gen và các đột biến kháng LAM, ADV của HBV. Phát hiện đột biến tại rt180 và rt204 kháng LAM của HBV sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP có đề tài nghiên cứu của Nguyễn Chí Vinh [22]; sử dụng phương pháp real-time PCR có công trình nghiên cứu của Nguyễn Sử Minh Tuyết và cộng sự [19], Nguyễn Thành Khôi và Hồ Huỳnh Thùy Dương [10]. Sử dụng phương pháp PCR và đọc kết quả qua điện di trên gel agarose 3% trong đề tài của Trần Thiện Toàn (Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên) [18]. Trong nghiên cứu này, tác giả sử dụng mồi ngược bắt cặp với bản mẫu hoang dại tại vị trí rt181, bản mẫu mang đột biến sẽ cho kết quả âm tính (không xuất hiện vạch) trên gel dưới tia UV. Trong khóa luận tốt nghiệp, Huỳnh Trường An (Đại học Mở, Tp. Hồ Chí Minh) [2], sử dụng mồi ngược bắt cặp với bản mẫu đột biến tại rt236 và mẫu dò phát huỳnh quang đọc tín hiệu qua mỗi chu kỳ khuếch đại. Trên thực tế, việc lựa chọn phương pháp nào cho đúng đắn để đưa vào chẩn đoán thường quy là không dễ. PCR kết hợp với giải trình tự hay PCR-RFLP đều là những phương pháp đòi hỏi kỹ thuật viên có trình độ tay nghề cao, thao tác khéo léo, thời gian cho kết quả lâu, thiên về nghiên cứu nhiều hơn là áp dụng vào thực tiễn và nhược điểm lớn nhất là độ nhạy không cao bằng real-time PCR. Với ưu điểm trên và có thể phát hiện chính xác nồng độ virus đột biến trong quần thể, real-time PCR được xem là công cụ hữu hiệu nhất với giá thành thấp, dùng để phát hiện các đột biến kháng ADV tại rt181 và rt236 của HBV ở những bệnh nhân mạn tính. 1.2 Đại cương về virus gây bệnh viêm gan siêu vi B 1.2.1 Lịch sử phát hiện bệnh viêm gan siêu vi B [6,7] Lịch sử của các loại VGVR thực ra là lịch sử của các bệnh vàng da (hoàng đảm), vì hội chứng này đã được ghi nhận rất lâu trong lịch sử loài người với nhiều bệnh khác nhau có thể gây nên vàng da. Vàng da có thể chỉ là một dấu hiệu của một bệnh toàn thân, hay là một bệnh chủ yếu ở lá gan. Bệnh ở gan gây nên vàng da cũng có nhiều nguyên nhân, trong đó tác nhân virus là chủ yếu. Sau đây là lịch sử của VG được ghi nhận theo kinh biểu niên. Vàng da nhiễm khuẩn được biết từ thời Hippocrates. Tuy người ta không biết rõ nơi nào và khi nào trận dịch VGVR đầu tiên xảy ra. Luerman (1883) mô tả một trận dịch tại xưởng đóng tàu Bremen ở những người được chủng ngừa vaxcin đậu mùa có bạch cầu người. Cùng năm này, một trận vàng da sau chủng ngừa khác xảy ra ở Merzig. Do vậy, sự hiện diện của một thể VGVR lây nhiễm trực tiếp từ máu người hoặc các dẫn xuất từ máu đã được nghĩ đến. Virchow (1885) đã mô tả bệnh gan là bệnh “vàng da xuất tiết” (catarrhal). Ông cho rằng vàng da xuất tiết có nguyên nhân là viêm đường mật do chất nhầy dính làm tắc đường mật, từ đó gây viêm ở chỗ nối đường mật – tá tràng và bệnh do vi khuẩn gây ra. Quan niệm này của Virchow gây ảnh hưởng lâu dài và đã cản trở quan điểm tiến bộ về nguyên nhân và sinh bệnh học VGVR cho mãi đến nửa đầu thế kỷ XX (Thế chiến thứ II). McDonald (1908) cho rằng tác nhân của vàng da xuất tiết là do virus. Lindstedl (Thụy Điển, 1919) đã tiên phong trong việc đặt ra thuật ngữ VG cho bệnh vàng da xuất tiết và đã chẩn đoán phân biệt hai dạng VG dịch tễ và VG huyết thanh. Năm 1943 – 1946, các nghiên cứu ở Anh và Quân Y Mỹ cho rằng VRVGB hiện diện trong huyết thanh gây vàng da và thường được mang bởi những người khỏe mạnh bình thường và không vàng da. Nhưng chỉ đến các trận dịch VG trên toàn thế giới trong Thế chiến thứ II mới đưa đến nhận thức tổng quát về bản chất lây nhiễm của bệnh vàng da xuất tiết của Virchow. Năm 1947, MacCallum đề nghị gọi tên bệnh VG nhiễm huyết thanh là VGB. Cuối cùng, các thuật ngữ này được Ủy Ban của Tổ chức Y tế Thế Giới về VGVR chấp thuận. Năm 1963, Blumberg, trong một nghiên cứu các protein huyết thanh đa hình (polymorphic), đã phát hiện một protein trong máu của một thổ dân Australia trước đó chưa từng biết. Năm 1965, protein Australia được gọi là kháng nguyên Australia (hiện nay được gọi là kháng nguyên bề mặt hoặc HBsAg). Vào lúc này, xét nghiệm miễn dịch men (EIA) đối với các dấu ấn miễn dịch của các loại VGVR trong huyết thanh vẫn còn là cơ sở chính trong chẩn đoán lâm sàng. Sau khi khám phá ra kháng nguyên Australia trong huyết thanh, Blumberg và cộng sự nhận xét rằng kháng nguyên này hiện diện với nồng độ cao ở bệnh nhân ung thư máu và ở các trẻ bị bệnh Down. Năm 1968, các nhà nghiên cứu khác, nhất là Prince, Okochi và Murakami, đã xác định kháng nguyên Australia chỉ được tìm thấy trong huyết thanh người nhiễm VRVGB, từ đó VRVGB mới được nhận biết và được xác lập đặc điểm. Blumberg nhận giải Nobel Y học vào năm 1976 nhờ phát hiện này. Từ năm 1942-1967, các nghiên cứu thực nghiệm viêm gan được thực hiện trên chính con người (Đức và Mỹ) đã bị nhiều người phê phán do vấn đề y đức. Nhưng cũng nhờ đó mà các đặc điểm dịch tễ, bệnh sử và phòng ngừa của hai loại VG A và B được hiểu biết rõ hơn. Năm 1970, hạt tương tự virus được phát hiện (gọi là hạt Dane) mang trên bề mặt của nó kháng nguyên Australia trong huyết thanh của bệnh nhân VGB và những hạt này được cho là VRVGB. Kaplan (1973) phát hiện DNA polymerase nội sinh bên trong vỏ ngoài của các hạt Dane. Chính DNA polymerase này giúp Robinson (1979) nhân dòng HBV DNA và xác định chuỗi mã nucleotide DNA toàn phần, cho rằng HBV là một tác nhân gây bệnh theo đường máu nhưng không sao chép trong môi trường nuôi cấy mô. Từ đó, bộ gen HBV là bộ gen độc đáo trong thế giới virus do bản chất đậm đặc của chúng, các khung đọc gối lên nhau và do phụ thuộc vào bước phiên mã ngược, dù rằng virion chứa chủ yếu DNA. Do phát hiện này, VRVGB người trở thành kiểu nguyên sinh của họ hepadnavirus, Hepadnaviridae. Năm 1972, Magnus phát hiện ra HBeAg. Mullis K.B. (1983) đã tìm ra phương pháp phản ứng chuỗi polymerase (PCR). Đây là một phương pháp nhân dòng in vitro nhằm tạo ra một số lượng lớn bản sao của một chuỗi mã nhất định. Nhờ phát minh này, Mullis nhận giải Nobel (1993) và sinh học phân tử có những bước tiến bộ mới. Sự khuếch đại virus bằng PCR giúp phát hiện trực tiếp và rất nhạy HBV DNA trong huyết thanh, tế bào và các mô, hơn là phát hiện nhiễm HBV gián tiếp qua đáp ứng miễn dịch ký chủ đối với kháng nguyên virus. Nhờ đó trong thập kỷ vừa qua, nhiều tiến bộ đã đạt được về sinh học phân tử, dịch tễ học, sinh bệnh học, chẩn đoán, điều trị và dự phòng của HBV. 1.2.2 Phân loại và các kiểu gen HBV 1.2.2.1 Phân loại HBV Hiện nay, virus có tính hướng gan được xếp vào một danh sách ngày càng dài, thường xếp theo thứ tự mẫu la tinh từ A (HAV), B (HBV), C (HCV), D (HDV) , E (HEV), G, TTV (đến nay đã có 16 kiểu huyết thanh TTV), virus SENV (phát hiện năm 1999, đến nay đã có 9 kiểu gen), virus SANBAN, virus nhỏ giống TTV, virus YONBAN, virus Sentinel… [6,7] Trong đó, chỉ có virus A và E là truyền theo đường tiêu hóa (thường gặp trong các vụ dịch ở Châu Á, Bắc Phi và Mexico); các virus khác (B, C, D) truyền theo đường máu; còn VRVG G cũng được cho là có thể truyền qua đường máu, là tác nhân gây bệnh nhưng hiếm, nếu có thì thường gây VG rõ rệt. Năm 1994, VRVG F được báo cáo, nhưng hiện nay, VRVG F được xem là thể biến dị của HBV gặp ở Nhật Bản [6,16]. Dựa theo sự xuất hiện ngoài tự nhiên: HBV thuộc virus động vật có xương sống. Dựa theo các nhóm acide nucleic của virus động vật, HBV nằm trong nhóm 1, chứa 2 sợi DNA có cấu trúc xoắn vòng, chỉ một mạch phiên mã tạo mRNA (dịch mã tạo protein vỏ capsid). HBV có cấu trúc 20 mặt, 42 capsomer, có vỏ ngoài, trọng lượng phân tử là 1,6kD, sợi thứ hai chưa hoàn chỉnh và có khác về chiều dài. Dựa theo khả năng gây bệnh: HBV là virus gây viêm gan (viêm nhiễm các tuyến) [4]. Hệ thống phân loại HBV: Họ Hepadnaviridae Chi Orthohepadnavirus Hepatitis B virus [20]. 1.2.2.2 Các kiểu gen HBV Dựa vào mức độ tương đồng về trình tự các nucleotide, hiện nay người ta chia HBV thành 8 kiểu gen (genotype) được gọi theo thứ tự mẫu la tinh: A, B, C, D, E, F, G, H [44]. Các kiểu gen HBV này khác nhau ít nhất 8%. Bên cạnh đó, chúng còn rất đa dạng, trong mỗi kiểu gen lại được chia ra thành nhiều phân týp (subgenotype) và các phân týp này khác nhau ít nhất 4% [26]. Các kiểu gen HBV khác nhau phân bố ở các vùng địa lí đặc trưng khác nhau: kiểu gen A phổ biến ở Bắc Mỹ, Châu Âu, Nam Phi, và Ấn Độ; kiểu gen B và C thì phổ biến ở Châu Á; kiểu gen D phổ biến ở Châu Âu (vùng Địa Trung Hải), Trung Đông, Ấn Độ và Nam Phi; kiểu gen E phổ biến ở Tây Phi; kiểu gen F phổ biến ở Trung và Nam Mỹ, Alaska; kiểu gen G phổ biến ở Châu Âu, Mexico, Mỹ; kiểu gen H thường thấy ở Trung Mỹ, Mỹ và Nhật Bản [37]. Hình 1.1: Sự phân bố các kiểu gen của HBV trên thế giới Nguồn: Marion Peters MD (2008), Hepatitis B - Diagnosis, Serology, Virology, UCSF. 1.2.3 Tình hình nhiễm virus HBV trên thế giới và Việt Nam Nhiễm HBV là một bệnh thường gặp nhất trên thế giới gây VG mạn ở người. VGB mạn tính có thể dẫn đến xơ gan và chết do suy gan; đây là nguyên nhân chính yếu của ung thư tế bào gan trên thế giới. 1.2.3.1 Thế giới Theo WHO (1997), có khoảng trên 2 tỷ người nhiễm HBV trên thế giới, hơn 350 triệu người mang HBV mạn, trong đó 60 triệu người chết vì ung thư tế bào gan và 45 triệu người chết vì xơ gan. Ngày nay, dù đã có các vacxin hiệu quả chống lại VGB, HBV cũng gây ra khoảng 1,2 triệu cái chết hàng năm trên toàn thế giới. Đến năm 2000, số người nhiễm HBV trên toàn cầu đã tăng lên 400 triệu người [1]. Tỷ lệ người mang HBsAg thay đổi khác nhau trên thế giới từ 0,1% đến 0,2% ở Anh, Mỹ và Scandinavia, đến hơn 3% ở Hy Lạp và miền Nam nước Ý và có thể lên đến 10% - 11% hoặc hơn nữa ở Châu Phi và Viễn Đông trong đó có Đông Nam Á. Người mang HBsAg có thể có tỷ lệ rất cao trong vài cộng đồng sống biệt lập như người Eskimo Alaska và người dân bản xứ Australia. HBV lưu hành trên toàn thế giới. Người ta ước tính trên thế giới có hơn 50 triệu người nhiễm HBV mới xảy ra hàng năm [1]. 1.2.3.2 Việt Nam Trên bản đồ dịch tễ của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỷ lệ dân số Việt Nam mang kháng nguyên HBsAg (chứng tỏ nhiễm HBV) là trên 8%, xếp vào hàng các quốc gia có tỷ lệ nhiễm HBV cao nhất thế giới. Nhận định này cũng được một số công trình nghiên cứu về dịch tễ học trong và ngoài nước xác nhận. Ở Việt Nam, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về VGB. Mức nhiễm HBV của Việt Nam tương đối cao, tỷ lệ có HBsAg trong cộng đồng nói chung vào khoảng 10-20% (Hoàng Thủy Nguyên, Nguyễn Thu Vân, 1992; Phạm Song và cs, 1996…) cho thấy nước ta là nước có dịch HBV địa phương cao [1]. 1.2.4 Dịch tễ học của bệnh viêm gan siêu vi B Căn cứ vào tần suất nhiễm HBV, tỷ lệ nhiễm virus toàn bộ, độ tuổi nhiễm virus và cách truyền bệnh chủ yếu, người ta chia thành 3 khu vực với 3 mức độ lưu hành rõ rệt: vùng nội dịch lưu hành cao, vùng nội dịch lưu hành trung bình và vùng nội dịch lưu hành thấp. Hơn phân nữa dân cư trên thế giới đã từng nhiễm HBV, dù tần suất chính xác khó dự đoán và rất khác nhau giữa các khu vực. Người ta đã tính có 45% dân số sống trong vùng dịch lưu hành cao, 43% trong vùng dịch trung bình và 12% trong vùng dịch lưu hành thấp [1]. 1.2.4.1 Vùng nội dịch lưu hành cao (high endemic area) Trong vùng dịch lưu hành cao có ≥ 8% người nhiễm HBV mạn và trong huyết thanh của đa số người lớn (> 70%) đã chứng tỏ có nhiễm virus trước đó. Những vùng này gồm đa số các nước châu Á, trong đó có Việt Nam (trừ Nhật và Ấn Độ), châu Phi, hầu hết vùng Trung Đông, vùng châu thổ Amazon Nam Mỹ, hầu hết các nhóm quần đảo Thái Bình Dương và một số dân địa phương khác như người Eskimo, thổ dân châu Úc và dân Maori. Trong các vùng dịch lưu hành như Đông Á, vùng Sahara Hạ ở châu Phi và lưu vực sông Amazon, tỷ lệ người mang HBV từ 8% đến 25% và tần suất anti-HBs từ 60-85%. Vì thế, phơi nhiễm HBV trong các vùng dịch lưu hành cao có thể đạt đến 100% [1]. 1.2.4.2 Vùng nội dịch lưu hành trung bình (intermediate endemic area) Trong vùng dịch lưu hành trung bình, tần suất của người nhiễm HBV mạn từ 2-7% và 20-50% người lớn đã từng nhiễm HBV. Những vùng này gồm Ấn Độ, một phần Trung Đông, miền Tây Á, Nhật, Đông Nam châu Âu và hầu hết miền Trung và Nam Mỹ. Trong các vùng này, nguy cơ cuộc sống trung bình của những người nhiễm HBV được ước tính từ 20-60%. Tần suất anti-HBs hoặc anti-HBc ở những người HBsAg(-) có nguy cơ trung bình hơi thấp và hầu hết các phơi nhiễm xảy ra ở trẻ con. Những vùng này bao gồm 43% dân số toàn cầu [1]. Hình 1.2: Sự phân bố HBV trên thế giới Nguồn: 1.2.4.3 Vùng nội dịch lưu hành thấp (low endemic area) Tần suất người mang HBV mạn dưới 2% và tần suất người lớn đã từng nhiễm virus dưới 20%. Những vùng này bao gồm Mỹ, Canada, Tây Âu, Úc, New Zealand. Tần suất của HBsAg từ dưới 0,1% ở Bắc Âu và 1% đến 5% ở Nam châu Âu. Trung tâm Kiểm soát Bệnh tật và Dự phòng Mỹ (CDC) ước tính ở Mỹ có 140000 đến 320000 người mới nhiễm HBV mỗi năm. Nhiễm HBV mới gây ra 8400 đến 19000 trường hợp nhập viện hàng năm và 140 đến 320 người chết vì viêm gan kịch phát. Ở Mỹ, có từ 1 đến 1,25 triệu người mang HBV mạn tính, nhiều người trong số họ di cư từ các vùng có tần suất cao và trung bình [6]. 1.2.5 Một số đặc điểm sinh học của HBV HBV thuộc họ Hepadnaviridae, một họ gây viêm gan cho nhiều loài động vật. HBV là một virus DNA nhỏ với các đặc điểm về siêu cấu trúc, phân tử, kháng nguyên và sinh học độc đáo, khác biệt với các thành viên của tất cả các họ virus đã được biết. DNA khá nhỏ, tròn, một phần mạch đơn (do cơ chế sao chép của chúng và do có men phiên mã ngược). Các đặc điểm sinh học đáng chú ý là tính hướng cơ quan (tropism) nổi bật đối với tế bào gan và có khuynh hướng gây nhiễm virus tồn tại (tình trạng người mang mạn tính), với nồng độ cao của kháng nguyên virus gồm các thể virus toàn vẹn hay không toàn vẹn chứa trong máu tồn tại trong nhiều tháng hoặc nhiều năm [6]. HBV là một virus bền vững, nó có thể sống và gây nhiễm trùng trong vòng 6 tháng ở diều kiện nhiệt độ phòng [3]. 1.2.5.1 Hình thái học và cấu trúc của HBV HBV là VRVG người đầu tiên mà đặc điểm cấu trúc protein và bộ gen được nhận dạng và xác định một cách cơ bản và đầy đủ.  Hình thái học hạt virus hoàn chỉnh HBV có 3 kiểu hạt hiện diện trong máu của người nhiễm virus. Virus hoàn chỉnh (virion, hạt Dane) có hình cầu, đường kính 42-45nm; các hạt cầu và các dạng sợi nhỏ hơn có đường kính khoảng 22nm chứa các protein và lipit vỏ ngoài HBsAg [6]. Hình 1.3: Các dạng HBV trong huyết thanh dưới kính hiển vi điện tử Nguồn:  Cấu trúc của HBV virion [6] Dùng phương pháp nhuộm âm bản, virion hấp phụ vào các rây của kính hiển vi điện tử và một cấu trúc hai vỏ của virion hiện rõ. Hình 1.4: Cấu trúc của HBV virion Nguồn: www.yanengbio.com/en/Product_view.asp?cp_id=72 - Vỏ protein bên ngoài hoặc màng bao kích thước 7nm, được tạo thành bởi các kháng nguyên bề mặt HBsAg, glycoprotein, lipid. Các chi tiết cấu trúc bề mặt như núm hoặc gai, như ở nhiều virus có màng bao khác, không thấy có trên HBV. - Bên trong là hạt lõi hay còn gọi là capsit có đường kính 28-34nm dưới kính hiển vi điện tử lạnh. Vỏ trong bao gói HBV DNA, có thành phần kháng nguyên HBcAg và một số enzyme quan trọng như polymerase, protein kinase… 1.2.5.2 Thành phần cấu trúc kháng nguyên  Hạt Dane: Huyết thanh của người bị nhiễm trùng cũng chứa một số lượng ít hơn những hạt kích thước khoảng 42nm. Đó là những virus còn nguyên vẹn và có khả năng gây nhiễm [3].  HBsAg: Sự hiện hữu của HBsAg là bằng chứng đầu tiên của nhiễm HBV, nó xuất hiện trước các bằng chứng về sinh hóa của bệnh gan [16]. Huyết thanh của người mang virus nồng độ cao chứa một lượng khá lớn các hạt không gây nhiễm là các protein HBs dư thừa (HBsAg). Đó là các hạt hình cầu hoặc hình sợi. Các hạt hình cầu có đường kính 17-25nm, chiếm đa số; chúng có dạng như là các túi nhỏ với thành dày độ 4nm và đường kính bên trong từ 10- 15nm. Các hạt hình sợi (hoặc hình ống) ít hơn, đường kính độ 20nm có chiều dài thay đổi. Huyết thanh của người mang HBV với nồng độ virus huyết thấp thường các hạt cầu HBs và các sợi HBs rất ít hoặc không có. Hai cấu trúc virus phụ này không chứa HBV DNA và vì thế không gây nhiễm [6].  HBcAg (các hạt lõi trong gan): Các hạt lõi HBV trống không có vỏ ngoài thường được thấy trong nhân tế bào gan là nơi chúng được tổng hợp và dự trữ (một số hạt lõi có thể được tổng hợp trong bào tương). Có hai loại hạt lõi: hạt lõi trống không chứa DNA và hạt lõi đầy có chứa DNA. Tuy nhiên, không có các hạt lõi trần nào được tìm thấy ở huyết thanh của người mang HBV dung nạp miễn dịch mà không có anti-HBc [6]. Vì vậy, HBcAg không xác định được bằng các phản ứng huyết thanh học, nó được tách ra sau khi phá vỡ hạt Dane ở các mẫu sinh thiết, sau đó xác định bằng phương pháp ELISA [20].  HBeAg: Kháng nguyên này đại diện cho dạng tiết ra của HBcAg xuất hiện trong quá trình ủ bệnh, giai đoạn tiền triệu và nhiễm trùng cấp. Xuất hiện sau HBsAg 2-4 tuần (khoảng 1,5 tháng sau khi nhiễm virus). Sự xuất hiện kháng nguyên này trong huyết thanh chỉ ra sự lây nhiễm. Sự tồn tại dai dẳng của HBeAg trong huyết thanh sau 3 tháng dẫn đến tăng khả năng viêm gan B mạn tính [6,16]. Vì hàm lượng của nó tỷ lệ thuận với lượng virus, do đó qua kháng nguyên này có thể đánh giá được mức độ nhiễm của người bệnh [20]. 1.2.5.3 Cấu trúc bộ máy di truyền  Cấu trúc của DNA virion Dưới kính hiển vi điện tử, HBV DNA hình vòng, mạch kép không hoàn chỉnh và dài khoảng 3181-3221 base. Việc đánh số bắt đầu ở một điểm phân cắt của EcoRI. Bên trong virion, mạch DNA mã hóa protein virus gọi là mạch (-), có chiều dài nguyên vẹn nhưng không đóng đồng hóa trị. Có một phần dư nhỏ từ 9 đến 10 base tại đầu tận. DNA mạch (-) mang tại đầu tận 5’ phần gắn kết đồng hóa trị của polymerase virus được gọi là protein tận cùng hoặc primase, vì cần thiết khởi động cho sự tổng hợp mạch (-). Mạch (+) giữ mạch (-) trong cấu hình vòng vì nó tạo cầu nối cho những đoạn không liên tục của mạch (-) [1]. Đầu tận 3’ của mạch (+) không ở một vị trí cố định và còn nối với HBV DNA polymerase. Đa số các bộ gen HBV chứa một lỗ hổng mạch đơn có chiều dài từ 300-2000 base do mạch (+) có chiều dài thay đổi từ 50-100% chiều dài của mạch (-) [6,20]. Mạch (-) đầy đủ có các đầu tận 5’ và 3’ xác định với một phần dư tận cùng gồm 9 base, trong vùng mà ở đó bộ gen có mạch ba. Polymerase virus nối đồng hóa trị vào tyrosin 63 qua một cầu phosphodieste vào đầu 5’ của mạch âm. Đầu tận 5’ của mạch DNA (+) được tạo bởi một oligonucleotide chiều dài 18 base, được gắn chóp theo cùng một cách như RNA thông tin (mRNA). Bộ gen chứa 2 chuỗi mã 10 hoặc 11 base được lặp lại một cách trực tiếp, được gọi là các chuỗi mã lặp lại trực tiếp, DR1 và DR2. Cấu trúc bộ gen này là điển hình cho tất cả Hepadnaviridae, nhưng trong các hepadnavirus gia cầm, sự gối lên nhau và khoảng cách giữa các đoạn lặp lại (DR) ngắn hơn [6]. Cấu trúc của bộ gen HBV không theo các tiêu chuẩn xếp loại thông thường của virus trong nhiều khía cạnh: cấu trúc bộ gen có cả DNA và RNA và bộ gen chứa DNA mạch đơn, mạch kép và ngay cả mạch ba không hoàn chỉnh. Các đặc trưng bất thường này là do hậu quả trực tiếp của cơ chế sao chép của chúng [6].  Cấu trúc bộ gen của HBV Định nghĩa các khung đọc mở: Từ chuỗi mã nucleotide của một phiên bản mạch kép của bộ gen HBV, người ta có thể nhận được 6 chuỗi mã khác nhau của bộ ba mã hóa aa của nucleotide (codon). Nếu có một chuỗi mã của các codon không mã hóa protein, nó sẽ bị cắt đứt một cách ngẫu nhiên bởi một trong 3 codon kết thúc, trong khi các chuỗi mã mã hóa protein thường không có codon kết thúc trong một khoảng ít nhất 50 codon. Các quãng codon này được gọi là khung đọc mở (KĐM) [6]. Cấu trúc bộ gen của HBV: Hầu hết KĐM chức năng của tổ chức tế bào cũng như các KĐM từ các virus lớn hơn, được xếp theo kiểu đường thẳng trên bộ gen và mã hóa một protein. Hơn nữa, chúng nằm rải rác cạnh các vùng rộng không mã hóa được gọi là intron (vùng không mã hóa), bị loại bỏ sau khi phiên mã bởi hiện tượng ghép nối. Các vùng điều hòa và mã hóa protein thường khá phân tán. Tuy nhiên, bộ gen HBV có chiều dài tối thiểu gồm: KĐM mã hóa DNA polymerase virus và các chức năng phụ; KĐM S nằm hoàn toàn trong phạm vi KĐM P; KĐM C và X gối lên KĐM P một phần; KĐM S mã hóa 3 protein HBs có chung một đầu tận cùng; KĐM C mã hóa cho cả 2 protein, HBe và HBc; KĐM X cũng có thể mã hóa hơn 1 protein [6]. - Vùng S (surface): gồm 3 gen S, preS1, preS2. Gen S: Mã hóa cho protein chính. Gen S và preS2 mã hóa loại protein trung bình (M). Gen S, preS1 và preS2 mã hóa protein lớn (L) của vỏ ngoài chứa 390 acide amine, tham gia vào việc gắn virus vào tế bào gan, lắp ráp virion và giải phóng virus ra khỏi tế bào. - Vùng C (core): gồm gen C và preC. Gen C mã hóa cho protein lớn của lõi gồm 138 acide amine, có khả năng gắn kết với acide nucleic, tham gia vào quá trình lắp ráp virus. Hình 1.5: Cấu trúc bộ gen HBV Nguồn: - Vùng P (polymerase): Gen P chiếm ¾ bộ gen của virus, gối lên phần cuối gen C, phần đầu gen X và toàn bộ gen S. Gen P mã hóa một polypeptide chứa 832 acide amine rất giàu histidine, trọng lượng phân tử khoảng 90kD, có hoạt tính DNA polymerase và enzyme phiên mã ngược (DNA polymerase phụ thuộc RNA). - Vùng X: Là gen có kích thước nhỏ nhất. Chức năng của gen này vẫn chưa được biết chính xác nhưng có lẽ nó giữ vai trò là nhân tố hoạt hóa (transactivation) trong quá trình nhân đôi của siêu vi. Virus DHBV không có vùng X [6,20]. 1.2.5.4 Quá trình sao chép của virus viêm gan B Quá trình sao chép của HBV và có thể được chia làm nhiều bước: 1. Gắn kết virus vào tế bào ký chủ; 2. Xâm nhập của virus vào tế bào (sự nhập bào); 3. Phóng thích bộ gen virus; 4. Biểu hiện các sản phẩm gen virus; 5. Sao chép bộ gen virus; 6. Lắp ráp các hạt virion (virus hoàn chỉnh); 7. Phóng thích virus.  Gắn kết virus vào tế bào ký chủ Sự gắn kết HBV vào tế bào chủ là một trong các bước then chốt xác định tính hướng cơ quan của virus nhờ vào các điểm gắn virus và các thụ thể tương ứng trên bề mặt tế bào [6]. Hạt HBV hoàn chỉnh lưu thông trong máu và tìm cách gắn kết vào tế bào chủ. Nhiều bằng chứng cho thấy một vùng protein bề mặt lớn (vùng PreS1) là nơi gắn kết thụ thể. Các kháng thể đối với PreS1 có thể phong tỏa sự gắn kết của virion HBV vào màng tế bào gan. Sự gắn kết cũng có thể qua trung gian albumin huyết thanh người đã biến đổi. Vì thế, HBV có thể dùng protein huyết thanh đã biến đổi như một phương tiện chuyên chở để vào tế bào gan [6].  Xâm nhập của virus vào tế bào (sự nhập bào) Cơ chế HBV đi vào tế bào chủ chưa được hiểu biết rõ ràng: hoặc vỏ ngoài HBV có protein dung hợp, protein dung hợp này chèn một chuỗi mã kị nước vào hai lớp lipid của tế bào đích và gây dung hợp màng virus với màng tế bào, qua đó phóng thích nucleocapsit virus vào bào tương; hoặc virus nhập nội bào qua trung gian thụ thể [6].  Phóng thích bộ gen virus Trước đây, người ta cho rằng toàn bộ hạt lõi được vận chuyển vào nhân. Các nghiên cứu gần đây cho thấy, đường kính tối đa các lỗ nhân là 25nm quá nhỏ so với kích cỡ của các hạt lõi là 36nm. Tuy nhiên, hạt lõi có thể vận chuyển bộ gen virus đến phức hợp lỗ nhân nếu nó bị phosphoryl hóa. Vì kích cỡ của hạt lõi, sự phóng thích bộ gen sau đó phải xảy ra khi bộ gen virus vào nhân, có thể qua trung gian của polymerase virus nối đồng hóa trị [1].  Biểu hiện các sản phẩm gen virus [20] Sự biểu hiện các gen của virus thông qua ít nhất hai bản phiên mã không qua xử lí ghép nối. Không có protein nào được mã hóa bởi mạch (+). Sau khi cởi bỏ vỏ capsid, HBV DNA kép với 2 sợi không bằng nhau được chui vào nhân và chuyển thành dạng cccDNA. Dạng này được dùng làm khuôn để tổng hợp 4 loại RNA với các kích thước khác nhau 3,5; 2,4; 2,1; và 0,7kb. Trong đó, mRNA 3,5kb gọi là RNA tiền genom, dùng làm khuôn để tổng hợp genom. Các mRNA còn lại được gọi là dưới genom dùng để tổng hợp các protein khác nhau trong đó có DNA polymerase (P), protein lõi C và preC, polypeptide X, protein bề mặt S và protienkinase. Các mRNA này được gắn đuôi và di chuyển ra tế bào chất. Protein lõi C tạo thành nucleocapsid (HBcAg). Polypeptide tiền lõi được vận chuyển đến mạng lưới nội chất, từ đó chúng được tiết ra ngoài dưới dạng kháng nguyên tiền lõi (HBeAg). RNA tiền genom được đóng gói cùng với HBV DNA polymerase và proteinkinase để tạo thành hạt lõi. Protein X tương tác với các yếu tố phiên mã trong nhân được kích thích bởi tín hiệu từ tế bào chất. Protein vỏ ngoài S gắn vào màng lipid của bộ mày golgi và mạng lưới nội chất để sau đó nucleocapsid này nảy chồi vào mạng lưới nội chất và bộ máy golgi để biến chúng thành vỏ ngoài của virus tương lai. Trong quá trình nhân lên, virus luôn tổng hợp thừa protein vỏ nên trong huyết thanh người bị nhiễm HBV, ngoài hạt virus hoàn chỉnh (hạt Dane) còn xuất hiện các dạng không hoàn chỉnh hình cầu, hình que hoặc hình sợi.  Sao chép bộ gen virus Sau khi hạt lõi được lắp ráp xong, RNA tiền genom được dùng làm khuôn để tổng hợp chuỗi DNA theo cơ chế sao chép ngược. Vùng primase của polymerase dùng như một đoạn mồi đối với men phiên mã ngược. Bởi thế, mạch DNA (-) lớn lên (ở dưới bên trái) được gắn kết vào đầu tận 5’ của primase. Sự phiên mã ngược tiến hành cho đến đầu tận 5’ của khuôn mẫu RNA được tiếp cận. Bởi thế một phần dư ngắn được sinh ra ở mạch (-). Hoạt tính RNase H kết hợp với men phiên mã ngược làm thoái hóa khuôn mẫu RNA và phân cắt một đoạn RNA có mũ chụp dài 18 base ở đầu tận 5’ của nó. Đoạn này có sự đồng dạng 6 base đối với DR1 và DR2 lặp lại trực tiếp. Sự tương tác yếu này cho phép chuyển đoạn và men phiên mã ngược /DNA polymerase từ DR1 vào DR2. Ở đây, đoạn RNA có chức năng như một đoạn mồi tổng hợp DNA mạch (+). DNA polymerase có khả năng xuyên qua tính không liên tục trong khuôn mẫu mạch (-) vì đoạn dư ngắn tận cùng của nó. Sau đó, cấu trúc của DNA virion được tái sản xuất [6]. Hình 1.6: Quá trình sao chép của HBV trong tế bào gan Nguồn: Một số genom trưởng thành sau khi tổng hợp lại quay về nhân để chuyển thành cccDNA nhằm duy trì một lượng khuôn ổn định cho dịch mã [20]. Các tế bào gan thường chỉ tích lũy khoảng 50 bản sao HBV cccDNA cho mỗi tế bào [6].  Lắp ráp các hạt virion Sự tổng hợp HBV DNA chưa được hoàn tất trước khi virus trưởng thành. Tại mạng lưới nội chất, các phân tử lõi trưởng thành được đóng gói vào trong các protein bề mặt [6,20].  Phóng thích virus khỏi tế bào chủ Sau khi có vỏ ngoài, virus hoàn chỉnh được tiết ra thông qua bọng vận chuyển [6,20]. 1.2.6 Đặc điểm sinh bệnh học và biện pháp phòng ngừa – điều trị HBV 1.2.6.1 Con đường lây nhiễm Nguồn hoặc ổ chứa HBV người chính là con người. Không có ổ chứa quan trọng nào khác trên động vật. Một vài bề mặt dụng cụ như kim tiêm, bàn chải đánh răng, dao cạo râu, đồ chơi, dụng cụ y tế… có thể là trung gian truyền nhiễm người – người của HBV cho một số lớn bệnh nhân. HBV thường không có trong phân và không có bằng chứng truyền nhiễm theo con đường phân – miệng như virus viêm gan A. Phương thức lây nhiễm chủ yếu trong viêm gan siêu vi B là lây qua đường ngoài tiêu hoá. Sự lây nhiễm sẽ dễ dàng xảy ra khi trong máu hoặc trong các dịch tiết của bệnh nhân đã nhiễm có nồng độ siêu vi B rất cao và khi bệnh nhân tiếp xúc thường xuyên với các yếu tố nguy cơ trong một thời gian dài. Mặt khác, đa số những người mang siêu vi B mạn tính thường không có triệu chứng và họ không hề hay biết để dự phòng nguy cơ lây nhiễm cho những người xung quanh [6]. Về phương diện dịch tễ học, người ta ghi nhận có ba phương cách lây nhiễm chính:  Lây truyền qua đường ngoài tiêu hoá do tiếp xúc với máu, các vật phẩm của máu (dịch nhiễm virus) Đây là con đường lây nhiễm thường gặp nhất, cả ở vùng dịch lưu hành cao và thấp. Việc sàng lọc máu hoặc các chế phẩm máu để loại HBsAg và không dùng dung môi là huyết thanh cho vacxin hầu như đã loại bỏ nguyên nhân này ở các nước phát triển. Tuy nhiên, các bệnh nhân nhận các yếu tố đông máu đậm đặc vẫn còn nguy cơ nhiễm virus do HBsAg ở mức độ thấp, không phát hiện được. Trong những quốc gia mà máu chưa được sàng lọc HBsAg hoặc sàng lọc không đúng mức, nguy cơ nhiễm HBV còn cao [6]. Cách lây nhiễm này thường gặp ở các nhân viên y tế, người được truyền máu nhiều lần, người mắc bệnh máu khó đông và được lọc máu ngoài thận... Ngoài ra bệnh còn có thể lây qua đường tiêm chích hoặc khi sử dụng các dụng cụ không đảm bảo vô khuẩn như phẫu thuật, nội soi đường tiêu hoá, châm cứu, xỏ lỗ tai, xâm mình, chữa răng và nhất là những người nghiện ma túy sử dụng chung ống tiêm.  Lây truyền qua đường sinh dục [6] Đây là con đường truyền nhiễm HBV đã được chứng minh và thường gặp ở các nước phát triển nhất là trong nhóm đồng tính luyến ái. Tuy nhiên, con đường lây này không quan trọng bằng con đường lây do phơi nhiễm với máu và dịch cơ thể ở các nước dịch lưu hành cao và trung bình. Trong các nghiên cứu về mãi dâm, những người tiếp xúc sinh lý với người mang HBV mạn và những người chăm sóc ở các cơ sở điều trị bệnh truyền theo đường sinh dục có tần suất của các dấu ấn nhiễm HBV cao hơn 3-5 lần trong cộng đồng. Trong nhóm này cũng như trong cộng đồng dân cư Mỹ, nguy cơ nhiễm HBV thường tỷ lệ thuận với số lượng bạn tình và với tình trạng nhiễm giang mai trước đó. Sự kết hợp chặt chẽ với giang mai có thể do tính chất gây loét của giang mai, giúp nhiễm HBV hiệu quả hơn. HBV cũng có thể là dấu ấn chỉ điểm cho những bệnh loét đường sinh dục mạn tính khác, hoặc cho việc tiếp xúc tình dục với người có nguy cơ cao.  Lây truyền từ mẹ sang con (truyền nhiễm chu sinh) [6] HBV được lây truyền chủ yếu trong lúc sanh hơn là lúc lây qua nhau thai. Mức độ nặng và tiên lượng của tình trạng lây nhiễm này tuỳ thuộc vào hai yếu tố: mức độ nhân đôi của siêu vi và thời gian bị nhiễm HBV cấp tính ở mẹ. Ở Đài Loan, người ta đã ước tính 40-50% người mang HBsAg mạn nhiễm tiên phát trong thời kỳ chu sinh, chỉ có 5-10% có thể nhiễm trong bào thai, những trẻ khác có thể nhiễm vào lúc sổ nhau do phơi nhiễm với máu người mẹ nhiễm virus. Vì vậy, việc cần thiết phải tiêm chủng bằng vacxin và có thể cả globulin miễn dịch viêm gan B (HBIG) ngay sau khi bé chào đời. Trẻ sinh ra từ người mẹ có HBsAg (+), HBeAg (+) có 60-80% nguy cơ nhiễm HBV phát triển trong 9 tháng sau khi sinh và 90% trong số đó trở thành người mang HBV tồn tại. Các trẻ sinh ra do người mẹ mang HBeAg (-), nguy cơ nhiễm trong năm đầu sau sinh thấp hơn (2-15%). Truyền nhiễm HBV chu sinh thay đổi theo đặc tính lưu hành và tần số HBeAg (+) ở những người mẹ mang HBV. Trên thế giới, truyền nhiễm chu sinh góp phần quan trọng (15-40%) vào số lượng người mang HBV trong cộng đồng.  Các đường lây truyền khác [6] Nhiễm HBV ở trẻ em: Nhiều trẻ không nhiễm HBV vào thời kỳ chu sinh, sẽ bị nhiễm vào vài tháng đầu sau sinh, có lẽ do tiếp xúc chặt chẽ với mẹ hoặc anh chị em bị nhiễm virus. Vai trò của nước bọt: Nước bọt là một đường truyền nhiễm HBV cần được nghiên cứu, có thể gây nhiễm do những tiếp xúc thân mật không phải tình dục. Khảo sát trên hắc tinh tinh cho thấy, nước bọt có thể gây nhiễm nếu có dây máu nhiễm HBV. Nhưng không truyền nhiễm khi niêm mạc đường tiêu hóa không bị tổn thương và nước bọt nhiễm HBV được phun khí dung vào mũi, khi uống nước có nhiễm HBV, hay khi chải răng. Tuy nhiên, truyền nhiễm có thể xảy ra qua vết cắn hoặc qua cơm được mớm từ người mẹ nhiễm virus. Nhiễm virus qua đường miệng: HBV không lây nhiễm qua đường phân miệng vì thế phân người không thể là nguồn lây nhiễm HBV trong cộng đồng. Gây nhiễm sau khi uống một lượng HBV đã được chứng minh liều lượng virus cần cho việc gây nhiễm thành công qua đường uống cao hơn qua đường máu; nhưng sự gây nhiễm qua đường uống không xảy ra qua đường tiêu hóa, mà qua những tổn thương nhỏ thường có trong niêm mạc miệng. Vai trò của tinh dịch và dịch tiết âm đạo: Tinh dịch và dịch tiết âm đạo chứa nồng độ virus bằng hoặc có phần cao hơn với nồng độ virus trong nước bọt và giữ một vai trò quan trọng trong truyền nhiễm HBV. Đường lây nhiễm qua da: Các yếu tố nguy cơ nhiễm virus là rệp hoặc ve bét trên giường của trẻ, muỗi truyền sốt rét, các tổn thương da, xỏ lỗ tai, cắt bao quy đầu… Tai nạn kim tiêm truyền HBV qua da trực tiếp có thể xảy ra với kim nhiễm máu và các sản phẩm của máu hoặc xảy ra khi thẩm tách máu, xâm mình, châm cứu…; những vật liệu gây nhiễm tiếp xúc với da hở, hoặc niêm mạc mắt… Vì sức đề kháng của HBV khá cao và ổn định, có thể lây nhiễm do tiếp xúc với niêm mạc hoặc da bị thương tổn như bàn chải đánh răng, chai sữa, đồ chơi, các dụng cụ ăn, dao cạo râu hoặc các bộ dụng cụ trong bệnh viện như máy hô hấp nhân tạo, nội soi, đồ thủy tinh trong phòng thí nghiệm… 1.2.6.2 Triệu chứng lâm sàng [6,16] Ở người lớn khi nhiễm viêm gan siêu vi B cơ thể họ thường phản ứng theo 2 cách khác nhau: thứ nhất là bệnh xảy ra cấp tính, ít hơn 1% số người bị nhiễm có thể phản ứng nặng nề và thiệt mạng vì bị hư gan trong vòng vài tuần sau khi nhiễm virus này. Thứ hai là bệnh chuyển thành mạn tính, khoảng 10% không loại trừ được siêu vi này và họ sẽ mang virus này trong gan suốt đời, những người này có khả năng lây sang người khác và có nguy cơ ung thư gan hoặc xơ gan. Trẻ sơ sinh và trẻ em có nhiều nguy cơ bị nhiễm viêm gan B mạn tính hơn sau khi bị nhiễm virus này. Tuy vậy, hầu hết những đứa trẻ bị nhiễm này đều không có triệu chứng gì. Khoảng 90% trẻ sơ sinh có mẹ bị nhiễm sẽ trở thành người mang virus mạn tính và chỉ 5-10% có khả năng loại trừ virus khỏi cơ thể. Đối với trẻ em bị nhiễm HBV sau khi tiếp xúc với mầm bệnh sẽ trở thành người mang siêu vi mạn tính, chỉ có khoảng 40% là lành bệnh nếu như được phát hiện và điều trị kịp thời. Hầu hết trẻ em khi bị nhiễm HBV không hề có triệu chứng. Người lớn nhiễm có khoảng một phần tư không có triệu chứng. Triệu chứng thường xuất hiện sau 4-6 tuần bị nhiễm: mức độ từ trung bình đến nặng. Các triệu chứng thường thay đổi theo từng người, thông thường có các triệu chứng sau: chán ăn, buồn nôn, mệt mỏi, suy nhược, nước tiểu sậm màu và nổi mẫn đỏ khắp người, đau bụng (nhất là ở vùng quanh gan), vàng da, vàng mắt (nguyên nhân vàng da là do gan bị suy giảm chức năng đào thải bilirubin, một sản phẩm chuyển hoá từ những tế bào hồng cầu già bị chết trong máu. Hậu quả là do bilirubin tích tụ và lắng đọng ở da gây ra màu vàng. 1.2.6.3 Biện pháp phòng ngừa và điều trị  Phòng bệnh Miễn dịch thụ động: Globulin miễn dịch (Ig – Immunoglobulin) có kháng thể kháng HBs với hiệu giá cao (Hepatitis B immune globuline, HBIG) có khả năng gây miễn dịch thụ động giúp ngăn chặn viêm nhiễm cấp tính và mạn tính nếu chúng ta sử dụng HBIG ngay trong vòng 7 ngày sau phơi nhiễm (liều người trưởng thành là 0,06ml/kg trọng lượng cơ thể), tiếp sau bằng bắt đầu hàng loạt mũi vaccin HBV. Hiện nay, cách tiếp cận này được khuyến khích đối với những người đã nhiễm chất liệu ô nhiễm kháng nguyên bề mặt viêm gan B qua niêm mạc hoặc qua vết xước ở da và cho những người có quan hệ tình dục với những bệnh nhân nhiễm HBV. HBIG cũng có khả năng bảo vệ bệnh nhân khỏi tình trạng tái nhiễm HBV sau quá trình cấy ghép gan. HBIG cũng được chỉ định cho những trẻ sơ sinh của những bà mẹ mang HBsAg dương tính [16]. Các kết quả từ việc sử dụng HBIG dự phòng cho những trẻ em có nguy cơ cao nhiễm VRVGB khá tốt nếu globulin miễn dịch được cho sớm sau sinh ngay khi có thể, hoặc trong vòng 12 giờ sau sinh và nguy cơ đứa trẻ phát triển tình trạng mang virus tồn tại được giảm độ 70% [6]. Miễn dịch chủ động: Miễn dịch chủ động có khả năng tạo miễn dịch cao. Vaccine VGB có thể được sản xuất từ huyết tương của người mang HBsAg dương tính hoặc bằng phương pháp tái tổ hợp sử dụng động vật có vú hoặc nấm men mang plasmid có chứa HBs hoặc chứa gen preS1 và preS2. Gần đây, các nghiên cứu dùng kết hợp tiêm chủng chủ động và thụ động cho thấy hiệu quả lên tới 90%. HBIG cùng với vacxin được khuyến cáo dùng trong tất cả các trường hợp như thế nhất là đứa trẻ của bà mẹ mang HBsAg (+) [6].  Điều trị Theo thông tin đăng trên tờ Informed (phát hành ngày 13/09/2001) của Tổ chức VGB phi lợi nhuận (Mỹ), các hợp chất đã và đang phát triển trong điều trị VGB gồm: Interferon (INF), các chất tương tự nucleotide, thuốc kháng virus không nucleotide, thuốc tăng cường miễn dịch không INF. Interferon Interferon là một họ các protein tự nhiên, có hoạt tính chống virus và kích thích hoạt động của hệ miễn dịch. Điều trị VGB mạn bằng INF-α, được FDA cho phép từ năm 1991 đã là phương tiện điều trị đầu tiên với các thuận lợi như sau: liệu trình điều trị tương đối ngắn (4 đến 6 tháng); làm chuyển huyết thanh HBeAg lâu dài trong 30-40% bệnh nhân người lớn nhiễm virus mạn (gấp đôi nhóm chứng) trong thời gian theo dõi 50 tháng; về lâu dài sẽ có từ 19-57% mất HBsAg ở những người đáp ứng; các chỉ số mạnh nhất đối với đáp ứng điều trị là ALT > 150U/L, HBV DNA < 200pg/ml, thời gian nhiễm virus ngắn; và cuối cùng INF làm thay đổi hậu quả xấu của bệnh gan mạn. Tuy nhiên, các kết quả trên là của bệnh nhân da trắng VGB mạn có nhiều đặc thù rất khác biệt với bệnh nhân người châu Á. INF cũng có những bất lợi sau: chỉ dùng được ở một số bệnh nhân (INF có tác dụng thấp trên bệnh nhân nhiễm virus chu sinh, ALT thấp, bệnh nhân có biến dị HBeAg (-)); dung nạp kém (thường có các tác dụng phụ gây khó chịu, đôi khi có tác dụng phụ nguy hiểm, làm nặng hơn tình trạng xơ gan, VGB mất bù); bệnh nhân khó chấp nhận do thuốc cần phải tiêm và đắt tiền. Chính vì thế, nhiều nhà khoa học cố gắng tìm các liệu pháp thay thế. Nhiều tác nhân tương tự nucleotide có hoạt tính kháng virus mạnh không độc đang là các liệu pháp thay thế đầy hứa hẹn cho các bệnh nhân vì lý do nào đó không dùng INF để điều trị VGB mạn [6]. Thuốc tăng cường miễn dịch không INF Tăng cường các tế bào miễn dịch chống nhiễm tế bào T và sản xuất INF tự nhiên trong cơ thể. Bao gồm: Theradigm, Thymosin α-1 (Zadaxin), vacxin HBV DNA, vacxin preS1-S2, Hepagen, EHT899, HBV antigen, BayHep B, Nabi-HB, Anti-Hepatitis B [6]. Thuốc kháng virus không nucleotide gồm: XTL-001 (kháng thể đơn dòng người) và IminoSugar hay Nonyl-DNJ (ức chế tạo nếp protein) [6]. Các chất tương tự như Nucleoside Nucleoside là thành phần cấu tạo chủ yếu của các chuỗi RNA và DNA. Những chất tương tự nucleoside là những chất đồng phân có cấu trúc hóa học tương tự như nucleoside tự nhiên và chính vì thế, có thể tham dự vào một số quá trình liên quan đến nucleoside. Phần lớn các cấu trúc nucleoside tự nhiên đều là có dạng đồng phân quang học quay phải, trong khi các chất tương tự nucleoside có dạng đồng phân quang học quay trái có hoạt tính mạnh nhưng lại rất ít độc tính. Các chất tương tự nucleotide sử dụng điều trị cho bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính chia làm 3 nhóm:  Nhóm I: L-Nucleotide gồm lamivudine (3TC), emtricitabine (FTC), telbivudine (L-dT) và clevudine (L-FMAU).  Nhóm II: acyclic phosphonate gồm adefovir (PMEA), tenofovir (PMPA) và cidofovir (HPMPC).  Nhóm III: cyclopentane (pentene) ring gồm entercavir và abacavir (carbovir). Các chất tương tự như nucleodide phải trải qua quá trình phosphoryl hóa và sau đó vào trong phân tử DNA của virus, ức chế polymerase bằng cách cạnh tranh trực tiếp với chất nền tự nhiên (Deoxyademosine triphosphate) và làm kết thúc chuỗi DNA của virus. Các nucleotide liên kết với nhau qua cầu nối phosphodiester được thành lập giữa nhóm 3’-hydroxyl trên phân tử đường và nhóm 5’- phosphate của nucleotide kế tiếp, tiếp tục như thế, chuỗi DNA nối dài ra. Các dideoxynucleoside dưới dạng triphosphate có khả năng gắn kết cạnh tranh với các nucleoside nội sinh trên chuỗi DNA do có cấu trúc tương tự. Tuy nhiên, các chất tương tự nucleoside này chỉ có đầu 5’ mà không có đầu 3’- hydroxyl, nên khi nó gắn vào chuỗi DNA sẽ ngăn trở các nucleoside nội sinh kế tiếp không gắn kết được. Quá trình tổng hợp DNA bị kết thúc nửa chừng và chuỗi DNA virus không thành lập được [6]. 1.3 Adefovir dipivoxil trong điều trị viêm gan B mạn tính 1.3.1 Adefovir dipivoxil (9-phosphoryl methoxyethyl adenine, PMEA) Mục đích của điều trị viêm gan B là làm giảm thiểu HBV DNA trong huyết thanh đến mức thấp không còn được phát hiện và ngăn ngừa diễn tiến đưa đến xơ gan, suy gan, và ung thư gan. Bệnh nhân nhiễm HBV mạn và có hoạt độ men ALT bình thường là đang dung nạp miễn dịch hoặc mang siêu vi không hoạt động thì không cần điều trị. Ngược lại bệnh nhân với nồng độ ALT cao, nồng độ HBV DNA cao và có tình trạng viêm hoại tử tế bào gan thì cần phải được điều trị. Hiện nay, FDA chấp thuận 5 thuốc để điều trị viêm gan virus B mạn tính gồm: INF alfa-2b (1992), LAM (1998), ADV (2002), và ETV (2005), Peg-INF alfa-2a (tháng 5/2005) và TDF (2008). ADV là một loại thuốc mới dùng để điều trị HBV, mới đây đã được chấp nhận cho việc điều trị bệnh nhiễm virus viêm gan B mạn tính ở Châu Âu và Mỹ. ADV có một phổ kháng virus gồm herpes- hepadnavirus và retrovirus, gồm cả HIV-1 và HIV-2, đã được chứng minh có hoạt tính in vitro chống lại các đột biến HBV kháng LAM và hoạt tính in vitro cũng như in vivo chống lại HBV nguyên sinh [6]. Trong thử nghiệm lâm sàng giai đoạn II, ADV đã chứng minh làm giảm HBV DNA hơn 1 log10 sau 4 tuần điều trị và 4 log10 sau 12 tuần ở bệnh nhân nhiễm HBV nguyên sinh. Trong VGB mạn, Adefovir được dùng trong 3 tháng. Thuốc làm giảm HBV DNA đến mức không phát hiện được và nồng độ ALT được cải thiện. ADV có một ích lợi chủ yếu là không bị tác động bởi đột biến như điều trị với LAM. Nhưng đa số các bệnh nhân bị tái phát sau khi hoàn tất đợt điều trị [6]. O N N N N NH 2 P O OH HO Adefovir Dipivoxil C8H12O4N5P Hình 1.7: Cấu trúc của Adefovir dipivoxil 1.3.2 Cơ chế tác động của Adefovir đối với HBV Adefovir dipivoxil là tiền chất dạng uống của ADV, một chất tương tự acyclic nucleotide phosphonate của adenosine monophosphate, chất được vận chuyển chủ động vào tế bào của động vật có vú. ADV nhanh chóng được chuyển đến huyết thanh và mô, tồn tại trong huyết thanh từ 5-7 giờ rồi được thải ra bằng nước tiểu (90% thuốc thải ra sau 24 giờ). Sau khi được vận chuyển vào nội bào bởi cơ chế thụ thể - base, ADV được phosphoryl hóa thành dạng diphosphate, một dạng tương tự của deoxyadenosine-5’-triphosphate nhưng không có gốc 3’-hydroxylic. Vì thế, kết quả đẫn đến việc ức chế việc tổng hợp DNA bằng cách cạnh tranh liên kết trực tiếp với chất nền tự nhiên (deoxyadenosine triphosphate) và sau đó sát nhập vào DNA của virus gây kết thúc chuỗi DNA [6,36,38]. Ngoài INF, thì chỉ có 2 loại thuốc - LAM và ADV là được chấp thuận khi điều trị đầu tiên cho bệnh nhiễm virus viêm gan B mạn tính ở Châu Âu. Mỗi chất tương tự nucleoside (nucleotide) có hoạt động chính là chất ức chế đặc biệt đối với polymerase/reverse transcriptase của virus (gọi tắt là Nucleos(t)ide Reverse Transcriptase Inhibitor (NRTI) có tác dụng ức chế chức năng của HBV polymerase). Một vài NRTI khác ngoài LAM và ADV đã được nghiên cứu có hiệu quả chống lại HBV. Các thuốc đó là ETV, được đăng kí ở Mỹ; và TDF được sử dụng để điều trị HIV-1. Trong hầu hết những trường hợp, điều trị cho bệnh nhân nhiễm viêm gan B mạn tính với những sản phẩm NRTI nhanh chóng ngăn chặn được sự nhân lên của HBV trong thời gian ngắn [38]. Hình 1.8: Cơ chế tác động của Adefovir dipivoxil 1.3.3 Cơ chế kháng Adefovir của HBV trong điều trị Cũng như các sinh vật khác, trong quá trình tiến hóa, virus luôn biến đổi để thích nghi với điều kiện môi trường bất lợi. Do virus có cấu tạo rất đơn giản và sự nhân lên hoàn toàn phụ thuộc vàu tế bào nên tần số đột biến của virus rất cao. Vấn đề kháng thuốc của virus đã gây trở ngại rất lớn cho công tác điều trị. Tính kháng thuốc có thể xuất hiện sau một thời gian dùng thuốc nhưng thậm chí có thể chỉ sau một lần dùng thuốc và tính chất này lại được truyền lại cho thế hệ sau. Cơ sở của sự biến đổi di truyền kháng thuốc ở virus dựa vào hai quá trình sau: đột biến và chọn lọc, trong đó môi trường luôn đóng vai trò quan trọng như là chất cảm ứng gây đột biến cũng như yếu tố chọn lọc [20]. VRVGB kháng thuốc là có thể xảy ra với tất cả các analogue của nucleotide và một nghiên cứu của Borroto-Esoda và cộng sự đã đánh giá tỉ lệ đột biến đề kháng enzyme phiên mã ngược ở vị trí rtA181V/T và rtN236T ở bệnh nhân viêm gan mạn B có HBeAg(-) sau 5 năm điều trị với ADV gia tăng là: 0%, 3%, 11%, 18% và 29% sau 1, 2, 3, 4, và 5 năm điều trị. Trong khi tỉ lệ tích lũy đột biến gen của ADV kèm với bùng phát của virus (> 1log copies /mL) là 16% và tần suất tích lũy đề kháng về mặt gen cộng với virus và hay là tăng men ALT là 11%. Bệnh nhân đề kháng với ADV đã được phối hợp với LAM thì đạt được sự giảm nồng độ HBV-DNA 2-6log copies/ml [35]. Hai đột biến chính dẫn đến việc kháng ADV là A181T/V và N236T/N236D. Thêm vào đó là những đột biến nằm trên vùng chức năng (domain) A là rtV84M, rtS85A và các đột biến khác nằm giữa 2 vùng chức năng C và D, là rtV214A và rtQ215S. Tương tự tính kháng LAM, đột biến A181T/V nằm ở vị trí gần liên kết triphosphate. Theo lý thuyết, đột biến này ảnh hưởng trên vị trí liên kết triphosphate gây cản trở về mặt không gian làm cho đột biến kháng ADV [35]. Hình 1.9: Ảnh hưởng của liên kết triphosphate và sự biến đổi vị trí của liên kết Mg2+ A HBV polymerase B Domain C Domain D Domain A A - Dạng hoang dại; B - Dạng đột biến rtN236T. Những đột biến kháng ADV là một pha trộn tính kháng cục bộ với TDF. Dữ liệu về việc điều trị cho bệnh nhân với HBV kháng ADV còn hạn chế. Những trường hợp báo cáo đã đề nghị rằng LAM có hiệu quả trong việc ngăn chặn sự nhiễm HBV trong mẫu huyết thanh ở bệnh nhân có tính kháng ADV. Tuy nhiên, ở những bệnh nhân có tính kháng LAM trước thì vẫn chưa biết được. TDF (300mg/ngày) được báo cáo rằng có kết quả trong việc làm giảm nồng độ HBV DNA trong huyết thanh ở những bệnh nhân có HBV kháng ADV, nguyên nhân có thể là do liều lượng cao khi sử dụng ADV cho bệnh nhân trong quá trình điều trị (10mg/ngày). Tuy nhiên hiệu quả của TDF trong trường hợp này có giới hạn. Hiệu quả của ETV ở những bệnh nhân với tính kháng ADV được thích nghi, tuy nhiên cũng có giới hạn. Giới hạn cơ bản ở hồ sơ bệnh án, tiếp cận tốt nhất để điều trị những bệnh nhân với tính kháng ADV là thêm vào LAM, L-dT hay ETV. ETV có lẽ là lựa chọn tốt hơn cho bệnh nhân khi có tính kháng LAM và những bệnh nhân với đột biến rtA181V/T [35]. 1.3.4 Ý nghĩa của việc phát hiện các đột biến kháng thuốc Việc phát hiện sớm chính xác các đột biến rtA181V/T và rtN236T kháng ADV trong thời gian điều trị cho những người mang HBV mạn tính bằng kỹ thuật real-time PCR sử dụng TaqMan probe với độ đặc hiệu cao, đơn giản, hiệu quả, chi phí thấp sẽ có ý nghĩa trong công tác theo dõi và điều trị bệnh. Đột biến được phát hiện sớm đối với những bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính chưa được điều trị giúp các bác sĩ định hướng cho phác đồ điều trị khác có hiệu quả hơn, nhờ đó giảm đáng kể chi phí nếu bệnh nhân điều trị trong thời gian lâu dài mà không có hiệu quả và còn chịu ảnh hưởng nặng nề do tác dụng phụ của thuốc gây ra. CHƯƠNG 2 – VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Vật liệu sinh học 2.1.1.1 Mẫu HBV DNA dùng làm mẫu chứng * Mẫu chứng dương (Amplicon) Xây dựng amplicon làm mẫu chứng dương mang các đột biến rtA181V/T và rtN236T kháng ADV trên vùng RT của HBV polymerase, được tổng hợp bởi IDT (Hoa Kỳ). * Mẫu HBV hoang dại Là mẫu không chứa các đột biến kháng ADV tại các vị trí rt181 và rt236 được xác định bằng phương pháp giải trình tự. 2.1.1.2 Mồi và mẫu dò Trình tự và vị trí các oligonucleotide thiết kế và tổng hợp bởi IDT (Hoa Kỳ). Bảng 2.1: Trình tự và vị trí các mồi và probe sử dụng trong đề tài Tên Trình tự 5’→3’ Vị trí nt F181 TATTCCCATCCCATCATCYTGGGCT 601 - 625 R181-1 CACTGAAATGGCACTAGTAAACTGAA* 699 - 671 R181-2 CACTGAAATGGCACTAGTAAACTGAGT** 699 - 670 P181 FAM-AGAAACGGACTGAGGCCCACTCCCA-TAMRA 641 – 665 F236 TGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGT 724 - 751 R236 CCCCAWCKTTTKGTTTTRTKAGGGG*** 680 - 836 P236 FAM-TGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGT-TAMRA 754 - 783 Ghi chú: * Vị trí bắt cặp nucleotide dạng đột biến tại codon rt181 nằm trên đầu 3’ của mồi ngược R181-1. ** Vị trí bắt cặp nucleotide dạng đột biến tại codon rt181 nằm trên đầu 3’ của mồi ngược R181-2. *** Vị trí bắt cặp nucleotide dạng đột biến tại codon rt181 nằm trên đầu 3’ của mồi ngược R236. 2.1.1.3 Mẫu bệnh phẩm Bao gồm các mẫu bệnh phẩm dương tính với HBV được thu nhận từ các phòng khám và xét nghiệm y khoa thuộc các tỉnh miền Trung trở vào và các phòng khám dịch vụ ở thành phố Hồ Chí Minh. 2.1.2 Dụng cụ và thiết bị Bao gồm dụng cụ và thiết bị của một phòng xét nghiệm vi sinh cơ bản: - Pipetman 1000μl, 200μl, 100μl, 10μl và các đầu tip tương ứng; - Eppendorf 0,2ml và eppendorf 1,5ml; - Máy ly tâm siêu tốc và máy ly tâm lạnh (tốc độ 13000 vòng/phút); - Máy luân nhiệt (máy real-time PCR); - Máy vortex, máy ủ nhiệt khô, tủ lạnh, tủ kính vô trùng; - Máy tính có phần mềm kết nối với máy real-time PCR. 2.1.3 Hóa chất sử dụng 2.1.3.1 Hóa chất tách chiết HBV DNA (MERCK) Hóa chất sử dụng tách chiết HBV DNA bằng phương pháp tủa (Chomczynski & Sacchi, 1987) bao gồm: - Dung dịch 1: Dung dịch Trizol, gồm có: + Phenol 38%; + Guanidium thyocianate 0,8%; + Glycerol 5%; + Điều chỉnh pH = 8. - Dung dịch 2: Cloroform. - Dung dịch 3: Isopropanol tuyệt đối có bổ sung chất trợ tủa. - Dung dịch 4: Ethanol 70%. - Dung dịch 5: Dung dịch TE 1X (Tris 0,1M – EDTA 0,001M). 2.1.3.2 Hóa chất sử dụng trong phản ứng real-time PCR (QIAGEN) - Đệm TE 1X: 10 mM Tris – HCl (pH 8,0), 1mM EDTA vô trùng; - Nucleotide các loại: dATP, dGTP, dCTP, dTTP; - Taq DNA polymerase; - Dung dịch MgCl2. 2.2 Nội dung nghiên cứu - Thiết kế các cặp primer và TaqMan probe đặc hiệu với các vị trí đột biến kháng ADV của HBV bằng phần mềm chuyên dụng và các công cụ trên NCBI và IDT. - Tối ưu hóa các điều kiện của phản ứng real-time PCR, tiến hành khảo sát các thông số sau: khả năng nhân bản của hệ primer-probe, nhiệt độ lai, nồng độ primer và probe, nồng độ Mg2+, độ nhạy của phản ứng, độ đặc hiệu của hệ primer và probe. - Thiết lập quy trình phản ứng phát hiện đột biến rtA181V/T và rtN236T kháng ADV của HBV bằng kỹ thuật real-time PCR. - Tiến hành chạy trên một số mẫu bệnh phẩm. 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp thiết kế và kiểm tra các oligonucleotide (mồi và mẫu dò) bằng cơ sở dữ liệu trên IDT và các phần mềm sinh học chuyên dụng như ClustalX và Annhyb 2.3.1.1 Các bước tiến hành Vì đột biến kháng ADV nằm trên vùng RT của gen HBV polymerase, do vậy, chúng tôi thu thập tất cả các trình tự về vùng gen HBV Polymerase đã được xác định cho đến nay từ ngân hàng dữ liệu gen NCBI (National Center for Biology Information). Sau đó, chúng tôi tiến hành so hàng (alignment) trên tất cả các trình tự tải về bằng phần mềm ClustalX. Dựa trên sự so hàng và kết quả công bố của các bài báo trước đó, chúng tôi chọn các vùng gen để thiết kế các cặp mồi (primer) và mẫu dò (probe) tương ứng với các đột biến kháng ADV tại hai vị trí là rt181 và rt236. Đặc tính của các oligonucleotide thiết kế được kiểm tra và chỉnh sửa để phù hợp với tiêu chuẩn (%GC, Tm…) bằng phần mềm trực tuyến OligoAnalyzer (IDT) và Annhyb. Sau khi đã thiết kế được các cặp mồi và mẫu dò có các thông số phù hợp, tôi tiến hành Blast search với các trình tự DNA có trên Ngân hàng dữ liệu gen của NCBI để xác định các trình tự mồi và mẫu đã thiết kế là đặc hiệu cao với DNA đích của HBV. 2.3.1.2 Các nguyên tắc thiết kế các oligonucleotide * Nguyên tắc thiết kế mồi [10,17,21] - Chúng tôi thiết kế các mồi ngược bắt cặp đặc hiệu với các vị trí đột biến, mồi xuôi bắt cặp hoàn toàn với cả bản mẫu hoang dại và đột biến. - Mồi thường dài từ 15-30 nucleotide. Hàm lượng GC cho phép khoảng 20-80% (tốt nhất là 50- 60%). Nucleotide G và C phải được phân bố đều khắp trình tự thiết kế. Thiết kế mồi sao cho base G và C nằm ở hai đầu của mồi. Tránh trường hợp đầu 3’ của mồi có nhiều hơn 3 nucleotide G hoặc C, vì mồi không đặc hiệu có thể được tạo ra. - Nhiệt độ nóng chảy của các mồi xuôi và ngược chênh nhau không quá 50C, và kiểm soát nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các mồi nằm trong khoảng 50-65 0C. - Mồi không được tự bắt cặp bổ sung hoặc bắt cặp bổ sung với mồi khác trong hỗn hợp phản ứng tạo thành các cấu trúc thứ cấp như:  Self-dimer: Cấu trúc được hình thành do sự bắt cặp bổ sung giữa các base của các mồi giống nhau.  Hairpin loop (Cấu trúc kẹp tóc): Cấu trúc được hình thành do sự bắt cặp bổ sung giữa các base trong cùng một mồi, đặc biệt nên tránh cấu trúc kẹp tóc chìm sâu ở đầu 3’ của mồi.  Hetero-dimer: Cấu trúc được hình thành do sự bắt cặp bổ sung giữa các base của oligonucleotide khác nhau. - Năng lượng tự do (∆G) giữa các cấu trúc thứ cấp không vượt quá -9kcal.mol-1. * Nguyên tắc thiết kế mẫu dò [17,21] Nguyên tắc thiết kế mẫu dò cũng tương tự như nguyên tắc thiết kế mồi: - Mẫu dò bắt cặp đặc hiệu với cả bản mẫu hoang dại và đột biến, nằm giữa hai mồi xuôi và ngược. - Thành phần GC trong trình tự nucleotide của mẫu dò phải nằm trong khoảng 30-80%. - Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mẫu dò phải lớn hơn nhiệt độ nóng chảy của các mồi từ 5-10 0C nhằm đảm bảo cho việc bắt cặp hoàn toàn với sợi DNA khuôn trong bước bắt cặp và kéo dài của chu kỳ PCR. - Không nên có G ở đầu 5’ của mẫu dò vì G có thể hấp thu ánh sáng huỳnh quang ngay cả khi mẫu DNA bị phân giải bởi Taq polymerase. 2.3.1.3 Các phần mềm máy tính sử dụng - ClustalX 1,83; - Annhyb 4,930 (Olivier Friard, Hoa Kỳ); - Phần mềm trực tuyến BLAST (NCBI, Hoa Kỳ); - Phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer 3,0 (IDT, Hoa Kỳ); - Phần mềm trực tuyến thiết kế primer: 2.3.2 Phương pháp thu nhận và xử lý mẫu bệnh phẩm - Lấy 3ml máu từ bệnh nhân cho vào ống nghiệm thu máu chuyên dụng. - Ly tâm ống nghiệm chứa máu 3000 vòng/phút trong 15 phút. - Thu khoảng 0,5ml huyết thanh chuyển vào 1 eppendorf 1,5ml sạch. - Giữ eppendorf huyết thanh ở -200C cho đến khi tiến hành xét nghiệm. 2.3.3 Phương pháp tách chiết HBV DNA Để tách chiết HBV DNA, chúng tôi sử dụng phương pháp tủa (Chomczynski & Sacchi, 1987). 2.3.3.1 Nguyên tắc Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là dùng các tác nhân biến tính mạnh để phá vỡ vỏ bao của virus và loại bỏ các thành phần không mong muốn (protein…). Để thu nhận DNA tinh sạch, ta cần loại bỏ những thành phần tạp nhiễm, mà quan trọng nhất là protein. DNA sẽ được tủa bởi isopropanol ở điều kiện lạnh và thu lại qua các lần ly tâm. Sau đó, cặn DNA được huyền phù trong TE 1X và bảo quản ở -20oC. 2.3.3.2 Cách tiến hành - Đánh dấu các tube vô trùng bằng ký hiệu mẫu. - Cho 200μl mẫu (huyết thanh) vào 1 tube vô trùng có sẵn 900μl dung dịch 1, vortex 30 giây, để yên 10 phút. Thêm vào 200μl dung dịch 2, trộn đều, để yên 10 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. - Thu 600μl dịch nổi có chứa DNA (chú ý chỉ thu dịch nổi) vào 1 tube vô trùng khác có sẵn 600μl dung dịch 3 (trộn đều trước khi sử dụng). Sau đó, trộn đều, để yên 10 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. - Loại bỏ dịch nổi, thu cặn màu xanh (tránh loại bỏ phần cặn). Cho từ từ 900μl dung dịch 4 vào. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút. - Loại bỏ hết dịch nổi (dùng pipet 200μl hút sạch phần dịch nổi), thu cặn (tránh loại bỏ luôn phần cặn). Để khô ở 600C trong 10-15 phút. Cho vào 50μl dung dịch 5. - Bảo quản mẫu DNA ở -200C. 2.3.4 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction – Phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase) do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Thực chất đây là một phương pháp tạo dòng in vitro (không cần sự hiện diện của tế bào) tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, nhờ hoạt động của DNA polymerase và một cặp mồi đặc hiệu. Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho loài vi sinh vật mục tiêu. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn. Nhờ hoạt động của DNA polymerase, đoạn mồi này được nối dài để hình thành mạch mới có trình tự bổ sung ngược chiều với mạch khuôn. Nếu có hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung ở hai đầu của một trình tự DNA, ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase trong phản ứng PCR, số lượng bản sao của đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được nhân lên (khuếch đại) đến mức có thể thấy được vạch DNA sau khi nhuộm bằng ethidium bromide. Vậy để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo cặp mồi chuyên biệt. Cặp mồi này gồm một mồi xuôi (sense primer) và một mồi ngược (antisense primer) so với chiều phiên mã của gen [5]. Phản ứng PCR nhân bản sao DNA là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn: Hình 2.1: Nguyên tắc của phương pháp PCR  Giai đoạn biến tính (Denaturation): ở nhiệt độ cao 90 – 950C (cao hơn Tm của DNA khuôn) trong vòng 30 giây đến 1 phút. Mục đích: Làm đứt các liên kiết hydro của phân tử DNA. DNA tách mạch, từ mạch đôi thành mạch đơn.  Giai đoạn gắn mồi (Annealing): Nhiệt độ khoảng 45 – 700C (thấp hơn Tm của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn). Giai đoạn này khoảng 30 giây đến 1 phút.  Giai đoạn tổng hợp (Elongation): Nhiệt độ 70 – 720C thích hợp cho điều kiện hoạt động của enzyme DNA polymerase chịu nhiệt. Mạch mới được hình thành từ mồi được nối dài theo chiều 5’- 3’, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Chu kỳ gồm ba giai đoạn như trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần và mỗi lần lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân [5,11,12,13,15]. 2.3.5 Phương pháp real-time PCR Trong phản ứng PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại được phát hiện qua phân tích điểm kết thúc, bằng cách điện di trên gel agarose. Ngược lại, real-time PCR cho phép phát hiện và định lượng sự tích lũy DNA khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra, đó là ý nghĩa của cụm từ “real-time”. Real- time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: khuếch đại DNA bằng PCR và đo độ phát quang tỷ lệ thuận với số lượng phân đoạn DNA tạo thành [17]. Khả năng này được thực hiện nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang. Những hóa chất phát huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA và những trình tự gắn huỳnh quang liên kết đặc hiệu với primer gọi là probe. Hệ thống real-time PCR bao gồm máy luân nhiệt (PCR) được nối với máy phát hiện quang phổ huỳnh quang và máy vi tính. Nguyên lý chủ yếu của real-time PCR là dựa trên cơ sở phát hiện và định lượng thể thông báo huỳnh quang [17]. Ưu điểm chính của real-time PCR so với PCR truyền thống là nó cho phép xác định số lượng bản sao khuôn mẫu ban đầu với sự chính xác và độ nhạy cao trong một phạm vi biến thiên rộng. Kết quả real-time PCR có thể là kết quả định tính (hiện diện hay vắng mặt một trình tự DNA) hay định lượng (số lượng bản sao DNA). Real-time PCR sử dụng để định lượng được gọi là PCR định lượng. Ngược lại, PCR truyền thống chỉ được xem là bán định lượng. Thêm vào đó, dữ liệu real-time PCR có thể được đánh giá mà không cần phải điện di trên gel, giúp tiết kiệm thời gian và gia tăng số lượng thí nghiệm thực hiện. Đồng thời, việc tiến hành phản ứng và đánh giá dữ liệu trong một hệ thống đóng kín giúp làm giảm nguy cơ ngoại nhiễm và loại bỏ những thao tác sau phản ứng khuếch đại. Hình 2.2: Nguyên tắc real-time PCR sử dụng TaqMan probe 2.3.6 Phương pháp tối ưu hóa phản ứng real-time PCR [17,21] Phản ứng real-time PCR thường chịu nhiều ảnh hưởng của các thành phần và điều kiện phản ứng. Trong phần thực nghiệm này, chúng tôi kiểm chứng một số điều kiện tối ưu trong phản ứng real-time PCR như: khả năng nhân bản của hệ primer-probe, nhiệt độ lai của phản ứng, nồng độ mồi, mẫu dò và nồng độ ion Mg2+, độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng. Sau một số chu kỳ nhất định, các thành phần trong phản ứng bị phân hủy hay bị cạn kiệt, các sản phẩm phụ hình thành gây ức chế phản ứng và các bản sao vừa được tổng hợp không bắt cặp với mồi mà tự bắt cặp với nhau, làm cho hiệu quả khuếch đại giảm. Vì vậy, để thu được kết quả cao cần thực hiện phản ứng không quá 40 chu kỳ. Để đảm bảo tính ổn định về nhiệt độ giữa các lần khảo sát nên sử dụng cùng một loại thiết bị và dụng cụ. Đồng thời, để tránh các trường hợp ngoại nhiễm, cần sử dụng tất cả dụng cụ mới cho phản ứng. 2.3.6.1 Khảo sát khả năng nhân bản của hệ mồi, mẫu dò Trong phương pháp real-time PCR, mồi và mẫu dò và yếu tố quyết định tính đặc hiệu của phản ứng. Khả năng bắt cặp của mồi, mẫu dò với DNA bản mẫu là hết sức quan trọng. Nó quyết định sự thành công hay thất bại của toàn bộ quy trình từ khâu thiết kế cho đến các kết quả trong thực nghiệm. Nếu mồi và mẫu dò hoạt động tốt thì khi khảo sát sẽ cho kết quả dương tính với mẫu chứa amplicon 1 - Biến tính 3 - Kéo dài 2 - Bắt cặp đột biến và cho kết quả âm tính với mẫu chứa codon hoang dại. Nếu mồi và mẫu dò không hoạt động tốt hoặc không cho ra kết quả thì không đạt yêu cầu và phải thiết kế lại [17]. Tiến hành khảo sát khả năng nhân bản của hệ primer và probe trên hai chủng đối chứng với đầy đủ các thành phần của một phản ứng real-time ở thể tích 25μl. 2.3.6.2 Khảo sát nhiệt độ lai của phản ứng Nhiệt độ lai (nhiệt độ bắt cặp) của phản ứng phụ thuộc trực tiếp vào độ dài và thành phần của các oligonucleotide. Nên sử dụng nhiệt độ bắt cặp Ta (annealing temperature) thấp hơn 5 0C so với nhiệt độ nóng chảy Tm của cặp mồi sử dụng. Nếu tạo ra sản phẩm không đặc hiệu, nhiệt độ bắt cặp phải được tối ưu bằng cách tăng từng bước từ 1-20C. Khi nhiệt độ bắt cặp Ta quá thấp, các mồi có thể bắt cặp với các trình tự đích khác do những base đơn bắt cặp nhầm có thể xảy ra. Điều này rất tốt với mục đích khuếch đại các trình tự tương tự hay họ hàng. Tuy nhiên, nó có thể dẫn tới khuếch đại không đặc hiệu và giảm hiệu suất sản phẩm mong muốn nếu base đầu 3’ của mồi bắt cặp với trình tự đích. Nếu giá trị Ta quá cao, rất ít sản phẩm được tổng hợp do sự bắt cạp của mồi bị giảm. Thời gian bắt cặp không lâu, hầu hết trong 30 giây hoặc ít hơn [17]. Do vậy, nhiệt độ lai tối ưu của phản ứng sẽ khắc phục được các sai sót trên và cho hiệu quả khuếch đại tối đa. Tiến hành khảo sát nhiệt độ lai theo dãy Gradient nồng độ sau: 70,0; 69,5; 68,3; 66,4; 63,9; 62,1; 60,8; 60,00C trên máy BIORAD. 2.3.6.3 Khảo sát nồng độ mồi của phản ứng Mồi là yếu tố quan trọng quyết định độ đặc hiệu và ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng. Việc thiết kế mồi đặc hiệu và sử dụng nồng độ mồi thích hợp sẽ dẫn đến phản ứng có sản phẩm hay không. Nồng độ mồi quá cao có thể cho kết quả không đặc hiệu và tạo ra cấu trúc nhị phân mồi. Nồng độ mồi quá thấp sẽ ảnh hưởng đến kết quả phản ứng, trừ khi mồi có độ suy biến cao [17]. Khi tiến hành khảo sát nồng độ mồi, chúng tôi thực hiện các phản ứng real-time PCR ở cùng một điều kiện với nhiệt độ lai là nhiệt độ lai tối ưu đã khảo sát ở trên. Thành phần các chất trong phản ứng cũng giống nhau, chỉ có một sự khác biệt giữa các phản ứng là nồng độ mồi có trong phản ứng. Trong nội dung đề tài này, để tìm nồng độ mồi tối ưu, chúng tôi khảo sát nồng độ mồi theo dãy nồng độ sau: 100, 200, 300, 400, 500nM trong một thể tích phản ứng. 2.3.6.4 Khảo sát nồng độ probe của phản ứng Mẫu dò (probe) phải đặc hiệu với trình tự đích và để tạo ra tín hiệu huỳnh quang thì mẫu dò phải nằm giữa hai mồi xuôi và ngược. Trong phản ứng real-time PCR với mẫu dò TaqMan, khuếch đại không đặc hiệu do mồi sai vị trí hoặc do hiện tượng nhị phân mồi cũng không tạo ra tín hiệu [17]. Do vậy, nồng độ probe cũng ảnh hưởng đến sự phát huỳnh quang và đọc tín hiệu sau mỗi chu kỳ của phản ứng. Nồng độ probe quá cao hay quá thấp đều ảnh hưởng xấu đến kết quả phản ứng. Để lựa chọn nồng độ probe tối ưu, chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ probe theo dãy nồng độ sau: 100, 200, 300, 400, 500nM. Thành phần phản ứng đều như nhau, nhiệt độ lai và nồng độ mồi tối ưu đã khảo sát ở trên, chỉ có nồng độ probe là thay đổi. 2.3.6.4 Khảo sát nồng độ Mg2+ của phản ứng Ion Mg2+ cũng là một trong những thành phần ảnh hưởng tới kết quả phản ứng. Ở một nồng độ tối ưu, ion này làm tăng khả năng bắt cặp của mồi vào bản mẫu và hoạt động kéo dài của Taq DNA polymerase, tạo sự kết hợp chặt chẽ giữa các dNTP. Nếu nồng độ Mg2+ quá thấp (< 0,5mM) sẽ làm giảm phản ứng kéo dài mạch DNA do hoạt động của Taq DNA polymerase bị ức chế. Ngược lại, nếu nồng độ Mg2+ quá cao sẽ không cho sản phẩm khuếch đại hoặc cho sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu. Vì vậy để xác định nồng độ Mg2+ tối ưu cho phản ứng, chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ Mg2+ theo dãy nồng độ sau: 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0mM. Trong phản ứng khảo sát nồng độ Mg2+, các chỉ tiêu về nhiệt độ lai tối ưu, nồng độ mồi, probe tối ưu được giữ nguyên, chỉ có nồng độ Mg2+ là thay đổi. 2.3.6.5 Khảo sát độ lặp lại của phản ứng real-time PCR Tính biến động của phản ứng real-time PCR là một yếu tố rất quan trọng, chính điều này có thể làm sai lệch kết quả. Trên cùng một mẫu bệnh phẩm, kết quả thu được có thể khác nhau giữa các lần thí nghiệm, cũng như giữa các phòng thí nghiệm khác nhau. Khả năng gây ra sự khác biệt này có thể là do thao tác của người tiến hành, sự biến động của các thành phần hóa chất trong phản ứng hoặc do sự khác biệt giữa các phương pháp chuẩn bị mẫu, cũng như phương pháp tách chiết HBV DNA… Để đánh giá độ lặp lại của phản ứng real-time PCR, chúng tôi tiến hành khảo sát độ lặp lại trong cùng một lần thí nghiệm (intra-assay) và độ lặp lại giữa các lần thí nghiệm khác nhau (inter-assay). 2.3.6.6 Khảo sát độ nhạy của phản ứng Dung dịch HBV DNA gốc có nồng độ 2.105 copies/ml được pha loãng bậc 10 liên tiếp trước khi tiến hành khảo sát độ nhạy của phản ứng. Chuẩn bị các eppendorf vô trùng chứa 90μl dung dịch TE 1X đã vô trùng. Sử dụng pipetman và đầu tip vô trùng, hút 10μl dung dịch HBV DNA gốc cho vào eppendorf có chứa sẵn 90μl dung dịch TE 1X, đồng nhất mẫu bằng máy vortex và ly tâm ở tốc độ dưới 2000 vòng/phút để được dung dịch có độ pha loãng ở nồng độ 10-1. Tiếp tục thực hiện các thao tác tương tự để được dung dịch HBV DNA có độ pha loãng 10-2, 10-3… Dung dịch HBV DNA sau khi được pha loãng thành nhiều nồng độ bậc 10 liên tiếp được sử dụng để khảo sát độ nhạy. Độ nhạy của phản ứng tương ứng với nồng độ amplicon đột biến thấp nhất cho kết quả dương tính. Hình 2.3: Pha loãng nồng độ HBV DNA theo nhiều nồng độ bậc 10 liên tiếp 2.3.7 Phương pháp khảo sát độ đặc hiệu của hệ mồi, mẫu dò Nhằm xác định khả năng nhân bản chọn lọc của mồi và probe đã thiết kế, đầu tiên chúng tôi tiến hành kiểm tra trên lý thuyết bằng cách sử dụng phần mềm Annhyb để kiểm tra sự bắt cặp của mồi trên genome của một số loài vi sinh vật thường gặp trong huyết thanh như MTB, EBV, HCV,HPV, CMV. Về mặt thực nghiệm, để đảm bảo các cặp mồi và probe được sử dụng trong phản ứng real-time PCR là đặc hiệu cho HBV, các phản ứng real-time PCR giữa các cặp mồi và probe cùng với DNA tách chiết của một số đối tượng vi sinh vật khác sẽ được thiết lập. Hệ primer, probe được xem là đặc hiệu đối với đột biến kháng ADV của HBV sẽ cho kết quả dương tính với mẫu chứng dương và cho kết quả âm tính với mẫu chứng âm và các chủng vi sinh vật khác. CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đánh giá các thông số của các oligonucleotide thiết kế 3.1.1 Trình tự và vị trí của các oligonucleotide Trình tự của các primer và probe phát hiện đột biến rtA181V/T và rtN236T kháng ADV của HBV đã được trình bày trong bảng 3.1 ở chương 3. Vì các đột biến kháng thuốc trong đề tài nghiên cứu thuộc dạng đột biến điểm, do vậy trình tự hoang dại và trình tự đột biến chỉ khác nhau bởi một nucleotide. Để phân biệt sự khác nhau này chúng tôi thiết kế các đoạn mồi ngược bắt cặp hoàn toàn với trình tự đột biến và có một mismatch ở nucleotide thứ nhất tính từ đầu 3’-OH khi bắt cặp với trình tự hoang dại. Các mồi này đi kèm với các mồi xuôi bắt cặp hoàn toàn với cả trình tự hoang dại lẫn trình tự đột biến. Trình tự của mồi F181 và R236 có một số nucleotide thay thế vì tại các vị trí này có thể có hai hay nhiều loại nucleotide chiếm tỷ lệ tương đương nhau. Các mồi này còn gọi là các mồi suy biến, vì có nhiều lựa chọn khác nhau ở một số vị trí base trên trình tự. Mồi F181 chỉ có một vị trí sử dụng nucleotide thay thế và nó không nằm trong số 5 nucleotide ở mỗi đầu của mồi nên không ảnh hưởng đến sự nhân bản và độ đặc hiệu của mồi. Mồi R236 có 5 vị trí sử dụng base thay thế. Nó cho một hỗn hợp 256 oligonucleotide khác nhau. Nếu làm như thế thì rất tốn kém vì giá mồi rất đắt. Mồi suy biến được chứng minh là một công cụ rất hữu hiệu dùng để nhân bản hầu hết các gen của cùng một họ tương đồng về cấu trúc [17]. Căn cứ vào sơ đồ vị trí các oligonucleotide thiết kế, chúng tôi thiết lập 3 phản ứng real-time PCR riêng biệt: phản ứng 1, 2, 3 lần lượt phát hiện đột biến rtA181V, rtA181T và rtN236T kháng ADV của HBV. Phản ứng 1 và 2 chỉ khác nhau ở mồi ngược do khác nhau ở các nucleotide đột biến. Hình 3.1: Sơ đồ vị trí các primer và probe thiết kế (1): Hệ mồi, probe phát hiện đột biến tại rt181 trong phản ứng 1 và 2; (2): Hệ mồi, probe phát hiện đột biến tại rt236 trong phản ứng 3. Sau đó, chúng tôi sử dụng phần mềm Annhyb để kiểm tra lại trình tự và vị trí của các oligonucleotide thiết kế có đúng với mục đích của đề tài hay không. Dựa vào hình 3.2, cặp mồi và probe trong phản ứng 1 hoàn toàn đặc hiệu với HBV và cho phép khuếch đại đoạn trình tự có độ dài 99bp, sử dụng chất phát huỳnh quang FAM. Hình 3.2: Kết quả kiểm tra hệ primer và probe của phản ứng 1 bằng phần mềm Annhyb Hình 3.3: Kết quả kiểm tra hệ primer và probe của phản ứng 2 bằng phần mềm Annhyb Hình 3.3 cho thấy cặp mồi F181, R181-2 và probe P181 hoàn toàn đặc hiệu với HBV và cho phép khuếch đại đoạn trình tự có độ dài 99bp. Hình 3.4: Kết quả kiểm tra hệ mồi, probe của phản ứng 3 bằng phần mềm Annhyb Căn cứ vào kết quả Annhyb ở hình 3.4, cặp mồi F236, R236 và probe P236 khuếch đại đoạn trình tự có độ dài 136 bp. 3.1.2 Đặc tính của các oligonucleotide Tính chất vật lý của các oligonucleotide được thiết kế và kiểm tra bằng phần mềm OligoAnalysis trên IDT (Hoa Kỳ) về các thông số như chiều dài, thành phần %GC, nhiệt độ nóng chảy (Tm), cấu trúc kẹp tóc, cấu trúc tự thân giữa các oligonucleotide giống nhau được tổng hợp ở bảng 2.1.  Qua bảng 2.1, chúng tôi nhận thấy:  Kích thước và tỷ lệ các base trong các primer và probe đều phù hợp với tiêu chuẩn thiết kế.  Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các mồi chênh lệch nhau không quá 2 0C; nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các mồi và probe chênh lệch nhau từ 5-80C hoàn toàn phù hợp với tiêu chuẩn.  Về thành phần GC: nằm trong khoảng tỷ lệ tốt nhất 40-60%.  Năng lượng tự do (∆G) của các cấu trúc thứ cấp như cấu trúc kẹp tóc (Hairpin), cấu trúc self- dimer và cấu trúc hetero-dimer càng lớn hơn -9 kcal.mol-1 thì các cấu trúc đó càng kém bền vững và không ảnh hưởng đến phản ứng. Trong bảng trên, ta thấy ∆G trong cấu trúc self-dimer của probe có một dạng có ∆G = -9,20kcal.mol-1. Vì nó không quá nhỏ so với -9kcal.mol-1 nên có thể chấp nhận được và chúng ta có thể tăng nhiệt độ bắt cặp của phản ứng để khắc phục. Bảng 3.1: Một số đặc tính của các oligonucleotide Tên Số base % GC Tm ( 0C) Năng lượng tự do (∆G, kcal.mol-1) Hairpin Self-dimer F181 25 50,0 60,7 > - 2,77 > - 8,09 R181-1 26 39,7 58,3 - 0,07 > - 8,16 R181-2 27 41,7 59,6 - 0,07 > - 8,16 P181 25 60,0 65,6 - 1,23 > - 9,20 F236 28 39,3 58,1 > 0,71 > - 3,91 R236 25 48,0 58,5 - 1,61 > - 9,36 P236 30 50,0 64,2 > - 1,93 > - 9,28 Ghi chú: - Tm : Nhiệt độ nóng chảy (nhiệt độ biến tính); - ∆G: Chỉ số xác định độ bền của một cấu trúc bậc hai.  Kết quả kiểm tra cấu trúc thứ cấp của các oligonucleotide khác nhau trong một phản ứng được thể hiện trong bảng 3.2 và 3.3. Trong bảng 3.2, chỉ có một cấu trúc hetero-dimer của mồi xuôi F181 và probe Pro181 có ∆G = - 11,23 kcal.mol-1; và chúng ta có thể khắc phục được bằng cách tăng nhiệt độ bắt cặp của phản ứng. Vì sẽ thiết lập hai phản ứng real-time PCR riêng biệt để phát hiện 2 đột biến tại rt181 nên chúng tôi không kiểm tra cấu trúc hetero-dimer của 2 mồi ngược là R181-1 và R181-2. Bảng 3.2: Năng lượng tự do (∆G, kcal.mol-1) của các cấu trúc Hetero-dimer trong phản ứng 1 và 2 F181 R181-1 R181-2 P181 F181 --- > - 6,5 > - 6,5 > - 11,23 R181-1 > - 6,5 --- --- > - 6,21 R181-2 > - 6,5 --- --- > - 6,21 P181 > - 11,23 > - 6,21 > - 6,21 --- Bảng 3.3: Năng lượng tự do (∆G, kcal.mol-1) của cấu trúc Hetero-dimer ở phản ứng 3 F236 R236 P236 F236 --- > - 6,5 > - 8,16 R236 > - 6,5 --- > - 11,16 P236 > - 8,16 > - 11,16 --- Qua kết quả trong bảng 3.3, cấu trúc Hetero-dimer của mồi ngược R236 với P236 có ∆G = -11,16 kcal.mol-1, là thấp so với tiêu chuẩn, nhưng cũng không cách biệt quá xa. Để khắc phục, chúng ta sẽ tăng nhiệt độ bắt cặp của phản ứng (Ta) lên cao so với Tm của chúng để tăng năng lượng phá vỡ liên kết. 3.1.3 Khả năng bắt cặp đặc hiệu của primer, probe theo lý thuyết Để xác định khả năng bắt cặp đặc hiệu của các primer, probe thiết kế ở trên, chúng tôi thực hiện ClustalX với 123 trình tự gen của HBV từ NCBI. Đồng thời, chúng tôi kiểm tra độ đặc hiệu của các oligonucleotide bằng công cụ Blast trên NCBI. 3.1.3.1 Khả năng bắt cặp đặc hiệu của mồi xuôi F181 Vì mồi xuôi F181 bắt cặp với sợi (-) nên không cần reverse mồi trước khi so hàng và blast trên NCBI. Hình 3.5: Mức độ bắt cặp của mồi xuôi F181 đối với vùng RT của gen HBV polymerase của HBV (sử dụng phần mềm CluxtalX 1.83) Hình 3.6: Khả năng đặc hiệu của primer F181 đối với vùng RT của gen HBV polymerase của HBV bằng công cụ Blast (NCBI) Dựa vào kết quả ClustalX ở hình 3.5, chúng tôi thấy có 1 vị trí không bảo tồn, vì có 2 loại nucleotide nên chúng tôi sử dụng nucleotide Y để thay thế như đã trình bày ở trên và điều này không ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng. Căn cứ vào hình 3.6, khả năng đặc hiệu của F181 đối với HBV rất cao vì các chỉ số Query coverage và Max ident lần lượt là 100% và 95%. 3.1.3.2 Khả năng bắt cặp đặc hiệu của mồi ngược R181-1 Mồi ngược R181-1 bắt cặp với sợi (+) nên chúng tôi tiến hành reverse trước khi tiến hành so hàng và blast trên NCBI. Hình 3.7: Mức độ bắt cặp của mồi ngược R181-1 đối với vùng RT của gen HBV polymerase của HBV (sử dụng phần mềm CluxtalX 1.83) Hình 3.8: Khả năng đặc hiệu của mồi ngược R181-1 đối với vùng RT của gen HBV polymerase của HBV bằng công cụ Blast (NCBI) Căn cứ vào kết quả ClustalX mồi ngược R181-1 trong hình 3.7, các nucleotide hoàn toàn tương đồng, duy chỉ có một nucleotide ở đầu 3’ của mồi là không bảo tồn. Vì đây là mồi phát hiện đột biến nên có sự sai khác tại vị trí này giữa các trình tự không chứa đột biến và trình tự đột biến từ ngân hàng dữ liệu gen. Các chỉ số Query coverage và Max ident trong hình 3.8 đều đạt 100% nên mồi ngược R181-1 là hoàn toàn đặc hiệu với HBV. 3.1.3.3 Khả năng bắt cặp đặc hiệu của mồi ngược R181-2 Mồi ngược R181-2 thiết kế nhằm bắt cặp với trình tự mục tiêu trên sợi (+) nên chúng tôi cũng tiến hành reverse trước khi so hàng và blast. Hình 3.9: Mức độ bắt cặp của mồi ngược R181-2 đối với vùng RT của gen HBV polymerase của HBV (sử dụng phần mềm CluxtalX 1.83) Hình 3.10: Khả năng đặc hiệu của mồi ngược R181-2 đối với vùng RT của gen HBV polymerase của HBV bằng công cụ Blast (NCBI) Mồi ngược R181-2 chính là mồi phát hiện đột biến nên nucleotide ở đầu 3’ của mồi không bảo tồn khi so hàng với các trình tự chứa đột biến và không chứa đột biến của HBV được thu thập từ ngân hàng dữ liệu gen. Mồi ngược R181-2 phát hiện đột biến rtA181T tại nt670 trên HBV genom, còn mồi R181-1 phát hiện đột biến rtA181V tại nt671 trên genom nên từ kết quả so hàng trong hình 3.9 trên có một vị trí không bảo tồn do các trình tự thu thập từ NCBI có chứa cả bộ ba hoang dại và 2 bộ ba đột biến tại rt181 trên vùng RT của HBV polymerase. Các chỉ số Query coverage và Max ident đều đạt 100% trong hình 3.10 khi sử dụng công cụ blast trên NCBI. Vậy mồi ngược R181-2 hoàn toàn đặc hiệu với HBV mang đột biến. 3.1.3.4 Khả năng bắt cặp đặc hiệu của mẫu dò P181 Mẫu dò P181 bắt cặp với mạch (+) nên được reverse trước khi so hàng và blast trên NCBI. Hình 3.11: Mức độ bắt cặp của probe Pro181đối với vùng RT của gen HBV polymerase của HBV (sử dụng phần mềm CluxtalX 1.83) Hình 3.12: Khả năng đặc hiệu của probe Pro181 đối với vùng RT của gen HBV polymerase của HBV bằng công cụ Blast (NCBI) Probe P181 hoàn toàn tương đồng với các trình tự gen HBV khi so hàng bằng phần mềm ClustalX ở hình 3.11. Khi so sánh Pro181 với các trình tự trên NCBI thì các chỉ số đều đạt 100% như trong hình 3.12. Do đó, chúng tôi khẳng định probe Pro181 là hoàn toàn đặc hiệu với HBV. 3.1.3.5 Khả năng bắt cặp đặc hiệu của mồi xuôi F236 Mồi xuôi F236 bắt cặp với sợi (-) nên chúng tôi không reverse trước khi so hàng. Qua kết quả ở hình 3.13, mồi xuôi F236 hoàn toàn tương đồng với các trình tự gen HBV thu thập từ NCBI. Kết quả Blast mồi xuôi F236 trên ngân hàng dữ liệu gen NCBI trong hình 3.14, cho thấy độ đặc hiệu của mồi xuôi F236 đối với bộ gen của HBV, các chỉ số Query coverage và Max ident đều đạt 100%. Hình 3.13: Mức độ bắt cặp của mồi xuôi F236 đối với vùng RT của gen HBV polymerase của HBV (sử dụng phần mềm CluxtalX 1.83) Hình 3.14: Khả năng đặc hiệu của mồi xuôi F236 đối với vùng RT của gen HBV polymerase của HBV bằng công cụ Blast (NCBI) 3.1.3.6 Khả năng bắt cặp đặc hiệu của mồi ngược R236 Hình 3.15: Mức độ bắt cặp của mồi ngược R236 đối với vùng RT của gen HBV polymerase của HBV (sử dụng phần mềm CluxtalX 1.83) Mồi ngược R236 bắt cặp với sợi (+) nên được reverse trước khi so hàng và blast trên ngân hàng dữ liệu gen. Mồi ngược R236 có 5 nucleotide thay thế nên khi so hàng trên ClustalX trong hình 3.15 thì có 5 vị trí không bảo tồn, nhưng điều này không hề ảnh hưởng đến khả năng bắt cặp của nó với bộ gen HBV. 3.1.3.7 Khả năng bắt cặp đặc hiệu của mẫu dò P236 Hình 3.16: Mức độ bắt cặp của probe Pro236 với vùng RT của gen HBV polymerase của HBV (sử dụng phần mềm CluxtalX 1.83) Mẫu dò TaqMan P236 hoàn toàn tương đồng với 123 trình tự gen của HBV khi ClustalX trong hình 3.16. Hình 3.17: Khả năng đặc hiệu của probe Pro236 đối với vùng RT của gen HBV polymerase của HBV bằng công cụ Blast (NCBI) Từ kết quả trong hình 3.17, probe P236 hoàn toàn đặc hiệu với HBV khi blast trên NCBI với các chỉ số Query coverage và Max ident là 100%. 3.2 Khảo sát khả năng bắt cặp của hệ mồi - probe Trong phản ứng real-time PCR, khả năng bắt cặp đặc hiệu của mồi và probe là yếu tố quan trọng quyết định sự thành công hay thất bại của thí nghiệm. Chúng tôi tiến hành khảo sát trên cùng điều kiện nhiệt độ trên máy BioRad: Chu kỳ 1, 950C trong 13 phút 30 giây, lặp lại 1 lần. Chu kỳ 2, 950C trong 15 giây, 640C trong 1 phút, lặp lại 40 lần. Từ kết quả ở hình 3.18 và bảng 3.4, ta thấy chủng hoang dại cũng cho kết quả dương tính khi khảo sát ở nhiệt độ lại là 640C đối với hệ mồi và probe ở phản ứng 2. Chứng tỏ trong giai đoạn bắt cặp, mặc dù xuất hiện mismatch giữa nucleotide ở đầu 3’ của mồi ngược (R181-2) với bản mẫu hoang dại, nhưng Taq polymerase vẫn kéo dài mạch và gây ra hiện tượng dương tính giả. A B B Hình 3.18: Khả năng bắt cặp của hệ mồi, probe phát hiện đột biến rtA181V/T và rtN236T kháng ADV của HBV A - Phản ứng 1; B - Phản ứng 2; C - Phản ứng 3. Và trên thực tế, trong một số điều kiện phản ứng nhất định, các đoạn mồi với một mismatch ở đầu 3’-OH vẫn có khả năng được kéo dài với một tỷ lệ thấp hơn hoặc bằng với các đoạn mồi bắt cặp hoàn toàn. Hiện tượng kéo dài không đặc hiệu này có thể do hoạt tính 3’-5’ exonuclease của các polymerase, sự tương tác không đặc hiệu về mặt không gian giữa các nucleotide tại vị trí mismatch và mức độ kéo dài của Taq polymerase ở các mồi có mang mismatch trong mỗi chu kỳ PCR vào khoảng 15-50% so với sự nhân bản xảy ra ở các mồi bắt cặp hoàn chỉnh [10]. Nguyên nhân khác có thể là do mẫu chứng không mang đột biến tại rt181 có nồng độ quá cao. Để khắc phục hiện tượng này, chúng tôi tiến hành gia tăng nhiệt độ bắt cặp (Ta) của phản ứng so với Tm của các oligonucleotide thiết kế. Khả năng bắt cặp của hệ primer và probe trong phản ứng 1 và 3 hoàn toàn ổn định, mẫu chứng dương (amplicon) cho kết quả dương tính, còn mẫu chứng âm cho kết quả âm tính. Bảng 3.4: Khả năng bắt cặp của hệ mồi, probe trên hai chủng đối chứng Mẫu (Identifier) Chất phát huỳnh quang Ct (Threshold cycle) VA181-1 (+) FAM 23,4 VA181-1 (-) FAM No Ct VA181-2 (+) FAM 27,6 VA181-2 (-) FAM 35,7 VA236 (+) FAM 24,9 VA236 (-) FAM No Ct C 3.3 Khảo sát nhiệt độ lai của 3 phản ứng Chúng tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ lai của từng phản ứng theo dãy gradient nhiệt độ trên máy BioRad như sau: 60,00C; 60,80C; 62,10C; 63,90C; 66,40C; 68,30C; 69,50C và 70,00C. Nhiệt độ được chọn làm nhiệt độ lai cho phản ứng nếu tại nhiệt độ đó mẫu chứng âm cho kết quả âm tính (chứng tỏ không có khuếch đại ký sinh) và mẫu chứng dương cho kết quả dương tính sau nhiều lần lặp lại thí nghiệm. 3.3.1 Khảo sát nhiệt độ lai của phản ứng 1 Ảnh hưởng của nhiệt độ lai trong phản ứng 1 phát hiện đột biến rtA181V kháng ADV của HBV được thể hiện ở hình 3.19 và bảng 3.5. Hình 3.19: Ảnh hưởng của nhiệt độ lai lên phản ứng 1 A – Trên chủng không mang đột biến; B – Trên amplicon mang đột biến. Bảng 3.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ lai lên phản ứng 1 Mẫu Giếng (Well) Nhiệt độ (0C) Chất phát huỳnh quang Threshold cycle (Ct) Mẫu VA181-1 (-) A02 70,0 FAM No Ct B02 69,5 FAM No Ct C02 68,3 FAM No Ct D02 66,4 FAM No Ct E02 63,9 FAM No Ct F02 62,1 FAM 32,7 G02 60,8 FAM 32,9 H02 60,0 FAM 32,5 Mẫu VA181-1 (+) A04 70,0 FAM No Ct B04 69,5 FAM 31,0 A B D04 C04 68,3 FAM 29,8 D04 66,4 FAM 24,3 E04 63,9 FAM 23,3 F04 62,1 FAM 23,7 G04 60,8 FAM 23,8 H04 60,0 FAM 24,8 Mồi ngược R181-1 được thiết kế để bắt cặp với bản mẫu mang đột biến (amplicon), do vậy trong điều kiện nhiệt độ lai tối ưu thì R181-1 sẽ không bắt cặp với bản mẫu hoang dại và cho kết quả âm tính. Căn cứ vào hình 3.19 và bảng 3.5, chúng tôi nhận thấy khi nhiệt độ lai >63,90C thì chứng âm cho kết quả âm tính, còn chứng dương cho kết quả dương tính từ 60,0-68,30C. Qua nhiều lần khảo sát, chúng tôi xác định tại nhiệt độ 660C mẫu chứng dương cho kết quả dương tính với các tín hiệu rõ đẹp và tại nhiệt độ này chứng âm cho kết quả âm tính. Do vậy, chúng tôi chọn nhiệt độ 660C làm nhiệt độ lại của phản ứng 1. 3.3.2 Khảo sát nhiệt độ lai của phản ứng 2 Kết quả khảo sát nhiệt độ lai của phản ứng 2 được thể hiện trong hình 3.20 và bảng 3.6. Từ kết quả trong hình 3.20 và bảng 3.6, chủng hoang dại cho kết quả âm tính ở nhiệt độ > 63,90C còn chủng đột biến cho kết quả dương tính ở nhiệt độ từ 60,0-69,50C. Hình 3.20: Ảnh hưởng của nhiệt độ lai lên phản ứng 2 A – Trên chủng không mang đột biến; B – Trên amplicon mang đột biến. Vì mục đích thiết kế các phản ứng cùng chạy trên một nhiệt độ như nhau, chúng tôi chọn nhiệt độ 660C để làm nhiệt độ lai cho phản ứng 2 và tại nhiệt độ này sau nhiều lần khảo sát chứng dương đều cho kết quả dương tính với tín hiệu mạnh, rõ đẹp. Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ lai lên phản ứng 2 A B D08 Mẫu Giếng (Well) Nhiệt độ (0C) Chất phát huỳnh quang Threshold cycle (Ct) Mẫu VA181-2 (-) A06 70,0 FAM No Ct B06 69,5 FAM No Ct C06 68,3 FAM No Ct D06 66,4 FAM No Ct E06 63,9 FAM 36,8 F06 62,1 FAM 35,8 G06 60,8 FAM 35,0 H06 60,0 FAM No Ct Mẫu VA181-2 (+) A08 70,0 FAM No Ct B08 69,5 FAM No Ct C08 68,3 FAM 29,9 D08 66,4 FAM 26,7 E08 63,9 FAM 26,2 F08 62,1 FAM 27,6 G08 60,8 FAM 27,4 H08 60,0 FAM 29,2 3.3.3 Khảo sát nhiệt độ lai của phản ứng 3 Kết quả khảo sát nhiệt độ lai của phản ứng 3 được thể hiện trong hình 3.21 và bảng 3.7. Từ kết quả trong hình 3.21 và bảng 3.7, chúng tôi thấy bản mẫu hoang dại hoàn toàn cho kết quả âm tính, còn bản mẫu đột biến cho kết quả dương tính từ nhiệt độ 60,0-69,50C. Do vậy, để đồng nhất nhiệt độ lai của lô thí nghiệm cho thuận tiện khi chạy phản ứng trên máy luân nhiệt, chúng tôi cũng chọn nhiệt độ lai là 660C. Hình 3.21: Ảnh hưởng của nhiệt độ lai lên phản ứng 3 A – Trên chủng không mang đột biến; B – Trên amplicon mang đột biến. Bảng 3.7: Ảnh hưởng của nhiệt độ lai lên phản ứng 3 Mẫu Well (Giếng) Nhiệt độ (0C) Chất phát huỳnh quang Ct (Threshold cycle) Mẫu VA236 (-) A02 70,0 FAM No Ct B02 69,5 FAM No Ct C02 68,3 FAM No Ct D02 66,4 FAM No Ct E02 63,9 FAM No Ct F02 62,1 FAM No Ct G02 60,8 FAM No Ct H02 60,0 FAM No Ct Mẫu VA236 (+) A04 70,0 FAM No Ct B04 69,5 FAM 28,1 C04 68,3 FAM 28,6 D04 66,4 FAM 26.4 E04 63,9 FAM 27,7 F04 62,1 FAM 27,3 D04 B A G04 60,8 FAM 31,1 H04 60,0 FAM 33,2 3.4 Khảo sát nồng độ mồi tối ưu Đối với phản ứng real-time PCR, mồi là yếu tố quyết định tính đặc hiệu của phản ứng. Cặp mồi được thiết kế phải đặc trưng cho đoạn DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên gen. Việc thiết kế mồi đặc hiệu và sử dụng nồng độ mồi thích hợp sẽ ảnh hưởng đến việc có cho sản phẩm khuếch đại hay không. Nếu nồng độ mồi quá cao có thể cho kết quả khuếch đại không đặc hiệu và tạo ra cấu trúc nhị phân mồi. Nồng độ mồi quá thấp cũng ảnh hưởng đến việc phân tích kết quả của phản ứng. Nồng độ mồi thấp trừ khi mồi có độ suy biến cao. Chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ mồi tối ưu của cặp mồi pha trộn trong phản ứng 1, 2, 3 với nồng độ mồi thay đổi theo dãy nồng độ sau: 100; 200; 300; 400; 500nM trong một thể tích phản ứng. Trong thí nghiệm khảo sát nồng độ mồi, chỉ có nồng độ mồi là thay đổi, nhiệt độ lai tối ưu là 660C, còn các thành phần phản ứng cũng không đổi và thêm nước cất cho đủ 25μl. 3.4.1 Khảo sát nồng độ mồi của phản ứng 1 Ảnh hưởng của nồng độ mồi lên phản ứng 1 được thể hiện trong hình 3.22 và bảng 3.8 dưới đây. Hình 3.22: Ảnh hưởng của nồng độ mồi lên phản ứng 1 A - Mẫu không chứa đột biến; B - Mẫu amplicon đột biến rtA181V. Từ kết quả trong hình 3.22 và bảng 3.8, cho thấy mẫu chứng dương đều cho kết quả dương tính ở tất cả các nồng độ mồi khảo sát; còn mẫu chứng âm đều cho kết quả âm tính (không vượt tín hiệu nền), duy chỉ có ở nồng độ mỗi mồi là 500nM cho kết quả dương tính. Nguyên nhân có thể là do nồng độ mồi quá cao dẫn đến bắt cặp không đặc hiệu và gây hiện tượng dương tính giả, nên nồng độ mồi tối ưu sẽ nằm trong khoảng 100-400nM. Sau đó, chúng tôi tiến hành lặp lại phản ứng nhiều lần và kết quả khảo sát luôn ổn định, trong đó tại nồng mỗi mồi là 300nM cho kết quả dương tính với tín hiệu mạnh, đường cong của đồ thị là cao A B 300nM nhất, nên chúng tôi chọn nồng độ 300nM là nồng độ mồi tối ưu của phản ứng 1 làm tiêu chí cho các lần khảo sát tiếp theo. Bảng 3.8: Ảnh hưởng của nồng độ mồi lên phản ứng 1 Mẫu Nồng độ mỗi mồi (nM) Chất phát huỳnh quang Threshold cycle (Ct) Mẫu VA181-1 (-) 500 FAM 36,4 400 FAM No Ct 300 FAM No Ct 200 FAM No Ct 100 FAM No Ct Mẫu VA181 (+) 500 FAM 25,6 400 FAM 24,3 300 FAM 23,0 200 FAM 25,2 100 FAM 24,7 3.4.2 Khảo sát nồng độ mồi của phản ứng 2 Ảnh hưởng nồng độ mồi lên phản ứng 2 được thể hiện trong hình 3.23 và bảng 3.9. Căn cứ vào kết quả trong hình 3.23 và bảng 3.9, mẫu amplicon mang đột biến rtA181T cho kết quả dương tính với tất cả các nồng độ mồi khảo sát, còn mẫu chứng âm không chứa đột biến tại codon 181 đều cho kết quả âm tính. Chúng tôi khảo sát lặp lại nhiều lần và kết luận tại nồng độ mỗi mồi là 300nM cho kết quả dương tính mạnh với đường cong đồ thị vượt tín hiệu nền và cao nhất. Từ đó, chúng tôi chọn nồng độ mỗi mồi là 300nM làm nồng độ tối ưu cho các lần khảo sát tiếp theo. A B 300nM Hình 3.23: Ảnh hưởng của nồng độ mồi lên phản ứng 2 A – Mẫu không chứa đột biến; B – Mẫu amplicon mang đột biến rtA181T. Bảng 3.9: Ảnh hưởng của nồng độ mồi lên phản ứng 2 Mẫu Nồng độ mỗi mồi (nM) Chất phát huỳnh quang Threshold cycle (Ct) Mẫu VA181-2 (-) 500 FAM No Ct 400 FAM No Ct 300 FAM No Ct 200 FAM No Ct 100 FAM No Ct Mẫu VA181-2 (+) 500 FAM 24,3 400 FAM 23,6 300 FAM 24,2 200 FAM 24,