Luận văn Xây dựng qui trình phát hiện escherichia coli trong thực phẩm bằng phương pháp pcr (polymerase chain reaction) và thử nghiệm ứng dụng

BOÄ GIAÙO DU ÏC VAØ ÑAØO TAÏO TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC SÖ PHAÏM THAØNH PHOÁ HOÀ CHÍ M IN H ÑOAØN THÒ NGO ÏC TUYEÀN X AÂY DÖÏN G QUI TRÌNH PHAÙT HIEÄN ESCHERICHIA COLI TRONG THÖÏC PHAÅM BAÈN G PHÖÔNG PHAÙP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION ) VAØ THÖÛ N GHIEÄM ÖÙNG DUÏNG LUAÄN VAÊN THAÏC SÓ SINH HOÏC THAØNH PHOÁ HOÀ CHÍ MINH – NAÊM 2005 Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn LÔØI CAÛM ÔN Em xin chaân thaønh caûm ôn thaày Traàn Linh Thöôùc vaø thaày Nguyeãn Tieán Duõng ñaõ taän tình höôùng daãn em thöïc hieän luaän vaên naøy. Caûm ôn taát caû caùc thaày coâ Khoa Sinh Tröôøng Ñaïi hoïc sö phaïm vaø Tröôøng Ñaïi hoïc Khoa hoïc töï nhieân (Ñaïi hoïc quoác gia Tp Hoà Chí Minh) ñaõ taän taâm giaûng daïy trong suoát thôøi gian em hoïc taäp taïi nhaø tröôøng. Caûm ôn caùc baïn Hueä, Na, Phöôïng, Thanh, AÙnh vaø taát caû caùc baïn cuûa Phoøng thí nghieäm Coâng ngheä Gen - Vi sinh Tröôøng Ñaïi hoïc Khoa hoïc töï nhieân ñaõ taän tình hoã trôï toâi veà maët cô sôû vaät chaát cuõng nhö veà maët kó thuaät. Caûm ôn gia ñình ñaõ hoã trôï vaät chaát vaø ñoäng vieân tinh thaàn cho con trong suoát thôøi gian hoïc taäp xa nhaø. Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn DANH MUÏC CAÙC TÖØ VIEÁT TAÉT AOAC : Assciation of Official Analytical Chemist (Hieäp hoäi caùc nhaø phaân tích nhaø nöôùc) bp : Base pair - caëp base CEN : European Committee for Normalization (Hoäi ñoàng Chaâu AÂu veà chuaån hoùa) dH 2O : Nöôùc caát DNA : Deoxyribonucleic acid d NTP : 3'- Deoxynucleoside - 5' triphosphate ELIS A : Enzyme linked immunosorbent assay (Thöû nghieäm haáp thu mieãn dòch gaén enzyme) FDA : Food and Drug Administration (Cuïc quaûn lyù Thöïc phaåm vaø Döôïc phaåm) FP : False positive (döông tính giaû) FN : False negative (aâm tính giaû) KDa : Kilo Dalton (1000Da, ñôn vò khoái löôïng protein) RA : Relative accuracy (ñoä chính xaùc töông ñoái) RS-P : Relative sensitivity (ñoä nhaïy töông ñoái) RS-N : Relative specificity (ñoä ñaëc hieäu töông ñoái) ISO : International Standards Organisation (Toå chöùc tieâu chuaån quoác teá) Nordval : Nordic Committee on Food Analysis (Hoäi ñoàng phaân tích thöïc phaåm Baéc AÂu) PCR : Polymerase chain reaction (Phaûn öùng chuoãi toång hôïp nhôø polymerase) TAE : Tris acetic acid – EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid) TE : Tris - EDTA Taq : Thermus aquaticus UV : Ultraviolet (tia töû ngoaïi) WHO : World Health Organization Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn ÑAËT VAÁN ÑEÀ Vaán ñeà veä sinh thöïc phaåm luoân được ñaët leân haøng ñaàu trong nhöõng chöông trình phaùt trieån cuûa caùc quoác gia. Trong nhöõng naêm gaàn ñaây, tình hình ngoä ñoäc thöïc phaåm coù xu höôùng gia taêng caû veà soá löôïng laãn qui moâ taùc haïi ở nhieàu nước. Theo thoáng keâ cuûa Toå chöùc Y teá theá giôùi (WHO), coù ñeán hôn 50% caùc vuï ngoä ñoäc thöïc phaåm laø do taùc nhaân vi sinh vaät gaây ra [20]. Hieän nay, xuaát khaåu thöïc phaåm ñang chieám tyû troïng quan troïng trong kinh teá xuaát khaåu cuûa nöôùc ta. Söï hoäi nhaäp kinh teá theo xu höôùng toaøn caàu hoùa coù taùc ñoäng raát lôùn ñeán caùc tieâu chuaån veà chaát löôïng an toaøn veä sinh thöïc phaåm. Vieäc ñaåy maïnh xaây döïng qui trình, caûi tieán caùc trang thieát bò ñöôïc xem laø giaûi phaùp ñoùng vai troø quyeát ñònh, giuùp naâng cao naêng löïc kieåm soaùt chaát löôïng veä sinh an toaøn thöïc phaåm. Veà maët naøy vieäc kieåm tra söï hieän dieän cuûa caùc vi sinh vaät gaây beänh trong thöïc phaåm nhö E. coli, Samonella, Shigella, Virio… coù vai troø raát quan troïng. E. coli ñöôïc xem laø vi sinh vaät chæ thò nhieãm khuaån thöïc phaåm, laø loaøi vi khuaån gaây beänh cô hoäi coù theå gaây vieâm ruoät vaø tieâu chaûy ôû treû nhoû, tieâu chaûy hoäi chöùng lî hay tieâu chaûy hoäi chöùng taû. Ngoaøi ra, E. coli coøn gaây beänh vieâm ñöôøng nieäu, vieâm khuaån baøng quang, thaän, tuyeán tieàn lieät, oáng daãn tröùng... Qui trình kieåm tra E. coli gaây beänh trong thöïc phaåm baèng phöông phaùp truyeàn thoáng thöôøng chaäm, toán thôøi gian (keùo daøi 3 - 4 ngaøy) vaø ñoä nhaïy thaáp. Trong khi ñoù caùc phöông phaùp chaån ñoaùn phaân töû döïa treân kyõ thuaät sinh hoïc phaân töû nhö lai phaân töû, PCR... coù khaû naêng khaéc phuïc ñöôïc caùc nhöôïc ñieåm naøy, ñang ñöôïc quan taâm nghieân cöùu vaø öùng duïng treân theá giôùi. Töø boái caûnh neâu treân, thöïc tieãn saûn xuaát ôû nöôùc ta ñaõ ñaët ra yeâu caàu caàn coù phöông phaùp phaùt hieän nhanh E. coli gaây beänh trong thöïc phaåm, thay theá caùc phöông phaùp truyeàn thoáng, cho pheùp giaùm saùt tính an toaøn vaø giaûm toái ña nguy cô gaây beänh töø nhoùm vi khuaån naøy trong thöïc phaåm. Do vaäy, muïc tieâu cuûa ñeà taøi luaän vaên naøy laø thieát laäp qui trình phaùt hieän E. coli trong thöïc phaåm baèng phöông phaùp PCR (Polymerase Chain Reaction) ñeå thay theá caùc phöông phaùp truyeàn thoáng. Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn PHAÀN I TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU 1. NGOÄ ÑOÄC TH ÖÏC PHAÅM VAØ VI SINH VAÄT GAÂY BEÄNH QUA THÖÏC PHAÅM 1.1. Mo ät soá khaùi nieäm li eân quan Trong lónh vöïc thöïc phaåm hieän nay, coù hai khaùi nieäm ñang ñöôïc söû duïng roäng raõi laø veä sinh thöïc phaåm vaø an toaøn thöïc phaåm vaø moät soá khaùi nieäm quan troïng khaùc caàn ñöôïc phaân bieät. - Veä sinh thöïc phaåm (food hygiene) [7,9] : laø khaùi nieäm ñeå bieåu thò thöïc phaåm khoâng chöùa vi sinh vaät gaây beänh vaø khoâng chöùa ñoäc toá. Khaùi nieäm naøy cuõng bao haøm tình traïng veä sinh trong khi vaän chuyeån, cheá bieán vaø baûo quaûn thöïc phaåm. - An toaøn thöïc phaåm (food safety) [7, 9]: laø khaû naêng khoâng gaây ngoä ñoäc cuûa thöïc phaåm ñoái vôùi con ngöôøi bôûi vi sinh vaät hoaëc bôûi hoùa chaát, caùc yeáu toá vaät lyù. Theo nghóa roäng, khaùi nieäm naøy coøn ñöôïc hieåu laø khaû naêng cung caáp ñaày ñuû vaø kòp thôøi veà soá löôïng vaø chaát löôïng thöïc phaåm khi moät quoác gia gaëp thieân tai hoaëc moät lyù do naøo ñoù. Muïc ñích cuûa an toaøn thöïc phaåm laø vieäc baûo ñaûm ñöôïc thöïc phaåm khoâng bò nhieãm vi sinh vaät gaây beänh, khoâng chöùa ñoäc toá sinh hoïc, ñoäc toá hoaù hoïc vaø caùc yeáu toá khaùc coù haïi cho söùc khoeû ngöôøi tieâu duøng trong caùc quaù trình saûn xuaát, vaän chuyeån, cheá bieán vaø baûo quaûn thöïc phaåm. - Ngoä ñoäc thöïc phaåm [6,17]: duøng ñeå chæ taát caû caùc beänh gaây ra bôûi caùc maàm beänh coù trong thöïc phaåm. Ngoä ñoäc thöïc phaåm ñöôïc chia thaønh 2 nhoùm: + Ngoä ñoäc do chaát ñoäc cuûa vi sinh vaät taïo ra trong nguyeân lieäu hoaëc hoùa chaát töø quaù trình chaên nuoâi, troàng troït baûo quaûn, cheá bieán… Caùc ñoäc chaát naøy ñaõ coù trong thöïc phaåm tröôùc khi ñöôïc tieâu thuï. + Ngoä ñoäc do nhieãm truøng: laø tröôøng hôïp vi khuaån gaây beänh theo thöïc phaåm vaøo cô theå baèng ñöôøng tieâu hoùa vaø taùc ñoäng tôùi cô theå do söï hieän dieän cuûa baûn thaân vi khuaån hoaëc do ñoäc toá cuûa vi khuaån . - Ñoäc toá [7, 8]: laø caùc hôïp chaát hoùa hoïc coù trong nguyeân lieäu, saûn phaåm thöïc phaåm ôû moät haøm löôïng coù theå gaây ngoä ñoäc khi ñöôïc tieâu thuï bôûi ngöôøi hay ñoäng vaät. Ñoäc toá coù theå toàn Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn taïi ôû nhieàu traïng thaùi khaùc nhau vaø ñöôïc taïo ra trong thöïc phaåm baèng nhieàu con ñöôøng khaùc nhau. Ñoäc toá coù nguoàn goác töø vi sinh vaät ñöôïc taïo ra baèng 2 con ñöôøng cô baûn sau: + Teá baøo vi sinh chöùa thaønh phaàn coù ñoäc tính. Vi sinh vaät taêng tröôûng thaønh maät ñoä cao trong thöïc phaåm, khi teá baøo bò cheát ñi, ñoäc toá ñöôïc phoùng thích vaøo thöïc phaåm. Loaïi ñoäc toá naøy ñöôïc goïi laø noäi ñoäc toá (endotoxin). + Teá baøo vi sinh toång hôïp caùc protein coù ñoäc tính ñöôïc tieát ra ngoaøi teá baøo. Loaïi ñoäc toá naøy ñöôïc goïi laø ngoaïi ñoäc toá (exotoxin). Noäi ñoäc toá vaø ngoaïi ñoäc toá khaùc nhau nhieàu veà baûn chaát hoùa hoïc, caùc ñaëc tính hoùa hoïc vaø phöông thöùc hoaït ñoäng. Baûng 1 so saùnh moät soá ñaëc tröng cuûa hai loaïi ñoäc toá naøy. Baûng 1. S o saùnh moät soá ñaëc ñieåm c uûa ngoaïi ñoäc toá vaø noäi ñoäc toá cuûa vi khuaån [7, 2 6] Ngoaïi ñoäc toá (exotoxin) Noäi ñoäc toá (endotoxin) - Do vi khuaån coøn soáng tieát ra - Coù ôû vi khuaån Gram döông vaø Gram aâm - Baûn chaát laø protein - Khoâng beàn vôùi nhieät - Ñoäc löïc cao - Trieäu chöùng beänh ñaëc hieäu, khoâng gaây soát - Do vi khuaån cheát phoùng thích - Coù ôû vi khuaån Gram aâm, ít ôû vi khuaån Gram döông - Baûn chaát laø lipopolysaccharide - Töông ñoái beàn vôùi nhieät - Töông ñoái ít ñoäc - Trieäu chöùng beänh khoâng ñaëc hieäu, hay gaây soát, choaùng. 1.2. Nhöõng vi sinh vaät gaây beänh tr ong thöïc phaåm thöôøng gaëp - Coliform [10]: Coliform vaø Feacal coliform (coliform phaân) laø nhoùm caùc vi sinh vaät duøng ñeå chæ thò khaû naêng coù söï hieän dieän cuûa caùc vi sinh vaät gaây beänh trong thöïc phaåm. Nhoùm coliform goàm nhöõng vi sinh vaät hieáu khí vaø kî khí tuøy yù, Gram aâm, khoâng sinh baøo töû, hình que, leân men ñöôøng lactose vaø sinh hôi trong moâi tröôøng nuoâi caáy loûng. Döïa vaøo nhieät ñoä taêng tröôûng, nhoùm naøy laïi ñöôïc chia thaønh 2 nhoùm nhoû laø coliform vaø coliform phaân coù nguoàn goác töø phaân cuûa caùc loaøi ñoäng vaät. Coliform phaân coù nguoàn goác töø ruoät ngöôøi vaø caùc ñoäng vaät maùu noùng bao goàm caùc gioáng Escherichia, Klebsiella vaø Enterobacter. Trong caùc thaønh vieân cuûa Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn nhoùm coliform phaân thì E. coli laø loaøi ñöôïc söï quan taâm nhieàu nhaát veà veä sinh an toaøn thöïc phaåm. - Escherichia coli [1,10]: vi khuaån hieän dieän trong ruoät ngöôøi vaø ñoäng vaät, ñöôïc thaûi ra ngoaøi thieân nhieân theo ñöôøng phaân neân thöôøng gaëp trong ñaát vaø nöôùc. Naêm 1971 E. coli ñöôïc xeáp vaøo nhoùm caùc vi sinh vaät gaây beänh trong thöïc phaåm vaø laø moät vi sinh vaät chæ thò nhieãm khuaån thöïc phaåm. Loaøi naøy laø tröïc khuaån Gram aâm mang ñaày ñuû tính chaát cô baûn cuûa vi khuaån ñöôøng ruoät. Khaû naêng gaây beänh cuûa E. coli raát ña daïng vaø tuøy thuoäc vaøo vò trí xaâm nhaäp. Ñoái vôùi nhieãm khuaån ngoaøi ñöôøng ruoät, E. coli gaây nhieàu beänh khaùc nhau vôùi caùc trieäu chöùng khoâng ñaëc tröng vaø ñöôïc xem laø nhöõng vi khuaån gaây beänh cô hoäi (nhö vieâm ñöôøng nieäu, vieâm nhieãm baøng quang, thaän, tuyeán tieàn lieät, oáng daãn tröùng hay nhieãm truøng maùu). Ngoaøi ra E. coli coøn coù theå gaây vieâm maøng naõo ôû treû sô sinh. Ñoái vôùi nhieãm khuaån ñöôøng ruoät, E. coli gaây caùc beänh vieâm ruoät, tieâu chaûy ôû treû nhoû, tieâu chaûy hoäi chöùng lî hay tieâu chaûy hoäi chöùng taû. - Salmonella [7,10]: laø tröïc khuaån Gram aâm, kî khí tuøy yù, khoâng sinh baøo töû, di ñoäng baèng chu mao. Vi khuaån naøy chòu nhieät keùm nhöng chòu ñöôïc moät soá hoùa chaát nhö brilliant green, sodium lauryl sulfate, selenite, tetrathionate. Ngöôøi ta ñaõ phaân laäp ñöôïc 2324 chuûng Salmonella khaùc nhau. Ngoaøi noäi ñoäc toá Salmonella coù theå taïo ra hai loaïi ngoaïi ñoäc toá laø ñoäc toá ruoät (enterotoxin) vaø ñoäc toá teá baøo (cytotoxin). Döïa vaøo caáu truùc khaùng nguyeân O vaø H, ngöôøi ta chia Salmonella gaây beänh ra thaønh 3 nhoùm: nhoùm chæ gaây beänh cho ngöôøi, nhoùm gaây beänh cho ñoäng vaät vaø nhoùm gaây beänh cho ngöôøi vaø ñoäng vaät. ÔÛ ngöôøi Salmonella coù theå gaây soát thöông haøn (do S. typhi hay S. typhi A, B,C), nhieãm truøng maùu (S. cholera-suis), roái loaïn tieâu hoaù (S. typhimurinum, S. enteritidis). Vi khuaån xaâm nhaäp vaøo cô theå baèng ñöôøng mieäng qua thöùc aên. Vaøo ruoät non, vi khuaån taêng tröôûng xaâm nhaäp vaøo maùu vaø caùc cô quan khaùc gaây vieâm . Ngoä ñoäc thöïc phaåm do noäi ñoäc toá cuûa Salmonella gaây ra caùc trieäu chöùng nhö noân möõa, ñau ñaàu, ôùn laïnh, tieâu chaûy. Soát xuaát hieän vaøo 12 – 24 giôø sau khi aên thöùc aên coù chöùa 1 – 10 trieäu teá baøo Salmonella/g thöùc aên. Beänh keùo daøi 2 – 3 ngaøy, phaàn lôùn beänh nhaân töï phuïc hoài nhöng cuõng coù tröôøng hôïp töû vong, ñaëc bieät laø ngöôøi giaø, treû sô sinh vaø ngöôøi suy yeáu heä mieãn dòch. - Shigella [7,10]: laø tröïc khuaån Gram aâm, khoâng di ñoäng, khoâng sinh baøo töû, kî khí tuøy yù, taêng tröôûng ôû nhieät ñoä töø 10 – 40C, pH 6 – 8, coù khaùng nguyeân O, moät soá coù khaùng nguyeân K, khoâng coù khaùng nguyeân H. Shigella goàm coù 4 loaøi: S. dysenteriae, S. flexneri, S. boyalia, S. Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn sonnei. Trong ñoù S. dysenteriae type 1 taïo ñoäc toá thaàn kinh coù ñoäc löïc raát cao, ñaõ töøng gaây nhöõng dòch lôùn. Tæ leä töû vong cuûa beänh do Shigella cao hôn beänh do Salmonella. Nhieãm khuaån Shigella chæ giôùi haïn ôû ñöôøng tieâu hoùa chæ caàn 10 – 100 teá baøo cuõng ñuû gaây beänh. Vi khuaån naøy taïo hai daïng ñoäc toá. Noäi ñoäc toá lipopolysaccharide coù ôû thaønh teá baøo vi khuaån gaây kích thích thaønh ruoät. Ngoaïi ñoäc toá vöøa taùc ñoäng leân ruoät vöøa taùc ñoäng leân heä thaàn kinh trung öông gaây caùc trieäu chöùng tieâu chaûy, öùc cheá haáp thu ñöôøng, axit amin ôû ruoät non, neáu taùc ñoäng leân heä thaàn kinh coù theå gaây töû vong. Vi khuaån seõ taán coâng nieâm maïc ruoät giaø taïo veát loeùt roài hoaïi töû. Khi ruoät giaø bò toån thöông gaây ñau buïng quaën döõ doäi, ñi tieâu nhieàu laàn, phaân nhaày nhôùt vaø coù maùu ñöôïc goïi laø hoäi chöùng lî Shigella. - Vibrio [6,10]: laø phaåy khuaån, Gram aâm, di ñoäng nhôø tieân mao ôû moät ñaàu, hieáu khí hoaëc yeám khí khoâng baét buoäc. Vibrio thöôøng gaëp trong thöïc phaåm, nhaát laø trong haûi saûn, goàm khoaûng 28 loaøi, trong ño coù 4 loaøi gaây beänh laø V. parahaemolyticus, V. cholerae,V. vulnificus vaø V. alginolyticus. + V. cholerae laø loaøi vi khuaån phoå bieán trong thieân nhieân gaây dòch taû ôû ngöôøi söû duïng nöôùc baån vaø thöïc phaåm bò nhieãm. Beänh taû xuaát hieän khi V. cholerae xaâm nhaäp vaøo ñöôøng tieâu hoùa, qua ñöôïc haøng raøo axit cuûa dòch vò, keát dính vaøo maøng nhaày bieåu moâ cuûa ruoät vaø tieát ra ñoäc toá ruoät. Ñoäc toá ruoät V. cholerae laø moät protein khoâng beàn nhieät, caáu taïo bôûi ñôn vò A vaø B. Phaàn B giuùp ñoäc toá gaén vaøo thuï theå treân beà maët teá baøo ruoät laø GM1. Tieåu ñôn vò A vaøo ruoät taêng hoaït ñoäng cuûa adenylcylase khieán teá baøo saûn xuaát cAMP quaù nhieàu laøm taêng tieát oà aït nöôùc vaø chaát ñieän giaûi töø teá baøo thöôïng bì vaøo loâng ruoät gaây tieâu chaûy. Virio coøn coù theå taïo hemolysin (chuûng Eltor), mucinase laøm troùc nieâm maïc thöôïng bì ruoät, neuramirdase laøm taêng thuï theå tieáp nhaän ñoäc toá. + V. parahaemolyticus ña soá gaây ñoäc trong thöùc aên laøm vieâm ruoät. + V. vulnificus hieän dieän roäng raõi ôû nöôùc bieån, haûi saûn, coù khaû naêng toång hôïp ñoäc toá cytotoxin, hemolysin, cytolysin. Tæ leä töû vong bôûi ñoäc toá cuûa vibrio thöôøng raát cao. + V. alginolyticus ít gaëp vaø ñöôïc phaùt hieän gaây beänh laàn ñaàu tieân vaøo naêm 1971. Vi khuaån naøy coù khaû naêng taïo ñoäc toá ruoät. Khi vaøo cô theå, chuùng phaùt trieån raát nhanh trong maùu vaø gaây beänh. Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn - Yersinia [7,10]: laø tröïc khuaån Gram aâm, kî khí tuøy yù, khoâng taïo baøo töû, taïo ñoäc toá ruoät chòu nhieät. Vi khuaån xaâm nhaäp vaøo cô theå qua da (veát boï cheùt caén), nieâm maïc (keát maïc, nieâm maïc haàu trong, ñöôøng hoâ haáp). Khi vaøo cô theå Yersinia sinh saûn raát nhanh, bieåu hieän laâm saøng laø caùc haïch treân cô theå. Vi khuaån ñi vaøo maùu vaø xaâm nhaäp vaøo caùc phuû taïng gaây xuaát huyeát. Thôøi gian uû beänh laø 2 – 7 ngaøy. Sau ñoù coù theå soát cao vaø ñoät ngoät, haïch to daàn gaây ñau ñôùn. Tröôøng hôïp nhieãm ñoäc thaàn kinh, ngöôøi beänh caûm thaáy böùt röùt, lo aâu. Tröôøng hôïp nhieãm truøng maùu sôùm coù theå keøm theo noân möõa, tieâu chaûy, neáu nhieãm muoän thì ñoâng maùu noäi haïch, haï huyeát aùp, ngöôøi trôû neân löø ñöø, suy thaän, suy tim. - Proteus [8,10]: laø vi khuaån coù trong töï nhieân, trong ñöôøng tieâu hoùa cuûa ngöôøi vaø ñoäng vaät. Thöïc phaåm bò nhieãm Proteus chuû yeáu töø nguoàn nöôùc hay töø duïng cuï vaät lieäu cheá bieán thöïc phaåm khoâng ñöôïc xöû lyù toát. Proteus chæ gaây ñoäc khi löôïng teá baøo trong cô theå ñuû lôùn. Ñoäc toá chæ ñoùng vai troø phuï trôï ñeå laøm taêng khaû naêng thaåm thaáu cuûa nieâm maïc ruoät, giuùp vi khuaån xaâm nhaäp vaøo maùu nhanh vaø nhieàu hôn. Thôøi gian uû beänh töông ñoái ngaén (khoaûng 3 giôø, ñoâi khi keùo daøi 16 giôø). Khi bò nhieãm khuaån, ngöôøi beänh bò noân möõa, tieâu chaûy caáp, vieâm daï daøy, ruoät. Nhieät ñoä cô theå taêng. Beänh xuaát hieän raát nhanh nhöng cuõng khoûi nhanh. Cô theå seõ phuïc hoài sau 1 – 3 ngaøy vaø khoâng gaây töû vong. - Staphylococcus [6,10]: laø caàu khuaån Gram döông, teá baøo bình thöôøng lieân keát vôùi nhau hình thaønh chuøm, thöôøng soáng ôû da ngöôøi, ñöôøng hoâ haáp, ñöôøng tieâu hoaù, quaàn aùo , ñoà vaät... Staphylococcus taïo 9 loaïi ñoäc toá chòu nhieät (A, B, C1, C2, C3, D, E, G, H) vaø caùc enzyme coù khaû naêng hoã trôï cho ñoäc toá gaây ñoäc ôû ngöôøi. Neáu bò ngoä ñoäc chæ sau 1- 8 giôø ngöôøi beänh seõ buoàn noân, oùi möõa, tieâu chaûy döõ doäi, khoâng soát vaø phuïc hoài. Löôïng ñoäc toá coù theå gaây ngoä ñoäc cho ngöôøi laø 2mg. - Clotridium [6,10]: laø nhöõng tröïc khuaån Gram aâm, yeám khí, taïo baøo töû, nhieät ñoä phaùt trieån toái öu 43 – 47C. Hai chuûng gaây ngoä ñoäc thöïc phaåm laø: + C. botulium laàn ñaàu tieân ñöôïc ghi nhaän gaây ngoä ñoäc vaøo naêm 1973 vaø coù 6 ngöôøi cheát do nhieãm ñoäc. C. botulium coù khaû naêng taïo ñoäc toá thaàn kinh vaø raát nhieàu ñoäc toá khaùc nhau (A, B, F, G, G2, D vaø G). Ñoäc toá thöôøng coù ñoäc löïc raát cao. + C. perfringens phaùt trieån ôû nhieät ñoä töø 12 - 50C, bò öùc cheá ôû noàng ñoä muoái NaCl 6%. Phaàn lôùn tröôøng hôïp ngoä ñoäc thöïc phaåm do C. perfringens khi maät ñoä teá baøo treân 106 teá baøo/gam Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn thöïc phaåm. Thôøi gian uû beänh laø 8 – 24 giôø. Trieäu chöùng laø ñau buïng, tieâu chaûy, soát, buoàn noân. Ñoäc toá cuûa C. perfringens bò baát hoaït ôû 60C trong 10 phuùt. - Listeria [6,10]: loaøi gaây beänh chuû yeáu laø L. monocytogenes, laø vi khuaån öa laïnh, coù theå phaùt trieån ôû nhieät ñoä 2,5 - 44C, thöôøng hieän dieän trong trong söõa, thòt, caù, rau vaø caû nöôùc beà maët. Trieäu chöùng beänh laø tieâu chaûy, soát nheï. Tröôøng hôïp naëng, chuûng gaây beänh coù theå sinh saûn trong caùc ñaïi thöïc baøo gaây nhieãm truøng maùu, taùc ñoäng leân heä thaàn kinh trung öông, tim, maét vaø coù theå xaâm nhaäp vaøo baøo thai trong buïng meï gaây saåy thai , ñeû non hoaëc nhieãm truøng thai nhi. Ngoaøi caùc vi khuaån thöôøng gaëp keå treân coøn coù nhieàu vi khuaån khaùc coù vai troø nhaát ñònh trong vieäc gaây beänh cho ngöôøi töø thöïc phaåm nhö Bacillus cereus, Campylobacter jejuni, Corynebacterium, Aeromonas hydrophila... - Virus [6,10]: laø nhoùm vi sinh vaät gaây beänh coù kích thöôùc nhoû nhaát, thay ñoåi töø 5- 20nm. Virus gaây beänh ôû thöïc phaåm ít ñöôïc nghieân cöùu do khoù nuoâi caáy treân moâi tröôøng nuoâi caáy thoâng thöôøng. Coù raát nhieàu vuï dòch hay ca beänh töø thöïc phaåm do virus gaây ra nhöng trong nhieàu tröôøng hôïp ngöôøi ta khoâng phaùt hieän ñöôïc nguoàn goác gaây beänh. Thöïc phaåm ñoùng vai troø moâi tröôøng lan truyeàn maàm beänh. Moät soá virus trong thöïc phaåm gaây beänh ôû ngöôøi ñaõ bieát laø virus Fadeno serotype 40 vaø 41 gaây loeùt daï daøy (hoï Adenoviridae, chöùa DNA, kích thöôùc 100 nm), virus Hepatitis E gaây beänh gan (hoï Calciviridae, chöùa RNA, kích thöôùc 34 nm), virus Pravo gaây ñau bao töû ( hoï Pravoviridae, chöùa DNA, kích thöôùc 22nm), virus Popilo type 1 – 3 vaø Echo type 1 – 65 gaây vieâm phoåi (hoï Picornarividae, chöùa RNA, kích thöôùc 28nm)... - Naám moác taïo ñoäc toá [7,20]: moät soá loaøi coù khaû naêng taïo ñoäc toá gaây ngoä ñoäc hay ung thö ôû ngöôøi vaø ñoäng vaät. Trong thöïc phaåm, moät soá loaøi coù khaû naêng taïo ra caùc ñoäc toá, thöôøng gaëp vaø nguy hieåm nhaát laø aflatoxin do Aspergillus flavus vaø A. parasiticus taïo ra. Möùc ñoä ngoä ñoäc bôûi naám moác laø khaùc nhau, bieåu hieän nhö nhieãm ñoäc nheï (gaây noân möõa, tieâu chaûy), toån thöông ôû gan, thaän, tuùi maät vaø oáng maät. Moät soá ñoäc toá coøn gaây u tuyeán hoaëc u gan, gaây thoaùi hoùa teá baøo nhu moâ gan, xô hoùa. Citrinin cuûa Penicilium citrinum vaø P. viridicatum coù theå gaây caùc beänh taêng urea huyeát, albumin nieäu, vieâm tieåu caàu thaän. Moät soá ñoäc toá cuûa naám moác nhö tetronic acid, terestic acid, viridicatic acid... taùc ñoäng vaøo tim gaây ñoäc ñoái vôùi chöùc naêng cuûa tim. Ñoäc toá cuûa Stachybotrys ata, Fusarium tricinctum, Dendrodocium toxicum, Aspergillus ochraceus... taùc ñoäng vaøo maùu vaø heä tuaàn hoaøn gaây hoäi chöùng chaûy maùu. Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn - Taûo sinh ñoäc toá [7]: caùc taûo naøy laøm oâ nhieãm nguoàn nöôùc, thuûy saûn, gaây ngoä ñoäc cho ñoäng vaät hoang daõ, gia suùc, gia caàm vaø con ngöôøi. Caùc loaøi taûo ñoäc coù theå chia ra thaønh 3 nhoùm: + Taûo Dinoflabellates: coù maët trong hôn 75% tröôøng hôïp thuûy trieàu ñoû nhöng chæ coù 9,5% coù ñoäc tính noùi chung vaø 1,5% gaây ñoäc cho ngöôøi. Thöôøng gaëp laø caùc gioáng Gymmodinium, Pyrodinium, Dinophysic, Alexandrium, Gonyaulas... + Taûo silic: thöôøng sinh ra domoic, laø moät axit amin gaây ñoäc cho heä thaàn kinh trong cô theå. + Taûo lam: coù nhieàu loaïi, taïo nhieàu loaïi ñoäc toá khaùc nhau, ñaëc bieät laø caùc chaát coù hieäu öùng gaây ñoäc cho heä thaàn kinh nhö Aphanizomenonf aquae sinh ra caùc alkaloid gaây ñoäc cho heä thaàn kinh gaây aûo giaùc. 2. MOÄT SOÁ ÑAËC ÑIEÅM S INH HOÏC VAØ BEÄNH H OÏC CUÛA E. COLI 2.1. Ñaëc ñieåm sinh hoïc - Phaân loaïi vaø ñaëc ñieåm hình thaùi [8] Escherichia coli coøn coù teân laø Bacterium coli comme, Bacillus coli communis do Escherich phaân laäp naêm 1885 töø phaân treû em. Ngaøy nay, E. coli ñöôïc xeáp vaøo hoï Enterobacteria, gioáng Escherichia, loaøi E. coli. Trong gioáng Escherichia, phaûn öùng sinh hoùa ñeå phaân loaïi ít coù giaù trò, vieäc phaân chia thaønh caùc type thöôøng phaûi caên cöù vaøo caáu taïo khaùng nguyeân. E. coli laø tröïc khuaån hình gaäy ngaén kích thöôùc 2 – 3 x 6m, hai ñaàu troøn (Hình 1), teá baøo ñöùng rieâng leõ, ñoâi khi xeáp thaønh chuoãi ngaén, coù tieân mao chung quanh thaân neân coù theå di ñoäng, khoâng taïo baøo töû, Gram aâm, thænh thoaûng coù hieän töông baét maøu ôû hai ñaàu. H ình 1. E. coli döôùi kính h ieån v i ñieän töû queùt SEM [10] Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn - Ñaëc ñieåm nuoâi caáy [6,8] E. coli laø tröïc khuaån hieáu khí vaø yeám khí tuyø yù, coù theå sinh tröôûng ôû nhieät ñoä töø 15 - 44C (toái öu ôû 37C), pH töø 5,5 – 8,5 (toái öu ôû 7,4). Khi taêng tröôûng treân maët thaïch PCA ôû 37C trong 24 giôøø, E. coli hình thaønh nhöõng khuaån laïc troøn öôùt, trong, maøu tro traéng nhaït, hôi loài, ñöôøng kính 2 – 3 mm. Trong moâi tröôøng nöôùc peptone E. coli phaùt trieån toát, laøm moâi tröôøng raát ñuïc coù laéng caën maøu tro nhaït ôû ñaùy duïng cuï nuoâi caáy, ñoâi khi hình thaønh maøng xaùm nhaït. Canh tröôøng coù muøi phaân thoái. Treân moâi tröôøng Endo, E. coli hình thaønh nhöõng khuaån laïc maøu ñoû aùnh kim. Treân moâi tröôøng DA (Desoxycholate Agar), E. coli cho khuaån laïc maøu ñoû, deït troøn vaø khoâ. Treân moâi tröôøng EMB( Eosine Methylene Blue), E. coli hình thaønh nhöõng khuaån laïc maøu tím ñen, ñoû tía thöôøng coù aùnh kim, bôø troøn ñeàu. Vi khuaån naøy khoâng phaùt trieån ôû moâi tröôøng Kauffmann vaø moâi tröôøng Wilson Blair. - Ñaëc ñieåm sinh hoùa [10] E. coli leân men sinh hôi vôùi nguoàn cacbon laø glucose, galactose, lactose, maltose, arabinose, xylose, ramnose, mannitol, fructose; coù theå leân men hay khoâng leân men saccharose, rafinose, esculin, duncid, glycerol; ít khi leân men inulin, pectin, adonite; khoâng leân men dextrin, amidon, glycogen, inositol, cellobiose. Vi khuaån thöôøng sinh indol, khoâng sinh urea vaø H2S, coù sinh lysin decarboxylase, khoâng söû duïng citrate. Söï taêng tröôûng cuûa vi khuaån bò öùc cheá bôûi chlorine, caùc daãn xuaát cuûa muoái maät, brilliant green, sodium deoxycholate, sodium tetrathionate, selenite... Ñeå phaân bieät E. coli vôùi caùc vi khuaån ñöôøng ruoät khaùc, 4 tính chaát sinh hoaù thöôøng ñöôïc duøng laø Indol, Methyl Red, Voges Proskauer vaø Citrate( coøn ñöôïc goïi laø thöû nghieäm IMViC). + Indol (I): trong moâi tröôøng coù tryptophan, tryptophanase cuûa E. coli thuyû phaân tryptophan thaønh indol. Ñeå phaùt hieän indol, duøng vaøi gioït thuoác thöû Kovac,s coù chöùa chaát p- dimethylaminobenzaldehyde. Chaát naøy seõ keát hôïp vôùi indol taïo neân hôïp chaát muoái dimethyl amonium coù maøu ñoû . + Methyl Red (ñoû methyl, MR): khi ñöôïc nuoâi caáy trong moâi tröôøng coù glucose, E. coli seõ taïo ra moät noàng ñoä H+ cao ( pH < 4,5). Khi boå sung vaøo moâi tröôøng ñaõ nuoâi caáy 24 giôø ôû 37C vaøi gioït thuoác thöû Methyl Red, moâi tröôøng seõ coù maøu ñoû. Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn + Voges Proskauer (VP): trong quaù trình leân men glucose, vi sinh vaät coù theå cho nhöõng saûn phaåm cuoái khaùc nhau, moät trong soá ñoù laø acetoin. Khi boå sung vaøo moâi tröôøng vaøi gioït potassium hydroxide (40%) vaø -naptol (5% trong coàn tuyeät ñoái), acetonin seõ taïo ra moät phöùc hôïp maøu ñoû. + Citrate (C): trong moâi tröôøng Simons coù nguoàn C duy nhaát laø citrate, vi khuaån naøo söû duïng ñöôïc citrate seõ laøm kieàm hoaù moâi tröôøng vaø ñieàu naøy ñöôïc nhaän dieän bôûi söï ñoåi maøu cuûa moâi tröôøng (xanh laù caây thaønh xanh döông). E. coli coù keát quaû thöû nghieäm IMViC laø nhö sau : I (+), MR (+), VP (-) vaø C (-). - Ñaëc ñieåm caáu truùc khaùng nguyeân [22] Töø naêm 1930, Kauffmann ñaõ ñöa ra bieåu ñoà phaân type huyeát thanh cuûa E. coli döïa treân khaùng nguyeân thaân (O), khaùng nguyeân voû (K) vaø khaùng nguyeân loâng ( H ). + Khaùng nguyeân O ñöôïc caáu taïo bôûi phöùc hôïp lipopolysacharide, coù lieân keát cheùo veà ñaëc tính huyeát thanh vôùi vi khuaån khaùc nhö Shigella, Samonlla. + Khaùng nguyeân K coù thaønh phaàn chính laø polysaccharide coù tính axit vaø ñöôïc chia laøm 3 nhoùm A, B vaø L. Tính ngöng keát cuûa nhoùm A khoâng bò baát hoaït ôû 121C trong khi L bò baát hoaït ôû 100C trong 1 giôø. + Khaùng nguyeân H coù tính ña daïng phuï thuoäc vaøo söï hieän dieän cuûa tieân mao ôû töøng chuûng. Nhieàu E. coli ban ñaàu khi phaân laäp thì khoâng di ñoäng hoaëc chuyeån ñoäng chaäm nhöng khi ñöôïc chuyeån qua moâi tröôøng thaïch baùn raén thì di ñoäng tích cöïc. Chæ nhöõng chuûng di ñoäng môùi coù khaùng nguyeân H. - Phaân boá E. coli hieän dieän ôû phaàn sau cuûa ruoät, nhieàu nhaát laø ôû ruoät giaø, ít khi ôû daï daøy hay phaàn tröôùc ruoät ñoäng vaät (traâu, boø, heo, choù, meøo, gia caàm vaø ngöôøi). Caùc loaøi ñoäng vaät aên thòt vaø loaøi hoãn thöïc baøi tieát nhieàu E. coli hôn loaøi aên coû. Vi khuaån naøy ñöôïc thaûi theo phaân ngöôøi vaø ñoäng vaät ra ngoaøi vaø nhieãm vaøo ñaát vaø nöôùc. Vieäc phaùt hieän E. coli trong nguoàn nöôùc laø moät thöû nghieäm chính nhaèm xaùc ñònh nöôùc coù bò nhieãm phaân hay khoâng. Tröôùc ñaây, E. coli ñöôïc xem laø moät vi khuaån bình thöôøng trong ruoät. Hieän nay coù nhieàu chuûng ñöôïc xem nhö moät trong nhöõng taùc nhaân gaây tieâu chaûy, ñaëc bieät ôû treû em. Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn 2.2. Ñaëc tính g aây beänh [1,7] E. coli soáng coäng sinh trong ruoät ngöôøi. Bình thöôøng vi khuaån naøy khoâng gaây beänh vaø öùc cheá söï phaùt trieån cuûa caùc vi khuaån gaây beänh khaùc, toång hôïp vitamin C vaø K raát caàn thieát cho con ngöôøi. Khi tæ leä E. coli giaûm xuoáng döôùi 20% so vôùi toång soá vi sinh vaät ñöôøng ruoät thì môùi xuaát hieän caùc trieäu chöùng roái loaïn tieâu hoùa do loaïn khuaån. Moät soá chuûng E. coli coù khaû naêng gaây beänh. Beänh gaây ra bôûi E. coli thay ñoåi theo vò trí xaâm nhaäp vaø chuûng gaây beänh. Moät soá bieåu hieän laâm saøng thöôøng gaëp laø: - Nhieãm khuaån ñöôøng tieåu: E. coli coù theå gaây beänh nhieãm khuaån ñöôøng tieåu vôùi caùc trieäu chöùng nhö tieåu nhieàu laàn, tieåu laét nhaét, tieåu ñau, tieåu ra maùu, tieåu ra muû. Coù tröôøng hôïp bieán chöùng thaønh nhieãm khuaån töû cung, ñöôøng nieäu, oáng daãn tröùng, thaän vaø nhieãm khuaån maùu. - Nhieãm khuaån maùu: khi söùc ñeà khaùng cuûa cô theå ngöôøi giaûm, vi khuaån coù theå vaøo maùu vaø gaây nhieãm khuaån. Thöôøng gaëp ôû treû sô sinh vaø sau khi nhieãm khuaån ñöôøng tieåu. - Vieâm maøng naõo: E. coli vaø streptococci nhoùm B laø nhöõng nguyeân nhaân haøng ñaàu gaây vieâm maøng naõo ôû treû em. E. coli chieám khoaûng 40 tröôøng hôïp gaây vieâm maøng naõo ôû treû sô sinh, trong ñoù 75% E. coli coù khaùng nguyeân K1. - Tieâu chaûy vaø caùc beänh ñöôøng ruoät: tröôùc ñaây, vai troø gaây tieâu chaûy cuûa E. coli ít ñöôïc ñeà caëp ñeán. Ngaøy nay, cuøng vôùi söï tieán boä cuûa kó thuaät xeùt nghieäm, ngöôøi ta ngaøy caøng phaùt hieän ñöôïc nhieàu chuûng E. coli gaây tieâu chaûy vaø caùc beänh ñöôøng ruoät khaùc. E. coli ñöôïc xem laø nguyeân nhaân haøng ñaàu gaây beänh tieâu chaûy, ñaëc bieät laø treû em. Beänh gaëp khaép nôi treân theá giôùi, ôû caùc nöôùc phaùt trieån laãn caùc nöôùc ñang phaùt trieån. Nhieàu nôi phaùt sinh thaønh dòch do khaû naêng laây lan raát nhanh vaø gaây hieäu quaû nghieâm troïng cho söùc khoûe coäng ñoàng. Ngöôøi ta chia caùc chuûng E. coli gaây beänh ñöôøng ruoät ra thaønh caùc nhoùm sau: - EPEC (Enterophathogenic E. coli): laø caùc chuûng E. coli ñaàu tieân ñöôïc xaùc ñònh gaây beänh tieâu chaûy ôû ngöôøi. Nhoùm naøy goàm moät soá typ huyeát thanh coå ñieån gaây vieâm ruoät vaø tieâu chaûy daïng nöôùc hoaëc laãn maùu ôû treû em cuõng nhö ngöôøi lôùn. - EIEC (Enteroinvavise E. coli): gaây tieâu chaûy vôùi trieäu chöùng laâm saøng daïng lî gioáng Shigella. Beänh thöôøng gaëp ôû treû em laãn ngöôøi lôùn vaø ñöôïc xaùc ñònh khi thaáy coù maùu vaø ñôøm xuaát hieän trong phaân. Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn - ETEC (Enteroxigenic E. coli): gaây tieâu chaûy cho treû em vaø 20 – 65% khaùch du lòch ñeán nhöõng nöôùc ñang phaùt trieån hoaëc nhöõng vuøng maø ñieàu kieän veä sinh coøn keùm. ETEC xaâm nhaäp vaøo cô theå qua ñöôøng tieâu hoùa töø nöôùc vaø thöùc aên. Khaû naêng gaây beänh cuûa ETEC tuøy thuoäc vaøo khaû naêng baùm dính vaøo thaønh ruoät vaø taïo ra moät hay nhieàu ñoäc toá. Ñoäc toá ETEC goàm 2 loaïi ST vaø LT. Ñoäc toá ST (Heat stable toxin) laø ñoäc toá beàn nhieät goàm 2 loaïi laø STI (STa) vaø STII (STb). Ñoäc toá LT (Heat labile toxin) laø ñoäc toá khoâng beàn vôùi nhieät, coù caáu truùc vaø chöùc naêng töông ñöông nhö ñoäc toá cuûa Vibrio cholerae laø moät protein ñöôïc caáu taïo bôûi moät tieåu ñôn vò A (30k Da) vaø 5 tieåu ñôn vò B. Ñoäc toá LT goàm 2 loaïi LT1 vaø LT2. - EHEC (Enterohemorrhagic E. coli): gaây xuaát huyeát ruoät, coøn coù teân laø VTEC (Verocytocin - producing E. coli), do coù khaû naêng saûn xuaát ñoäc toá verocytocin coù ñoäc tính ñoái vôùi teá baøo vero. VTEC khoâng nhöõng laø nguyeân nhaân gaây tieâu chaûy maø coøn laø nguyeân nhaân gaây hai bieán chöùng coù theå daãn tôùi töû vong laø vieâm ñaïi traøng xuaát huyeát vaø hoäi chöùng tan maùu ureâ huyeát (50% ca beänh daãn tôùi töû vong). E. coli O157:H7 laø ñaïi dieän cuûa nhoùm naøy, taïo ra moät loaïi ñoäc toá maïnh. Nguoàn thöùc aên deã nhieãm E. coli O157: H7 laø xuùc xích, söõa khoâng qua khöû truøng pasteur, nöôùc traùi caây, nöôùc uoáng… Vi khuaån trong phaân cuûa ngöôøi bò tieâu chaûy coù theå ñöôïc laây lan sang ngöôøi khaùc neáu thoùi quen röûa tay hoaëc veä sinh khoâng toát. Trieäu chöùng gaây beänh bôûi E. coli O157: H7 laø tieâu chaûy naëng vaø chuoät ruùt buïng, ít khi bò soát. Beänh seõ khoûi sau 5 - 10 ngaøy. ÔÛ moät soá ngöôøi, ñaëc bieät laø treû em döôùi 5 tuoåi vaø ngöôøi giaø, beänh coù theå bieán chöùng thaønh hoäi chöùng tan maùu ureâ huyeát, khoaûng 2 - 7 tröôøng hôïp laây nhieãm daãn ñeán bieán chöùng treân. 3 . CAÙC PHÖÔNG PHAÙP PHAÙT HIEÄN E. COLI TRONG THÖÏC PHAÅM 3.1. Phöông phaùp nuoâi caáy truyeàn th oáng [6,10] Phöông phaùp nuoâi caáy truyeàn thoáng ñeå phaùt hieän E. coli goàm ba böôùc: (1) taêng sinh choïn loïc treân moâi tröôøng phuø hôïp nhö BGBL (Brilliant Green Bile Lactose 2%) hoaëc canh Lauryl Sulphate Tryptose; (2) phaân laäp treân moät caùc moâi tröôøng nhö Endo, EMB (Eosine Methylene Blue Agar), DA (Desoxycholate agar) vaø (3) thöû sinh hoùa treân caùc moâi tröôøng MRVP (Methyl Red Voges Proskauer) vaø Simons citrate agar. - Taêng sinh choïn loïc: muïc tieâu cuûa böôùc naøy laø laøm taêng soá löôïng E. coli coù trong maãu, öùc cheá moät soá löôïng lôùn caùc sinh vaät khaùc. Moâi tröôøng duøng ñeå taêng sinh choïn loïc laø BGBL vì Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn trong thaønh phaàn cuûa moâi tröôøng naøy coù chöùa maät boø choïn loïc vi khuaån Gram aâm, öùc cheá söï phaùt trieån cuûa vi khuaån Gram döông. - Phaân laäp: böôùc naøy nhaèm taùch bieät vaø nhaän daïng E. coli töø taäp hôïp caùc quaàn theå vi sinh vaät khaùc nhau trong maãu sau böôùc taêng sinh choïn loïc. Coù nhieàu moâi tröôøng raén khaùc nhau ñöôïc söû duïng ñeå phaân laäp E. coli, moãi moâi tröôøng nhaän daïng moät vaøi ñaëc tính chung nhaát cuûa E. coli. Möùc ñoä choïn loïc, tính ñaëc tröng vaø hình thaùi bieåu hieän khuaån laïc cuûa E. coli treân töøng moâi tröôøng cuõng khaùc nhau. Vì vaäy caùc tieâu chuaån veä sinh an toaøn thöïc phaåm khuyeán khích cuøng moät luùc söû duïng ít nhaát hai loaïi moâi tröôøng phaân laäp khaùc nhau ñeå taêng cöôøng khaû naêng phaùt hieän E. coli, trong ñoù moâi tröôøng EMB ñöôïc khuyeán khích söû duïng. Caùc bieåu hieän cuûa E. coli treân caùc moâi tröôøng khaùc nhau nhö sau: + Treân moâi tröôøng Endo khuaån laïc E. coli thöôøng coù maøu ñoû aùnh kim troøn, bôø ñeàu, ñöôøng kính khoaûng 0,5mm. + Treân moâi tröôøng EMB khuaån laïc E. coli ñoû tía, coù aùnh kim, bôø ñeàu, ñöôøng kính 0,5mm. + Treân moâi tröôøng DA khuaån laïc E. coli coù maøu ñoû, troøn, khoâ vaø hôi deïp, ñöôøng kính 0,5mm. - Thöû phaûn öùng sinh hoùa: choïn nhöõng khuaån laïc nghi ngôø laø E. coli töø moâi tröôøng phaân laäp ñeå thöû nghieäm IMViC (trang 13, 14). Maãu kieåm ñöôïc keát luaän laø coù E. coli khi laøm ñoåi maøu vaø sinh hôi treân moâi tröôøng taêng sinh, taïo khuaån laïc ñaëc tröng treân moâi tröôøng phaân laäp vaø cho keát quaû sinh hoùa laø: I (+), MR (+), VP (-), Ci (-). Phöông phaùp naøy cho keát quaû sau 4 - 6 ngaøy keå töø ngaøy phaân tích. Maëc duø tieâu toán nhieàu thôøi gian vaø coâng söùc, song phöông phaùp truyeàn thoáng vaãn ñöôïc aùp duïng taïi nhieàu nöôùc treân theá giôùi, vaãn ñöôïc xem laø phöông phaùp tieâu chuaån ñeå ñaùnh giaù caùc phöông phaùp thay theá khaùc. Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn 3.2. Caùc phöông phaùp c aûi tieán Do phöông phaùp truyeàn thoáng toán nhieàu thôøi gian, chaäm thu keát quaû, maát nhieàu coâng söùc, toán keùm... neân nhieàu phöông phaùp nhanh vaø töï ñoäng ñaõ ñöôïc phaùt trieån vaø thöông maïi hoùa [10]. Moät soá phöông phaùp khoâng truyeàn thoáng ñang ñöôïc phaùt trieån vaø söû duïng laø: - Phöông phaùp ELISA ( Enzyme - Linked Immunosorbent Assay) [4, 10] Phöông phaùp ELISA (haáp thuï mieãn dòch duøng enzym) ñöôïc quan taâm nhieàu do ñôn giaûn vaø hieäu quaû cao. Phöông phaùp naøy ñöôïc döïa treân nguyeân taéc laø söû duïng khaùng theå phuû beân ngoaøi nhöõng ñóa gieáng (microplate). Khaùng nguyeân (neáu coù) trong maãu seõ ñöôïc giöõ laïi treân beà maët gieáng. Caùc khaùng nguyeân naøy seõ ñöôïc phaùt hieän baèng caùch söû duïng khaùng theå thöù caáp coù gaén vôùi enzyme horseradish peroxidase hoaëc alkaline phosphatase. Khi boå sung moät cô chaát ñaëc hieäu vaøo gieáng, enzyme seõ xuùc taùc phaûn öùng thuûy phaân cô chaát ñeå taïo ra saûn phaåm coù maøu hoaëc phaùt saùng. Theo doõi söï ñoåi maøu coù theå phaùt hieän vaø ñònh löôïng ñöôïc khaùng nguyeân trong maãu. Phöông phaùp naøy coù ñoä nhaïy vaø ñoä ñaëc hieäu cao. ELISA ñaõ ñöôïc söû duïng roäng raõi döôùi daïng caùc boä hoùa chaát (kit) thöông maïi (phaùt hieän Samonella, E. coli gaây beänh, Listeria…) vaø coù theå ñöôïc caûi tieán ñeå töï ñoäng hoùa. ELISA coù theå söû duïng phaùt hieän vaø ñònh löôïng vi sinh vaät trong thöïc phaåm trong thôøi gian vaøi giôø sau khi taêng sinh. Kyõ thuaät naøy coù ñoä nhaïy phaùt hieän khoaûng 106 CFU/ml. Tuy nhieân trong phöông phaùp naøy vaãn caàn thöïc hieän böôùc taêng sinh vaø taêng sinh choïn loïc tröôùc khi thöïc hieän caùc phaûn öùng mieãn dòch. - Phöông phaùp lai phaân töû [4,10] Phöông phaùp lai phaân töû ñeå phaùt hieän vi sinh vaät trong thöïc phaåm ñöôïc döïa treân söï phaùt hieän moät ñoaïn gen ñaëc tröng cuûa vi sinh vaät. Cô sôû cuûa phöông phaùp naøy laø söï baét caëp cuûa hai sôïi nucleic acid maïch ñôn (DNA, RNA) neáu coù hai trình töï boå sung ngöôïc chieàu nhau ôû nhieät ñoä thaáp hôn nhieät ñoä taùch maïch Tm cuûa hai phaân töû nucleic acid maïch ñôn. Moät trong hai maïch DNA boå sung (thöôøng laø DNA muïc tieâu) ñöôïc coá ñònh treân moät giaù theå raén hoaëc naèm ngay treân teá baøo hay moâ. Söï lai phaân töû xaõy ra khi ñoaïn maãu doø coù trình töï nucleotide boå sung vôùi moät vuøng trình töï treân DNA muïc tieâu gaëp nhau do chuyeån ñoäng nhieät vaø khi nhieät ñoä moâi tröôøng thaáp hôn Tm ít nhaát vaøi ñoä. Söï lai phaân töû coøn coù theå xaõy ra giöõa DNA vaø RNA [10]. ETEC laø moät trong nhöõng vi sinh vaät gaây beänh ñaàu tieân ñöôïc phaùt hieän baèng phöông phaùp lai phaân töû. Naêm 1982, ngöôøi ta ñaõ söû duïng coù hieäu quaû caùc maãu doø DNA ñeå phaùt hieän gen maõ hoùa ST vaø Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn LT trong maãu phaân vaø maãu moâi tröôøng baèng phöông phaùp lai phaân töû. Hieän nay ñaõ coù moät soá boä kit thöông maïi döïa treân kó thuaät phaân tích nucleic acid duøng trong phaùt hieän E. coli gaây beänh trong thöïc phaåm. 4. PHÖÔNG PHAÙP PCR PH AÙT H IEÄN E. COLI TRONG PH AÅM [4, 10] Döïa treân söï hieåu bieát veà nguyeân taéc nhaân baûn DNA trong teá baøo, naêm 1985 Karl Mullis vaø coäng söï ñaõ phaùt minh ra moät phöông phaùp cho pheùp nhaân baûn sao cuûa DNA trong oáng nghieäm goïi laø phöông phaùp PCR (Polymerase Chain Reaction). Ñaây laø moät trong nhöõng phöông phaùp nhaân baûn DNA in vitro ñöôïc söû duïng roäng raõi nhaát. 4.1. Nguyeân taéc Taát caû DNA polymerase ñeàu caàn moài chuyeân bieät ñeå toång hôïp moät maïch DNA môùi töø maïch khuoân. Maïch khuoân thöôøng laø moät trình töï DNA cuûa gen (goïi laø trình töï DNA muïc tieâu) ñaëc tröng cho loaøi vi sinh vaät muïc tieâu hoaëc laø gen. Moài laø ñoaïn oligonucleotide ngaén, baét caëp boå sung vôùi moät ñaàu cuûa maïch khuoân vaø nhôø hoaït ñoäng cuûa DNA polymerase ñoaïn moài naøy ñöôïc noái daøi ñeå hình thaønh maïch môùi. Phöông phaùp PCR ñöôïc hình thaønh döïa treân ñaëc tính naøy cuûa DNA polymerase. Khi coù söï hieän dieän cuûa hai moài chuyeân bieät baét caëp boå sung vôùi hai ñaàu cuûa moät trình töï DNA, ôû ñieàu kieän ñaûm baûo hoaït ñoäng cuûa DNA polymerase, phaûn öùng PCR cho pheùp nhaân baûn ñoaïn DNA naèm giöõa hai moài thaønh soá löôïng lôùn baûn sao ñeán möùc coù theå thaáy ñöôïc sau khi nhuoäm baèng ethidium bromide. Nhö vaäy ñeå khueách ñaïi (nhaân baûn sao) moät trình töï DNA xaùc ñònh, caàn coù nhöõng thoâng tin toái thieåu veà trình töï cuûa DNA, ñaëc bieät laø trình töï base ôû hai ñaàu ñoaïn DNA ñeå taïo caëp moài boå sung chuyeân bieät. Caëp moài naøy goàm moài xuoâi (sense primer) vaø moài ngöôïc (antisense primer) so vôùi chieàu phieân maõ cuûa gen. Phöông phaùp PCR goàm nhieàu chu kyø laëp laïi noái tieáp nhau. Moãi chu kyø goàm 3 böôùc laø: - Böôùc bieán tính (denaturation): trong moät dung dòch phaûn öùng bao goàm caùc thaønh phaàn caàn thieát cho söï sao cheùp, phaân töû DNA ñöôïc bieán tính ôû nhieät ñoä cao hôn nhieät ñoä tan (taùch maïch) Tm cuûa phaân töû DNA (thöôøng laø 94 - 95C) trong voøng 30 - 60 giaây. Maïch ñoâi DNA taùch ra thaønh daïng maïch ñôn ñeå laøm khuoân cho phaûn öùng PCR. Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn - Böôùc baét caëp (anealation): trong böôùc naøy, nhieät ñoä phaûn öùng ñöôïc haï thaáp hôn Tm cuûa moài vaø DNA, cho pheùp moài baét caëp vôùi maïch khuoân. Trong thöïc nghieäm nhieät ñoä naøy dao ñoäng trong khoaûng 40 - 70C tuøy thuoäc Tm cuûa caùc moài söû duïng vaø keùo daøi 30 - 60 giaây. - Böôùc keùo daøi (elongation): ñöôïc xuùc taùc bôûi DNA polymerase caùc deoxynucleoside triphosphate laàn löôït gaén vaøo ñaàu 3’-OH moài theo nguyeân taéc boå sung vôùi maïch khuoân. Maïch môùi ñöôïc taïo thaønh töø moài ñöôïc noái daøi. Nhieät ñoä phaûn öùng khoaûng 72C. Trong phaûn öùng PCR moät chu kyø goàm 3 böôùc treân seõ ñöôïc laëp laïi nhieàu laàn, moãi laàn (moãi chu kyø) laïi laøm taêng gaáp ñoâi soá löôïng baûn sao cuûa laàn tröôùc (Hình 2, 3). Ñaây laø söï khueách ñaïi baûn sao theo caáp soá nhaân. Trong thöïc teá sau 30 - 40 chu kyø, phaûn öùng seõ taïo ra khoaûng 106 baûn sao. Sau phaûn öùng PCR, saûn phaåm phaûn öùng ñöôïc ñieän di treân gel agarose vaø vaïch cuûa saûn phaåm khueách ñaïi ñöôïc nhuoäm bôûi ethidium bromide vaø coù theå thaáy ñöôïc döôùi hoäp ñeøn soi UV böôùc soùng 312nm. H ình 2. Caùc böôùc trong ph aûn öùng PCR 94C 94C 72C 72C 4C  55Caa 1’30’’ 10’ 0,45’’ 5’ 1’ 30 Chu kyø Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn Hình 3. Soá lö ôïng baûn sao DNA qua caùc c hu kyø khueách ñaïi c uûa phaûn öùng PCR 4.2. Caùc y eáu toá aûnh höôûng ñeán phaûn ö ùng PCR - DNA khuoân: veà lyù thuyeát DNA khuoân duøng trong phaûn öùng PCR phaûi thaät tinh saïch nhöng treân thöïc teá kó thuaät naøy cuõng cho pheùp khueách ñaïi treân DNA thu nhaän tröïc tieáp töø dòch chieát teá baøo maø vaãn cho keát quaû toát. Löôïng DNA khuoân duøng trong phaûn öùng PCR ôû möùc 1pg. Löôïng DNA khuoân quaù cao coù theå taïo ra nhöõng saûn phaåm phuï khoâng mong muoán hay coøn goïi laø vaïch kí sinh. Khuoân DNA coù theå ñöôïc thu nhaän töø caùc maãu khoâng ñöôïc baûo quaûn toát, ñaõ bò phaân huûy töøng phaàn nhö trong caùc veát maùu laâu ngaøy, tinh dòch ñaõ khoâ, hoùa thaïch, toùc, moùng tay cuûa ngöôøi ñaõ cheát... - Enzyme: thoâng thöôøng DNA polymerase duøng trong phaûn öùng PCR phaûi chòu ñöôïc nhieät ñoä bieán tính DNA ñeå coù khaû naêng xuùc taùc söï toång hôïp töø ñaàu ñeán cuoái cuûa quaù trình phaûn öùng. Enzyme thöôøng ñöôïc söû duïng hieän nay laø Taq DNA polymerase ñöôïc taùch chieát töø vi khuaån suoái nöôùc noùng Thermus aquaticus. Ngaøy nay, nhieàu loaïi enzyme polymerase chòu nhieät khaùc ñaõ ñöôïc phaùt hieän vaø ñöa ra thò tröôøng vôùi chöùc naêng hoaøn thieän vaø chuyeân bieät hôn. Enzyme Tth polymerase ñöôïc taùch töø Thermus thermophilus vöøa coù theå hoaït ñoäng nhö moät enzyme phieân maõ Chu kyø 1 2.097.152 baûn sao (lyù thuyeát) Chu kyø 3 dNTP Taq 1 baûn sao Chu kyø 2 > 20 chu kyø Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn ngöôïc ñeåï hình thaønh cDNA trong tröôøng hôïp khuoân laø RNA, vöøa coù khaû naêng xuùc taùc phaûn öùng khueách ñaïi DNA. - Moài vaø nhieät ñoä lai: moài laø moät trong nhöõng yeáu toá quan troïng ñeå ñaït ñöôïc söï khueách ñaïi ñaëc tröng. Vieäc thieát keá vaø choïn moài phaûi ñaït caùc yeâu caàu sau: + Trình töï cuûa moài ñöôïc choïn sao cho khoâng coù söï baét caëp boå sung giöõa moài “xuoâi” vaø moài “ngöôïc”, khoâng coù nhöõng caáu truùc “keïp toùc” do söï baét caëp boå sung giöõa caùc phaàn khaùc nhau cuûa moät moài. + “Nhieät ñoä noùng chaûy” (Tm) cuûa moài xuoâi vaø moài ngöôïc khoâng caùch bieät quaù xa. Thaønh phaàn nucleotide cuûa caùc moài caân baèng traùnh chöùa nhieàu GC. + Moài phaûi daëc tröng cho trình töï DNA caàn khueách ñaïi, khoâng truøng vôùi trình töï laëp laïi treân gen. + Trình töï naèm giöõa hai moài xuoâi vaø ngöôïc khoâng quaù lôùn, phaûn öùng PCR toát nhaát cho nhöõng trình töï nhoû hôn 1kb. - Caùc thaønh phaàn khaùc trong phaûn öùng PCR: boán loaïi nucleotide (dNTP) thöôøng ñöôïc söû duïng ôû noàng ñoä laø 200M cho moãi loaïi nucleotide. Noàng ñoä dNTP cao hôn deã daãn ñeán söï khueách ñaïi kyù sinh. Söï maát caân baèng trong thaønh phaàn caùc nucleotide laøm taêng caùc loãi sao cheùp cuûa polymerase. Noàng ñoä Mg2+ cuõng laø moät nhaân toá aûnh höôûng ñeán quaù trình khueách ñaïi. Noàng ñoä toái öu cuûa ion naøy khoâng tuaân theo moät quy luaät chung, thoâng thöôøng phaûi ñöôïc xaùc ñònh cho töøng phaûn öùng. - Soá löôïng chu kyø phaûn öùng: Soá löôïng chu kyø trong moät phaûn öùng PCR thoâng thöôøng khoâng vöôït quaù 40 chu kyø. Do phaûn öùng PCR dieãn tieán qua 2 giai ñoaïn, trong giai ñoaïn ñaàu soá löôïng baûn sao taêng theo caáp soá nhaân tæ leä vôùi löôïng maãu ban ñaàu. Sau ñoù, ôû caùc chu kyø tieáp theo hieäu quaû khueách ñaïi giaûm haún vì nhieàu nguyeân nhaân nhö söï phaân huûy vaø caïn kieät caùc thaønh phaàn cuûa phaûn öùng; söï xuaát hieän nhöõng saûn phaåm phuï öùc cheá phaûn öùng khueách ñaïi, caùc baûn sao vöøa ñöôïc toång hôïp khoâng baét caëp vôùi moài maø chuùng töï baét caëp vôùi nhau... Ngoaøi ra, soá chu kyø cho moät phaûn öùng coøn phuï thuoäc vaøo soá löôïng baûn maãu ban ñaàu. 4.3. Öu nhöôïc ñieåm cuûa phö ông p haùp PCR ñeå phaùt hieän v i sinh vaät tr ong th öïc ph aåm [10,18] Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn Phöông phaùp PCR giuùp phaùt hieän vi sinh vaät gaây beänh trong thöïc phaåm moät caùch nhanh choùng vaø tin caäy. Öu ñieåm cuûa phöông phaùp naøy laø thôøi gian cho keát quaû nhanh, ít toán keùm veà maët nhaân söï, coù theå nhaän dieän ñöôïc nhöõng sinh vaät khoù nuoâi caáy, vieäc nuoâi caáy taêng sinh laø ñôn giaûn hôn vaø coù khi khoâng caàn thieát. Ngoaøi ra, hoùa chaát caàn cho phaûn öùng PCR saün coù hôn vaø deã toàn tröõ hôn so vôùi tröôøng hôïp huyeát thanh hoïc vaø khoâng caàn duïng cuï vaø moâi tröôøng chaån ñoaùn phöùc taïp. Tuy nhieân phöông phaùp naøy cuõng coù moät soá nhöôïc ñieåm nhö: - Söï öùc cheá hoaït tính cuûa Taq DNA polymerase bôûi thaønh phaàn phöùc taïp cuûa maãu thöïc phaåm. Maëc duø vaäy vieäc taùch chieát vaø tinh cheá DNA töø thöïc phaåm hay moâi tröôøng tröôùc khi thöïc hieän phöông phaùp PCR cho pheùp loaïi boû nhöõng hôïp chaát öùc cheá. - Maät ñoä vi sinh vaät gaây beänh hieän dieän trong maãu thöôøng thaáp, neân trong ña soá tröôøng hôïp caàn coù böôùc nuoâi caáy laøm giaøu ñeå coù maät ñoä ñuû ñeå phaùt hieän baèng PCR. - Phöông phaùp PCR khoâng phaân bieät ñöôïc teá baøo soáng vôùi teá baøo cheát. Do vaäy coù theå daãn ñeán tröôøng hôïp döông tính giaû do DNA töø teá baøo cheát. Ngöôïc laïi phöông phaùp naøy cho pheùp phaùt hieän baøo töû daïng tieàm sinh, hay teá baøo ñaõ cheát cuûa caùc vi sinh vaät gaây beänh hoaëc gaây ngoä ñoäc. Moät giaûi phaùp chung ñoái vôùi caùc nhöôïc ñieåm treân laø keát hôïp moät böôùc taêng sinh ngaén vaø moät böôùc ly taâm loaïi boû thaønh phaàn moâi tröôøng nuoâi caáy vaø röûa teá baøo tröôùc khi tieán haønh phaûn öùng PCR. 4.4. Caùc nghi eân c öùu öùng duïng PCR tr ong phaùt h ieän vi sinh v aät trong thöïc pha åm [10] Hieän nay, coù nhieàu öùng duïng cuûa phaûn öùng PCR trong caùc boä kit thöông maïi duøng ñeå phaùt hieän ñaëc hieäu caùc chuûng vi sinh vaät gaây beänh trong thöïc phaåm, beänh phaåm hoaëc nhöõng loaøi khoù nuoâi caáy. Vieäc phaùt hieän vi sinh vaät gaây beänh trong thöïc phaåm baèng phöông phaùp PCR caàn phaûi qua böôùc nuoâi caáy taêng sinh choïn loïc vi sinh vaät caàn phaùt hieän tröôùc khi taùch chieát DNA ñeå thöïc hieän phaûn öùng PCR. Sau khi nuoâi caáy taêng sinh, tieán haønh thu teá baøo töø dòch taêng sinh ñeå taùch chieát DNA laøm khuoân cho phaûn öùng PCR. Taïi Vieät Nam ñaõ coù moät soá nghieân cöùu öùng duïng kó thuaät PCR trong vieäc phaùt hieän vi sinh vaät gaây beänh trong thöïc phaåm taïi Trung taâm Khoa hoïc vaø Coâng ngheä Sinh hoïc, Tröôøng ÑH Khoa hoïc töï nhieân, Ñaïi hoïc Quoác gia TP. HCM ñaõ thieát laäp Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn ñöôïc moät soá boä kit phaùt hieän moät soá loaøi gaây beänh khaùc trong thöïc phaåm nhö Samonella, Shigella…baèng PCR [10] 5. XAÙC NH AÄN H IEÄU LÖÏC PHÖÔNG PHAÙP [20, 21] 5.1. Ñònh nghóa Xaùc nhaän hieäu löïc (validation) laø quaù trình thöïc hieän ñeå cuûng coá moät muïc ñích söû duïng, thöïc hieän moät qui trình hay moät phöông phaùp baèng nhöõng thí nghieäm kieåm tra vaø cung caáp nhöõng chöùng cöù khaùch quan veà nhöõng keát quaû thu ñöôïc. Xaùc nhaän hieäu löïc moät phöông phaùp phaân tích vi sinh môùi (hay phöông phaùp thay theá, alternative method) laø quaù trình thöïc nghieäm ñeå so saùnh nhöõng keát quaû thu ñöôïc töø phöông phaùp thay theá vaø keát quaû thu ñöôïc so vôùiø phöông phaùp tieâu chuaån (phöông phaùp tham chieáu, reference method) cho cuøng muïc ñích söû duïng. Qui trình xaùc nhaän hieäu löïc cuûa phöông phaùp thay theá thöôøng goàm 2 böôùc: - Xaùc nhaän hieäu löïc sô caáp (primary validation): böôùc naøy do phoøng thí nghieäm ñeà xuaát phöông phaùp môùi tieán haønh nhaèm ñöa ra caùc thoâng soá kó thuaät cuûa phöông phaùp ñeå chöùng minh raèng phöông phaùp naøy coù tính naêng töông ñöông hay coù nhieàu öu ñieåm hôn so vôùi phöông phaùp tieâu chuaån. - Xaùc nhaän hieäu löïc thöù caáp (secondary validation): böôùc naøy nhaèm thaåm tra caùc thoâng soá kó thuaät trong böôùc xaùc nhaän hieäu löïc sô caáp ñoàng thôøi xaùc nhaän ñoä laëp laïi (repeatability), ñoä taùi laäp (reproducibility), ñoä leäch chuaån (standard deviation) cuûa phöông phaùp thay theá. Böôùc naøy ñöôïc tieán haønh bôûi nhieàu phoøng thí nghieäm khaùc nhau döôùi söï chuû trì cuûa moät cô quan coù chöùc naêng. Keát quaû xaùc nhaän hieäu löïc thöù caáp seõ ñöôïc trình leân hoäi ñoàng quoác gia hay caùc toå chöùc quoác teá coù thaåm quyeàn ban haønh phöông phaùp ñeå xem xeùt, ñaùnh giaù vaø ban haønh phöông phaùp trôû thaønh moät phöông phaùp chính thöùc. 5.2. Caùc thoâng soá kó thuaät trong xaùc nhaän h ieäu lö ïc phöông phaùp Ñoä chính xaùc (accuracy): laø thoâng soá ñaùnh giaù khaû naêng cho keát quaû chính xaùc cuûa phöông phaùp thay theá so vôùi phöông phaùp tham chieáu. Ñoä chính xaùc cuûa phöông phaùp thay theá bieåu thò baèng tæ leä cho keát quaû döông hay aâm tính treân caùc maãu coù keát quaû döông tính hay aâm tính khi phaân tích baèng phöông phaùp tham chieáu. - Ñoä ñuùng (precision): laø möùc ñoä thoáng nhaát giöõa nhöõng keát quaû kieåm tra ñoäc laäp cuûa nhöõng laàn phaân tích khaùc nhau töø moät maãu chung. Ñoä chính xaùc bao goàm ñoä laëp laïi vaø ñoä taùi laëp. Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn - Ñoä laëp laïi (repeability): laø möùc ñoä thoáng nhaát giöõa caùc keát quaû töø nhöõng laàn khaûo saùt ñoäc laäp treân moät maãu xaùc ñònh ôû trong cuøng moät ñieàu kieän thöïc hieän veà qui trình, thieát bò, ngöôøi thöïc hieän, taïi cuøng moät thôøi ñieåm. - Ñoä taùi laëp (reproducibility): laø möùc ñoä thoáng nhaát giöõa caùc keát quaû töø nhieàu laàn phaân tích khaùc nhau treân moät maãu xaùc ñònh baèng phöông phaùp phaân tích nhöng ñöôïc thöïc hieän taïi caùc phoøng thí nghieäm khaùc nhau, thôøi gian, ñieàu kieän thöïc hieän vaø ngöôøi phaân tích khaùc nhau. - Ñoä oån ñònh (robustness): laø khaû naêng duy trì tính oån ñònh cuûa keát quaû phaân tích khi caùc ñieàu kieän thöïc hieän coù söï thay ñoåi nhoû. Ñoä oån ñònh cho bieát giôùi haïn thay ñoåi cho pheùp cuûa caùc thaønh phaàn tham gia vaøo qui trình phaân tích vaø cung caáp thoâng tin veà ñoä tin caäy cuûa phöông phaùp trong quaù trình söû duïng. - Ñoä nhaïy (sensitivity): laø chæ soá ñaùnh giaù khaû naêng phaùt hieän vi sinh vaät muïc tieâu coù trong maãu cuûa phöông phaùp thay theá. Chæ soá naøy laø tæ leä giöõa soá keát quaû phaùt hieän döông tính so vôùi soá keát quaû döông tính khi phaân tích baèng phöông phaùp tham chieáu. - Ñoä ñaëc hieäu (specificity): laø khaû naêng phöông phaùp ñoù cho keát quaû aâm tính treân maãu phaân tích khoâng chöùa vi sinh vaät muïc tieâu (ñöôïc kieåm chöùng baèng phöông phaùp tham chieáu). Chæ soá naøy laø tæ leä giöõa soá keát quaû phaùt hieän döông tính so vôùi soá keát quaû aâm tính khi phaân tích baèng phöông phaùp tham chieáu. - AÂm tính giaûû (false negative): laø keát quaû aâm tính khi phaân tích moät maãu chaéc chaén chöùa vi sinh vaät muïc tieâu. - Döông tính giaû (false positive): quaû döông tính khi phaân tích maãu chaéc chaén khoâng chöùa vi sinh vaät muïc tieâu. - Giôùi haïn phaùt hieän: laø maät ñoä teá baøo vi sinh vaät thaáp nhaát maø moät phöông phaùp phaân tích coù theå phaùt hieän ñöôïc. Taïi giôùi haïn phaùt hieän, soá laàn phaân tích cho keát quaû döông tính phaûi treân 50%. Vieäc xaùc nhaän hieäu löïc phaûi chöùng minh ñöôïc raèng phöông phaùp thay theá coù giôùi haïn phaùt hieän baèng hoaëc thaáp hôn giôùi haïn phaùt hieän cuaû phöông phaùp tham chieáu. Theo tieâu chuaån AOAC, giôùi haïn phaùt hieän cuaû phöông phaùp phaân tích vi sinh vaät coù theå choïn ôû caùc caáp ñoä khaùc nhau. Thaáp nhaát laø 1 –5 teá baøo/25g maãu thöïc phaåm, cao nhaát laø 10 – 50 teá baøo/25g maãu thöïc phaåm. Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn Caùc thoâng soá kó thuaät neâu treân cho pheùp ta ñaùnh giaù tính khaû thi cuûa phöông phaùp thay theá, ñoàng thôøi cuõng cho bieát ñoä tin caäy cuûa keát quaû khi phaân tích baèng phöông phaùp naøy. Caùc thoâng soá kó thuaät cuûa phöông phaùp thay theá khi ñöôïc coâng boá, seõ cho pheùp caùc phoøng thí nghieäm löïa choïn phöông phaùp phuø hôïp vôùi yeâu caàu vaø naêng löïc cuûa mình. 5.3. YÙ nghóa c uûa v ieäc xaùc nhaän hieäu löïc phöô ng ph aùp thay theá Moät phöông phaùp môùi phaûi ñöôïc ñaùnh giaù so saùnh vôùi nhöõng phöông phaùp truyeàn thoáng ñaõ ñöôïc xem laø ñaùng tin caäy, ñöôïc söû duïng töø tröôùc tôùi nay. Vieäc ñaùnh giaù naøy giuùp cho chuùng ta nhaän ñònh moät caùch töông ñoái phöông phaùp naøo laø toái öu hôn veà caùc maët nhö thôøi gian, tieàn baïc... Töø ñoù tuøy vaøo ñieàu kieän yeâu caàu cuï theå phoøng thí nghieäm vaø ngöôøi phaân tích seõ löïa choïn phöông phaùp mang tính hieäu quaû nhaát ñaùp öùng cho coâng vieäc cuûa mình. Do ñoù vieäc xaùc nhaän hieäu löïc phaûi ñöôïc thöïc hieän moät caùch khaùch quan vaø phaûi ñöôïc kieåm ñònh laïi bôûi caùc cô quan toå chöùc coù thaåm quyeàn. Xaùc nhaän hieäu löïc phöông phaùp thay theá giuùp boå sung nhöõng thieáu soùt haïn cheá cuûa phöông phaùp ñeå trôû thaønh moät phöông phaùp ñaùng tin caäy vaø ñöôïc söû duïng roäng raõi. Trong boái caûnh vaán ñeà veà an toaøn veä sinh thöïc phaåm ñang raát ñöôïc quan taâm nhö hieän nay, vieäc löïa choïn phöông phaùp phaân tích naøo ñeå ñaùnh giaù chaát löôïng cuûa caùc loaïi thöïc phaåm laø vaán ñeà raát quan troïng. Vieäc xaùc nhaän hieäu löïc ñeå hoaøn thieän phöông phaùp, giuùp phöông phaùp thay theá ñöôïc chaáp nhaän roäng raõi taïo söï thoáng nhaát, söï hoøa hôïp mang tính quoác teá trong vieäc phaân tích caùc chæ tieâu vi sinh seõ goùp phaàn mang laïi söï tieän lôïi trong quaù trình mua baùn trao ñoåi caùc maët haøng thöïc phaåm. Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn PHAÀN II VAÄT LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP 1. VAÄT LIEÄU 1.1. Thieát bò v aø duïng cuï Caùc duïng cuï vaø thieát bò chính ñöôïc söû duïng bao goàm: - Maùy daäp maãu STOMACHER 400 CIRCULATOR - Maùy ly taâm (Hettich Centrifuge) - Maùy luaân nhieät Mastercycler do haõng Eppendorf saûn xuaát - Boä ñieän di ngang Horizon 58 (Life technoogy) - Hoäp soi ñeøn töû ngoaïi Hoefer (Model No UVTM – 19 – 30V) - Beå ñieàu nhieät - Tuû aám - Tuû saáy - Noài haáp - Maùy chuïp hình gel IMAGE MASTERS VDS (Amersham Pharmacia Biotech APB) 1.2. Hoaù chaát vaø moâi tröôøng: - Hoùa chaát duøng cho PCR + Taq DNA polymerase do Amersham Pharmacia Biotech (APB) cung caáp coù noàng ñoä 5U/ml. Enzyme naøy ñöôïc baûo quaûn trong dung dòch goàm 500mM Tris HCl pH 7,5, 0,1 mM EDTA, 5mM DTT vaø 50% glycerol, ñöôïc baûo quaûn ôû - 20C. + Ñeäm PCR 10X: ñöôïc cung caáp keøm vôùi Taq DNA polymerase. Thaønh phaàn dung dòch ñeäm naøy goàm 500mM KCl, 15mM MgCl2,100mM Tris HCl pH 9,0, ñöôïc baûo quaûn ôû nhieät ñoä phoøng. + dNTP ñöôïc cung caáp bôûi APB; moãi dNTP coù noàng ñoä 100mM trong nöôùc, pH 7,5. Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn + Moài: trình töï ñích ñöôïc choïn ñoái vôùi E. coli laø moät phaàn cuûa gen uidA qui ñònh söï toång hôïp enzym ß-D-glucuronidase hieän dieän ôû taát caû caùc chuûng cuûa loaøi E. coli. Caëp moài EC töï thieát keá ñeå taïo saûn phaåm khueách ñaïi daøi 299bp. + Thang DNA: trong nghieân cöùu naøy chuùng toâi söû duïng thang DNA chuaån 100bp do Promega cung caáp ; kích thöôùc caùc vaïch cuûa thang chuaån nhö Hình 4. H ình 4. Thang DNA ch uaån 100bp - Hoaù chaát duøng cho ñieän di vaø quan saùt keát quaû + Gel agarose (Sigma): gel noàng ñoä 1,5% agarose ñöôïc pha trong ñeäm TAE. + Dung dòch nhuoäm DNA treân gel: ethidium bromide 5mg/ml + Ñeäm TAE 1X chöùa 4,48g Tris, 2ml Na2 EDTA 0,5M pH 8,0, 1,14ml glacial acetic acid vaø nöôùc vöøa ñuû 1000ml. + Dung dòch TE chöùa10 mM Tris – HCl pH 8,0. + Dung dòch naïp maãu (Loading dye buffer) coù thaønh phaàn 30% glycerol, 0,15% bromophenol blue, 200mM Tris, 20mM EDTA. - Thuoác thöû sinh hoùa + Thuoác thöû Kovac ,s: 5g p–ethylamino benzaldehyde trong 75ml amyl hoaëc isoamyl alcohol chöùa 25ml HCl ñaäm ñaëc. + Thuoác thöû Methyl red: hoøa tan 0,1g ñoû methyl vaøo 300ml ethanol 95%. Theâm nöôùc caát vaøo cho ñuû 500ml. + Thuoác thöû Voges Proskauer: 5% -napthol trong coàn tuyeät ñoái vaø dung dòch KOH 40%. Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn - Dung dòch Saline pepton Water (SPW): duøng ñeå ñoàng nhaát maãu thöïc phaåm coù thaønh phaàn goàm 1g pepton; 5g NaCl, nöôùc caát vöøa ñuû 1lít. Haáp 121C trong 15 phuùt. - Moâi tröôøng Tryptic Soya Agar (TSA) duøng ñeå phuïc hoài vaø giöõ gioáng vi sinh vaät thaønh phaàn goàm 1,5g Trypticase pepton, 3g Phytone pepton, 20g NaCl, 15g agar nöôùc caát vöøa ñuû 1 lít. Ñun ñeå hoaø tan moâi tröôøng, phaân phoái 5ml vaøo caùc oáng nghieäm, haáp 121C trong 15 phuùt, pH cuoái 7,3 ± 0,2. - Moâi tröôøng Tryptic Soya Broth (TSB): duøng ñeå hoaït hoùa gioáng vi sinh vaät. Thaønh phaàn moâi tröôøng goàm 17g Trypticase pepton, 3g Phytone pepton, 20g NaCl, 2,5g KH2PO4, 2,5g glucose, nöôùc caát vöøa ñuû 1 lít. Ñun noùng, laéc nheï ñeå hoøa tan, phaân phoái vaøo erlen hoaëc oáng nghieäm, haáp 121C trong 15 phuùt, pH cuoái cuøng 7,3 ± 0,2. - Moâi tröôøng Plate Count Agar (PCA): duøng ñeå kieåm tra maät ñoä vi sinh vaät baèng phöông phaùp ñeám khuaån laïc. Thaønh phaàn moâi tröôøng goàm 17g casein, 3g solbean meal, 5g NaCl, 2,5g K2HPO4, 2,5g glucose, nöôùc caát vöøa ñuû 1 lít, pH cuoái cuøng 7,3 ± 0,3. - Moâi tröôøng Brilliant Green Bile Lactose Broth (canh BGBL): duøng ñeå taêng sinh choïn loïc E. coli. Thaønh phaàn moâi tröôøng goàm 10g pepton, lactose10g, 20g maät boø, 0,0133g brilliant green nöôùc caát vöøa ñuû 1 lít. Hoøa tan pepton vaø lactose vaøo 500ml nöôùc caát, maät boø vaøo trong khoaûng 200ml vaø brilliant green trong khoaûng 100ml nöôùc caát. Troän ñeàu 3 dung dòch ñaït theå tích cuoái cuøng laø 1 lít, chænh pH moâi tröôøng khoaûng 7,4 vaø phaân phoái 10ml vaøo moãi oáng nghieäm coù chöùa oáng Durham. Haáp 110C trong 15 phuùt, pH 7,2 ± 0,2 ôû 25C. - Moâi tröôøng EMB: duøng ñeå phaân laäp E. coli coù thaønh phaàn goàm 10g peptone, 2g K2HPO4, 5g lactose, 5g saccharose, 0,4g ñoû Eosin, 0,07g xanh methylen, 13,5g agar. - Moâi tröôøng thöû nghieäm sinh hoùa + Simon citrate: duøng ñeå thöû nghieäm khaû naêng söû duïng citrate cuûa vi sinh vaät coù thaønh phaàn goàm 2g sodium citrate, 5g NaCl,1g KH2PO4,1g NH4H2PO4, 0,2g MgSO4, 0,08g xanh Bromthymol, 15g agar, nöôùc caát vöøa ñuû 1 lít, pH 6,8 ± 0,2. + Trypton water (nöôùc trypton): duøng ñeå thöû nghieäm khaû naêng sinh Indol coù thaønh phaàn goàm 20g tryptone hoaëc trypticase, nöôùc caát vöøa ñuû 1 lít, pH 7,3 ± 0,2 . Phaân phoái 4ml moâi tröôøng vaøo caùc oáng nghieäm, haáp 121C trong 15 phuùt. Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn + Moâi tröôøng thöû nghieäm MR – VP coù thaønh phaàn goàm 7g buffered pepton powder, 5g glucose, 5g KH2PO4 nöôùc caát vöøa ñuû 1 lít, pH cuoái cuøng 6,9 ± 0,2. Hoaø tan moâi tröôøng trong nöôùc noùng, phaân phoái 10 ml vaøo oáng nghieäm haáp 121C trong 15 phuùt. 1 .3. Vaät li eäu thí nghieäm - Maãu thöïc phaåm: maãu thöïc phaåm söû duïng trong nghieân cöùu naøy ñöôïc mua töø caùc chôï (Taân Phuù, Thuû Ñöùc, Baøo Sen,ï Nancy, Traïm 2 Caàu Vöôït vaø sieâu thò ( Ñaàm Sen , Mieàn Ñoâng) trong thaùng 8 naêm 2004 thuoäc khu vöïc thaønh phoá Hoà Chí Minh. - Chuûng vi sinh vaät: caùc chuûng vi sinh vaät duøng trong luaän vaên ñöôïc nhaän töø Phoøng thí nghieäm Coâng ngheä Sinh hoïc phaân töû Tröôøng Ñaïi hoïc Khoa hoïc töï nhieân, Ñaïi hoïc Quoác gia TP. HCM, bao goàm: Salmonella typhimurinum, Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus, Staphylococus aureus, Shigella sonnei, Clostridium botulinum ,Clostridium perfringgens vaø caùc chuûng E. coli coù nguoàn goác töø Ñaïi hoïc RMIT (UÙc) vaø Vieän Pasteur TP. HCM. 2. PHÖÔNG PHAÙP 2.1. Thu vaø chuaån bò maãu Maãu thöïc phaåm ñöôïc choïn ñaïi dieän cho caùc loaïi thöïc phaåm theo höôùng daãn cuûa qui trình ñaùnh giaù NordVal (Ñan Maïch). Maãu ñöôïc thu mua töø caùc chôï, sieâu thò vaø ñöôïc baûo quaûn taïm thôøi trong caùc bao nilon voâ truøng ôû ñieàu kieän laïnh vaø ñöôïc ñoâng laïnh ôû - 20C taïi phoøng thí nghieäm. Tröôùc khi xöû lyù maãu, röûa saïch tay baèng xaø phoøng, nöôùc saïch vaø saùt truøng baèng coàn 70. Thöïc hieän vieäc xöû lyù maãu beân trong tuû caáy voâ truøng. Duøng coàn 70 saùt truøng keùo, nhíp vaø mieäng bao nylon. Ghi chuù chi tieát nhö teân maãu, ngaøy laáy maãu, kyù hieäu maãu treân bao nilon. Duøng keùo, nhíp thu chính xaùc 10g maãu moät caùch ngaãu nhieân ôû nhieàu ñieåm khaùc nhau treân khoái maãu vaøo bao daäp maãu, ñoàng nhaát vaø tieán haønh phaân tích. 2.2. Ñoàng nhaát maãu Theâm 90g moâi tröøông Saline Pepton Water (SPW) vaøo bao daäp maãu chöùa 10g maãu. Ñoàng nhaát maãu baèng maùy daäp maãu ôû toác ñoä 230 voøng/phuùt trong 30 giaây. Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn 2.3. Phöông phaùp pha loaõng baäc 10 Dòch teá baøo sau khi taêng sinh ñöôïc pha loaõng baäc 10 lieân tieáp tröôùc khi tieán haønh xaùc ñònh maät ñoä teá baøo baèng phöông phaùp ñeám khuaån laïc. Chuaån bò caùc eppendorf chöùa 0,9ml nöôùc muoái sinh lyù 0,85% voâ truøng. Duøng pipetman vaø ñaàu tip voâ truøng chuyeån 0,1ml dòch teá baøo vi khuaån vaøo eppendorf. Vortex ñeå ñöôïc dung dòch coù ñoä pha loaõng laø 10–1. Huùt 0,1ml dung dòch coù ñoä pha loaõng 10–1 cho vaøo oáng nghieäm khaùc vaø thöïc hieän nhö treân ñeå coù ñoä pha loaõng 10–2. Laëp laïi vieäc pha loaõng moät caùch töông töï ñeå coù caùc dòch pha loaõng 10 –3 ñeán 10–9. 2.4. Ñònh löôïng E. coli baèng p höông phaùp ñeám khuaån laïc Duøng pipetman vaø ñaàu tip voâ truøng chuyeån voâ truøng 0,1ml maãu ôû caùc ñoä pha loaõng khaùc nhau vaøo giöõa ñóa petri voâ truøng; söû duïng moãi ñaàu tip rieâng cho moät ñoä pha loaõng vaø moãi ñoä pha loaõng thöïc hieän töø 2 – 4 ñóa. Ñoã 15 - 20ml moâi tröôøng thaïch PCA (ñem ñun chaûy vaø ñeå nguoäi 45oC) moät caùch voâ truøng vaøo ñóa petri. Xoay troøn hoäp petri khoaûng 5 laàn xuoâi vaø ngöôïc chieàu kim ñoàng hoà. Ñaët ñóa treân maët phaúng ngang cho ñoâng töï nhieân. Khi moâi tröôøng ñaõ ñoâng, laät uùp ñóa vaø ñaët vaøo tuû aám ôû 37 ± 1C trong 24 giôø. Ñeám soá löôïng khuaån laïc moïc treân ñóa. Choïn noàng ñoä pha loaõng coù soá löôïng khuaån laïc naèm trong khoaûng 25 – 250 khuaån laïc/petri. - Tính soá löôïng khuaån laïc coù trong 1ml maãu nhö sau: C = N/ n1x v1x f1+ ....+ ni x vi x fi (CFU/ml) Trong ñoù, C: soá löôïng vi sinh vaät trong 1ml maãu (CFU/ml) N: taát caû caùc khuaån laïc ñeám ñöôïc treân taát caû caùc ñóa ni: soá löôïng ñóa ñöôïc ñeám taïi ñoä pha loaõng i V: theå tích dòch maãu caáy vaøo trong 1 ñóa fi: ñoä pha loaõng töông öùng 2.5. Phaân laäp chu ûng E. coli töø maãu thöïc p haåm - Taêng sinh: caân chính xaùc 10g maãu vaøo moät bao PE, boå sung 90g moâi tröôøng BGLB. Ñem ñoàng nhaát maãu vaø huùt 1ml cho vaøo oáng tröôøng Durham, uû ôû 44C ± 0,5C trong 24 giôø. Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn - Phaân laäp: sau khi taêng sinh 24 giôø duøng khuyeân caáy ria dòch maãu töø oáng coù phaûn öùng döông tính (coù boït khí trong oáng Durham) leân moâi tröôøng EMB. UÛ ôû 37C trong 24 giôø. Quan saùt ñaëc ñieåm hình thaùi ñaëc tröng cuûa khuaån laïc E. Coli (maøu ñoû tía, coù aùnh kim, bôø ñeàu, ñöôøng kính 0,5mm). - Khaúng ñònh baèng caùc thöû nghieäm sinh hoaù: caùc khuaån laïc nghi ngôø laø E. coli treân moâi tröôøng EMB ñöôïc caáy sang oáng nghieäm chöùa moâi tröôøng TSA thaïch nghieâng. OÁng nghieäm ñöôïc uû ôû 37C ± 0,5C trong 24 giôø. Caáy caùc khuaån laïc vaøo caùc oáng moâi tröôøng thöû nghieäm sinh hoaù sau ñaây: 1 oáng canh trypton; 2 oáng MR-VP; 1 oáng Simon citrate ñeå thöïc hieän thöû nghieäm IMViC (indol, methyl red, VP vaø citrate). + Thöû nghieäm Indol: nhoû vaøi gioït thuoác thöû Kovac,s vaøo canh khuaån trong moâi tröôøng canh trypton. Phaûn öùng indol laø döông tính khi coù voøng ñoû xuaát hieän treân beà maët, phaûn öùng laø aâm tính khi khoâng coù voøng ñoû treân. + Thöû nghieäm Methyl Red: nhoû vaøi gioït thuoác thöû Methyl Red vaøo canh khuaån trong moâi tröôøng MR–VP, laéc ñeàu. Phaûn öùng MR laø döông tính khi canh khuaån chuyeån sang maøu ñoû, phaûn öùng laø aâm tính khi canh khuaån khoâng chuyeån maøu. + Thöû nghieäm Voges Proskauer: cho 0,2ml thuoác thöû –napthol 5% vaøo canh khuaån MR–VP, laéc maïnh; boå sung theâm 0,2 – 0,3 ml KOH 40%, laéc maïnh, quan saùt 10 – 30 phuùt. Phaûn öùng VP laø döông tính khi canh khuaån chuyeån sang maøu ñoû, phaûn öùng laø aâm tính khi canh khuaån khoâng chuyeån maøu. - Thöû nghieäm Simon citrate: trong moâi tröôøng Simon citrate, phaûn öùng laø döông tính khi moâi tröôøng coù xuaát hieän sinh khoái vi khuaån vaø maøu moâi tröôøng chuyeån sang xanh da trôøi, phaûn öùng laø aâm tính khi moâi tröôøng khoâng coù sinh khoái vaø khoâng chuyeån maøu. Qui trình phaân laäp, ñònh danh E. coli baèng phöông phaùp nuoâi caáy vaø thöû nghieäm sinh hoùa ñöôïc toùm taét treân H ình 5. Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn Laáy 1g (1ml) maãu vaøo 10ml moâi tröôøng BGBL UÛ ôû 44C  0,5C trong 24 – 48 giôø Choïn caùc oáng coù sinh hôi caáy sang EMB agar. Maãu khoâng sinh hôi ñöôïc xem laø aâm tính E. coli UÛ ôû 37  0,5C trong 24 giôø Choïn khuaån laïc deït, coù aùnh kim tím, ñöôøng kính khoaûng 1mm ñeå caáy sang TSA UÛ ôû 37C  0,5C qua ñeâm Thöû nghieäm IMViC E. coli coù bieåu hieän sinh hoaù: Indol (+), MR (+), VP (-), Citrat (-). Moät trong soá caùc phaûn öùng treân sai laø khoâng phaûi E. coli Keát luaän: coù hay khoâng coù E. coli/g thöïc phaåm H ình 5. Quy trình phaân l aäp, ñònh danh E. coli baèng phöông p haùp nuoâi caáy v aø thö û nghieäm sinh hoaù Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn 2.6. Thu vaø xöû lyù khuoân DNA ch o ph aûn öùng PCR Huùt 1ml dòch taêng sinh cho vaøo eppdorrf saïch. Ly taâm 800 voøng/phuùt trong 5 phuùt. Chuyeån phaàn dòch beân treân sang moät eppendorf khaùc. Ly taâm 10.000 voøng/phuùt trong 10 phuùt ñeå thu nhaän sinh khoái. Röûa sinh khoái teá baøo trong 1ml nöôùc caát voâ truøng. Thu nhaän sinh khoái sau khi röûa baèng caùch ly taâm 10000 voøng/ phuùt trong 5 phuùt. Huyeàn phuø hoaù sinh khoái trong 0,2ml TE. Ñun soâi caùch thuûy dòch huyeàn phuø teá baøo trong 10 phuùt, ly taâm 10.000 voøng/phuùt trong 5 phuùt. Dòch noåi phía treân ñöôïc söû duïng laøm khuoân DNA cho phaûn öùng PCR. 2.7. Ñieàu kieän cuûa phaûn öùng PCR phaùt hieän E. coli Phaûn öùng PCR ñöôïc thöïc hieän trong theå tích 25l vôùi caùc thaønh phaàn nhö sau: - d H2O 13l - Ñeäm PCR 10X 2,5l - dNTP 10X 2,5l - MgCl2 25 mM 2,5l - Moài EC1 6 pM 1,0l - DNA 3,0l - Taq DNA polymerase 1UI/l 0,5l Chöông trình cuûa phaûn öùng PCR ñöôïc thieát laäp nhö sau: hoãn hôïp phaûn öùng ñöôïc giöõ ôû 95C trong 10 phuùt ñeå bieán tính hoaøn toaøn caùc sôïi DNA, ñoàng thôøi hoaït hoùa Taq DNA polymerase. Phaûn öùng chính ñöôïc thöïc hieän trong 35 chu kyø, moãi chu kyø goàm: 95C trong 1 phuùt, 55C trong 45 giaây, 72C trong 1 phuùt. Sau khi keát thuùc phaûn öùng chính maãu ñöôïc giöõ ôû 72C trong 10 phuùt. Maãu ñöôïc giöõ oån ñònh ôû 4C trong 30 phuùt tröôùc khi phaân tích. Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn 2 .8. Phaân tíc h saûn p haåm PCR baèng ñieän di tr eân g el agar ose - Chuaån bò gel agarose 1,5%: caân 0,75g agarose vaøo bình tam giaùc 100ml, theâm vaøo 50ml ñeäm TAE, ñun baèng loø vi ba trong khoaûng 2 - 3 phuùt cho ñeán khi agarose tan hoaøn toaøn, laéc ñeàu. Ñeå nguoäi khoaûng 60C. Ñoå hoãn hôïp gel vaøo khay ñoå gel ñaõ chuaån bò saün cuøng vôùi caùc löôïc taïo gieáng. Ñeå yeân trong khoaûng 30 phuùt cho gel ñoâng ñaëc hoaøn toaøn. Beà daøy cuûa gel sau ñoâng ñaëc khoaûng 0,7 - 0,8cm. - Nheï nhaøng laáy löôïc ra khoûi gel, ñaët khuoân gel vaøo boàn ñieän di. Cho dung dòch ñieän di vaøo boàn cho ñeán khi ngaäp gel. - Cho vaøo moãi oáng PCR chöùa saûn phaåm khueách ñaïi 2,5l dung dòch naïp maãu. Troän ñeàu, duøng micropipette huùt 10l moãi maãu cho vaøo trong caùc gieáng treân gel ñieän di ñaõ chuaån bò. Trong quaù trình phaân tích luoân daønh 1 gieáng cho thang DNA chuaån (DNA ladder) hay maãu ñoái chöùng döông. Thöïc hieän quaù trình ñieän di ôû hieäu ñieän theá 100V, trong 45 - 50 phuùt. Sau khi keát thuùc ñieän di, gel ñöôïc ngaâm trong dung dòch ethidium bromide1l/ml trong 10 phuùt, sau ñoù röûa baèng nöôùc trong 5 phuùt. - Phaùt hieän caùc saûn phaåm khueách ñaïi döôùi hoäp ñeøn soi UV 312nm. ÔÛ caùc maãu ñoái chöùng aâm, phaûi khoâng coù vaïch cuûa saûn phaåm khueách ñaïi. Caùc maãu döông tính laø nhöõng maãu coù vaïch khueách ñaïi truøng vôùi vaïch khueách ñaïi cuûa maãu ñoái chöùng döông hay coù kích thöôùc khoaûng 299bp. Caùc maãu khoâng coù saûn phaåm khueách ñaïi hay coù vaïch saûn phaåm khueách ñaïi khoâng truøng vôùi vaïch khueách ñaïi cuûa maãu ñoái chöùng döông hay khoâng töông öùng vôùi kích thöôùc ñaõ bieát treân thang DNA chuaån laø nhöõng maãu aâm tính. 2.9. Kieåm c höùng maãu aâm tính Caùc maãu aâm tính ñöôïc söû duïng trong caùc thí nghieäm gaây nhieãm E. coli ñeå xaùc ñònh ñoä nhaïy, thoâng soá kyõ thuaät vaø phaïm vi aùp duïng cuûa phöông phaùp PCR. Maãu naøy caàn ñöôïc kieåm chöùng khoâng coù söï hieän dieän cuûa E. coli (aâm tính) baèng caùch laëp laïi 3 laàn phaân tích ôû caùc phaàn khaùc nhau cuûa khoái maãu baèng phöông phaùp nuoâi caáy truyeàn thoáng treân cuøng moät maãu. Neáu caû ba laàn ñeàu cho keát quaû aâm tính thì keát luaän maãu thöïc phaåm ñoù khoâng chöùa E. coli. 2.10. Xaùc ñònh ñoä nhaïy cuûa phaûn öùng PCR Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn Pha dòch vi khuaån E. coli baèng dung dòch NaCl 0,85% voâ truøng ôû caùc noàng ñoä pha loaõng baäc 10–1 ñeán 10–9 vaø xaùc ñònh maät ñoä teá baøo E. coli ôû moãi ñoä pha loaõng. Phöông phaùp xaùc ñònh maät ñoä nhö sau: huùt 100l dòch pha loaõng cho vaøo ñóa petri voâ truøng, ñoã vaøo moãi ñóa 10 – 15ml moâi tröôøng PCA ñaõ ñöôïc ñun chaûy vaø laøm nguoäi ôû 45C. Troän ñeàu dòch maãu vaø moâi tröôøng baèng caùch xoay ñóa xuoâi vaø ngöôïc chieàu kim ñoàng hoà 3 – 5 laàn. Ñaët ñóa treân maët phaúng naèm ngang khoaûng 30 phuùt cho agar ñoâng laïi, uû 37C trong 24 giôø. Ñeám soá khuaån laïc xuaát hieän treân ñóa. Huùt 500l dòch pha loaõng ñaõ ñöôïc xaùc ñònh maät ñoä vaøo eppendorf voâ truøng, xöû lí teá baøo ñeå ly trích khuoân DNA vaø thöïc hieän phaûn öùng PCR laàn löôït treân caùc maãu coù maät ñoä teá baøo 9 x 101 – 9 x 105 CFU/ml. 2.11. Kieåm chöùng tính chu yeân bieät c uûa c aëp moài EC Tính chuyeân bieät cuûa caëp moài ñaõ ñöôïc thieát laäp cho vi sinh vaätmuïc tieâu ñöôïc khaûo saùt baèng caùch söû duïng khuoân DNA töø caùc chuûng E. coli vaø caùc loaøi vi sinh vaät khaùc nhö Salmonella typhimurinum, Shigella sonnei, Clostridium botulinum, C. perfringgens, Vibrio cholerae...Caëp moài laø chuyeân bieät khi cho keát quaû (+) vôùi E. coli vaø cho keát quaû (-) vôùi caùc loaøi khaùc. 2.12. Kieåm chöùng ñieàu kieän toái ö u cuûa ph aûn öùng PCR Phaûn öùng PCR chòu aûnh höôûng cuûa nhieàu yeáu toá nhö nhòeât ñoä baét caëp giöõa moài vaø khuoân, noàng ñoä moài , noàng ñoä Mg2+ vaø noàng ñoä Taq… - Nhieät ñoä: ñöôïc kieåm chöùng trong daõy nhieät ñoä töø 50 - 67C. - Mg2+: ñeå xaùc ñònh noàng ñoä Mg2+ toái öu cho phaûn öùng PCR, phaûn öùng PCR ñöôïc thöïc hieän ôû nhieät ñoä baét caëp toái öu vôùi caùc noàng ñoä Mg2+ laø 2, 2,5, 3 , 3,5 vaø 4mM. - Noàng ñoä moài: ñöôïc kieåm chöùng laø 5,5; 6 vaø 6,5pM/phaûn öùng. 2.13. Khaûo saùt thôøi g ian taêng sinh toái thieåu phaùt h ieän E. coli treân maãu th öïc phaåm Tieán haønh khaûo saùt thôøi gian taêng sinh toái thieåu cho giai ñoaïn taêng sinh E. coli trong caùc maãu thöïc phaåm vaø aûnh höôûng cuûa chaát neàn thöïc phaåm leân phaûn öùng PCR. Ba loaïi maãu aâm tính ñoái vôùi E. coli ñöôïc choïn laø caù, pate vaø söõa. Gaây nhieãm E. coli vaøo 10g maãu, ñoàng nhaát vôùi 90ml Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn dung dòch pepton vaø uû ôû 37C. Thöïc hieän phaûn öùng PCR treân dòch taêng sinh sau moãi 2 giôø vaø xaùc ñònh thôøi gian taêng sinh toái thieåu taïi thôøi ñieåm keát quaû PCR baét ñaàu döông tính. 2.14. Xaùc ñònh gi ôùi haïn phaùt h ieän Gaây nhieãm E. coli laàn löôït vaøo caùc maãu thöïc phaåm aâm tính ñeå xaùc ñònh giôùi haïn phaùt hieän cuûa phöông phaùp PCR. Khaûo saùt giôùi haïn phaùt hieän ñöôïc thöïc hieän treân 5 maãu thöïc phaåm ñaïi dieän cho caùc nhoùm thòt, rau, söõa, boät vaø tröùng. Maãu ñöôïc gaây nhieãm E. coli ôû 4 maät ñoä trong caùc khoaûng 1 –5, 5 – 10, 10 – 20, 20 – 50 CFU/g. Moãi ñoái töôïng maãu ñöôïc laëp laïi 3 laàn. Qui trình xaùc ñònh giôùi haïn phaùt hieän ñöôïc tieán haønh theo H ình 6. Hình 6. Sô ñoà khaûo saùt g iôùi haïn phaùt hieän E. coli tr ong maãu thö ïc ph aåm g aây nhieãm theo phöông ph aùp tr uyeàn thoáng vaø PCR 2. 15. K ieåm chöùng ñoä laëp laïi Thöïc hieän phaân tích laäp laïi 10 laàn baèng phöông phaùp PCR treân cuøng moät dòch maãu ñaõ xöû lyù, taïi cuøng moät thôøi ñieåm, treân cuøng moät ñieàu kieän vôùi moïi thaønh phaàn cuûa phaûn öùng ñeàu khoâng thay ñoåi. Vieäc khaûo saùt ñöôïc thöïc hieän treân moät dòch maãu aâm tính vaø moät dòch maãu döông tính. 10 g maãu + 90 g SPW Ñoàng nhaát maãu Huùt 10 ml + 90 ml TSB Gaây nhieãm E. coli ôû 4 maät ñoä. UÛ ôû 370C trong 24 giôø Phaùt hieän E. coli baèng phöông phaùp truyeàn thoáng Phaùt hieän E. coli baèng phöôngphaùp PCR Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn 2.16. Xaùc ñònh c aùc giôùi h aïn oån ñònh cuûa phöô ng p haùp PCR - Khaûo saùt nhieät ñoä baét caëp cuûa moài: tieán haønh khaûo saùt caùc phaûn öùng PCR ôû nhöõng ñieàu kieän nhieät ñoä baét caëp khaùc nhau trong khi vaãn giöõ nguyeân caùc thaønh phaàn phaûn öùng. Caùc nhieät ñoä ñöôïc choïn ñeå khaûo saùt laø 50C , 52C, 55C, 58C, 60C vaø 62C. - Khaûo saùt noàng ñoä Mg2+ trong khoaûng giaù trò 1,0mM, 1,5mM, 2,0mM, 2,5mM, 3,0mM, 3,5mM vaø 4mM. - Khaûo saùt giôùi haïn noàng ñoä moài cho pheùp: trong qui trình ñaõ ñöôïc thieát laäp, noàng ñoä moãi moài trong moät phaûn öùng laø 6pM. Giôùi haïn dao ñoäng noàng ñoä cho pheùp ñöôïc khaûo saùt vôùi caùc noàng ñoä:1,25pM, 2,5pM, 3,75 M, 5pM, 6,25pM, 7,5p vaø 8,75pM trong moät phaûn öùng (25 l). Toång theå tích vaø caùc thaønh phaàn khaùc cuûa phaûn öùng khoâng thay ñoåi. - Khaûo saùt giôùi haïn dao ñoäng noàng ñoä Taq DNA polymerase cho pheùp: trong qui trình ñaõ ñöôïc thieát laäp, löôïng Taq DNA polymerase ñöôïc söû duïng trong phaûn öùng laø 0,5U/25µl. Do söû duïng vôùi theå tích nhoû neân ñeå deã daøng thao taùc chuùng toâi tieán haønh pha loaõng noàng ñoä Taq polymerase 5 laàn trong ñeäm pha loaõng daønh rieâng cho Taq DNA polymerase. Khaûo saùt giôùi haïn dao ñoäng noàng ñoä Taq cho pheùp ñöôïc tieán haønh vôùi caùc giaù trò 0,5, 1, 1,5 vaø 2µl/phaûn öùng. 2.17. Xaùc ñònh caùc thoâng soá kyõ thuaät cuûa phöông phaùp PCR so vôùi nuoâi caáy Choïn khoaûng 30 maãu ñaïi dieän cho caùc nhoùm thöïc phaåm khaùc nhau goàm thòt, gia caàm, rau quaû, nguõ coác, söõa, boät... ôû caùc daïng nguyeân lieäu hay ñaõ qua cheá bieán. Kieåm chöùng maãu aâm tính vôùi E. coli. Gaây nhieãm E. coli vôùi maät ñoä töông ñöông giôùi haïn phaùt hieän vaøo 1g maãu aâm tính. Tieán haønh phaân tích ñoàng thôøi baèng hai phöông phaùp nuoâi caáy vaø PCR. Keát quaû phaùt hieän cuûa moãi phöông phaùp seõ ñöôïc toùm taét treân Baûn g 2 ñeå tính toaùn caùc thoâng soá kyõ thuaät cuûa phöông phaùp thay theá. Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn Baûng 2. Baûng g iaù trò g iaû ñònh söï töông ñoàng keát quaû ph aùt hieän E. coli baèng phöông phaùp nuoâi ca áy vaø PCR Phöông phaùp tham chieáu Phöông phaùp löïa choïn Maãu döông tính Maãu aâm tính Toång keát quaû Maãu döông tính N11 N12 C Maãu aâm tính N21 N22 D Toång keát quaû A B A+ B hay C+D = N Caùc thoâng soá kyõ thuaät töông ñoái cuûa phöông phaùp PCR so vôùi phöông phaùp nuoâi caáy ñöôïc tính nhö sau: Ñoä chính xaùc töông ñoái: RA% = ( N11 + N22) x 100/ C + D hoaëc A + B Giaù trò döông tính giaû töông ñoái: FP% = N21 x 100/ D Giaù trò aâm tính giaû töông ñoái: FN% = N12 x100/ C Ñoä nhaïy töông ñoái: RS - P(%) = N11 x100/ C Ñoä ñaëc hieäu töông ñoái: RS - N(%) = N22 x100/ D Ñoä khaùc bieät coù yù nghóa cuûa 2 phöông phaùp:  2 = (( { N12 - N21 }) - 1) 2  ( N12 + N21), vôùi baäc töï do df = 1. 2.18. ÖÙng duïng qui trình phaùt h ieän E. coli trong caùc maãu thö ïc ph aåm tr eân thò tröôøng Choïn khoaûng 70 maãu thuoäc nhieàu chuûng loaïi thöïc phaåm khaùc nhau. Moãi maãu laáy ñaïi dieän 10g, ñoàng nhaát vôùi 90g TSB, uû ôû 37oC trong 24 giôø. Canh khuaån sau khi uû ñöôïc tieán haønh phaùt hieän E. coli baèng caû hai phöông phaùp nuoâi caáy vaø phöông phaùp PCR. Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn PHAÀN III KEÁT QUAÛ VAØ BIEÄN LUAÄN 1. PHAÂN LAÄP CHUÛNG E. COLI TÖØ MAÃU TH ÖÏC PHAÅM: Ñeå coù nguoàn chuûng E. coli phuïc vuï vieäc xaây döïng qui trình phaùt hieän E. coli vaø ñaùnh giaù hieäu löïc qui trình, beân caïnh hai chuûng E. coli chuaån ñöôïc cung caáp töø Ñaïi hoïc RMIT (UÙc) vaø vieän Pasteur TP. HCM, chuùng toâi ñaõ tieán haønh phaân laäp E. coli töø khoaûng 67 maãu thöïc phaåm khaùc nhau nhö thòt, caù, tröùng, söõa, rau quaû, gia vò vaø saûn phaåm khoâ... theo phöông phaùp nuoâi caáy truyeàn thoáng. Maãu ñöôïc taêng sinh choïn loïc trong caùc oáng moâi tröôøng BGBL chöùa oáng Durham ôû 440C trong 24 giôø. Caùc oáng moâi tröôøng coù leân men vaø sinh hôi (ñuïc, coù boït khí trong oáng Durham) (Hình 7) ñöôïc duøng ñeå caáy leân caùc ñóa petri chöùa moâi tröôøng EMB nhaèm muïc ñích taùch vaø phaân laäp khuaån laïc ñaëc tröng cuûa E. Coli. Sau 24 giôø uû ôû nhieät ñoä 370C ôû ñóa petri töø caùc maãu chöùa E. coli ñaõ xuaát hieän caùc khuaån laïc maøu ñoû tía, coù aùnh kim, bôø troøn ñeàu vaø ñöôøng kính khoaûng 0,5mm (Hình 8). H ình 7. E. coli tre ân moâi tröôøng BGBL co ù oáng Dur ham 1: Moâi tröôøng ñoái chöùng , 2: Moâi tröôøng sau khi caáy E. coli Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn Hình 8. Khuaån laïc E. Coli treân moâi tröôøng EMB 1: Moâi tröôøng ñaái chöùng; 2: Moâi tröôøng coù chöùa khuaån laïc E. Coli Choïn ôû moãi ñóa moät khuaån laïc ñaëc tröng ñeå tieán haønh thöû nghieäm IMViC nhö sau : - Thöû nghieäm Indol döông tính vì xuaát hieän voøng ñoû treân neàn moâi tröôøng canh trypton (Hình 9.1) - Thöû nghieäm Methyl Red döông tính vì maøu canh khuaån trôû neân ñoû(H ình 9.2) - Thöû nghieäm Vosges Proskauer aâm tính vì moâi tröôøng thöû nghieäm maøu vaøng khoâng thay ñoåi ( Hì nh 9.3) - Thöû nghieäm Citrate aâm tính vì moâi tröôøng khoâng chuyeån sang maøu xanh döông (Hình 9. 4). Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn Hình 9. Keát quaû thö û nghieäm IMViC cuûa caùc chuûng E.Coli ph aân laäp 1 : Thöû nhghieäm Indol (+) ; 2 : Thöû nghieäm Methyl Red (+) ; 3 : Thöû nghieäm Voges Prokaeur (-) ; 4 : Thöû nghieäm Citrate (-) Taát caû 40 chuûng E. coli ñaõ ñöôïc phaân laäp ñeàu ñöôïc khaúng ñònh laø E. coli baèng phaûn öùng sinh hoaù vaø ñöôïc kieåm tra laïi baèng phaûn öùng PCR. Keát quaû phaân laäp ñöôïc trình baøy ôû Baûng 3. Baûng 3 K eát quaû phaân laäp chuûng E. coli tö ø maãu th öïc ph aåm : STT Teân maãu - Nguoàn goác Phöông phaùp truyeàn thoáng Phöông phaùp PCR Kyù hieäu 1 Chaû caù Chôï Taân Phuù + + E. coli 1 2 Gan heo + + E. coli 2 3 Thòt gaø + + E. coli 3 4 Caù côm Chôï Thuû Ñöùc + + E. coli 4 5 Caù roâ + + E. coli 5 6 Caù treâ + + E. coli 6 7 Chaû luïa + + E. coli 7 8 Caù loøng tong + + E. coli 8 9 Soø luïa + + E.coli 9 Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn 10 Baïch tuoäc Chôï Baøo Sen + + E. coli 10 11 Soø loâng + + E. coli 11 12 Caù soøng + + E. coli 12 13 Caù nuïc + + E. coli 13 14 Teùp + + E. coli 14 15 Môõ heo + + E. coli 15 16 Caù höôøng + + E. coli 16 17 Caù thu Chôï Taân Phuù + + E. coli 17 18 OÁc böôu Traïm 2 Caàu Vöôït + + E. coli 18 19 Caù chieâm + + E. coli 19 20 Caù lìm kìm + + E .coli 20 21 Caù baïc maù + + E. coli 21 22 Caù ñieâu hoàng + + E. coli 22 23 Thòt heo Sieâu thò Ñaàm Sen + + E. coli 23 24 Thòt gaø + + E. coli 24 25 Thòt boø + + E. coli 25 26 Pate Chôï Thuû Ñöùc + + E. coli 26 27 Döa leo + + E. coli 27 28 Caø roát + + E. coli 28 29 Chaø boâng + + E.coli 29 30 Baùnh mì + + E. coli 30 31 Ñaäu huû + + E. coli 31 32 Ñaäu que + + E. coli 32 33 Khoùm + + E. coli 33 34 Chuoái + + E. coli 34 35 Sapo + + E. coli 35 36 Khoai cao + + E .coli 36 Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn 37 Mì + + E. coli 37 38 Khoâ möïc Chôï Nancy + + E. coli 38 39 Khoâ boø + + E. coli 39 40 Nho Traïm 2 Caàu Vöôït + + E. coli 40 Trong quaù trình phaân laäp chuùng toâi nhaän thaáy E. coli hieän dieän nhieàu trong caùc maãu thöïc phaåm töôi soáng vaø caùc maãu chöa qua khöû truøng ñoùng goùi, phaàn ngoaøi cuûa khoái maãu thöôøng chöùa nhieàu E. coli hôn phaàn trong caùc maãu ñaõ khöû truøng, gia nhieät thì ít bò nhieãm E. coli . 2. THIEÁT LAÄP QUI TRÌNH PCR PHAÙT HIEÄN E. COLI BAÈNG CHUÛNG CHUAÅN 2.1. Thô øi gian xöû l yù nhieät trích khuoân DNA Caùc khaûo saùt tröôùc ñaây cho thaáy coù theå ñun caùch thuûy ñeå phaù teá baøo giaûi phoùng DNA duøng laøm khuoân cho phaûn öùng PCR. Ñeå xaùc ñònh thôøi gian xöû lyù toát nhaát chuùng toâi tieán haønh khaûo saùt xöû lyù baèng nhieät ôû caùc thôøi gian khaùc nhau trong khoaûng 10 – 40 phuùt. Dòch sau khi xöû lyù ñöôïc duøng laøm khuoân ñeå thöïc hieän phaûn öùng PCR. Keát quaû ñöôïc trình baøy ôû Hình10. Hình 10. Keát quaû khaûo saùt th ôøi gian ñun caùch th uûy ñeå phaù vôõ teá baøo giaûi p hoùng DNA boä gen vi khuaån 1: Vaïch 299bp chuaån; 2: 10 phuùt ;3: 20phuùt; 4: 30 phuùt; 5: 40 phuùt 299bp Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn Keát quaû ñieän di cho thaáy töø gieáng 2 ñeán gieáng 6, phaûn öùng PCR cho saûn phaåm khueách ñaïi coù ñoä daøi baèng vôùi saûn phaåm chuaån ôû taát caû caùc tröôøng hôïp xöû lyù dòch teá baøo baèng nhieät phaùp xöû lyù baèng nhieät. ÔÛ caùc khoaûng thôøi gian xöû lyù nhieät khaùc nhau ñeàu cho tín hieäu ñaïi roõ neùt do vaäy ñeå tieát kieäm thôøi gian chuùng toâi choïn thôøi gian xöû lyù ñeå phaù vôõ teá baøo giaûi phoùng khuoân DNA laø 10 phuùt. 2.2. Khaû naêng khueác h ñaïi cuûa caëp moài EC Khi thöïc hieän phaûn öùng khueách ñaïi vôùi caëp moài EC cho 6 chuûng E. coli coù nguoàn goác khaùc nhau, keát quaû ñieän di cho thaáy caùc gieáng coù caùc vaïch vôùi kích thöôùc 299bp. Nhö vaäy caëp moài EC coù khaû naêng khueách ñaïi ñoaïn DNA ñuùng kích thöôùc 299pb (Hình 11). H ình 11. K haû naêng khueác h ñaïi cuûa ca ëp moài EC 1: Thang 100pb chuaån ; 2, 3, 4, 5, 6, 7 caùc chuûng E. coli khaùc nhau 2.3. Khaûo saùt tính ch uyeân bieät c uûa caëp moài EC Tính chuyeân bieät cuûa phöông phaùp PCR trong phaùt hieän E. coli chính laø tính chuyeân bieät cuûa caëp moài EC ñaõ ñöôïc thieát laäp. Ñeå khaûo saùt tính chuyeân bieät cuûa caëp moài EC, chuùng toâi tieán Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn haønh thí nghieäm treân 6 chuûng E. coli coù nguoàn goác khaùc nhau vaø 9 chuûng vi sinh vaät khaùc. Caùc chuûng vi sinh vaät naøy ñöôïc nhaän töø Phoøng thí nghieäm Coâng ngheä Sinh hoïc phaân töû, Tröôøng ÑH Khoa hoïc töï nhieân, Ñaïi hoïc Quoác gia Tp Hoà Chí Minh, Ñaïi hoïc RMIT (UÙc) vaø Vieän Pasteur Tp Hoà Chí Minh. Keát quaû ñöôïc trình baøy treân Baûng 4 vaø Hình 12. Hì nh 12. K eát quaû khaûo saùt tính chuyeân bieät cuûa ca ëp moài EC 1: Thang 100bp; 2, 3, 4, 5, 6, 7 chuûng E. coli; 8: Salmonella typhimurinum; 9: Listeria monocytogenes; 10: Virio cholerae; 11: Virio parahaemotylicus; 12: Bacielus cereus; 13: Staphylococus aureus; 14: Shigella sonnei; 15: Clostridium botulinum; 16: Clostridium perfringens. Baûng 4. Keát quaû khaûo sa ùt chuyeân bieät cuûa phö ông phaùp PCR phaùt hieän E. Coli STT Teân chuûng Nguoàn goác Soá chuûng Soá keát quaû döông tính 1 Escherichi coli RMIT, UÙc 2 2 2 Escherichia coli Vieän Pasteur TP HCM 1 1 3 Escherichia coli Phaân laäp töø thöïc phaåm 3 3 4 Salmonella typhimurinum TTKHCNSH 1 0 299bp Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn 5 Listeria monocytogenes TTKHCNSH 1 0 6 Vibrio cholerae TTKHCNSH 1 0 7 Vibrio parahaemolyticus TTKHCNSH 1 0 8 Bacilus cereus TTKHCNSH 1 0 9 Staphylococus aureus TTKHCNSH 1 0 10 Shigella sonnei TTKHCNSH 1 0 11 Clostridium botulinum TTKHCNSH 1 0 12 Clostridium perfringens TTKHCNSH 1 0 Keát quaû khaûo saùt cho thaáy phaûn öùng PCR vôùi caëp moài EC chæ cho saûn phaåm khueách ñaïi coù ñoä daøi 299 bp treân caùc chuûng E. coli; caùc vi sinh vaät khaùc ñeàu cho keát quaû aâm tính vôùi caëp moài naøy. Nhö vaäy coù theå keát luaän caëp moài EC laø ñaëc tröng cho E. coli chæ cho saûn phaåm khueách ñaïi 299 bp vôùi caùc chuûng E. coli. 2.4. Caùc ñieàu kieän toái öu c uûa p haûn ö ùng PCR - Nhieät ñoä baét caëp giöõa moài vaø khuoân: nhieät ñoä baét caëp giöõa moài vaø khuoân laø yeáu toá quan troïng quyeát ñònh keát quaû PCR. Keát quaû khaûo saùt cho thaáy tröø tröôøng hôïp nhieät ñoä 67oC, caùc tröôøng hôïp 50 -62C phaûn öùng ñeàu cho saûn phaåm khueách ñaïi 299pb nhöng keát quaû 58C cho keát quaû toát nhaát (gieáng 5). Nhö vaäy 58C ñöôïc xem laø nhieät ñoä toái öu cho moài baét caëp vaø khuoân (Hình 13). Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn H ình 13. Nhieät ñoä baét c aëp giöõa moài vaø khuoân toái öu cuûa phaûn öùng PCR 1: Vaïch chuaån; 2: 500C; 3: 53C; 4: 55C; 5: 58C ,6: 62C; 7: 67C - Noàng ñoä moài: khaûo saùt noàng ñoä moài nhaèm muïc ñích toái öu hoaù haøm löôïng moài EC trong phaûn öùng PCR. Chuùng toâi tieán haønh khaûo saùt ôû caùc noàng ñoä moài khaùc nhau laø 5,5; 6 vaø 6,5pM/phaûn öùng cho moãi moài. Keát quaû ñöôïc theå hieän treân Hình 14. H ình 14. Khaûo saùt noàng ñoä moài toái öu c uûa ph aûn öùng PCR 1: Vaïch chuaån; 2: 5,5pM; 3: 3: 6pM; 4: 6,5pM Keát quaû treân cho thaáy noàng ñoä moài töø 5,5 – 6,5 ñeàu cho tín hieäu khueách ñaïi. Tuy nhieân tính hieäu khueách ñaïi roõ nhaát ôû vaïch 6pM (gieáng 3). Do ñoù chuùng toâi choïn noàng ñoä moài 6pM/phaûn öùng laø noàng ñoä moài thích hôïp nhaát cho phaûn öùng PCR. 299bp 299bp Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn - Noàng ñoä Mg2+: ion Mg2+ coù taùc duïng taêng cöôøng aùi löïc giöõa moài vaø khuoân DNA ñoàng thôøi giuùp cho Taq DNA polymerase gaén dNTP vaøo moài trong giai ñoaïn keùo daøi. Vì vaäy neáu haøm löôïng Mg2+ trong phaûn öùng quaù cao seõ khoâng cho saûn phaåm khueách ñaïi hay saûn phaåm khueách ñaïi khoâng ñaëc hieäu. Ngöôïc laïi, neáu haøm löôïng ion naøy quaù thaáp seõ khoâng cho hay cho quaù ít saûn phaåm khueách ñaïi, khoâng theå phaùt hieän ñöôïc khi ñieän di. Trong khaûo saùt naøy, chuùng toâi tieán haønh thay ñoåi haøm löôïng ion Mg2+ dao ñoäng trong khoaûng 2 - 4mM trong moät phaûn öùng. Keát quaû khaûo saùt ñöôïc theå hieän treân Hình 15. Hình 15. Noàng ñoä Mg 2+ toái öu c uûa phaûn öùng PCR 1: Vaïch chuaån; 2: 2mM; 3: 2,5mM; 4: 3mM; 5: 3,5mM; 6: 4mM Keát quaû treân Hình 15 cho thaáy ôû taát caû caùc phaûn öùng PCR ñeàu cho saûn phaåm khueách ñaïi. Tuy nhieân saûn phaåm khueách ñaïi toát nhaát khi thöïc hieän vôùi noàng ñoä Mg2+ laø 3mM/phaûn öùng. Ñaây ñöôïc xem laø noàng ñoä toái öu cho phaûn öùng PCR. Tuy nhieân ñeå ñoàng nhaát vôùi caùc qui trình phaùt hieän vi sinh vaät trong thöïc phaåm baèng PCR chuùng toâi choïn noàng ñoä Mg2+ laø 2,5mM ñeå thieát laäp qui trình phaùt hieän E. coli. Töø caùc keát quaû khaûo saùt caùc ñieàu kieän toái öu cuûa phaûn öùng PCR neâu treân chuùng toâi choïn ñieàu kieän toái öu cuûa phaûn öùng PCR nhö sau: Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn - Chöông trình cuûa phaûn öùng khueách ñaïi ñöôïc thieát laäp vôùi 35 chu kyø goàm 95C trong 1 phuùt, 58C trong 45 giaây, 72C trong 1 phuùt. - Noàng ñoä moãi moài EC laø 6pmol - Noàng ñoä Mg2+ thích hôïp laø 2,5mM - Noàng ñoä Taq thích hôïp laø 0,5l 2.5. Thô øi gian taêng sinh c aàn thieát ñeå ph aùt hieän E. coli tr ong th öïc ph aåm Ñeå thieát laäp qui trình phaùt hieän E. coli trong thöïc phaåm, chuùng toâi thöïc hieän phaûn öùng PCR treân caùc maãu thöïc phaåm caù, pate vaø söõa ñöôïc gaây nhieãm E. coli vôùi maät ñoä khoaûng 10CFU/10g. Nuoâi taêng sinh trong tuû aám ôû 37C trong 24 giôø. Sau moãi 2 giôø laáy 1ml dòch nuoâi caáy ly taâm thu sinh khoái vaø huyeàn phuø hoùa trong TE, xöû lyù nhieät vaø thöïc hieän phaûn öùng PCR. Caùc thí nghieäm ñöôïc laëp laïi 3 laàn. Keát quaû ôû Baûng 5 cho thaáy ôû maãu söõa sau 12 giôø taêng sinh ñaõ coù theå phaùt hieän E. coli baèng PCR. Tröôøng hôïp maãu pate thì caàn 16 giôø taêng sinh. Tröôøng hôïp caù gaây nhieãm E.coli caàn ñeán 20 giôø môùi phaùt hieän ñöôïc E.coli. Do vaäy, chuùng toâi choïn thôøi gian taêng sinh toái thieåu treân moâi tröôøng TSB laø 20 giôø. Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn Baûng 5. Thôøi gian taêng sinh toái thieåu ñeå p haùt hieän E. coli tr ong caùc maãu th öïc phaåm bò g aây nhieãm. Thôøi gian taêng sinh (giôø) Keát quaû phaûn öùng PCR Caù Pate Söõa 4 - - - 6 - - - 8 - - - 10 - - - 12 - - + 14 - - + 16 - + + 18 - + + 20 + + + 24 + + + Kyù hieäu : +, phaûn öùng PCR döông tính -, phaûn öùng PCR aâm tính 2.6. Xaùc ñònh ñoä nhaïy cuûa phaûn öùng PCR Ñoä nhaïy cuûa phaûn öùng PCR ôû ñaây ñöôïc xaùc ñònh baèng soá teá baøo E. coli toái thieåu coù trong moät phaûn öùng maø phöông phaùp PCR coù theå phaùt hieän ñöôïc. Trong khaûo saùt naøy, chuùng toâi tieán haønh pha loaõng baäc 10 dòch teá baøo E. coli ñöôïc taêng sinh trong moâi tröôøng TSB qua ñeâm baèng dung dòch NaCl 0,85% sao cho coù maät ñoä töø 9 x 101 – 9 x 105 CFU/ml. Dòch teá baøo naøy ñöôïc duøng ñeå xöû lyù nhieät, ñeå thu DNA duøng cho phaûn öùng PCR. Ba ûng 6 vaø Hình 16 trình baøy keát quaû xaùc ñònh ñoä nhaïy cuûa phaûn öùng PCR. Baûng 6. K eát quaû phaùt h ieän E. coli baèng phöông phaùp PCR ôû c aùc maät ñoä khaùc nhau Maät ñoä Ñoä pha loaõng Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn 10 -1 10-2 10-3 10-4 10-5 CFU /ml 9. 105 9. 104 9.103 9.102 9.101 CFU / phaûn öùng 3. 102 3. 101 3. 100 3. 10-1 3. 10-2 Keát quaû PCR + + + _ _ H ình 16. Ñoä nhaïy cuûa phaûn öùng PCR 1: Thang DNA ; 2: Vaïch chuaån 299bp; 3: 9 x 105 CFU/ml; 4: 9 x 104 CFU/ml; 5: 9 x103 CFU/ml; 6: 9 x 102 CFU/ml; 7: 9 x 101CFU/ml 2.7. Quy trình phaùt hieän E. coli trong thöïc phaåm baèng phöông phaùp PCR Caên cöù vaøo keát quaû cuûa caùc thí nghieäm treân, chuùng toâi ñeà nghò qui trình PCR ñeå phaùt hieän E. coli trong thöïc phaåm nhö sau: - Chuaån bò maãu: Caân 10 g thöïc phaåm vaøo bao PE voâ truøng, boå sung 90g Buffered Pepton Water, ñoàng nhaát vaø uû trong tuû aám ôû 370C trong 20 giôø. Huùt 1ml dung dòch sau khi taêng sinh vaøo eppendorf, ly taâm vôùi toác ñoä 10.000 voøng/phuùt trong 5 phuùt. Loaïi dòch trong beân treân, röûa caën teá baøo baèng 1ml nöôùc caát voâ truøng. Ly taâm ñeå loaïi boû phaàn nöôùc. Huyeàn phuø hoùa sinh khoái teá baøo trong 299bp Baûng 6 vaø Hình 16 cho thaáy phaûn öùng PCR cho pheùp phaùt hieän E. coli ôû maät ñoä 9 x 103 CFU/ml hay 3CFU/ phaûn öùng PCR. Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn eppendorf vôùi 0,2ml TE, ñun soâi caùch thuûy trong 10 phuùt. Ly taâm vôùi toác ñoä 10000 voøng/phuùt trong 5 phuùt ñeå loaïi boû caùc maõnh vôõ teá baøo. Phaàn dòch beân treân ñöôïc duøng laøm khuoân DNA cho phaûn öùng PCR. - Thaønh phaàn cuûa 25l phaûn öùng PCR : Ñeäm duøng cho phaûn öùng PCR ( 10X) 2,5µl dNTP 100µl 2,5µl MgCl2 (25mM) 2,5µl Moài EC 1 (6pM) 1,0 µl Moài EC 2 (6pM) 1,0 µl Taq polymerase 1U 0,5µl DNA khuoân 3,0µl Nöôùc caát 12,0µl - Chöông trình cuûa phaûn öùng khueách ñaïi: bieán tính DNA ôû 95C trong 5 phuùt; phaûn öùng PCR goàm 35 chu kyø, moãi chu kyø goàm 3 böôùc bieán tính ôû 95C trong 1 phuùt, baét caëp cuûa moài vôùi DNA khuoân ôû 58C trong 45 giaây, keùo daøi ôû 72C trong 1 phuùt. Sau phaûn öùng maãu ñöôïc giöõ ôû 72C trong 10 phuùt ñeå cho caùc ñoaïn DNA chöa toång hôïp hoaøn chænh seõ tieáp tuïc ñöôïc toång hôïp ñeå hoaøn taát chieàu daøi cuûa chuùng. Maãu ñöôïc giöõ oån ñònh ôû 4C trong 30 phuùt tröôùc khi keát thuùc. - Phaân tích saûn phaåm khueách ñaïi: saûn phaåm sau khueách ñaïi ñöôïc ñieän di treân gel agarose 1,5% ôû ñieän theá 100V trong 45 phuùt. Sau ñieän di gel ñöôïc nhuoäm trong dung dòch ethidium bromide trong 10 phuùt, röûa laïi baèng nöôùc roài quan saùt saûn phaåm khueách ñaïi treân hoäp ñeøn soi UV coù böôùc soùng 312nm. - Dieãn giaûi keát quaû: + Neáu xuaát hieän vaïch töông ñöông vôùi 299bp thì keát luaän laø döông tính (+) + Neáu khoâng xuaát hieän vaïch hoaëc vaïch coù kích thöôùc khoâng phaûi 299bp keát luaän laø aâm tính (-). Thôøi gian cho toaøn boä qui trình khoaûng 24 giôø (bao goàm khoaûng 20 giôø taêng sinh vaø 4 giôø thöïc hieän phaûn öùng PCR) tính töø luùc nhaän maãu cho ñeán luùc traû lôøi keát quaû. Caùc böôùc cuûa qui trình phaùt hieän E. coli döôïc toùm taét treân Hì nh 17 Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn Ñoàng nhaát UÛ ôû 370C trong 20 giôø Laáy 1ml cho vaøo eppendorf, li taâm 10.000 voøng/phuùt Loaïi boû phaàn nöôùc. Röûa sinh khoái teá baøo vôùi 1ml nöôùc caát voâ truøng Li taâm 10.000 voøng/phuùt , thu nhaän sinh khoái Huyeàn phuø hoùa sinh khoái vaøo 0,2 ml TE. Ñun soâi caùch thuûy trong 10 phuùt Li taâm 10000 voøng/phuùt, thu laáy phaàn dòch phía treân Phaûn öùng PCR trong 35 chu kyø vôùi caùc böôùc 95C trong 1 phuùt, 55C trong 45 giaây, 72C trong 1phuùt Phaân tích keát quaû treân gel agarose 1,5% Dieãn giaûi keát quaû Hình 17. Toùm taét qui trình phaùt hieän E. coli trong thöïc phaåm baèng PCR Maãu thöïc phaåm 10 g + 90g BPW Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn 3. XAÙC NH AÄN H IEÄU LÖÏC PHÖÔNG PHAÙP 3.1. Giôùi h aïn pha ùt hieän Giôùi haïn phaùt hieän laø maät ñoä teá baøo thaáp nhaát cuûa vi sinh vaät muïc tieâu maø phöông phaùp coù khaû naêng phaùt hieän ñöôïc trong maãu so vôùi phöông phaùp chuaån. Giôùi haïn phaùt hieän laø thoâng soá quan troïng quyeát ñònh phöông phaùp ñöôïc thieát laäp coù ñaùp öùng ñöôïc yeâu caàu thöïc teá hay khoâng. Trong luaän vaên naøy giôùi haïn phaùt hieän cuûa qui trình phaùt hieän E. coli trong thöïc phaåm ñöôïc khaûo saùt treân 4 chuûng E. coli coù nguoàn goác khaùc nhau, moãi chuûng ñöôïc thöïc hieän treân 5 maãu ñaïi dieän cho 5 nhoùm thöïc phaåm. Moãi loaïi maãu ñöôïc gaây nhieãm vôùi caùc maät ñoä E. coli 3CFU, 8CFU, 15CFU vaø 36CFU/g maãu vaø laëp laïi 2 laàn. Tieán haønh phaân tích caùc maãu ñaõ gaây nhieãm baèng 2 phöông phaùp PCR vaø nuoâi caáy. Keát quaû ñöôïc trình baøy ôû Baûng 7 vaø H ình 18 Baûng 7. K eát quaû khaûo saùt giô ùi haïn phaùt hieän c uûa q uy tr ình PCR xeùt nghieäm E. coli trong thöïc phaåm Laàn Maät ñoä gaây nhieãm (CFU/g) Phöông phaùp Maãu gaây nhieãm Thòt Caù Baùnh Söõa töôi Caø chua 1 0 Nuoâi caáy _ _ _ _ _ PCR _ _ _ _ _ 3 Nuoâi caáy + + - + + PCR + + - + + 8 Nuoâi caáy + + + + + PCR + + + + + 15 Nuoâi caáy + + + + + PCR + + + + + 36 Nuoâi caáy + + + + + PCR + + + + + 0 Nuoâi caáy _ _ _ _ _ PCR _ _ _ _ _ 3 Nuoâi caáy + + + + + PCR + + + + + 8 Nuoâi caáy + + + + + Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn 2 PCR + + + + + 15 Nuoâi caáy + + + + + PCR + + + + + 36 Nuoâi caáy + + + + + PCR + + + + + ÔÛ maät ñoä gaây nhieãm 3CFU/g maãu thì caû hai phöông phaùp ñeàu cho keát quaû döông tính ôû 4 loaïi maãu. Maãu baùnh boâng lan gaây nhieãm laàn 1 cho keát quaû aâm tính ôû caû hai phöông phaùp nhöng laàn 2 cho keát quaû döông tính, coù leõ do laàn 1 vieäc gaây nhieãm khoâng thaønh coâng. Nhö vaäy giôùi haïn phaùt hieän naøy laø 3CFU/g maãu thöïc ph