Luận văn Xây dựng phương pháp định lượng azithromycin trong huyết tương

bộ GIáO DụC Và ĐàO TạO Bộ Y Tế TRƯờNG ĐạI HọC DƯợC Hà NộI Dương Hải Thuận xây dựng phương pháp định lượng azithromycin trong huyết tương luận văn thạc sĩ dược học Hà nội - 2008 bộ GIáO DụC Và ĐàO TạO Bộ Y Tế TRƯờNG ĐạI HọC DƯợC Hà NộI Dương Hải Thuận xây dựng phương pháp định lượng azithromycin trong huyết tương Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc - độc chất Mã số: 607315 luận văn thạc sĩ dược học Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Kiều Anh TS. Phạm Thị Thanh Hà Hà nội - 2008 Lời cảm ơn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Kiều Anh, TS. Phạm Thị Thanh Hà đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo, và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trìmh học tập và nghiên cứu thực hiện đề tài. Tôi xin trân trọng cám ơn Ban giám hiệu nhà trường, trân trọng cám ơn các thầy giáo, cô giáo Phòng Đào tạo sau đại học, Bộ môn Phân tích cùng các Bộ môn khác của trường Đại học Dược Hà Nội đã giảng dạy tận tình và tạo điều kiện tốt cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. Tôi xin chân thành cám ơn Ban lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương, Ban lãnh đạo Viện dinh dưỡng, phòng Vật lý đo lường-viện kiểm nghiệm thuốc trung ương, Trung tâm kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm- Viện dinh dưỡng nơi tôi thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cám ơn Ban lãnh đạo Trung tâm y tế dự phòng tỉnh Thái Nguyên nơi tôi công tác đã quan tâm tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành nhiệm vụ học tập và nghiên cứu trong thời gian qua. Cuối cùng xin cám ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ, khích lệ và giúp đỡ tôi tận tình để có kết quả ngày hôm nay. Dương Hải Thuận Học viên cao học khóa 11 chuyên ngành Kiểm nghiệm thuốc và độc chất Mục lục Lời cảm ơn. Mục lục. Danh mục các từ viết tắt. Danh mục các bảng. Danh mục các hình. Trang Đặt vấn đề 1 Chương 1: Tổng quan 3 1.1. Vài nét về azithromycin 3 1.2. Một số phương pháp định lượng AZI trong dịch sinh học. 5 1.3. Nguyên tắc chung về phương pháp phân tích bằng HPLC 7 1.3.1. Phân tích định tính. 7 1.3.2. Phân tích định lượng: 8 1.4. Vài nét về HPLC với detector huỳnh quang. 9 1.5. Vài nét về LC-MS. 10 Chương 2: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu. 13 2.1. Đối tượng nghiên cứu. 13 2.2. Hoá chất và thiết bị 13 2.3. Phương pháp nghiên cứu: 14 2.3.1. Khảo sát xây dựng quy trình định lượng AZI trong dung môi bằng HPLC detector huỳnh quang 15 2.3.2. Khảo sát xây dựng quy trình định lượng AZI trong HT bằng LC-MS. 15 2.3.2.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn. 15 2.3.2.2. Xử lý mẫu 16 2.3.2.3. Khảo sát điều kiện để định lượng AZI. 16 2.3.2.4 Thẩm định phương pháp phân tích 16 2.3.2.5. Xác định hiệu suất chiết 18 2.3.3. Định lượng thăm dò AZI trong HT người uống AZI 18 2.3.4. Phân tích số liệu thực nghiệm 18 Chương 3: Kết quả 19 3.1. Xây dựng quy trình xử lý mẫu 19 3.2. Khảo sát xây dựng quy trình định lượng AZI trong dung môi bằng HPLC detector huỳnh quang. 21 3.2.1.Điều kiện chạy sắc ký để định lượng AZI 21 3.2.2. Khảo sát điều kiện tạo dẫn xuất huỳnh quang 22 3.2.3. Kết quả đánh giá một số chỉ tiêu thẩm định. 24 3.3. Khảo sát xây dựng chương trình sắc ký lỏng khối phổ để định lượng AZI trong HT. 30 3.3.1. Khảo sát lựa chọn chất chuẩn nội 30 3.3.2. Xác định điều kiện khối phổ. 32 3.3.3. Xác định chương trình sắc ký. 33 3.3.4. Kết quả thẩm định phương pháp phân tích. 36 3.3.4.1. Đánh giá tính chọn lọc. 36 3.3.4.2. Đánh giá tính phù hợp của hệ thống. 37 3.3.4.3. Xác định khoảng nồng độ tuyến tính. 38 3.3.4.4. Xác định LOD và LOQ 40 3.3.4.5. Độ đúng 40 3.3.4.6. Độ chính xác 41 3.4. Xác định hiệu suất chiết 42 3.5. Định lượng thăm dò AZI trong HT người tình nguyện. 43 Chương 4. Bàn luận. 45 4.1. Về xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng AZI. 45 4.1.1.Về xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng AZI trong dung dịch bằng HPLC với dertecter huỳnh quang. 45 4.1.2. Về xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng AZI trong HT bằng LC-MS. 46 4.2. Về kết quả định lượng thăm dò AZI trong HT người tình nguyện. 48 Kết luận và kiến nghị 49 Kết luận 49 Kiến nghị 51 Tài liệu tham khảo Phụ lục BẢNG CHÚ THÍCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT APCI : Ion húa học ở ỏp xuất thường (Atmospheric pressure chemical ionization) AZI : Azithromycin CLA : Clarithromycin Cmax : Nồng độ thuốc tối đa ESI Ion húa bằng phun điện tử (Electronsray Ionization) FMOC-Cl 9-fluorenylmethyloxycarbonyl chlorid HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) HT : Huyết tương IS : Nội chuẩn (Internal standard) LC-MS : Sắc ký lỏng ghộp khối phổ (Liquid Chromatography-Mass Spectrometry) LOD : Giới hạn phỏt hiện (Limit of Detection) LOQ : Giới hạn định lượng (Limit of Quantification) MS : Khối phổ (Mass Spectrometry) PĐ : Pha động PA : Tinh khiết phõn tớch (Pure for Analysis) RSD : Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) ROXI : Roxithromycin SD : Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) S/N : Tớn hiệu/nhiễu đường nền (Signal/Noise) TB : Trung bỡnh TƯ : Trung ương UV : Tử ngoại (Ultra Violet) VN : Việt Nam DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN Bảng Nội dung Trang 1.1 Một số nghiên cứu định lượng AZI trong dịch sinh học bằng HPLC 6 2.1 Danh mục hóa chất- thuốc thử-chất chuẩn 13 3.1 Quy trình tạo dãy mẫu chuẩn và dẫn xuất hóa 22 3.2 Kết quả khảo sỏt tớnh phự hợp của hệ thống HPLC. 27 3.3 Sự phụ thuộc giữa tỷ số diện tớch pic và nồng độ AZI 28 3.4 Kết quả khảo sỏt tớnh phự hợp của hệ thống LC-MS 38 3.5 Sự phụ thuộc giữa tỷ số diện tớch pic và nồng độ AZI trong HT 39 3.6 Kết quả xỏc định độ đỳng của phương phõn tớch 41 3.7 Kết quả xỏc định độ lặp trong ngày của phộp phõn tớch 42 3.8 Kết quả xỏc định hiệu suất chiết 43 3.9 Kết quả định lượng thăm dũ AZI trong HT người tỡnh nguyện 43 DANH MỤC CÁC HèNH TRONG LUẬN VĂN Hỡnh Nội dung Trang 3.1 Sơ đồ quy trình chiết AZI trong HT 20 3.2. Kết quả khảo sát nhiệt độ phản ứng tạo dẫn xuất huỳnh quang 23 3.3 Kết quả khảo sát thời gian phản ứng tạo dẫn xuất huỳnh quang 24 3.4 Sắc ký đồ mẫu trắng 25 3.5 Sắc ký đồ mẫu có AZI 25 3.6 Sắc ký đồ mẫu có CLA 26 3.7 Sắc ký đồ mẫu có AZI và CLA 26 3.8 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa tỷ số diên tích pic và nồng độ AZI 28 3.9 Sắc ký đồ AZI 0,5 mg/ml và CLA 5mg/ml 29 3.10 Phổ khối AZI 30 3.11 Phổ khối CLA 31 3.12 Phổ khối ROXI 31 3.13 Sắc ký đồ AZI và ROXI chạy cột Thermo C18(50x2,1mm; 5mm) 34 3.14 Sắc ký đồ AZI và ROXI chạy cột Zorbax C18 SB (150x4,6; 5mm) 34 3.15 Sắc ký đồ AZI và ROXI chạy chạy chế độ dẳng dòng 0,5ml/phút hệ dung môi acetonitril : amoni acetat 0,05M(6:4) 35 3.16 Các sắc ký đồ thể hiện sự chon lọc của phương pháp. 37 3.17 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa tỷ số diên tích pic(AZI/ROXI) và nồng độ AZI trong HT 39 3.18 Sắc ký đồ mẫu HT xác định LOQ 40 3.19 Các sắc ký đồ định lượng AZI trong HT 2 người tình nguyện T1 và T2 44 Đặt vấn đề Cùng với sự phát triển của ngành công nghiệp dược phẩm, lĩnh vực phân tích và đảm bảo chất lượng thuốc cũng không ngừng lớn mạnh, gắn bó chặt chẽ với nhau và có quan hệ tương hỗ để cùng nhau phát triển. Vào những năm 60 của thế kỷ 20, vấn đề sinh khả dụng của thuốc được đề cập tới và nhanh chóng trở thành vấn đề được hầu hết các hãng dược phẩm lớn quan tâm và phát triển. Nó trở thành một động lực thúc đẩy các nhà bào chế tìm ra công thức thuốc tốt nhất, an toàn nhất cho một loại hoạt chất Từ cuối năm 2003, Viện Kiểm nghiệm đã triển khai một mô hình thử nghiệm để đánh giá tương đương sinh học của thuốc nhằm xây dựng nên một qui chế cho đánh giá tương đương sinh học [7]. Những quy chế này sẽ làm tiền đề cho các nghiên cứu sinh khả dụng, tương đương sinh học và dược động học của thuốc, góp phần quản lý chặt chẽ, nâng cao chất lượng thuốc sản xuất trong nước. Chúng ta đã có một số nghiên cứu về lĩnh vực này [1], [3], [7]. Tuy nhiên, con người được đào tạo về lĩnh vực phân tích sinh học này rất ít do đó để triển khai và phát triển nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học của thuốc không những phải đầu tư vào trang thiết bị mà còn phải chú trọng vào đào tạo con người. Phương pháp phân tích để định lượng thuốc và chất chuyển hóa của nó trong dịch sinh học đóng vai trò quyết định trong đánh giá và diễn giải các số liệu nghiên cứu sinh khả dụng, tương đương sinh học và dược động học của thuốc. Để làm được điều này, các phương pháp phân tích sinh học dựa trên kỹ thuật hóa lý và sinh học hiện đại được phát triển và ứng dụng rộng rãi trong đó có phương pháp HPLC được sử dụng rất phổ biến. Các phương pháp phân tích sinh học phải được thẩm định trước để đảm bảo kết quả thu được là chính xác, đáng tin cậy. Qui định một qui trình và các tiêu chí thẩm định phương pháp phân tích sinh học đã được thảo luận ở rất nhiều hội nghị quốc tế lớn về công nghiệp dược phẩm. Trong thực tế chúng tôi nhận thấy thuốc của Việt Nam sản xuất không thua kém về sinh khả dụng so với chế phẩm nổi tiếng cùng loại của nước ngoài (các chế phẩm nghiên cứu đều có tương đương sinh học với chế phẩm đối chiếu) nhưng giá thành chênh lệch nhau gấp 10 lần thậm chí 30 – 40 lần. Về giá bán cũng đúng với trường hợp chế phẩm azithromycin, trong khi viên Azithrin 250 của Pfizer giá khoảng 80.000 – 90.000 đ/ viên, viên Usmax 250 của Dong In Dang Pharmaco (Hàn Quốc) giá khoảng 34.000 đ/ viên, ... thì viên Azithromycin 250 của Traphaco hoặc Azimax 250 của Imexpharm giá chỉ khoảng 3.000 đ/ viên. Do đó, đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học của chế phẩm chứa Azithromycin nói riêng và các thuốc của Việt Nam sản xuất nói chung là một việc làm hết sức cần thiết nhằm mục đích phục vụ người bệnh những thuốc có chất lượng cao, giá cả hợp lý phù hợp với điều kiện kinh tế người Việt Nam, đồng thời thúc đẩy nhà sản xuất không ngừng nâng cao chất lượng để sản phẩm của mình có tính cạnh tranh cao. Xuất phát từ thực tế đó chúng tôi chọn đề tài "Xây dựng phương pháp định lượng arithromycin trong huyết tương" Mục tiêu của đề tài: - Xây dựng phương pháp định lượng AZI trong HT. - Thẩm định phương pháp phân tích đã xây dựng để khẳng định phương pháp có thể áp dụng định lượng AZI trong HT phục vụ cho nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học. Chương 1: Tổng quan Vài nét về azithromycin(AZI). *Công thức cấu tạo của AZI [6]. Công thức phân tử C38H72N2O12. Khối lượng phân tử: 748,98. Tên khoa học là:10-dihydro-10-deoxo-11-methyl-11-azaerythromycinA. Trong cấu trúc của AZI không có dây nối đôi liên hợp và các nhóm mang màu nên nó hấp thụ UV kém, đây chính là điều khó khăn để định lượng AZI trong dịch sinh học. * Tính chất [4], [6]. AZI là một kháng sinh thuộc nhóm macrolid, ở dạng bột màu trắng đến màu trắng ngà, không mùi, vị hơi đắng. Thực tế không tan trong nước, rất dễ tan trong methanol, aceton, ethanol, diethyl ether, cloroform và dung dịch acid hydrocloric loãng. Dung dịch 0,2% trong hỗn hợp methanol – nước (1 : 1) có pH là 9,0– 11,0. Năng suất quay cực là - 45o tới – 49o (dung dịch 1% trong ethanol) . * Dược động học [4]. Hấp thu: AZI hấp thu nhanh và sinh khả dụng đường uống khoảng 40%. Đặc biệt thuốc đạt nồng độ trong tế bào cao hơn so với trong HT vỡ vậy dựng điều trị vi khuẩn nội bào tốt. Thức ăn làm giảm hấp thu thuốc. Phõn bố: Phõn bố rộng khắp trong cơ thể, chủ yếu vào cỏc mụ như phổi, amidan, tiền liệt tuyến, bạch cầu hạt và đại thực bào..., cao hơn trong mỏu nhiều lần, tuy nhiờn nồng độ thuốc trong hệ thống thần kinh trung ương rất thấp. Chuyển hoỏ: Một lượng nhỏ AZI bị khử methyl trong gan, và được đào thải qua mật ở dạng khụng biến đổi và một phần ở dạng chuyển hoỏ. Thải trừ: Khoảng 6% liều uống thải trừ qua nước tiểu trong vũng 72 giờ dưới dạng khụng biến đổi. *Cơ chế và tác dụng dược lý [4]. AZI tỏc động bằng cỏch gắn kết vào tiểu đơn vị 50S của ribosom và qua đú ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn. AZI cú phổ khỏng khuẩn rộng và sau khi uống, nồng độ đỉnh trong HT đạt được sau 2-3 giờ. AZI là một kháng sinh mới có hoạt phổ rộng, có tác dụng tốt trên các vi khuẩn gram(+) (như Streptococcus, Pneumococcus, Staphilococcus aureus…) và gram(-) (như Haemophilus influenzae, Neissria gonorrhoeae…). Có tác dụng vừa phải trên các vi khuẩn Escherichia coly, Samonella enteritis, Samonella typhi, Klebsiella. * Tác dụng không mong muốn [4]. - AZI được dung nạp tốt, tỷ lệ tác dụng không mong muốn thấp. Hay gặp nhất là chứng rối loạn tiêu hoá (khoảng 10%) với các triệu chứng như buồn nôn, đau bụng, co cứng cơ bụng, nôn, đầy hơi, ỉa chảy, nhưng thường nhẹ và ít xẩy ra hơn so với erythromycin. - ảnh hưởng thính giác: sử dụng lâu dài ở liều cao AZI có thể làm giảm sức nghe có hồi phục ở một số người bệnh. * Chỉ định [4]. AZI được chỉ định dùng trong các trường hợp nhiễm khuẩn do các vi khuẩn nhạy cảm với thuốc như nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới (viêm phổi, viêm phế quản, các nhiễm khuẩn da và mô mềm, viêm tai giữa), đường hô hấp trên (viêm xoang, viêm họng và viêm amidan), nhiễm khuẩn đường sinh dục chưa biến chứng do Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae không đa kháng. * Liều dùng và cách dùng [4]. - Dùng 1 lần mỗi ngày, uống trước bữa ăn 1 giờ hoặc sau khi ăn 2 giờ. - Người lớn: ngày đầu uống 1 liều 500mg và dùng tiếp 4 ngày nữa với liều đơn 250mg/ngày. - Trẻ em: liều gợi ý cho trẻ uống ngày đầu là 10mg/kg thể trọng, và 4 ngày tiếp theo là 5mg/kg thể trọng mỗi ngày uống một lần. * Dạng bào chế [5]. - Viên nang AZI dihydrat tương đương AZI 250mg và 500mg. - Bột pha hỗn dịch uống AZI dihydrat tương đương 200mg AZI/ 5ml, lọ bột đông khô pha tiêm 500mg. - Viên nén và viên nén bao phim tương đương AZI 125mg, 250mg và 500mg; viên nén phân tán tương đương AZI 100mg. 1.2. Một số phương pháp định lượng AZI trong dịch sinh học. Theo tài liệu khoa học của nước ngoài có thể định lượng AZI trong dịch sinh học bằng những phương pháp sau: *Các nghiên cứu sử dụng sắc ký Bảng 1.1. Một số nghiên cứu định lượng AZI trong dịch sinh học bằng HPLC T/ liệu Mẫu thử Cột sắc ký Điều kiện sắc ký [12] HT người Acquity UPLC TM BHE C18 ( 50 x 2,1 mm; 1,7mm Waters) - Dung môi chiết: Diethyl ether - Pha động: MeCN- NH4CH3COO 0,05M - Chuẩn nội: ROXI - Tốc độ dòng: 0,35ml/phút - Detector: MS - Đường chuẩn: 1-1000ng/ml - LOQ: 1ng/ml [18] Huyết thanh người Al2O3 - Pha động: Na3PO4 0,02M : MeCN(1:3) pH=10. - Tốc độ dòng: 1,5ml/phút - Detector: điện hóa. - Đường chuẩn: 10ng/ml – 1000ng/ml [13] HT người Symmetry C18 (250 x 2,1mm; 3mm) - Pha động: MeCN- NH4CH3COO 0,05M. - Chuẩn nội: CLA - Tốc độ dòng: 0,5ml/phút - Detector : MS - Đường chuẩn 2,5-2000ng/ml [10] Huyết thanh người Phenyl C18 (250 x 2,1mm; 5mm) - Dung môi chiết: Hexan - Pha động: MeOH- Na3PO40,05M (71:29); pH=5,9 - Chuẩn nội: CLA - Tốc độ dòng: 2,5ml/phút - Detector huỳnh quang. - Chất dẫn xuất huỳnh quang: FMOC-Cl. - Đường chuẩn: 1-500ng/ml [14] Huyết thanh người Chromegabond alkylphenyl 5mm -Pha động: MeCN-MeOH-NH4COOCH3-NaHClO3 (53:10:22:23) - Detector: điện hóa. -LOQ: 90ng/ml [16] HT người Waters C8 (100 x 4,6mm ; 3,5 mm) - Dung môi chiết: Tert-butyl metyl ether - Pha động: MeCN- đệm phosphat (36,5:63,5) pH=7,40 - Tốc độ dòng: 1,2ml/phút - Detector : điện hóa [17] HT người Spheri-5 cyano (100x4,6mm; 5mm) Norwark USA - Dung môi chiết: Ethyl acetat-hexan(1:1) - Pha động: MeCN-MeOH-Đệm phosphat 0,04M pH=6,9 (52:9:39) - Tốc độ dòng: 1ml/phút - Detector: điện hóa. - Đường chuẩn: 40-800ng/ml [15] HT người Zorbax SB CN (150x4,6mm; 5mm) - Dung môi chiết: Tert-butyl methyl ether - Pha động:Na2HPO450mM-NaH2PO450mM -MeCN-MeOH pH 6,5-7,5 - Tốc độ dòng: 1ml/phút - Detector : điện hóa - Đường chuẩn: 25-1000ng/ml *Các phương pháp khác - Phương pháp Cực phổ, mẫu thử là dịch sinh học [20]. - Phương pháp vi sinh: Xử lý mẫu: pha loãng HT bằng ethanol (1:1), ủ ở 4o C , ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút, lấy dịch nổi ở trên cô ở 55oC đến thể tích ban đầu của mẫu. Định lượng trong môi trường thạch với chủng vi khuẩn chỉ thị là Micrococcus luteus NCTC 8440, khoảng nồng độ tuyến tính từ 0,005 đến 1mg/L[11]. 1.3. Nguyên tắc chung về phương pháp phân tích bằng HPLC [2]. Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng- rắn). Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lý hóa của các chất khác nhau nên khả năng tương tác của chúng với pha động và pha tĩnh khác nhau. Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau. 1.3.1. Phân tích định tính. Một trong các đại lượng đặc trưng cho sự tách sắc ký của các chất trong một hệ pha đã chọn là thời gian lưu của các chất. Nghĩa là trong một hệ pha và trong các điều kiện tách HPLC đã chọn thì mỗi chất phân tích sẽ có thời gian lưu khác nhau và cố định. Chính đại lượng này là một tính chất hay thông số để định tính các chất trong một hỗn hợp mẫu. Vì vậy, sau khi đã chọn được các điều kiện tối ưu cho quá trình sắc ký, tiến hành ghi sắc đồ của mẫu phân tích, và xác định thời gian lưu của từng pic ứng với mỗi chất trong sắc đồ. Sau đó so sánh thời gian lưu của chất phân tích với thời gian lưu của chất chuẩn, từ đó sẽ xác định được trong mẫu phân tích có những chất nào. 1.3.2. Phân tích định lượng: Để có thể định lượng được thì yêu cầu giữa đáp ứng phân tích (chiều cao, diện tích pic) phải có tương quan với nồng độ chất thử. Hi = k1.Ci Si= k2.Ci Hi; Si là chiều cao pic và diện tích pic tương ứng của chất i Ci là nồng độ chất i k1; k2 là các hằng số thực nghiệm. *Phương pháp đường chuẩn: - Phương pháp ngoại chuẩn: Lập đường chuẩn với chuẩn đối chiếu ở ngoài mẫu phân tích. - Phương pháp thêm đường chuẩn: Lập đường chuẩn với chuẩn đối chiếu trên nền mẫu phân tích. - Phương pháp nội chuẩn: Để giảm sai số và tăng độ lặp lại, người ta thường dùng một chuẩn thứ 2 thêm vào mẫu phân tích và mẫu chuẩn đối chiếu. Chất thêm vào này gọi là nội chuẩn. Trong cùng điều kiện sắc ký nó có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất phân tích nhưng được tách hoàn toàn, có tính chất tương tự như chất cần phân tích nhưng không gây ảnh hưởng lên tín hiệu của chất cần phân tích. Tỷ số diện tích hoặc chiều cao pic của chất phân tích và chất chuẩn nội trong dung dich chuẩn đối chiếu là thông số phân tích được dùng để xây dựng đường chuẩn. *Phương pháp chuẩn hóa diện tích: Hàm lượng phần trăm của một thành phần trong mẫu phân tích được xác định bằng tỷ số (tính bằng phần trăm) của diện tích pic của thành phần đó và tổng diện tích của tất cả các thành phần có mặt trong mẫu( trừ pic dung môi, thuốc thử và pic các chất có hàm lượng nhỏ hơn giới hạn phát hiện). Hai yêu cầu cần đáp ứng khi sử dụng phương pháp này: - Tất cả các thành phần trong mẫu phân tích cần được rửa giải, xuất hiện trân sắc ký đồ. - Detector của thiết bị có đáp ứng như nhau đối với tất cả các thành phần có mặt trong mẫu. Do hai yêu cầu trên rất khó được đáp ứng đầy đủ nên kết quả thường không tin cậy. Để tăng độ tin cậy người ta dùng hệ số đáp ứng của detector đối với từng thành phần của mẫu. 1.4. Vài nét về HPLC với detector huỳnh quang. Quang phổ huỳnh quang ngoài việc áp dụng để định tính, định lượng các chất trên máy đo quang phổ huỳnh quang thì nó còn được dùng để chế tạo bộ phận phát hiện của máy HPLC. Detector huỳnh quang đóng vai trò như một máy huỳnh quang kết nối với sắc ký lỏng để phát hiện về phân tích định tính và định lượng các chất sau khi ra khỏi cột sắc ký. Detector huỳnh quang có độ chọn lọc và nhạy hơn (có thể đến 1000 lần) detector hấp thụ UV. HPLC-detector huỳnh quang có thể phát hiện tới 10-12g. Do có độ nhạy cao nên detector huỳnh quang được sử dụng trong phân tích vết trong kiểm soát môi trường, giám định pháp y, định lượng hoạt chất trong dịch sinh học... Tùy theo các chất cần định lượng có khả năng phát quang hay không mà tiến hành định lượng trực tiếp hay gián tiếp thông qua dẫn chất có khả năng phát quang của nó. Người ta có thể cho chất cần phân tích phản ứng với thuốc thử để tạo dẫn chất phát huỳnh quang mạnh trước khi đến detector huỳnh quang. Việc tạo dẫn xuất này có thể tiến hành trước hoặc sau khi chất cần phân tích đi qua cột sắc ký. Nếu chất cần phân tích được phản ứng với thuốc thử trước khi qua cột thì kỹ thuật này gọi là tạo dẫn xuất trước cột. Nếu chất cần phân tích được phản ứng với thuốc thử sau khi đã đi ra khỏi cột, thì được gọi là tạo dẫn xuất sau cột. 1.5. Vài nét về LC-MS. LC-MS là kỹ thuật phân tích dựa trên sự kết hợp sắc ký lỏng hiệu năng cao và phân tích khối phổ. Sự kết hợp này tạo nên một hệ thống có những ứng dụng rộng lớn trong phân tích. - Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ cho phép phân tích hỗn hợp các chất khó bay hơi như các thuốc bảo vệ thực vật, các thuốc chữa bệnh,... các độc tố, các phân tử protein có phân tử lượng lớn từ vài ngàn đến hàng trăm ngàn đơn vị dalton... [8]. - Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ có bộ kết nối phun điện được sử dụng rất hữu hiệu phân tích dược phẩm cả định tính và định lượng, ví dụ các thuốc có trong các mẫu sinh học phức tạp như HT, huyết thanh, nước tiểu... [8]. *Nguyên tắc hoạt động của máy phân tích khối phổ: Đây là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hay nguyên tử của mẫu. Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phân tích khối trước khi đến detector. Tất cả các quá trình này diễn ra trong thiết bị áp suất thấp, áp suất trong hệ dao động từ 10-3 đến 10-6 Pa. Nhiệm vụ của detector khối phổ: Chuyển các ion đã đến detector thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ. *Các bộ phận của máy phân tích khối phổ: - Bộ nạp mẫu: Có đường kết nối với đầu ra của máy sắc ký lỏng. - Bộ nguồn ion hóa: Nhiệm vụ ion hóa các phân tử, nguyên tử của mẫu. Có rất nhiều kỹ thuật ion hóa khác nhau nhưng hiện nay thường sử dụng kỹ thuật ion hóa bằng phun điện tử (ESI) và ion hóa hóa học ở áp suất thường (APCI) Trong đề tài này chúng tôi sử dụng kỹ thuật ESI. ESI có vai trò chuyển ion từ pha lỏng sang pha khí. Kỹ thuật này được mô tả như sau: Các phân tử dung môi và hóa chất sau khi ra khỏi cột sắc ký sẽ được đưa vào một ống mao quản cao thế 2 đến 5 KV (điện thế dương ở đầu kim tạo ion dương, điện thế âm ở đầu kim tạo ion âm và được quyết định tùy chất khảo sát). Dưới tác động của điện thế cao có sự tạo thành những hạt nhỏ mang điện. Sau khi qua ống mao quản dưới tác động của luồng khí nitơ nóng các phân tử dung môi từ từ bay hơi, các hạt mang điện tích nhỏ dần. Sau đó các ion dương hay âm tạo thành được đưa vào bộ phận tách ion qua một cửa rất nhỏ, dung môi và khí nitơ bị bơm hút ra ngoài [21]. - Bộ phân tích khối: có nhiệm vụ tách các ion có trị số m/z khác nhau thành từng phần riêng biệt. - Bộ phận phát hiện ion: Có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ. -Bộ xử lý dữ liệu: Tín hiệu điện được khuyếch đại trước khi chuyển thành tín hiệu phục vụ sử lý dữ liệu theo yêu cầu khác nhau: Ghi phổ, định lượng... * Một số kỹ thuật LC-MS - Kỹ thuật phân tích toàn thang (full scan) Là kỹ thuật phân tích mà phổ khối sẽ đưa ra toàn bộ ion sinh ra từ ion gốc, ta có một sắc đồ toàn ion (Total Ion Chromatogram). Kỹ thuật này có độ nhiễu đường nền rất lớn nên độ nhạy kém [9]. - Kỹ thuật phân tích chọn lọc ion (SIM) Đây là kỹ thuật ngay từ đầu chỉ cho phổ kế nhận diện một ion và ghi sắc đồ theo thời gian. Lúc này sắc đồ chỉ ghi tất cả các mũi có chứa ion đó. Kỹ thuật này có tác dụng làm giảm bớt nhiễu đường nền và do đó làm tăng độ nhạy (tăng tỷ lệ tín hiệu /nhiễu đường nền). Kỹ thuật này thuận lợi để phân tích dư lượng một chất đã biết trong một mẫu phức tạp [9]. - Kỹ thuật MS/MS Kỹ thuật này chọn một ion ở chế độ MS lần 1, ion đó sẽ được phân tích tiếp bằng cách tạo ra mảnh ion nhỏ hơn đặc trưng cho ion trước đó, được phân tích MS lần 2. Nếu tiếp tục chọn ion và bẻ gãy ion ta có kỹ thuật MSn (n là số lần bẻ gẫy ion) [21] Chương 2: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu. 2.1.Đối tượng nghiên cứu Để xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích AZI trong HT người, chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên các đối tượng sau: - Mẫu trắng: là HT người của viện Huyết học và truyền máu trung ương. - Mẫu chuẩn: là mẫu trắng được thêm AZI với nồng độ xác định. - Mẫu thử: là HT người có sử dụng AZI. 2.2. Hoá chất và thiết bị * Hoá chất : Bảng 2.1: Danh mục hóa chất- thuốc thử- chất chuẩn Tên chất Nguồn gốc Tiêu chuẩn Hàmlượng Hóa chất thuốc thử Diethyl ether Merck - Đức P.A 99,5% Acetonitril Baker - Mỹ HPLC nhà sản xuất 99,9% Methanol Baker - Mỹ HPLC nhà sản xuất 99,8% Natri carbonat Vel - Bỉ P.A Acid boric Vel - Bỉ P.A Kali clorid Vel - Bỉ P.A Amoni acetat Vel - Bỉ P.A FMOC-Cl Aldrich-Mỹ P.A Chất chuẩn Azithromycin Viện kiểm nghiệm TƯ - VN 97,27% Roxithromycin Viện kiểm nghiệm TƯ - VN 97,73% Clarithromycin Viện kiểm nghiệm TƯ - VN 97,82% Chế phẩm HT người Viện huyết học và truyền máu TƯ -VN Viên nén Zithromax Pfizer-USA 250mg * Thiết bị - dụng cụ - Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu 10A-VP - Detector huỳnh quang. - Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ Thermo-Finnigan LCQ Advantage Max. - Bộ lọc dung môi (màng lọc 0,45μm), bộ lọc mẫu (màng lọc 0,2μm) - Máy lắc siêu âm (Brasonic - Mỹ). - Cân phân tích (Sartorius - Đức) - Máy đo pH (Metrohm - Thụy Sĩ). - Máy ly tâm (Jouan - Pháp) - Máy siêu li tâm (Sartorius - Đức) - Tủ lạnh sâu (Frigo - Đan Mạch). - Máy lọc nước siêu sạch (Elga -Anh). - Máy lắc (Labinco - Hà Lan). - Nồi cách thủy. - ống nghiệm lấy máu chứa EDTA, - ống nghiệm teflon dung tích 30ml. - Bình định mức chính xác, pipet chính xác và các dụng cụ thủy tinh khác. 2.3. Phương pháp nghiên cứu Định lượng AZI trong HT là quá trình phân tích phức tạp yêu cầu phương pháp phân tích phải có tính chọn lọc tốt, độ nhạy, độ chính xác cao. Sau khi tìm hiểu sâu về đối tượng nghiên cứu, mục tiêu của đề tài và tham khảo tài liệu chúng tôi đã lựa chọn hai phương án để tiến hành khảo sát đó là: HPLC với detector huỳnh quang và LC-MS. 2.3.1. Khảo sát quy trình định lượng AZI trong dung môi bằng HPLC detector huỳnh quang. *Chuẩn bị dung dịch: - Dung dịch chuẩn AZI nồng độ lần lượt là 5, 10, 25, 50, 100 mg/ml trong methanol - Dung dịch nội chuẩn CLA (IS) 50 mg/ml - Dung dịch dẫn xuất huỳnh quang FMOC-Cl: 0,5mg/ml - Dung dịch đệm Borat 0,1M pH 7,4 * Khảo sát điều kiện chạy sắc ký. Khảo sát về cột, nhiệt độ cột, pha động, tốc độ dòng, detector huỳnh quang (bước sóng kích thích, bước sóng phát xạ) * Khảo sát điều kiện tạo dẫn xuất huỳnh quang. - Khảo sát nhiệt độ phản ứng tạo dẫn xuất: Giữ nguyên các điều kiện phản ứng khác, chỉ thay đổi nhiệt độ từ 30 đến 70oC, cách 10oC - Khảo sát thời gian phản ứng: Giữ nguyên nhiệt độ phản ứng tối ưu là 50oC, thay đổi thời gian phản ứng trong khoảng từ 30 đến 60 phút, cách 10 phút. * Đánh giá một số thông số kỹ thuật của phương pháp. - Tính chọn lọc. - Tính phù hợp của hệ thống sắc ký. - Khoảng tuyến tính. - Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ). 2.3.2. Khảo sát xây dựng quy trình định lượng AZI trong HT bằng LC-MS. 2.3.2.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn. Để giảm các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phân tích và tăng độ chính sác chúng tôi chọn phương pháp nội chuẩn. Sau khi tìm hiểu, tham khảo một số tài liệu chúng tôi chọn hai chất có cùng cấu trúc phân tử là CLA và ROXI để tiến hành khảo sát chọn làm chuẩn nội. - Pha dung dịch chuẩn gốc AZI: cân chính xác chất chuẩn AZI, hòa tan trong methanol để được dung dịch gốc. Từ đó pha thành các dung dịch chuẩn thứ cấp có nồng độ 0,2- 20mg/ml trong methanol. 2.3.2.2. Sử lý mẫu Từ các tính chất lý hóa của AZI và theo các tài liệu đã công bố, chúng tôi chọn xây dựng quy trình sử lý mẫu theo phương pháp chiết lỏng - lỏng. 2.3.2.3. Khảo sát điều kiện để định lượng AZI. Tiến hành chạy thử trên từng mẫu AZI, chuẩn nội (IS) và hỗn hợp AZI và IS trong dung môi pha động để: * Khảo sát điều kiện khối phổ. - Kỹ thuật MS một lần: phân tích toàn thang để xác định ion phân tử. - Kỹ thuật SIM sử dụng ion phân tử để định lượng. * Khảo sát điều kiện sắc ký. - Cột sắc ký: khảo sát khả năng tách của AZI và IS trên các cột: Thermo C18 (50 x 2,1mm; 5mm) và Zorbax C18 SB (150 x4,6; 5mm). - Pha động: dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát trên hệ pha động acetonitril : amoni acetat 0,05M với tỷ lệ khác nhau và chạy chế độ đẳng dòng hay gradient. - Tốc độ dòng: thay đổi lưu lượng pha động từ 0,2 – 0,6ml/phút để xác định được tốc độ phù hợp cho thời gian lưu tối ưu. - Tiêm mẫu tự động 25ml 2.3.2.4 Thẩm định phương pháp phân tích * Tính chọn lọc Chuẩn bị mẫu: - HT trắng. - HT có AZI. - HT có IS. - HT có AZI và IS. Xử lý mẫu và tiến hành phân tích * Tính phù hợp của hệ thống sắc ký Chuẩn bị mẫu chuẩn có AZI và IS trong pha động. Tiến hành sắc ký 6 lần liên tiếp, xác định độ lệch chuẩn tương đối của các thông số: thời gian lưu, tỷ số diện tích pic. * Khoảng nồng độ tuyến tính, hàm đáp ứng Chuẩn bị các mẫu HT trắng, thêm AZI và IS tạo thành các mẫu có nồng độ AZI từ 0,02 - 2 mg/ml, xử lý mẫu theo sơ đồ hình 3.1 và tiến hành phân tích. *LOD và LOQ LOD là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể xác định được nhưng không nhất thiết phải định lượng được trong điều kiện thí nghiệm cụ thể. LOD được coi là nồng độ chất phân tích gây nên sự tăng tín hiệu đáp ứng 3 lần so với đáp ứng tín hiệu của mẫu trắng (S/N=3). LOQ là nồng độ thấp nhất của chất cần phân tích có thể định lượng được với độ đúng và độ chính xác phù hợp. LOQ được chấp nhận nếu đáp ứng của chất phân tích phải ít nhất gấp 10 lần đáp ứng của mẫu trắng. Trong phương pháp sắc ký độ nhiễu của đường nền có thể thay cho tín hiệu của mẫu trắng. Tiến hành xử lý các mẫu HT trắng và mẫu chuẩn có nồng độ AZI thấp dần và tiến hành phân tích. * Độ đúng Chuẩn bị các mẫu AZI trong HT trắng ở 3 nồng độ khảo sát, mỗi nồng độ làm 5 mẫu, xử lý mẫu và tiến hành phân tích, so sánh giá trị trung bình giữa các lần định lượng của mỗi nồng độ với giá trị thực có trong mẫu, tính theo lượng chuẩn đã cân và thể tích đã pha. *Độ chính xác. Chuẩn bị các mẫu AZI trong HT trắng ở 3 nồng độ, mỗi nồng độ làm 5 mẫu và xử lý như trong phần xác định độ đúng, sau khi tiến hành sác ký, đánh giá độ lệch chuẩn tương đối của các mẫu theo từng nồng độ. 2.3.2.5. Xác định hiệu suất chiết Chuẩn bị các mẫu AZI trong HT trắng ở 3 nồng độ khảo sát, mỗi nồng độ làm 3 mẫu, song song tiến hành sắc ký các mẫu chuẩn pha trong pha động ở 3 nồng độ tương ứng. Đánh giá hiệu suất chiết thông qua so sánh chỉ số diện tích pic trung bình trong HT so với trong pha động ở từng nồng độ tương ứng. 2.3.3. Định lượng thăm dò AZI trong HT người uống AZI Tiến hành lấy máu định lượng AZI trong HT 2 người tình nguyện sử dụng chế phẩm có chứa AZI ( uống 2 viên nén Athromax hàm lượng 250 mg). Mỗi người được lấy máu ở 2 thời điểm, sau uống thuốc 1 giờ và 1,75 giờ. Lấy máu tĩnh mạch cánh tay vào ống nghiệm có chứa EDTA, ly tâm lấy HT thêm chuẩn nội, xử lý mẫu và tiến hành phân tích. 2.3.4. Phân tích số liệu thực nghiệm Tính toán các số liệu: giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, độ lệch chuẩn tương đối, phương trình hồi quy và hệ số tương quan hồi quy bằng chương trình phần mềm Microsoft Excel. Chương 3: Kết quả 3.1. Xây dựng quy trình xử lý mẫu Từ các tính chất lý hóa của AZI và theo các tài liệu đã công bố, trên cơ sở điều kiện hiện có chúng tôi xây dựng quy trình chiết AZI từ HT theo phương pháp chiết lỏng-lỏng. - Kiềm hóa bằng Na2CO3 0.05M - Dung môi chiết: Diethyl ether - Thể tích dung môi:10ml - Thời gian lắc xoáy: 3 phút - Nhiệt độ cô bay hơi dung môi: 45oC Quy trình xử lý mẫu được trình bày cụ thể tại hình 3.1  0,5ml HT+ 0,1ml IS Hỗn hợp chiết Lắc xoáy 30 giây HT đã kiềm hóa + Kiềm hóa bằng 0,4ml đệm Carbonat 0,05M + Lắc xoáy 30 giây Dịch chiết + Dung môi chiết (10ml) + Lắc xoáy 5 phút + Siêu ly tâm 10phút (12.500 vòng/phút) + Hút 7 ml dung môi Cắn khô Bốc hơi cách thủy 45oC Dung dịch trong Dịch lọc + 0,7 ml pha động + Lắc xoáy 60 giây Lọc qua màng lọc có đường kính lỗ lọc 0,2mm Chạy sắc ký Hình 3.1. Sơ đồ quy trình chiết AZI trong HT 3.2. Khảo sát quy trình định lượng AZI trong dung môi bằng HPLC detector huỳnh quang. Định lượng AZI trong nền mẫu HT bằng phương pháp HPLC với detector huỳnh quang đòi hỏi trải qua quá trình xử lý mẫu phức tạp và quá trình dẫn xuất hóa để tạo chất phát huỳnh quang. Trước hết, tiến hành khảo sát trên mẫu AZI chuẩn pha trong acetonitril. Để hạn chế các sai số có thể gặp phải chúng tôi lựa chọn sử dụng chất nội chuẩn. Qua quá trình khảo sát chúng tôi chọn CLA là một chất có nhiều tính chất tương đồng với AZI làm chất nội chuẩn. *Chuẩn bị dung dịch chuẩn: - Dung dịch chuẩn gốc AZI: Cân chính xác một lượng chất chuẩn AZI pha trong acetonitril sao cho thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1000 mg/ml. Từ dung dịch chuẩn gốc AZI pha loãng bằng acetonitril để thu được các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ lần lượt là 5, 10, 25, 50, 100 mg/ml - Dung dịch nội chuẩn CLA 50 mg/ml trong acetonitril *Dung dịch dẫn xuất huỳnh quang FMOC-Cl: 0,5mg/ml pha trong acetonitril *Dung dịch đệm Borat 0,1M pH 7,4 (0,625g acid boric và 0,750 KCl pha trong 100ml nước, chỉnh pH tới 7,4). 3.2.1.Điều kiện chạy sắc ký để định lượng AZI Qua khảo sát các điều kiện phân tích, chúng tôi đã chọn lựa điều kiện phân tích như sau: Cột: C18 (150 mm x 4,6 mm x 5 m) của Symmestry Waters Nhiệt độ cột: 400C Pha động: Acetonitril: Đệm phosphat 0,1M pH 7,7 (76:24) Tốc độ dòng: 1,5ml/phút Tiêm mẫu: 50ml Detector huỳnh quang: Bước sóng kích thích: 270 nm Bước sóng phát xạ: 317 nm 3.2.2. Khảo sát điều kiện tạo dẫn xuất huỳnh quang Dẫn xuất hóa với FMOC-Cl để tạo dẫn xuất phát huỳnh quang Theo các nghiên cứu trước đây, nhiều tác giả đã sử dụng FMOC-Cl để tạo dẫn xuất huỳnh quang cho định lượng nhiều chất thuộc nhóm Macrolid, trong đó có AZI. Chúng tôi triển khai nghiên cứu các điều kiện phản ứng cho tối ưu với điều kiện ở phòng thí nghiệm. Dung dịch dẫn xuất hóa FMOC-Cl được pha trong acetonitril với nồng độ giữ cố định 0,5mg/ml và phản ứng được thực hiện ở pH 7,4 [10]. Hai thông số chúng tôi khảo sát thêm là nhiệt độ tiến hành phản ứng và thời gian phản ứng. *Chuẩn bị dung dịch chuẩn tiến hành dẫn xuất hóa Chuẩn bị 5 ống nghiệm thủy tinh có nắp kín và tiến hành theo bảng sau: Bảng 3.1: Quy trình tạo dãy mẫu chuẩn và dẫn xuất hóa ống Chuẩn 1 2 3 4 5 AZI 5mg/ml 0,1ml AZI 10mg/ml 0,1ml AZI 25mg/ml 0,1ml AZI 50mg/ml 0,1ml AZI 100mg/ml 0,1ml CLA 50mg/ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml Thổi khô bằng khí Nitơ ở nhiệt độ < 500C Dung dịch FMOC-Cl 0,5mg/ml 0,8ml 0,8ml 0,8ml 0,8ml 0,8ml Dung dịch đệm Borat pH 7,4 0,2ml 0,2ml 0,2ml 0,2ml 0,2ml Lắc xoáy 30s Phản ứng ở 500C trong 40 phút Làm lạnh, lọc qua màng lọc 0,45mm và bơm vào HPLC Nồng độ chuẩn AZI/dung dịch (mg/ml) 0,5 1,0 2,5 5,0 10,0 * Khảo sát nhiệt độ phản ứng: Giữ nguyên các điều kiện phản ứng khác, chỉ thay đổi nhiệt độ từ 30, 40, 50, 60, 70o C. Kết quả được thể hiện theo biểu đồ sau: Hình 3.2. Kết quả khảo sát nhiệt độ phản ứng tạo dẫn xuất huỳnh quang Kết quả cho thấy ở nhiệt độ 500C là nhiệt độ mà phản ứng đạt được hiệu suất tốt nhất * Khảo sát thời gian phản ứng Giữ nguyên nhiệt độ phản ứng tối ưu là 50oC, thay đổi thời gian phản ứng trong khoảng từ 30 đến 60 phút. Kết quả thu được theo biểu đồ sau: Hình 3.3. Kết quả khảo sát thời gian phản ứng tạo dẫn xuất huỳnh quang Kết quả cho thấy phản ứng xảy ra tốt nhất trong vòng khoảng 40 phút, do đó chúng tôi quyết định chọn thời gian phản ứng là 40 phút và phản ứng ở 50 0C. Tổng kết các điều kiện dẫn xuất hóa: + Nồng độ thuốc thử FMOC-Cl: 0,5mg/ml, pH 7,4. + Nhiệt độ 500C + Thời gian 40 phút 3.2.3. Kết quả đánh giá một số chỉ tiêu thẩm định. *Tính chọn lọc: Chuẩn bị: Mẫu trắng Mẫu có AZI Mẫu có CLA Mẫu có AZI và CLA Tiến hành dẫn xuất hóa và chạy sắc ký. Hình 3.4: Sắc ký đồ mẫu trắng Hình 3.5: Sắc ký đồ mẫu có AZI Hình 3.6: Sắc ký đồ mẫu có CLA Hình 3.7: Sắc ký đồ mẫu có AZI và CLA Nhận xét: trên sắc ký đồ mẫu trắng tại các vị trí tương ứng với thời gian lưu của các pic AZI và CLA đã dẫn xuất hóa không xuất hiện pic lạ, các pic AZI và CLA cân đối, sắc nét, tách riêng biệt. Từ các kết quả trên cho thấy phương pháp có tính chọn lọc tốt. *Tính phù hợp của hệ thống HPLC: Chuẩn bị mẫu chuẩn có Azi nồng độ 10mg/ml và CLA nồng độ 5mg/ml và tiến hành phản ứng dẫn xuất hóa và phân tích theo điều kiện sắc ký đã xác định. Tiến hành sắc ký 6 lần liên tiếp, xác định độ lệch chuẩn tương đối của các thông số: thời gian lưu, tỷ số diện tích pic. Bảng 3.2.: Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống HPLC Lần tiêm Thời gian lưu AZI(phút) Diện tích pic AZI(Volts*s) Thời gian lưu CLA(phút) Diện tích pic CLA (Volts*s ) Tỷ số dt AZI/CLA 1 12,94 1709837 10,61 244582 6,99 2 13,21 1774072 10,87 236838 7,49 3 13,24 1787837 10,75 256497 6,97 4 13,13 1770982 10,70 243870 7,26 5 12,87 1761861 10,54 244921 7,19 6 13,01 1771063 10,72 243981 7,26 TB 13,07 1766,11 7,19 SD 0,15 4299,78 0,19 RSD (%) 1,15 1,06 2,70 Nhận xét: độ lệch chuẩn tương đối của các thông số phân tích đều nhỏ hơn 3%, điều này chứng tỏ hệ thống sắc ký có tính thích hợp chấp nhận được. *Khoảng tuyến tính: Chuẩn bị các mẫu có nồng độ AZI từ 0,5 – 10,0 mg/ml và CLA có nồng độ cố định 5,0mg/ml, tiến hành dẫn xuất huỳnh quang, phân tích theo quy trình đã xác định. Bảng 3.3: Sự phụ thuộc giữa tỷ số diện tích pic và nồng độ AZI Nồng độ AZI (mg/ml) Diện tích pic AZI(Volts*s) Diện tích pic CLA(Volts*s) Tỷ số diện tích píc 0,5 68486 255288 0,26827 1,0 143670 254804 0,563845 2,5 412723 244074 1,690975 5,0 849246 230574 3,683182 10,0 1796312 250506 7,170734 Phương trình hồi qui: Y=0,7315X – 0,0982 Hệ số tương quan : R2= 0,9993 Trong đó : Y là tỷ số diện tích pic (AZI/CLA) X là nồng độ AZI Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa tỷ số diện tích pic và nồng độ AZI Nhận xét: Từ các kết quả trên cho thấy có sự phụ thuộc tuyến tính giữa tỷ số diện tích pic (AZI/CLA) và nồng độ AZI. Đường chuẩn hồi quy có dạng thẳng và hệ số tương quan lớn hơn 0,999 chứng tỏ có sự tương quan tuyến tính chặt giữa tỷ số diện tích pic (AZI/CLA) và nồng độ AZI ở trong khoảng nồng độ khảo sát. *LOD và LOQ: Tại nồng độ 0,5mg/ml dựa vào sắc ký đồ và theo kết quả tính toán ta thấy tỷ lệ S/N 10. Vậy ta có: LOQ = 0,5 mg/ml LOD = 0,5/3,3 = 0,15 mg/ml Hình 3.9: Sắc ký đồ AZI 0,5mg/ml và CLA 5,0mg/ml Nhận xét: Với LOQ là 0,5 mg/ml, rất khó có thể áp dụng phương pháp HPLC với detector huỳnh quang đã khảo sát trên để phân tích AZI trong HT vì theo một số nghiên cứu thì AZI có Cmax = 0,33238±0,09012mg/ml trong HT[16], Cmax= 0,3942±0,1339mg/ml trong huyết thanh[10], khi uống 2 viên Zithromax(Pfizer,USA) 250mg. Vì vậy chúng tôi chuyển sang khảo sát xây dựng quy trình định lượng AZI trong HT bằng LC-MS để đạt được độ nhạy phù hợp. 3.3. Khảo sát xây dựng chương trình LC-MS để định lượng AZI trong HT 3.3.1.Khảo sát lựa chọn chất chuẩn nội Bơm trực tiếp lần lượt dung dịch AZI, CLA và ROXI có nồng độ 500ng/ml trong acetonitril : amoni acetat 0,05M (1:1) vào hệ thống khối phổ với tốc độ 5μl/phút, với chế độ phun điện tử ion dương ( +ESI). Phổ khối của AZI, CLA và ROXI được ghi ở hình 3.10, 3.11 và 3.12. Hình3.10.Phổ khối AZI Hình3.11.Phổ khối CLA Hình3.12.Phổ khối ROXI Sau khi khảo sát chúng tôi chọn ROXI làm chất chuẩn nội vì có mảnh khối mẹ m/z= 837,7 khác nhiều so với mảnh mẹ của AZI, trong khi đó CLA có mảnh khối quá gần AZI (chỉ khác nhau 1 đơn vị) 3.3.2. Xác định điều kiện khối phổ *Tối ưu hóa điều kiện bắt ion phân tích ( ion mẹ m/z) Để xác định điều kiện khối phổ, trước tiên chúng tôi pha từng chất trong pha động, sau đó bơm trực tiếp bằng syringe và chạy chương trình Tune để điều chỉnh các thông số khối phổ. Quá trình tiến hành như sau: - Pha dung dịch chuẩn AZI và ROXI riêng rẽ trong acetonitril : amoni acetat 0,05M (1:1) có nồng độ 500ng/ml. - Bật máy khối phổ, khởi động phần mềm điều khiển trên màn hình windows (Instrument Setup) vào Tune Plus, xuất hiện cửa sổ Tune Plus, chọn chế độ +ESI. - Bơm dung dịch AZI 500ng/ml vào hệ thống khối phổ với tốc độ 5μl/phút, sau một thời gian sẽ xuất hiện mảnh ion mẹ có m/z= 749,3. Nhấn vào biểu tượng Tune trên màn hình sẽ xuất hiện cửa sổ chạy chế độ Automatic Tune, trong ô Mass (m/z) đánh số 749 để Tune cho mảnh mẹ, máy sẽ tự động điều chỉnh và tối ưu hóa các thông số sao cho bắt ion m/z= 749 tốt và nhạy nhất. Quá trình này diễn ra trong khoảng 5 phút. Sau khi máy đã tự động điều chỉnh sẽ cho tín hiệu của ion m/z lớn hơn ban đầu. Lưu file Tune này với tên AZI.LCQ Tune. - Tiến hành như trên với dung dịch ROXI, mảnh ion mẹ có m/z= 837 lưu lại file Tune với tên ROXI.LCQ Tune * Tối ưu hóa điều kiện bắt ion phân tích dưới điều kiện tốc độ dòng của sắc ký lỏng. - Gọi chương trình Tune Plus và phương pháp Tune như đã nêu, gọi file AZI.LCQ Tune. - Tiếp tục điều chỉnh tối ưu hóa điều kiện khối phổ ở điều kiện thực tế của sắc ký lỏng (tốc độ dòng 0,5ml/ phút). Tiến hành bơm AZI nồng độ 500ng/ml vào hệ thống khối phổ với tốc độ 5ml/phút và được trộn với dòng dung môi sắc ký qua bộ trộn hình chữ T (T Union). Lượng dung môi theo dòng sắc ký lúc này là 0,5ml/phút gấp 100 lần lúc trước (5ml/phút), do đó cần thiết phải dùng khí để bay hơi dung môi, chọn Sheath gas=30; Auxilary gas=20. Sau một thời gian sẽ xuất hiện mảnh khối m/z 749, quá trình Tune tiếp tục được tiến hành tương tự như đã nêu ở trên sau đó lưu lại file Tune với tên AZI Flow 0,5mlph.LCQ Tune. - Tiến hành tương tự với ROXI ghi lại file Tune với tên ROXI flow 0,5mlph.LCQ Tune. Như vậy ngoài các thông số được lựa trọn tối ưu tự động cần thiết lập một số thông số sau: - MS chế độ SIM: + Chọn ion có m/z từ 748-750 (để xác định AZI), + Chọn ion có m/z từ 836- 838 (để xác định ROXI). - Sheath Gas: 30 - Auxilary Gas: 20 3.3.3. Xác định chương trình sắc ký. *Khảo sát cột sắc ký: Pha dung dịch chuẩn AZI 1mg/ml và dung dịch chuẩn ROXI 10mg/ml trong pha động, chạy LC-MS chế độ SIM, pha động acetonitril : amoni acetat 0,05M(5:5). (AZI) (ROXI) Hình 3.13. Sắc ký đồ AZI và ROXI chạy cột Thermo C18(50x2,1mm; 5mm) (AZI) (ROXI) Hình 3.14: Sắc ký đồ AZI và ROXI chạy cột Zorbax C18 SB (150x4,6; 5mm) Cột Thermo cho pic xấu, kéo đuôi thời gian lưu của AZI và ROXI gần trùng nhau. Chúng tôi chọn sử dung cột Zorbax C18 SB (150 x4,6; 5mm) vì cho pic tương đối đẹp với thời gian lưu hợp lý. *Pha động: Khảo sát hệ pha động acetonitril : amoni acetat 0,05M với các tỷ lệ (9:1),(8:2), (7:3) ,(6:4) và (5:5). Kết quả khảo sát cho thấy với tỷ lệ (6:4) có khả năng tách tốt nhất, cho 2 pic sắc nét tách rời nhau, chân pic gọn, cân đối và có thời gian phân tích hợp lý. Khảo sát chạy pha động theo chế độ gradient như sau: Pha động kênh A ( NH4CH3COO 50mM), kênh B(MeCN) Chạy chế độ Gradient bắt đầu 40% B thay đổi tuyến tính tới 90%B trong 1,5 phút. Sau đó duy trì 90%B trong 0,5 phút rồi trở lại tỷ lệ ban đầu nhưng kết quả pic thu được không tốt bằng chạy chế độ đẳng dòng, pic bị kéo đuôi và rất tù. Do vậy, trong quá trình xây dưng phương pháp, chúng tôi chọn hệ dung môi này với tỷ lệ 6:4 và không sử dụng chế độ trộn tự động. - Tốc độ dòng: qua khảo sát lưu lượng dòng từ 0,2 – 0,6ml/phút cho thấy lưu lượng dòng là 0,5 ml/phút là tối ưu vì vẫn có khả năng tách riêng AZI và ROXI, lại có thời gian phân tích hợp lý. - Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng - Thể tích tiêm: tiêm tự động với thể tích 25ml. - Điều kiện phân tích khối phổ: theo các thông số đã được thiết lập ở trên. Hình 3.15: Sắc ký đồ AZI và ROXI chạy chế độ đẳng dòng 0,5ml/phút hệ dung môi acetonitril : amoni acetat 0,05M(6:4) 3.3.4. Kết quả thẩm định phương pháp phân tích. 3.3.4.1. Đánh giá tính chọn lọc. Chuẩn bị mẫu: HT trắng. HT trắng có thêm AZI. HT trắng có thêm ROXI. HT trắng có thêm AZI và ROXI. Xử lý mẫu theo sơ đồ hình 3.1 và tiến hành phân tích theo điều kiện sắc ký đã xác định. Kết quả thu được trình bày ở hình 3.16. Sắc ký đồ mẫu HT trắng Sắc ký đồ và phổ khối mẫu HT có AZI Sắc ký đồ và phổ khối mẫu HT có ROXI Sắc ký đồ mẫu HT có AZI và ROXI Hình 3.16. Các sắc ký đồ đánh giá tính chọn lọc của phương pháp. Nhận xét: Trên sắc ký đồ mẫu trắng tại các vị trí tương ứng với thời gian lưu của AZI và ROXI không xuất hiện pic lạ, các pic AZI và ROXI cân đối, sắc nét, tách riêng biệt. Phổ khối của pic tại thời điểm 3,12 phút có m/z=749,3 và tại thời điểm 6 phút có m/z=837,08 trùng với giá trị m/z của chất chuẩn AZI và ROXI khi tiến hành các điều kiện chạy MS. Từ các kết quả trên, chúng ta thấy phương pháp có tính chọn lọc tốt. 3.3.4.2. Đánh giá tính phù hợp của hệ thống. Chuẩn bị mẫu chuẩn có AZI nồng độ 1mg/ml và ROXI nồng độ 2mg/ml trong pha động, phân tích theo điều kiện LC-MS đã xác định. Tiến hành phân tích 6 lần liên tiếp, kết quả các thông số: thời gian lưu, diện tích pic, tỷ số diện tích pic được trình bày ở bảng 3.4. Bảng 3.4. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống LC-MS Lần tiêm Thời gian lưu AZI (phút) Diện tích pic AZI (relative Abundance*s) Thời gian lưu ROXI (phút) Diện tích pic ROXI (relative Abundance*s) Tỷ số diện tích AZI/ROXI 1 3,24 83975382 5,97 55977799 1,50 2 3,25 97146667 5,97 60627152 1,60 3 3,26 106438830 5,95 63970613 1,66 4 3,27 108898880 5,94 67171078 1,62 5 3,25 100948268 5,93 65374934 1,54 6 3,24 108645034 5,93 69106856 1,57 TB 3,25 5,95 1,58 SD 0,01 0,02 0,06 RSD (%) 0,36 0,31 3,67 Nhận xét: độ lệch chuẩn tương đối của các thông số phân tích đều nhỏ hơn 4%, điều này chứng tỏ hệ thống sắc ký có tính thích hợp chấp nhận được, có thể ứng dụng phân tích mẫu để cho kết quả tin cậy. 3.3.4.3. Xác định khoảng nồng độ tuyến tính. Chuẩn bị các mẫu HT trắng, thêm AZI và ROXI tạo thành các mẫu có nồng độ AZI lần lượt là 0,02mg/ml; 0,05mg/ml; 0,15mg/ml; 0,5mg/ml; 1,5mg/ml và 2mg/ml, nồng độ ROXI cố định 2mg/ml. Xử lý mẫu theo quy trình đã xây dựng như trong sơ đồ hình 3.1 và tiến hành phân tích theo điều kiện sắc ký đã xác định. Kết quả thu được trình bày trong bảng 3.5 Bảng 3.5. Sự phụ thuộc giữa tỷ số diện tích pic và nồng độ AZI trong HT Mẫu 1 2 3 4 5 6 7 Nồng độ (mg/ml) 0,02 0,05 0,15 0,50 1,00 1,50 2,00 Tỷ số diện tích (AZI/ROXI) 0,0367 0,0742 0,2387 0,5807 1,0956 1,6322 2,3405 Phương trình hồi quy: Y= 1,1237 X + 0,019 Hệ số tương quan: R2= 0,9966 Trong đó: X là nồng độ của AZI trong HT (mg/ml) Y là tỷ số giữa diện tích pic của AZI và diện tích pic của ROXI Hình 3.17. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa tỷ số diện tích pic(AZI/ROXI) và nồng độ AZI trong HT Nhận xét: từ các kết quả trong bảng 3.5. và hình 3.17 cho thấy có sự phụ thuộc tuyến tính giữa tỷ số diện tích pic (AZI/ROXI) và nồng độ AZI trong HT. Đường chuẩn hồi quy có dạng thẳng và hệ số tương quan lớn hơn 0,99 chứng tỏ có sự tương quan tuyến tính chặt giữa tỷ số diện tích pic (AZI/ROXI) và nồng độ AZI trong HT ở khoảng nồng độ khảo sát. 3.3.4.4. Xác định LOD và LOQ Tiến hành chiết, phân tích mẫu HT có nồng độ 0,05mg/ml AZI, phân tích cho đáp ứng có tỷ số S/N=75. Phân tích với mẫu có nồng độ 0,02mg/ml AZI cho đáp ứng với tỷ số S/N=15, chỉ số gần với 10 nên xác định LOQ khoảng 0,02mg/ml và LOD vào khoảng 0,006 mg/ml. (A) (B) Hình 3.18. Sắc ký đồ mẫu HT xác định LOQ (A) có nồng độ AZI 0,05 mg/ml; (B) có nồng độ AZI 0,02mg/ml 3.3.4.5. Độ đúng Chuẩn bị các mẫu AZI có ROXI trong HT trắng ở 3 nồng độ 0,05mg/ml; 0,5mg/ml và 1,5mg/ml; mỗi nồng độ làm 5 mẫu, xử lý mẫu theo sơ đồ hình 3.1 và tiến hành phân tích theo điều kiện sắc ký đã xác lập, rồi so sánh giá trị trung bình giữa các lần định lượng của mỗi nồng độ với giá trị thực có trong mẫu. Kết quả đánh giá độ đúng được trình bày ở bảng 3.6. Bảng 3.6. Kết quả xác định độ đúng của phương pháp phân tích Mẫu STT 0,05mg/ml 0,50mg/ml 1,50mg/ml Nồng độ đo được (mg/ml) Độ đúng (%) Nồng độ đo được (mg/ml) Độ đúng (%) Nồng độ đo được (mg/ml) Độ đúng (%) 1 0,0502 100,48 0,5555 111,10 1,4357 95,71 2 0,0491 98,23 0,4999 99,98 1,5088 100,58 3 0,0477 95,46 0,4956 99,12 1,3059 87,06 4 0,0486 97,17 0,5693 113,87 1,3899 92,66 5 0,0515 103,09 0,4868 97,37 1,4131 94,21 TB 0,0494 98,89 0,5214 104,29 1,4107 94,05 Nhận xét: kết quả khảo sát cho thấy phương pháp định lượng có độ đúng biến thiên từ 94,05% - 104,29%, chứng tỏ phương pháp có độ đúng cao. 3.3.4.6. Độ chính xác Tiến hành tương tự như phần xác định độ đúng nhưng kết quả dựa trên đánh giá độ lệch chuẩn tương đối của tỷ số diện tích pic các mẫu ở từng nồng độ. Kết quả xác định độ lặp lại trong ngày được trình bày trong bảng 3.7. Bảng 3.7. Kết quả xác định độ lặp lại trong ngày của phép phân tích STT Tỷ số diện tích píc ở các nồng độ 0,05mg/ml 0,50mg/ml 1,50mg/ml 1 0,0755 0,5555 1,6322 2 0,0742 0,4999 1,7144 3 0,0726 0,4956 1,4864 4 0,0736 0,5693 1,5809 5 0,0769 0,4868 1,6070 TB 0,0746 0,5214 1,6042 SD 0,0017 0,0380 0,0827 RSD (%) 2,24 7,29 5,16 Nhận xét: kết quả từ bảng 3.7 cho thấy phương pháp có độ lặp lại trong ngày đạt yêu cầu (RSD tại 3 nồng độ đều <15%). Trong phân tích dịch sinh học, với giá trị RSD dao động từ 2,24% - 7,29% thì phương pháp này được coi là có độ chính xác trung bình (5 - 10%), [19]. 3.4. Xác định hiệu suất chiết. Chuẩn bị các mẫu AZI trong HT trắng ở 3 nồng độ khảo sát, mỗi nồng độ làm 3 mẫu, song song tiến hành sắc ký các mẫu chuẩn pha trong pha động ở 3 nồng độ tương ứng. Kết quả xác định hiệu suất chiết AZI được trình bày trong bảng 3.8. Bảng 3.8. Kết quả xác định hiệu suất chiết Nồng độ STT 0,05mg/ml 0,5mg/ml 1,5mg/ml Diện tích pic AZI Trong HT Diện tích pic AZI Trong PĐ Hiệu suất (%) Diện tích pic AZI Trong HT Diện tích pic AZI Trong PĐ Hiệu suất (%) Diện tích pic AZI Trong HT Diện tích pic AZI Trong PĐ Hiệu suất (%) 1 2731470 3047678 26468816 25995430 65566638 73791647 2 2605301 2936448 23350781 21805271 79792243 82674135 3 2744469 2800785 21812699 26001376 85689724 83012457 TB 2693747 2928304 91,99 23877432 24600692 97,06 77016202 79826080 96,48 Nhận xét: kết quả thực nghiệm cho thấy phương pháp cho hiệu suất chiết cao ở cả 3 nồng độ (từ 91,99% - 97,06%), do đó phương pháp xử lý mẫu đã xây dựng thích hợp để có thể chiết tách AZI từ HT người. 3.5. Định lượng thăm dò AZI trong HT người tình nguyện. Tiến hành lấy máu định lượng AZI trong HT 2 người tình nguyện uống chế phẩm có chứa AZI ( viên nén Zithromax liều 500 mg) sau bữa ăn 2 giờ. Mỗi người được lấy máu ở 2 thời điểm, sau uống thuốc 1giờ và 1,75 giờ. Các mẫu máu được đánh số và mã hóa theo thời gian lấy máu. Lấy máu tĩnh mạch cánh tay vào ống nghiệm có chứa EDTA, ly tâm lấy HT . Mỗi mẫu lấy 0,5ml thêm 100ml IS xử lý mẫu theo sơ đồ hình 3.1 và tiến hành sắc ký theo điều kiện đã xác định. Kết quả phân tích được trình bày trong bảng 3.9. Bảng 3.9.Kết quả định lượng thăm dò AZI trong HT người tình nguyện NTN Nồng độ AZI trong HT (μg/ml) Sau uống thuốc 1 giờ Sau uống thuốc 1,75 giờ 1 0,048 0,195 2 0,052 0,211 (T1) (T2) Sắc ký đồ mẫu sau 1giờ uống thuốc (T1) (T2) Sắc ký đồ mẫu sau 1,75 giờ uống thuốc Hình 3.19. Các sắc ký đồ định lượng AZI trong HT 2 người tình nguyện T1 và T2 Chương 4: Bàn luận. 4.1. Về xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng AZI. 4.1.1. Về xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng AZI trong dung dịch bằng HPLC với dertecter huỳnh quang. *Về Xây dựng phương pháp: Thiết lập được các điều kiện chạy sắc ký, khảo sát một số điều kiện tạo dẫn xuất huỳnh quang như: nhiệt độ, thời gian. *Về thẩm định phương pháp: Quá trình thẩm định phương pháp định lượng đã được nêu chi tiết tại mục 3.2.3 với kết quả như sau: - Phương pháp có tính chọn lọc tốt. - Hệ thống có tính phù hợp cao do có độ lệch chuẩn tương đối của các thông số phân tích đều nhỏ hơn 3% khi tiến hành sắc ký 6 lần liên tiếp trên cùng một mẫu chuẩn. - Khoảng nồng độ tuyến tính: 0,5mg/ml- 10mm/ml. Có sự tương quan chặt giữa tỷ số diện tích pic (AZI/CLA). - LOQ là 0,5 mg/ml không phù hợp để tiến hành xây dựng quy trình định lượng AZI trong HT, vì để định lương AZI trong HT đòi hỏi phương pháp có LOQ thấp hơn (ng/ml). Với giới hạn định lượng và khoảng tuyến tính trên thì phương pháp này có thể áp dụng để định lượng AZI trong các chế phẩm. 4.1.2. Về xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng AZI trong HT bằng LC-MS. *Về Xây dựng phương pháp: - Phương pháp xử lý mẫu: để tạo điều kiện tối ưu cho định lượng AZI trong HT người (có nồng độ thấp, nền mẫu phức tạp) đạt kết quả tốt, quy trình xử lý mẫu phải có khả năng loại tạp tốt và hiệu suất chiết cao. Chúng tôi lựa chọn phương pháp chiết lỏng - lỏng để tách AZI trong HT nhằm giảm chi phí cho quá trình phân tích, ngoài ra chiết lỏng - lỏng cũng không đòi hỏi các trang thiết bị đặc biệt, quá trình tiến hành đơn giản, dễ triển khai. Chiết lỏng - lỏng sử dụng dung môi hữu cơ còn có khả năng làm giàu mẫu do quá trình bay hơi dung môi (cô đặc mẫu). Tuy nhiên, trong quá trình bay hơi dung môi, để tránh AZI có thể bị phân hủy bởi nhiệt độ, nên khi bay hơi dung môi không để nhiệt độ cao ( nhỏ hơn 50oC). - Phương pháp LC-MS định lượng AZI trong HT: phương pháp LC-MS để định lượng AZI trong dịch sinh học đã được nghiên cứu và công bố trong một số tài liệu[12],[13]. Dựa vào các tài liệu đã công bố, kết hợp với các điều kiện khách quan phù hợp chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký. Kết quả đánh giá thông qua xác định tính chọn lọc, tính phù hợp của hệ thống, khoảng nồng độ đáp tuyến tính, hàm đáp ứng, tính đúng, độ chính xác, hiệu suất chiết. Qua các kết quả thu được, chúng tôi nhận thấy chương trình được xây dụng và đã sử dụng trong đề tài là phù hợp để phân tích định lượng AZI trong HT người. Pic AZI có thời gian lưu ngắn (khoảng 3 phút), tách riêng biệt khỏi pic của nội chuẩn (khoảng 6 phút), pic cân đối, gọn, với thời gian sắc ký phù hợp (8,5 phút). * Về thẩm định phương pháp định lượng. Sau khi xây dựng xong một quy trình phân tích, để đảm bảo có thể áp dụng quy trình vào phân tích trong thực tế một cách chính xác, cần thẩm định lại phương pháp với đầy đủ các chỉ tiêu như: tính chọn lọc, khoảng nồng độ tuyến tính, giới hạn định lượng, độ đúng, độ chính xác, độ ổn định của mẫu phân tích. Quá trình thẩm định phương pháp định lượng đã được nêu chi tiết tại mục 3.3.4 với kết quả như sau: *Phương pháp có tính chon lọc cao. LC-MS là một trong những thiết bị phân tích có tính chọn lọc và độ nhạy cao nhất hiện nay. Xây dụng phương pháp bằng LC-MS đảm bảo tốt được tính chọn lọc và độ nhạy nhưng hạn chế là thiết bị chưa được trang bị rộng rãi tại các trung tâm kiểm nghiệm, hiện tại chỉ có tại các trung tâm kiểm nghiệm đầu ngành do đó triển khai ứng dụng các phương pháp phân tích trên LC-MS trong ngành Y, Dược còn rất hạn chế. * Khoảng nồng độ tuyến tính: 0,02μg/ml - 2μg/ml. Hệ số tương quan lớn hơn 0,99 (R2 = 0,9966) là chấp nhận được cho định lượng trong dịch sinh học ở nồng độ thấp. Khoảng nồng độ tuyến tính thu được phù hợp để định lượng AZI trong HT người sử dụng AZI (uống 2 viên Zithromax 250mg Cmax= 332,08 ± 90,12 ng/ml, Tmax= 2,82± 1,11 h [16].) * Giới hạn định lượng: LOQ= 0,02μg/ml Trong đề tài này, giới hạn định lượng được xác định theo tỷ số S/N. Giới hạn định lượng này là phù hợp để định lượng AZI trong huyết tương phục vụ nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học * Độ đúng Phương pháp nghiên cứu có độ đúng cao với giá trị biến thiên từ 94,05% - 104,29%, độ lệch nằm trong giới hạn cho phép (±15%). Như vậy, theo tài liệu [19], phương pháp định lượng của đề tài nghiên cứu đạt tiêu chuẩn về độ đúng cho phương pháp phân tích các dịch sinh học và có thể áp dụng để định lượng AZI trong HT người. * Độ chính xác: Trong đề tài chúng tôi tiến hành thẩm định độ chính xác theo tiêu chí độ lặp lại trong ngày và kết quả cho thấy đối với độ lặp lại trong ngày, các giá trị RSD biến thiên từ 2,24% - 7,29% (< 10%), vậy phương pháp phân tích được xây dựng trong đề tài đạt tiêu chuẩn về độ chính xác cho phương pháp phân tích các dịch sinh học [19], và có độ chính xác trung bình. * Độ ổn định: Do điều kiện khách quan là không chủ động được thời gian cũng như lịch trình sử dụng thiết bị (LC-MS) nên chúng tôi chưa thực hiện đánh giá độ ổn định của AZI trong thời gian phân tích và trong thời gian bảo quản. 4.2. Về kết quả định lượng thăm dò AZI trong HT người tình nguyện. Định lượng thăm dò trên 2 người tình nguyện uống viên nén Zithromax liều 500mg sau bữa ăn 2 giờ, đo được nồng độ AZI trong HT tại thời điểm sau uống thuốc 1 giờ là: 0,048μg/ml và 0,052μg/ml; tại thời điểm sau uống thuốc 1,75 giờ là: 0,195μg/ml và 0,211μg/ml Vậy chúng tôi khẳng định phương pháp đã được xây dựng định lượng được AZI trong HT. Có thể dùng phương pháp này để định lượng AZI trong HT người dùng thuốc phục vụ công tác điều trị, nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học. Kết luận và kiến nghị Kết luận: Từ các kết quả thực nghiệm thu được, chúng tôi đã đạt mục tiêu đề ra là xây dựng phương pháp định lượng azithromycin trong HT. Phương pháp được xây dựng trên thiết bị LC-MS. Qua quá trình thực hiện đề tài chúng tôi rút ra một số kết luận sau: * Với phương pháp định lượng AZI bằng HPLC với detector huỳnh quang. Quá trình xây dựng dừng lại ở giai đoạn khảo sát định lượng trong dung dịch khi xác định thấy giới hạn định lượng không phù hợp cho định lượng AZI trong HT. Đã xây dựng được phương pháp định lượng AZI trong dung dịch, có thể áp dụng phương pháp này để định lương AZI trong chế phẩm. Phương pháp được tóm tắt như sau: - Dùng CLA làm chuẩn nội. - Dẫn xuất hóa trước cột bằng FMOC-Cl . + Kiềm hóa bằng đệm borat 0,1M pH=7,4. + Nhiệt độ phản ứng: 500C + Thời gian 40 phút. - Điều kiện sắc ký: + Cột: C18 (150 mm x 4,6 mm x 5mm). + Nhiệt độ cột: 400C. + Pha động: Acetonitril: Đệm phosphat 0,1M pH 7,7 (76:24). + Lưu lượng dòng: 1,5ml/phút. + Tiêm mẫu: 50ml + Detector huỳnh quang : bước sóng kích thích: 270nm. Bước sóng phát xạ : 317nm. *Với phương pháp định lượng AZI trong HT bằng LC-MS - Dùng ROXI làm chuẩn nội - Đã thiết lập được một quy trình chiết AZI từ HT bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng, sử dụng dung môi chiết là diethyl ether sau khi kiềm hóa bằng dung dịch Na2CO3 0,05M và cô bay hơi dung môi ở nhiệt độ 45oC. - Đã xác định được chương trình LC-MS để định lượng AZI trong HT như sau: + Cột Zorbax C18 SB (150 x4,6; 5mm). + Pha động: acetonitril : amoni acetat 0,05M (6 : 4) + Tốc độ dòng: 0,5ml/phút +Thể tích tiêm mẫu: 25μl. + MS chế độ SIM: Chọn ion có m/z từ 748-750 để xác định pic của AZI, ion có m/z từ 836- 838 để xác định pic của ROXI. + Khí Sheath Gas: 30 + Auxilary Gas: 20 * Thẩm định phương pháp phân tích: Đã tiến hành thẩm định phương pháp một cách tương đối đầy đủ, bao gồm các chỉ tiêu: tính chọn lọc, sự phù hợp của hệ thống, khoảng nồng độ tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ đúng, độ chính xác. Kết quả cho thấy các chỉ tiêu trên đều đạt yêu cầu. * Về định lượng thăm dò AZI trong HT người tình nguyện: Kết quả thu được cho phép khẳng định phương pháp xây dựng bằng LC – MS định lượng được AZI trong HT người sử dụng chế phẩm có chứa AZI. Kiến nghị: - Phương pháp cần tiếp tục hoàn thiện phần thẩm định phương pháp (xác định độ ổn định) để đảm bảo khả năng ứng dụng cao trong thực tế. - ứng dụng để nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học các chế phẩm AZI trong nước sản xuất. Tài liệu tham khảo Tiếng Việt. 1. Trần Tử An, Trần Tích, Nguyễn Văn Tuyền, ... (2003), Đánh giá tương đương sinh học viên nang cephalexin sản xuất trong nước, Tạp chí dược học 10/2003, tr. 15 - 19. 2. Trần Tử An, Thái Nguyễn Hùng Thu (2006), Hóa phân tích, tập 2, Trung tâm thông tin – thư viện trường đại học Dược Hà Nội, tr 107-124, tr 173-210. 3. Nguyễn Thị Kiều Anh, Từ Minh Koóng, Vũ Thị Thanh Loan (2002), Định lượng ketoprofen trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, Tạp chí dược học 8/ 2002, tr. 20 - 22. 4. Bộ Y tế - Hội đồng Dược điển việt nam (2002), Dược thư quốc gia Việt Nam, Nhà xuất bản y học, tr. 166-168. 5. Tào Duy Cần, Hoàng Trung Quang (2005), Tra cứu biệt dược mới và dạng thuốc thường dùng, tập 1, Nhà xuất bản Y học, tr. 128-131. 6. Trần Đức Hậu (2004), Hóa dược tập 2, Trung tâm thông tin – thư viện trường đại học Dược Hà Nội, tr. 238-239. 7. Trịnh Văn Quỳ, Phùng Thị Vinh, Tạ Mạnh Hùng (2004), Kết quả triển khai mô hình đánh giá tương đương sinh học in vivo tại Viện Kiểm nghiệm - Bộ Y tế, Tạp chí kiểm nghiệm thuốc 1/2004, tr. 13 - 17. 8. Nguyễn Đình Triệu (2005), Các phương pháp phân tích vật lý và hóa lý, tập 2, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, tr. 41-60. Tiếng Anh 9. Robert E.Ardray (2003), Liquid chromatography – Mass Spectrometry: An introduction, University of Huddersfield. 10. Bahrami, S. Mirzaeei, A. Kiani, Journal of Chromatography B, 820 (2005), pp. 277-281. 11. C. Blandizzi, T. Malizia, G. Gherardi, F. Costa, S. Marchi, C. Marveggio, G. Natale, S. Senesi, M. Bellini, G. Maltinti, M. Campa, M. Del Tacca, Journal of Microbial Chemotherapy, 42 (1998), pp. 75-82. 12. L. Chen, F. Qin, Y. Ma, F. Li, Journal of Chromatography B, in press (2007). 13. L.M. Chiu, A.M. Menhinick, P.W. Johnson, G.W. Amsden, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 50 (2002), pp. 1075-1079. 14. J.E. Conte, J. Golden, S. Duncan, E. McKenna, E. Lin, E. Zurlinden, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 40 (1996), pp. 1617-1622. 15. F. Kees , S. Spangler, M. Wellenhofer, Journal of Chromatography A, 812 (1998), pp. 287–293. 16. N.M. Najib, N. Idkaidek, I.E. Ghanem, I. Admour, S.M. Alam, Q. Zaman, R. Dham, Biopharmaceutics and Disposition, 22 (2001), pp. 15-21. 17. J. Niopas, A.C. Daftsios, Biomedica Chromatography, 15 (2001), pp. 507-508. 18. K.M. Olsen, G.S. San Pedro, L.P. Gann, P.P. Gubbins, D.M. Halinski, G.D. Campbell, Antimicrobial Agents Chemotherapy, 40 (1996), pp. 2582-2585. 19. C. M. Riley, T. W. Rosanske (1996), Development and Validation of Analytical Method, Vol. 3. 20. R.A. Shawabkeh, M.F. Tutunji, Sensors, 2 (2002), pp. 436-446. 21. Gary Siuzdak (1994), The emergence of mass spectrometry in biochemical research, Proceeding of the national Academy of science of the United States of America, vol.1, No 21, pp. 11290-11297. Phụ lục Các sắc ký đồ khảo sát tính phù hợp của hệ thống Các sắc ký đồ khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của AZI trong huyết tương Sắc ký đồ và phổ khối AZI 0,02mg/ml Sắc ký đồ và phổ khối AZI 0,05mg/ml Sắc ký đồ và phổ khối AZI 0,15mg/ml Sắc ký đồ và phổ khối AZI 0,5mg/ml Sắc ký đồ và phổ khối AZI 1mg/ml Sắc ký đồ và phổ khối AZI 1,5mg/ml