Luận văn Xác định vai trò gây bệnh của vi khuẩn E. coli, C. perfringens trong hội chứng tiêu chảy ở lợn từ sơ sinh đến 60 ngày tuổi tại tỉnh Hưng Yên và thử nghiệm phác đồ điều trị

- 1 - Đại học Thái Nguyên Trƣờng đại học Nông Lâm Lê Thị Hoài Xác định vai trò gây bệnh của vi khuẩn E. coli, C. perfringens trong hội chứng tiêu chảy ở lợn từ sơ sinh đến 60 ngày tuổi tại tỉnh Hƣng Yên và thử nghiệm phác đồ điều trị Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp Thái Nguyên – 2008 - 2 - Đại học Thái Nguyên Trƣờng đại học Nông Lâm Lê Thị Hoài Xác định vai trò gây bệnh của vi khuẩn E. coli, C. perfringens trong hội chứng tiêu chảy ở lợn từ sơ sinh đến 60 ngày tuổi tại tỉnh Hƣng Yên và thử nghiệm phác đồ điều trị Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60 62 50 Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. T.S Phạm Đức Chƣơng 2. T.S Đỗ Ngọc Thuý Thái Nguyên - 2008 - 3 - LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi trực tiếp thực hiện cùng với sự cộng tác giúp đỡ của T.S Phạm Đức Chương và T.S Đỗ Ngọc Thuý tại Viện Thú y Quốc gia. Các số liệu, hình ảnh và kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Tôi xin đảm bảo rằng các thông tin, trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn LÊ THỊ HOÀI - 4 - LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên, Viện Thú Y Quốc Gia, Trường trung học KTKT - Tô Hiệu Hưng Yên đã cho phép và tạo điều kiện giúp đỡ và tạo điều kiện cho chúng tôi hoàn thành luận văn này. Xin bày tỏ lòng biết ơn PGS. TS. Cù Hữu Phú;TS. Phạm Đức Chương; TS. Đỗ Ngọc Thuý đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin cảm ơn Khoa sau Đại Học - Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên; Bộ môn vi trùng - Viện Thú Y Quốc Gia, cùng toàn thể các bạn bè đồng nghiệp đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn. Để góp phần thực hiện thành công luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ động viên đáng kể của gia đình và đồng nghiệp. Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với mọi sự giúp đỡ quí báu đó. Xin trân trọng cảm ơn ! Thái Nguyên, tháng 5 năm 2008 Lê Thị Hoài - 5 - MỤC LỤC Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các bảng Danh mục biểu đồ, đồ thị Danh mục các ảnh tư liệu đề tài Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt MỞ ĐẦU .................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ........................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................. 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .................................................................. 2 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................... 3 1.1. Một số hiểu biết chung về hội chứng tiêu chảy ....................................... 3 1.1.1. Khái niệm về hội chứng tiêu chảy ....................................................... 3 1.1.2. Một số nguyên nhân gây tiêu chảy ...................................................... 4 1.1.3. Bệnh lý, lâm sàng của hội chứng tiêu chảy .......................................... 8 1.1.4. Một số đặc điểm dịch tễ hội chứng tiêu chảy ..................................... 10 1.1.5. Biện pháp phòng trị tiêu chảy cho lợn ............................................... 11 1.2. Một số nghiên cứu về vi khuẩn E. coli gây bệnh đường tiêu hoá............ 14 1.2.1. Đặc điểm về hình thái cấu trúc .......................................................... 14 1.2.2. Đặc tính nuôi cấy sinh vật hoá học .................................................... 16 1.2.3. Đặc tính gây bệnh của vi khuẩn E. Coli ............................................. 18 1.2.4. Khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn E. Coli............................... 23 1.2.5. Vai trò của vi khuẩn E. coli trong hội chứng tiêu chảy ....................... 25 1.3. Những nghiên cứu về vi khuẩn C. perfringens gây bệnh đường tiêu hoá .... 26 - 6 - 1.3.1. Đặc điểm hình thái cấu trúc .............................................................. 27 1.3.2. Đặc tính nuôi cấy sinh vật hoá học .................................................... 29 1.4. Tình hình gây dịch bệnh trên đàn lợn của tỉnh Hưng Yên ...................... 33 1.4.1. Một số đặc điểm tụ nhiên ảnh hưởng đến bệnh tiêu chảy .................... 33 1.4.2. Tình hình dịch bệnh trên đàn lợn ....................................................... 33 Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................ 35 2.1. Đối tượng, địa điểm, thời gian nghiên cứu ............................................ 35 2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................... 35 2.3. Nguyên liệu dùng cho nghiên cứu ........................................................ 36 2.4. Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 37 2.4.1. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ ...................................................... 37 2.4.2. Phương pháp thu thập mẫu và phân lập vi khuẩn................................ 38 2.4.3. Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn .......................................... 40 2.4.4. Phương pháp xác định serotyp kháng nguyên của vi khuẩn phân lập được ........................................................................................... 40 2.4.5. Phương pháp xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn phân lập được ....... 41 2.4.6. Phương pháp kiểm tra độc lực của vi khuẩn phân lập trên chuột bạch ... 43 2.4.7. Phương pháp xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được ........................................................... 44 2.4.8. Thử nghiệm một số phác đồ điều trị tiêu chảy cho lợn........................ 45 2.4.9. Phương pháp sử lý số liệu ................................................................. 45 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................... 47 3.1. Một số đặc điểm dịch tễ hội chứng tiêu chảy ở lợn từ sơ sinh đến 60 ngày tuổi tại Hưng Yên .................................................................. 47 3.1.1. Tỷ lệ lợn tiêu chảy và chết do tiêu chảy tại một số huyện thuộc tỉnh Hưng Yên.................................................................................... 47 3.1.2. Tỷ lệ lợn tiêu chảy và chết do tiêu chảy theo mùa vụ.......................... 49 3.1.3. Tỷ lệ lợn tiêu chảy và chết do tiêu chảy theo phương thức chăn nuôi ....... 52 - 7 - 3.1.4. Tỷ lệ lợn tiêu chảy và chết do tiêu chảy theo lứa tuổi lợn ................... 55 3.1.5. Các triệu chứng ở lợn tiêu chảy ......................................................... 58 3.2. Nghiên cứu xác định vai trò của vi khuẩn E. coli và C. perfringens trong hội chứng tiêu chảy ở lợn từ sơ sinh đến 60 ngày tuổi ................. 60 3.2.1. Kết quả phân lập vi khuẩn E.coli và C. perfringen từ phân lợn bình thường và phân lợn tiêu chảy theo lứa tuổi ................................. 60 3.2.2. Kết quả phân lập vi khuẩn E. coli và C. perfringens từ các mẫu bệnh phẩm.......................................................................................... 63 3.2.3. Mức độ biến động vi khuẩn E. coli và C. perfringens trong phân lợn khoẻ và phân lợn tiêu chảy ............................................................ 65 3.2.4. Kết quả giám định đặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn E. coli và C. perfringens phân lập được .......................................................... 69 3.2.5 Kết quả xác định serotyp kháng nguyên O của các chủng vi khuẩn E coli phân lập được từ lợn bệnh ......................................................... 71 3.2.6. Tỷ lệ các chủng vi khuẩn E.coli mang các yếu tố gây bệnh................. 73 3.2.7. Kết quả xác định độc lực trên chuột bạch của một số chủng E. coli phân lập được từ lợn bệnh ................................................................... 75 3.2.8. Kết quả xác định khả năng mẫn cảm của kháng sinh với một số chủng vi khuẩn E. coli và C. perfringens phân lập được từ lợn bệnh......... 78 3.3. Kết quả thử nghiệm phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy cho lợn ................ 81 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................... 85 Kết luận .................................................................................................... 85 Đề nghị ..................................................................................................... 87 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................... 88 PHỤ LỤC .................................................................................................... - 8 - DANH MỤC CÁC BẢNG SỐ LIỆU Bảng Trang 3.1. Tỷ lệ lợn tiêu chảy và chết do tiêu chảy tại một số huyện ...................... 48 3.2. Tỷ lệ lợn mắc tiêu chảy và chết do tiêu chảy theo mùa vụ ..................... 50 3.3. Tỷ lệ lợn tiêu chảy và chết do tiêu chảy theo phương thức chăn nuôi........... 53 3.4. Tỷ lệ lợn mắc tiêu chảy và chết do tiêu chảy theo lứa tuổi ..................... 55 3.5. Tổng hợp các triệu chứng ở lợn mắc tiêu chảy ...................................... 59 3.6. Kết quả phân lập vi khuẩn E.coli và C. perfringen từ phân lợn bình thường và phân lợn tiêu chảy theo lứa tuổi........................................... 61 3.7. Kết quả phân lập vi khuẩn E. coli và C. perfringens từ các mẫu bệnh phẩm.......................................................................................... 64 3.8. Mức độ biến động vi khuẩn E. coli và C. perfringens trong phân lợn khoẻ và phân lợn tiêu chảy ............................................................ 66 3.9. Kết quả giám định đặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn E. coli và C. perfringens phân lập được .......................................................... 70 3.10. Kết quả xác định serotyp kháng nguyên O của các chủng vi khuẩn E coli phân lập được từ lợn bệnh ......................................................... 71 3.11. Tỷ lệ các chủng vi khuẩn E.coli mang các yếu tố gây bệnh.................. 74 3.12. Kết quả xác định độc lực trên chuột bạch của một số chủng E. coli phân lập được từ lợn bệnh ................................................................... 76 3.13. Kết quả xác định khả năng mẫn cảm của kháng sinh với một số chủng vi khuẩn E. coli và C. perfringens phân lập được từ lợn bệnh......... 79 3.14. Kết quả điều trị thực nghiệm một số phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy cho lợn từ sơ sinh đến 60 ngày tuổi ............................................. 83 - 9 - DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ 3.1. Tỷ lệ lợn tiêu chảy và chết do tiêu chảy tại một số huyện ..................... 48 3.2. Tỷ lệ lợn mắc tiêu chảy và chết theo mùa vụ ....................................... 50 3.3. Tỷ lệ lợn tiêu chảy và chết do tiêu chảy theo phương thức chăn nuôi .... 53 3.4. Tỷ lệ lợn mắc tiêu chảy và chết do tiêu chảy theo lứa tuổi .................... 56 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Qui trình phân lập vi khuẩn đường ruột (Bộ môn Vi trùng - Viện Thú ........ 39 - 10 - DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN EEC : Adherence Enteropathogenic Escherichia coli BHI : Brain-heart infusion cs : Cộng sự CPU : Colonial Forming Unit ED : Edema disease EDP : Edema disease pathogenic EHEC : Enterohaemorrhagic Escherichia coli EMB : Eosin Methylene Blue Agar EPEC : Enteropathogenic Escherichia coli ETEC : Enterotoxigenic Escherichia coli HEM : Heamolysin Hly : Heamolysin KN : Kháng nguyên LT : Heat-Labile enterotoxin NXB : Nhà xuất bản PCR : Polymerase Chain Reaction SLT : Shiga-like toxin SLT1 : Shiga-like toxin 1 SLT2 : Shiga-like toxin 2 ST(a,b) : Heat-Stable Enterotoxin (a,b) ST1 : Heat-Stable1 Stx2e : Shiga toxin 2e Tr : Trang TSI : Triple Surgar Iron tt : Thể trọng UV : Ultraviolet VP : Voges Pros Kauer VT2e : Verotoxin 2e VTEC : Verotoxigenic Escherichia coli C. perfringens : Clostridium perfringens - 1 - MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Nền kinh tế nước ta liên tục phát triển nhờ vào sự phát triển các ngành nghề đồng đều nhau, công nghiệp và nông nghiệp phát triển song song. Cùng trên đà phát triển, nông nghiệp là một ngành có đóng góp hết sức quan trọng trong sự tăng trưởng chung của kinh tÕ đất nước, đặc biệt là ngành chăn nuôi đã trở thành một ngành sản xuất chính trong cơ cấu kinh tế nông nghiệp, trong đó chăn nuôi lợn ngày càng phát triển và chiếm ưu thế. Người chăn nuôi không chỉ dừng lại ở tập quán sản xuất đơn thuần mà ngày càng đầu tư áp dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật vào sản xuất, không ngừng nâng cao năng xuất chất lượng, đến nay đã đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng trong nước và xuất khẩu ra thị trường thế giới. Ở tỉnh Hưng Yên, chăn nuôi lợn có tốc độ tăng trưởng khá nhanh: Toàn tỉnh tổng đàn lợn đạt 600.510 con, tăng 5.553 con so với năm 2006, đàn lợn nái 68.155 con, lợn thịt 531.747 con, đàn lợn hướng nạc 330.200 con, chiếm 52,5% tổng đàn (số liệu thống kê tính đến tháng 1/2008). Theo Nghị quyết của Đảng bộ tỉnh Hưng Yên là định hướng phát triển chăn nuôi chuyên nghiệp, chăn nuôi theo hướng trang trại tập trung, cải thiện môi trường chăn nuôi, ưu đãi đầu tư cho chăn nuôi về khoa học kỹ thuật, vốn đầu tư cải thiện và đa dạng cơ cấu giống vật nuôi, chăn nuôi lợn đã bắt đầu chuyển đổi theo hướng sản xuất hàng hoá và xuất khẩu với định hướng phát triển chăn nuôi. Tuy nhiên, chăn nuôi còn gặp nhiều khó khăn về dịch bệnh, phần lớn nguyên nhân là do chăm sóc nuôi dưỡng chưa đúng kỹ thuật, ý thức của người chăn nuôi chưa tốt, đã và đang phát sinh nhiều nguy cơ như: dịch bệnh (cúm gia cầm, lở mồm long móng, tiêu chảy...) mà trong nhiều năm qua chưa khắc phục được triệt để, cụ thể là hội chứng tiêu chảy thường gặp ở lợn do rất nhiều nguyên nhân và gây thiệt hại đáng kể. - 2 - Theo nhiều tác giả, hội chứng tiêu chảy do rất nhiều nguyên nhân gây ra (virus, vi khuẩn, độc tố, thức ăn, thời tiết, vệ sinh, chăm sóc, nuôi dưỡng….) qua thực tế theo dõi tình hình dịch bệnh trên đàn lợn ở tỉnh Hưng Yên, chúng tôi nhận thấy hội chứng tiêu chảy xảy ra phổ biến ở lợn và gây nhiều thiệt hại. Xuất phát từ những lý do trên và nhằm hạn chế thấp nhất thiệt hại do bệnh gây ra, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xác định vai trò gây bệnh của vi khuẩn E. coli, C. perfringens trong hội chứng tiêu chảy ở lợn từ sơ sinh đến 60 ngày tuổi tại tỉnh Hƣng Yên và thử nghiệm phác đồ điều trị”. 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Xác định một số đặc điểm dịch tễ bệnh tiêu chảy ở lợn từ sơ sinh đến 60 ngày tuổi và tình hình nhiễm khuẩn: E. coli, C. perfringens ở lợn nuôi tại tỉnh Hưng Yên - Phân lập xác định đặc tính, khả năng gây bệnh, xác định serotyp của các chủng E. coli, C. perfringens ở lợn từ sơ sinh đến 60 ngày tuổi mắc bệnh tiêu chảy - Xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được - Thử nghiệm một số phác đồ điều trị ở lợn mắc bệnh tiêu chảy tại tỉnh Hưng Yên 3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN - Kết quả của đề tài đã chứng minh vai trò của vi khuẩn E. coli, C. perfringens trong bệnh tiêu chảy ở lợn từ sơ sinh đến 60 ngày tuổi tại tỉnh Hưng Yên. - Kết quả nghiên cứu của đề tài cũng là cơ sở khoa học phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo, đồng thời đóng góp tư liệu tham khảo cho các nhà nghiên cứu thú y và người chăn nuôi - Đưa ra phác đồ điều trị có hiệu quả, giúp cho thú y cơ sở và các hộ chăn nuôi trong phòng trị hội chứng tiêu chảy ở lợn, góp phần giảm thiệt hại và tăng thu nhập trong chăn nuôi lợn. - 3 - Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. MỘT SỐ HIỂU BIẾT CHUNG VỀ HỘI CHỨNG TIÊU CHẢY 1.1.1. Khái niệm chung về hội chứng tiêu chảy Tiêu chảy là biểu hiện lâm sàng của quá trình bệnh lý đặc thù ë đường tiêu hoá. Biểu hiện lâm sàng này tuỳ theo đặc điểm, tính chất diễn biến, mức độ tuổi mắc bệnh, tuỳ theo yếu tố được coi là nguyên nhân chính mà nó được gọi theo nhiều tên bệnh khác nhau như: Bệnh xảy ra đối với gia súc non theo mẹ gọi là bệnh lợn con phân trắng còn ở gia súc sau cai sữa là chứng khó tiêu, chứng rối loạn tiêu hoá… Với bất cứ cách gọi như thế nào thì tiêu chảy luôn là triệu chứng phổ biến trong các dạng bệnh của đường tiêu hoá, xảy ra mọi lúc mọi nơi và đặc biệt là gia súc non với biểu hiện triệu chứng là ỉa chảy, mất nước và chất điện giải, suy kiệt có thể dẫn đến truỵ tim mạch (Radostits.O.M và cộng sự 1994) [88]. Tiêu chảy ở gia súc là một hiện tượng bệnh lý phức tạp gây ra bởi sự tác động tổng hợp của nhiều yếu tố. Một trong những nguyên nhân quan trọng là sự tác động của ngoại cảnh bất lợi, gây ra các stress cho cơ thể, mặt khác trong các khâu chăm sóc nuôi dưỡng gia súc, chuồng trại không vệ sinh thường xuyên sạch sẽ, thức ăn nước uống bị nhiễm khuẩn… cũng tạo điều kiện thuận lợi cho các vi sinh vật gây bệnh xâm nhập vào vật chủ, đặc biệt là các vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hoá dẫn tới sự nhiễm khuẩn và dễ xảy ra loạn khuẩn đường ruột. Đây là một trong những nguyên nhân đóng vai trò quan trọng trong hội chứng tiêu chảy ở lợn. Bệnh lý xuất hiện thường là thể cấp tính hoặc mãn tính, tuỳ thuộc vào tính chất và nguyên nhân bệnh tác động. Đặc điểm của sự rối loạn về tiêu hoá thường gây tiêu chảy nhiều lần trên ngày, trong phân có nhiều nước so với bình thường do tăng tiết dịch ruột (Blackwell, 1989 [65]). - 4 - 1.1.2. Một số nguyên nhân gây tiêu chảy ở lợn Tiêu chảy là một hiện tượng bệnh lý có liên quan đến nhiều yếu tố, có yếu tố là nguyên nhân nguyên phát, có yếu tố là nguyên nhân thứ phát. Vì vậy việc phân biệt giữa các nguyên nhân gây tiêu chảy là rất khó khăn (Phạm Ngọc Thạch, 1996 [51]). Bằng rất nhiều công trình nghiên cứu, các nhà khoa học đã đưa ra những nguyên nhân chính gây hội chứng tiêu chảy ở lợn như sau: 1.1.2.1. Ảnh hưởng của môi trường, khí hậu Môi trường ngoại cảnh là yếu tố quan trọng ảnh huởng đến sức đề kháng của cơ thể gia súc. Khi có sự thay đổi các yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm, mưa, nắng, điều kiện chuồng nuôi đều ảnh hưởng đến sức khoẻ của lợn, đặc biệt là lợn con theo mẹ, do cấu tạo và chức năng sinh lý chưa ổn định và hoàn thiện, khi gặp các yếu tố bất lợi dễ bị stress dẫn đến nhiều bệnh trong đó có tiêu chảy. Trong các yếu tố khí hậu thì nhiệt độ lạnh và ẩm độ của gia súc bị nhiễm lạnh kéo dài sẽ làm giảm phản ứng miễn dịch, giảm tác dụng thực bào, làm cho gia súc dễ bị nhiễm khuẩn gây bệnh (Hồ Văn Nam và cs 1997 [27]). Khẩu phần ăn cho vật nuôi không thích hợp, trạng thái thức ăn không tốt, thức ăn kém chất lượng như mốc, thối, nhiễm các tạp chất, các vi sinh vật có hại dễ dẫn đến rối loạn tiêu hoá kèm theo viêm ruột, ỉa chảy ở gia súc (Trịnh Văn Thịnh, 1985[54], Hồ Văn Nam, 1997 [327]). Khi gặp điều kiện ngoại cảnh không thuận lợi, thay đổi đột ngột về thức ăn, vitamin, protein, thời tiết, vận chuyển… làm giảm sức đề kháng của con vật thì các vi khuẩn thường trực sẽ tăng độc tố và gây bệnh (Bùi Quý Huy, 2003 [19]). Như vậy nguyên nhân môi trường ngoại cảnh gây bệnh tiêu chảy không mang tính đặc hiệu mà mang tính tổng hợp. Lạnh và ẩm gây rối loạn hệ thống điều hoà trao đổi nhiệt của cơ thể, dẫn đến rối loạn trao đổi chất các mầm bệnh có thời cơ tăng cường độc lực và gây bệnh. - 5 - 1.1.2.2. Nguyên nhân do vi sinh vật Vi sinh vật bao gồm các loại virus, vi khuẩn và nấm mốc. Chúng vừa là nguyên nhân nguyên phát, cũng vừa là nguyên nhân thứ phát gây tiêu chảy. * Tiêu chảy do vi khuẩn Trong đường tiêu hoá của gia súc có hệ vi khuẩn gọi là hệ vi khuẩn đường ruột được chia thành 2 loại: Các vi khuẩn có lợi có tác dụng lên men phân giải các chất dinh dưỡng, giúp cho quá trình tiêu hoá được thuận lợi và vi khuẩn có hại khi gặp điều kiện thuận lợi thì gây bệnh. Vi khuẩn đường ruột là họ vi khuẩn cộng sinh thường trực trong đường ruột. Các vi khuẩn này, muốn từ vi khuẩn cộng sinh trở thành vi khuẩn gây bệnh phải có 3 điều kiện (Jones, 1980, dẫn theo Lê Văn Tạo, 1997a [48]): - Trên cơ thể vật chủ có cấu trúc giúp cho vi khuẩn thực hiện được chức năng bám dính - Vi khuẩn có khả năng sản sinh các yếu tố gây bệnh, đặc biệt là sản sinh độc tố, trong đó quan trọng là độc tố đường ruột Enterotoxin có khả năng xâm nhập vào lớp tế bào biểu mô của niêm mạc ruột, từ đó phát triển nhân lên. Một số vi khuẩn đường ruột là E. coli, Samonella sp., Shigella, C. perfringens... luôn là những nguyên nhân gây nên sự rối loạn về tiêu hoá, viêm ruột và tiêu chảy ở người cùng nhiều loài động vật Đào Trọng Đạt và cộng sự (1996) [11] cho biết: Chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các vi khuẩn đường ruột gây tiêu chảy là E. coli (45,6%). Cũng theo tác giả này, vi khuẩn yếm khí C. perfringens gây bệnh khi có điều kiện thuận lợi và khi nó trở thành vai trò chính Hồ Văn Nam và cộng sự (1997) [27] Archie,H (2001) [1] nhấn mạnh: Vi khuẩn đường ruột có vai trò không thể thiếu được trong hội chứng tiêu chảy. - 6 - Vũ Bình Minh, Cù Hữu Phú (1999) [39] khi nghiên cứu về E. coli và Salmonella ở lợn tiêu chảy cho biết tỷ lệ phát hiện E. coli độc trong phân là 80-90% số mẫu xét nghiệm. Theo Phan Thanh Phượng và cs (1996) [38], vi khuẩn yếm khí C. perfringens là một trong những tác nhân gây bệnh quan trọng trong hội chứng tiêu chảy của lợn ở lứa tuổi từ 1-120 ngày tuổi. Ở lợn con theo mẹ, tỷ lệ mắc bệnh do vi khuẩn này gây ra có thể đến 100% và tỷ lệ chết lªn ®Õn 60%. Lượng vi khuẩn C. perfringens chứa trong 1g phân lợn ở lứa tuổi 1-60 ngày tuổi dao động từ 10 6 ÷ 10 10 /0,2 ml CFU (Colonial forming unit); số mẫu có lượng vi khuẩn cao (10 8 , 19 9 , 10 10 ) chiếm tỷ lệ 37-45%. Ở lợn từ 60-120 ngày tuổi bị tiêu chảy, số lượng vi khuẩn trong 1g phân ở mức 10 8 , 10 9 chiếm tỷ lệ 27,14% - 35,71%. * Tiêu chảy do virus Ngoài nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy cho lợn do vi khuẩn còn có nguyên nhân do virus. Đã có nhiều công trình nghiên cứu khẳng định vai trò của một số virus như: Rotavirus, Enterovirus, Transmissible Gastroenteritis (TGE) là những nguyên nhân chủ yếu gây viêm dạ dày- ruột và gây triệu chứng tiêu chảy đặc trưng ở lợn. Các virus này tác động gây viêm ruột và gây rối loạn quá trình tiêu hoá, hấp thu của lợn và cuối cùng dẫn đến triệu chứng tiêu chảy. Theo tài liệu của Bergeland (1980) (trích theo Đào Trọng Đạt 1996) [11] trong số những mầm bệnh thường gặp ở lợn trước và sau cai sữa bị mắc tiêu chảy có rất nhiều loại virus: 20,9% lợn bệnh phân lập được Rotavirus; 11,2% có virus viêm dạ dày- ruột truyền nhiễm; 2% có Enterovirus; 0,7% có Parvovirus. * Tiêu chảy do nấm mốc Thức ăn khi chế biến hoặc bảo quản không đúng kỹ thuật dễ bị nấm mốc. Một số loài như: Aspergillus, Penicillin, Fusarium...có khả năng sản sinh nhiều độc tố, nhưng quan trọng nhất là nhóm độc tố Aflatoxin (Aflatoxin B2, G1, G2, M1). - 7 - Độc tố Aflatoxin gây độc cho người và gia súc, gây bệnh nguy hiểm nhất cho người là ung thư gan, huỷ hoại gan, độc cho thận, sinh dục và thần kinh. Aflatoxin gây độc cho nhiều loài gia súc, gia cầm, mẫm cảm nhất là vịt, gà, lợn. Lợn thường bỏ ăn, thiếu máu, vàng da, ỉa chảy ra máu. Nếu trong khẩu phần có 500-700  g Aflatoxin/kg thức ăn sẽ làm cho lợn con chậm lớn, còi cọc, giảm sức đề kháng với các bệnh truyền nhiễm khác (Lê Thị Tài,1997) [45]. 1.1.2.3. Tiêu chảy do ký sinh trùng Có nhiều loại ký sinh trùng gây bệnh tiêu chảy ở lợn như: Cầu trùng (Eimeria, Isospora suis), Crytosporidium, Ascaris suum, Trichuris suis... hoặc một số loài giun tròn khác thuộc lớp Nematoda ... Bệnh do Isopora suis, Crytosporidium thường tập trung vào giai đoạn lợn con từ 5 - 25 ngày tuổi, còn ở lợn trên 2 tháng tuổi do cơ thể đã tạo được miễn dịch đối với bệnh cầu trùng, nên lợn chỉ mang mầm bệnh mà ít khi xuất hiện triệu chứng tiêu chảy (Nguyễn Như Pho, 2003[35]). Cầu trùng và một số loại giun tròn (giun đũa, giun tóc, giun lươn) là một trong những nguyên nhân gây tiêu chảy ở lợn sau cai sữa nuôi trong các hộ gia đình tại Thái Nguyên (Nguyễn Thị Kim Lan và cs, 2006a [22]). Đặc điểm chủ yếu của tiêu chảy do ký sinh trùng là con vật mắc bệnh bị tiêu chảy nhưng không liên tục, có sự xen kẽ giữa tiêu chảy và bình thường, cơ thể thiếu máu, da nhợt nhạt, gia súc kém ăn, thể trạng sa sút. Như vậy có thể thấy, có rất nhiều nguyên nhân gây tiêu chảy, nhưng theo một số chuyên gia nghiên cứu về bệnh tiêu chảy ở lợn như Nguyễn Thị Nội (1985) [28], Lê Văn Tạo (1993) [46], Hồ văn Nam (1997) [27] thì cho dù nguyên nhân nào gây tiêu chảy cho lợn đi nữa, cuối cùng cũng là quá trình nhiễm khuẩn, vi khuẩn kế phát viêm ruột, tiêu chảy nặng thêm, có thể dẫn đến chết hoặc viêm ruột tiêu chảy mãn tính. - 8 - 1.1.3. Bệnh lý lâm sàng của hội chứng tiêu chảy 1.1.3.1. Cơ chế sinh bệnh Cơ chế sinh bệnh của hội chứng tiêu chảy là quá trình rối loạn chức phận bộ máy tiêu hoá và nhiễm khuẩn. Hai quá trình này có thể diễn ra đồng thời, hoặc cũng có thể quá trình này trước, quá trình kia sau và ngược lại song không thể phân biệt rõ được từng quá trình. Theo Phạm Ngọc Thạch (1996) [51], khi thiếu mật thì cã tới 60% mỡ không tiêu hoá được gây ra chứng đầy bụng khó tiêu và ỉa chảy, hoặc việc giảm hấp thu cũng dẫn đến ỉa chảy. Trịnh Văn Thịnh (1985b) [55] cho rằng: Do một tác nhân bất lợi nào đó, trạng thái cân bằng của khu hệ vi khuẩn đường ruột bị phá vỡ tất cả hoặc chỉ một loài nào đó sinh sản quá nhiều sẽ gây hiện tượng loạn khuẩn, gây ra sự biến động ở nhóm vi khuẩn đường ruột, cũng như ở nhóm vi khuẩn vãng lai, các vi khuẩn gây bệnh có cơ hội tăng mạnh cả về số lượng và độc lực, các vi khuẩn có lợi cho quá trình tiêu hoá do không cạnh tranh nổi nên giảm đi, cuối cùng loạn khuẩn xảy ra, hấp thu bị rối loạn gây tiêu chảy. 1.1.3.2. Bệnh lý, lâm sàng của hội chứng tiêu chảy Bệnh lý, lâm sàng của hội chứng tiêu chảy ở gia súc đó là sự biến đổi về tổ chức, tình trạng mất nước và điện giải, trạng thái trúng độc của cơ thể bệnh. Khi nghiên cứu về tiêu chảy ở lợn do vi khuẩn E. coli, Nguyễn Như Pho (2003) [35] cho rằng, ruột chỉ xung huyết, không thấy xuất huyết, không có vết loét hoặc hoại tử như trong bệnh phó thương hàn. Sự mất nước kéo theo mất các chất điện giải trong đó đặc biệt là các ion: HCO3 - , K + , Na + , CL - … đồng thời, khi gia súc bị rối loạn tiêu hoá thì cũng làm cản trở đến khả năng tái hấp thu nước ở gia súc ỉa chảy, nếu lượng dịch mất di trong đường ruột vượt quá lượng dịch đưa vào khi ăn uống, thận sẽ cố gắng bù lại bằng cách cô đặc nước tiểu để giảm lượng nước thải ra. Nếu - 9 - thận không bù được mức dịch thể trong tổ chức bị giảm và máu bị đặc lại. Hiện tượng này gọi là mất nước và triệu chứng lâm sàng là yếu, bỏ ăn, thân nhiệt hạ thấp và có thể truỵ tim, mắt bị hõm sâu, nhìn lờ đờ, da khô khi véo da lên nếp da chậm trở lại vị trí cũ (Archie. H, 2000 [1]). Lợn bị tiêu chảy gầy sút nhanh, da nhăn, tính đàn hồi kém; nếu tiêu chảy lâu ngày lợn gày nhô xương sống, da thô, lông dựng ngược. Mặt khác khi cơ thể mất nước và chất điện giải kéo theo sự biến đổi hàng loạt các bệnh lý khác nhau. Hiện tượng trúng độc xảy ra do thức ăn lên men phân giải sinh độc tố, hệ vi khuẩn đường ruột sinh sôi, sản sinh ra nhiều độc tố. Các độc tố đó cùng với các sản phẩm của viêm, tổ chức phân huỷ ngấm vào máu tác động vào gan làm chức năng gan rối loạn, gia súc bị trúng độc, đồng thời tác động cản trở quá trình tiêu hoá tiếp tục, quá trình gây tiêu chảy nặng hơn, tăng nguy cơ nhiễm độc máu và gây tử vong. 1.1.3.3. Hậu quả cña hội chứng tiêu chảy Hậu quả trực tiếp và nặng nề của hiện tượng tiêu chảy là sự mất nước và mất các chất điện giải của cơ thể, kéo theo hàng loạt các biến đổi bệnh lý (Lê Minh Chí, 1995 [4]). Hiện tượng mất nước rất nghiêm trọng và có thể gây chết nếu không được điều chỉnh. Gia súc non dự trữ dịch thể tương đối thấp nên đặc biệt mẫn cảm với sự mất nước. Vì vậy, trong điều trị tiêu chảy luôn luôn phải đặt vấn đề điều trị mất nước lên hàng đầu (Archie.H, 2000 [1]). Lợn bị tiêu chảy giảm khả năng tiêu hoá, chuyển hoá và hấp thụ các chất dinh dưỡng nên lợn gày còm, chậm tăng trọng, dễ dàng mắc các bệnh khác (Phạm Sỹ Lăng và cs, 1997 [24]). Ở lợn, hiện tượng tiêu chảy thường có quá trình nhiễm khuẩn. Khi tiêu chảy do nhiễm khuẩn, các triệu chứng trầm trọng hơn và hậu quả để lại nặng nề hơn, có thể kế phát nhiều bệnh khác, gây thiệt hại cho ngành chăn nuôi. Như vậy, với mỗi một nguyên nhân gây bệnh khác nhau để lại những hậu quả khác nhau. - 10 - 1.1.4. Một số đặc điểm dịch tễ hội chứng tiêu chảy Hội chứng tiêu chảy ở gia súc do nhiều nguyên nhân gây ra. Chính vì vậy, sự xuất hiện của bệnh phụ thuộc vào sự xuất hiện các nguyên nhân và sự tương tác giữa nguyên nhân với cơ thể gia súc. Các yếu tố như tuổi gia súc, mùa vụ, thức ăn, chuồng trại, điều kiện chăm sóc, nuôi dưỡng... đều có ảnh hưởng đến hội chứng tiêu chảy ở gia súc. Ở lợn, hội chứng tiêu chảy có thể xảy ra ở mọi lứa tuổi. Archie.H (2000) [1], Frairbrother. J.M (1992) [74] cho rằng khi bệnh tiêu chảy xảy ra, thường gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi. Bệnh thường xuất hiện ở 3 giai đoạn phát triển của lợn: - Giai đoạn sơ sinh (1-4 ngày tuổi) - Giai đoạn lợn con theo mẹ (5-21 ngày tuổi) - Giai đoan lợn sau cai sữa (>21 ngày tuổi) Tỷ lệ mắc bệnh tiêu chảy trong một số cơ sở chăn nuôi lợn phụ thuộc vào điều kiện chăm sóc, vệ sinh thú y, còn tỷ lệ chết, mức độ trầm trọng của bệnh ở một đàn phụ thuộc vào giai đoạn mắc bệnh (Đoàn Kim Dung, 2003[9], Hoàng Văn Tuấn, 1998[59]). Khi nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ hội chứng tiêu chảy ở lợn từ sau cai sữa của các hộ chăn nuôi gia đình tại Thái Nguyên, Nguyễn Thị Kim Lan và cs (2006b) [23] cho rằng, bệnh chịu ảnh hưởng rõ rệt của lứa tuổi mắc bệnh, mùa vụ trong năm, các loại thức ăn, nền chuồng và tình trạng vệ sinh thú y. Về độ tuổi mắc bệnh, tỷ lệ lợn tiêu chảy giảm theo tuổi, cao nhất ở giai đoạn sau cai sữa đến 2 tháng (13,9%), sau đó giảm dần và chỉ còn 5,55% ở lợn trên 6 tháng tuổi (Nguyễn Thị Kim Lan và cs, 2006b [23]. Về mùa vụ, bệnh tiêu chảy ở lợn con theo mẹ xảy ra quanh năm, nhưng cao nhất là tháng 5-8 (Hoàng Văn Tuấn và cs, 1998 [59] ). Trong năm, lợn - 11 - nuôi ở mùa xuân và mùa hè mắc tiêu chảy cao hơn (13,67-14,75%) so với 2 mùa còn lại (9,18-9,68%) (Nguyễn Thị Kim Lan và cs, 2006b [23]. Về thức ăn, lợn nuôi thức ăn tổng hợp dạng viên, không qua chế biến, mắc tiêu chảy với tỷ lệ 8,96%. Tỷ lệ này tăng lên khi cho thức ăn truyền thống mang tính tận dụng và ăn rau sống (16,1%) (Nguyễn Thị Kim Lan và cs, 2006b [23]). Điều kiện chuồng trại vệ sinh cũng có ảnh hưởng khá rõ rệt đến tỷ lệ mắc tiêu chảy ở lợn. Lợn nuôi trong nền lát gạch có tỷ lệ tiêu chảy là 9,49%, tăng lên ở chuồng có nền láng xi măng (12,64%) và cao nhất ở chuồng nền đất nện (20,37%). Lợn được nuôi ở điều kiện vệ sinh thú y tốt tỷ lệ tiêu chảy là 8%, thấp hơn rõ rệt so với nuôi trong điều kiện vệ sinh thú y kém (20,35%) (Nguyễn Thị Kim Lan và cs, 2006b [23]). Ngoài các vấn đề nêu trên, hội chứng tiêu chảy còn bị ảnh hưởng bởi các tác nhân gây bệnh do virus, vi khuẩn... Các tác giả đều cho rằng, khi lợn mắc tiêu chảy do các tác nhân vi sinh vật, thường làm tăng tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết. 1.1.5. Biện pháp phòng trị tiêu chảy cho lợn 1.1.5.1. Phòng bệnh Phòng bệnh là biện pháp chủ động không để bệnh xảy ra. Các biện pháp phòng bệnh đều xoay quanh các vấn đề về môi trường, vật chủ và mầm bệnh. Các tác giả Trịnh Văn Thịnh (1985b) [55], Đào Trọng Đạt (1985) [10] đề xuất biện pháp phòng bệnh là: Giữ ấm và sưởi cho lợn sơ sinh vào mùa đông, dọn phân, rác thải trong chuồng, đem ủ nhiệt sinh vật, định kỳ tẩy uế tiêu độc chuồng trại và dụng cụ chăn nuôi. Phạm Khắc Hiếu, Trần Thị Lộc (1998) [16] cho rằng: Để phòng bệnh tiêu chảy, trước hết cần hạn chế loại trừ các yếu tố stress sẽ mang lại hiệu quả - 12 - tích cực, đồng thời khắc phục những yếu tố khí hậu, thời tiết bất lợi để tránh rối loạn tiêu hoá, giữ ổn định trạng thái cân bằng giữa cơ thể và môi trường. Lợn con đẻ ra phải được sưởi ấm ở nhiệt độ 37 o C trong 7 ngày, sau đó giảm nhiệt độ dần, nhưng không được thấp hơn 30 o C. Một số tác giả đã tập trung nghiên cứu chế tạo và sử dụng vacxin phòng bệnh nhằm kích thích cơ thể chủ động sản sinh kháng thể chống lại mầm bệnh. Nguyễn Thị Nội (1985) [28] dựa trên kết quả xác định tần suất các serotype O của E. coli gây bệnh phân trắng lợn con để chọn các serotype O có tần suất xuất hiện cao chế vacxin. Lê Văn Tạo (1996) [47] đã chọn chủng vi khuẩn E. coli mang kháng nguyên K88 kết hợp với ít nhất 2 yếu tố gây bệnh khác nhau là Ent và Hly dùng để sản xuất vacxin cho uống và tiêm phòng bệnh cho lợn con phân trắng. Các tác giả Nguyễn Thị Nội, Nguyễn Ngọc Nhiên, Cù Hữu Phú (1989) [29] tiến hành nghiên cứu một loại vacxin tổng hợp gồm các chủng vi khuẩn Salmonella, E. coli và Streptococcus để phòng bệnh tiêu chảy cho đến hiện nay vẫn đang được tiếp tục nghiên cứu. Ngoài sử dụng vacxin, một số tác giả đã đi sâu nghiên cứu các chế phẩm dùng để phòng bệnh tiêu chảy. Đây là biện pháp vừa giúp tăng khả năng đề kháng, vừa khống chế sự phát triển quá mức của một số loài vi khuẩn có hại cho cơ thể gia súc. Đỗ Trung Cứ và cs (2000)[6] đã sử dụng chế phẩm Biosubtyl phòng bệnh tiêu chảy cho lợn con, làm giảm được 42% số lợn tiêu chảy ở lợn con giai đoạn từ 1 - 60 ngày tuổi. Tạ Thị Vịnh, Đặng Thị Hoè (2002) [61] đã sử dụng chế phẩm VITOM1.1 (có chứa Bacillus subtilis chủng VKPMV-7092) để phòng trị bệnh tiêu chảy cho lợn con từ sơ sinh đến 3 tuần tuổi. Trần Thị Hạnh và cs (2004) [21] đã chế tạo sinh phẩm E. coli-sữa và C. perfringens-toxoid dùng phòng bệnh tiêu chảy cho lợn con. - 13 - Như vậy, vấn đề phòng bệnh tiêu chảy cho lợn đã có rất nhiều tác giả nghiên cứu. Mỗi một công trình nghiên cứu đều đi sâu vào một số khía cạnh, một số nguyên nhân gây bệnh và đã đạt được một số kết quả khả quan. Tuy nhiên, do có nhiều nguyên nhân và yếu tố gây bệnh nên vẫn còn nhiều vấn đề thực tiễn đòi hỏi phải giải quyết trong phòng bệnh tiêu chảy cho lợn. 1.1.5.2. Điều trị bệnh Lê Minh Chí (1995) [4] cho rằng: Trên thực tế lâm sàng, điều trị mất nước là điều trị bắt buộc và là điều kiện để hạ thấp mức độ thiệt hại do bệnh tiêu chảy gây ra. Phạm Ngọc Thạch (2005) [52] cho biết: để điều trị hội chứng tiêu chảy ở gia súc nên tập trung vào 3 khâu là: - Loại trừ sai sót trong nuôi dưỡng như: Loại bỏ thức ăn kém phẩm chất (ôi mốc), chăm sóc nuôi dưỡng tốt, loại bỏ thức ăn không tiêu hoá được đang lên men trong đường ruột. - Khắc phục rối loạn tiêu hóa và chống nhiễm khuẩn - những vi khuẩn đã phân lập được ở gia súc viêm ruột ỉa chảy. - Điều trị hiện tượng mất nước và chất điện giải. Theo Đặng Xuân Bình, 2004 [2] có thể dùng kháng thể chống E. coli chế tạo qua lòng đỏ trứng gà để điều trị , cho hiệu quả tốt, không có tồn dư kháng sinh, không gây còi cọc lợn sau điều trị Hiện nay, để điều trị hội chứng tiêu chảy ở lợn, nhiều tác giả nghiên cứu cho rằng, cần phải xác định được nguyên nhân gây bệnh, hiểu rõ cách sinh bệnh và triệu chứng bệnh. Việc sử dụng kháng sinh trong điều trị tiêu chảy do nhiễm khuẩn được nhiều người nghiên cứu và đưa ra nhiều phác đồ khác nhau, nhưng các tác giả đều thống nhất rằng: Sử dụng kháng sinh có hiệu quả cần phải xem xét khả năng mẫn cảm và tính kháng thuốc của vi khuẩn. Vấn đề này chúng tôi sẽ trình bày rõ hơn ở các phần tiếp sau. - 14 - 1.2. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ VI KHUẨN E. COLI GÂY BỆNH ĐƢỜNG TIÊU HOÁ Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) trước đây gọi là Bacterium coli commune hay Bacilus coli communis, lần đầu tiên phân lập từ phân trẻ em bị tiêu chảy năm 1885 và đặt theo tên của bác sĩ nhi khoa Đức. Theo dor Escherich (1857-1991) (Nguyễn Vĩnh Phước, 1974 [36], Nguyễn Lân Dũng, 1976 [8], Nguyễn Như Thanh và cộng sự, 1997 [53], Lê Văn Tạo, 1997a [48]). Vi khuẩn E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae, họ vi khuẩn thường trực ở trong ruột, chiếm tới 80% các vi khuẩn hiếu khí vừa là vi khuẩn cộng sinh thường trực đường tiêu hoá, vừa là vi khuẩn gây nhiều bệnh ở đường ruột và ở các cơ quan khác (Lê Văn Tạo, 1997a [48]). Trong điều kiện bình thường, E. coli khu trú thường xuyên ở phần sau của ruột, ít khi có ở dạ dày hay đoạn đầu ruột non của động vật. Khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng phát triển nhanh về số lượng, độc lực, gây loạn khuẩn, bội nhiễm đường tiêu hoá và trở thành nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978[37]). 1.2.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc của vi khuẩn 1.2.1.1. Đặc điểm hình thái Theo Nguyễn Như Thanh và cs (1997) [53], E. coli là một trực khuẩn ngắn 2 đầu tròn, kích thước 2-3  m. Trong cơ thể có hình cầu trực khuẩn đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. Trong môi trường nuôi cấy, có khi quan sát thấy những trực khuẩn dài 4-8  m và thường gặp trong canh khuẩn già. Phần lớn vi khuẩn E. coli có khả năng di động do có lông ở xung quanh thân, nhưng cũng có 1 số chủng không có khả năng di động. Vi khuẩn không sinh nha bào, có thể có giáp mô. Vi khuẩn bắt màu Gram âm, có thể bắt màu đều hoặc sẫm ở hai đầu. Nếu lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc để nhuộm có thể quan sát thấy giáp mô. Dưới - 15 - kính hiển vi điện tử người ta còn phát hiện được cấu trúc pilli - yếu tố mang kháng nguyên bám dính của vi khuẩn E. coli. 1.2.1.2. Cấu trúc của vi khuẩn Vi khuẩn E. coli được chia làm các serotype khác nhau dựa vào cấu trúc kháng nguyên thân O, kháng nguyên giáp mô K, kháng nguyên lông H và kháng nguyên bám dính F. Bằng phản ứng ngưng kết, các nhà khoa học đã tìm ra được 250 serotype O, 89 serotype K, 56 serotype H và một số serotype F (Fairbrother .J.M, 1992[74]). Khi xác định serotype đầy đủ của một chủng vi khuẩn E. coli thì phải xác định ở cả 3 loại kháng nguyên nói trên. Kháng nguyên O (Kháng nguyên thân - Somatic antigen) được coi như là một yếu tố độc lực có thể tìm thấy ở thành tế bào vi khuẩn và có liên hệ trực tiếp với hệ thống miễn dịch. Kháng nguyên O khi gặp kháng huyết thanh tương ứng sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết. Ngưng kết kháng nguyên O tạo thành những hạt nhỏ khó tan. Kháng nguyên H (Kháng nguyên lông - Hauch) là thành phần lông của vi khuẩn, có bản chất protein, kém bền vững hơn so với kháng nguyên O. Kháng nguyên H không phải là yếu tố độc lực của vi khuẩn, nhưng có khả năng tạo miễn dịch mạnh. Phản ứng miễn dịch xảy ra nhanh hơn so với kháng nguyên O. Kháng nguyên H của vi khuẩn E. coli không có vai trò bám dính, không có tính độc và cũng không có ý nghĩa trong đáp ứng miễn dịch phòng vệ nên ít được quan tâm nghiên cứu, nhưng nó có ý nghĩa rất lớn trong xác định giống loài của vi khuẩn (Orskov.F,1978[86]). Kháng nguyên K (Kháng nguyên vỏ bọc - Capsular), còn được gọi là kháng nguyên bề mặt (OMP- Outer membrane protein) hoặc kháng nguyên vỏ bọc (Capsular). Vai trò kháng nguyên K chưa được thống nhất. Có rất nhiều ý kiến cho rằng, nó không có ý nghĩa về mặt độc lực của vi khuẩn, vì thấy rằng độc lực của chủng E. coli có kháng nguyên K cũng giống như độc lực của - 16 - chủng không có kháng nguyên K (Orskov. F,,1978[86]). Tuy nhiên, có 1 số ý kiến khác cho rằng, nó có ý nghĩa về mặt độc lực vì nó tham gia bảo vệ vi khuẩn trước những yếu tố phòng vệ của vật chủ. Tuy vậy phần lớn các ý kiến đều thống nhất kháng nguyên K có 2 nhiệm vụ sau: + Hỗ trợ phản ứng ngưng kết của kháng nguyên O, nên thường ghi liền công thức serotype của vi khuẩn là Ox:Ky, ví dụ như O139: K88, O149: K88... + Tạo ra thành hàng rào bảo vệ cho vi khuẩn chống lại các tác động ngoại cảnh và hiện tượng thực bào, yếu tố phòng vệ của vật chủ Tóm lại, dựa vào kháng nguyên O, E. coli được chia thành nhiều nhóm; căn cứ vào cấu tạo kháng nguyên O, K, H, E. coli được chia làm nhiều type; mỗi type đều ghi thứ tự các yếu tố kháng nguyên O, H, K. Kháng nguyên F (Kháng nguyên Fimbriae - kháng nguyên bám dính): Hầu hết các chủng E. coli gây bệnh đều sản sinh ra một hoặc nhiều kháng nguyên bám dính. Các chủng không gây bệnh thì không có kháng nguyên bám dính. Kháng nguyên bám dính giúp vi khuẩn bám vào các thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào biểu mô ruột và trên lớp màng nhày để xâm nhập và gây bệnh, đồng thời chống lại khả năng đào thải vi khuẩn của nhu động ruột. Một số loại kháng nguyên bám dính của vi khuẩn E. coli thuộc nhóm ETEC (Enteroxigenic E. coli) gây bệnh chủ yếu cho lợn là F4(K88), F5(K99), F6(987P), F18 và F41 (Cater.G.R và cs, 1995) [68]. 1.2.2. Đặc tính nuôi cấy, sinh vật, hoá học 1.2.2.1. Đặc tính nuôi cấy Theo Nguyễn Như Thanh và cs (1997) [53], vi khuẩn E. coli dễ dàng phát triển trên môi trường nuôi cấy thông thường, một số chủng có thể phát triển được ở môi trường tổng hợp nên người ta đã chọn chúng để nghiên cứu về sinh vật học. - 17 - E. coli là trực khuẩn hiếu khí tuỳ tiện, có thể sinh trưởng ở nhiệt độ từ 5- 40 o C, nhiệt độ thích hợp nhất là 37 o C. pH thích hợp nhất là 7,2 - 7,4, phát triển được ở pH từ 5,5-8. - Môi trường thạch thường: Sau 24 giờ nuôi cấy ở 37 o C, vi khuẩn hình thành những khuẩn lạc tròn, ướt bóng láng, không trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính từ 2-3mm. Nếu nuôi lâu, khuẩn lạc có màu nâu nhạt và mọc rộng ra, có thể quan sát thấy cả những khuẩn lạc dạng R (Rough) và M (Mucoid). - Môi trường nước thịt: Sau 24 giờ nuôi cấy ở 37 o C, vi khuẩn E. coli phát triển rất nhanh, môi trường rất đục, có cặn màu tro trắng nhạt lắng xuống đáy, đôi khi có màng màu xám nhạt trên mặt môi trường, môi trường có mùi thối (do vi khuẩn phát triển sinh ra H2S). - Trên môi trường MacConkey: Sau 24 giờ nuôi cấy ở 37 o C, khuẩn lạc có màu cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, không nhầy, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường. - Trên môi trường thạch máu: Sau 24 giờ nuôi cấy ở 37 o C, hình thành khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn, màu sáng, có thể có hoặc không có dung huyết, tuỳ thuộc vào chủng vi khuẩn. - Trên môi trường Endo: Sau 24 giờ nuôi cấy ở 37 o C, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc màu đỏ mận chín, hoặc không có ánh kim. - Trên môi trường EMB (Eosin Methyl Blue): Sau 24 giờ nuôi cấy ở 37 o C, vi khuẩn hình thành những khuẩn lạc màu tím đen có ánh kim. - Trên môi trường thạch SS: E. coli phát triển thành các khuẩn lạc có màu đỏ. - Trên môi trường thạch Brilliant Green Agar: Sau 24 giờ nuôi cấy ở 37 o C, vi khuẩn E. coli hình thành khuẩn lạc dạng S (Smooth), màu vàng chanh. - 18 - 1.2.2.2. Đặc tính sinh vật hoá học - Phản ứng lên men đường: Vi khuẩn E. coli lên men sinh hơi các loại đường Lactose, Fructose, Glucose, Levulose, Galactose, Xylose, Manitol; lên men không chắc chắn các loại đường Duncitol, Saccarose và Salixin. Hầu hết các chủng vi khuẩn E. coli đều lên men đường Lactose nhanh và sinh hơi. Đây là đặc điểm quan trọng để dựa vào đó phân biệt vi khuẩn E. coli và Samonella. - Một số phản ứng sinh hoá khác: Phản ứng Indol và MR dương tính, phản ứng H2S, VP, Urea âm tính. 1.2.3. Đặc tính gây bệnh của vi khuẩn E. coli 1.2.3.1. Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn E. coli Để có thể gây bệnh, trước hết vi khuẩn E. coli phải bám dính vào tế bào nhung mao ruột bằng các yếu tố bám dính như kháng nguyên F. Sau đó, nhờ các yếu tố xâm nhập (Invasion), vi khuẩn sẽ xâm nhập vào tế bào biểu mô của thành ruột. Ở đó, vi khuẩn phát triển, nhân lên, phá huỷ lớp tế bào biểu mô, gây viêm ruột, đồng thời sản sinh độc tố đường ruột Enterotoxin. Độc tố đường ruột tác động vào quá trình trao đổi muối, nước, làm rối loạn chu trình này. Nước từ cơ thể tập trung vào lòng ruột làm căng ruột, cùng với khí do lên men ở ruột gây nên một tác dụng cơ học, làm nhu động ruột tăng, đẩy nước và chất chứa ra ngoài, gây nên hiện tượng tiêu chảy. Sau khi đã phát triển ở thành ruột, vi khuẩn vào hệ lâm ba, đến hệ tuần hoàn, gây nhiễm trùng máu. Trong máu, vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào, gây dung huyết, làm cho cơ thể thiếu máu. Từ hệ tuần hoàn, vi khuẩn đến các tổ chức cơ quan. Ở đây, vi khuẩn lại phát triển nhân lên lần thứ hai, phá huỷ tế bào tổ chức, gây viêm và sản sinh độc tố như: Enterotoxin, Verotoxin, phá huỷ tế bào tổ chức, gây tụ huyết và xuất huyết. - 19 - 1.2.3.2. Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E. coli Các yếu tố gây bệnh của E. coli bao gồm khả năng ®Ò kháng , yếu tố bám dính, khả năng xâm nhập, yếu tố gây dung huyết và khả năng sản sinh độc tố. Các chủng vi khuẩn E. coli không có các yếu tố trên thì không có khả năng gây bệnh. Dựa vào các yếu tố gây bệnh nói trên, người ta đã phân loại vi khuẩn E. coli thành các loại sau: Enterotoxigenic E. coli (ETEC), Enteropathogenic E. coli (EPEC), Adherence Enteropathogenic E. coli (AEEC) và Verotoxingenic E. coli (VTEC) (Lê Văn Tạo, 1997a [48]). Trong đó, các chủng vi khuẩn thuộc nhóm ETEC và VTEC thường gây bệnh tiêu chảy cho lợn con sơ sinh và lợn sau cai sữa (Fairbrother.J.M, 1992 [74]). * Yếu tố kháng khuẩn: Nhiều chủng vi khuẩn E. coli có khả năng sản sinh ra chất kháng khuẩn có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt các loại vi khuẩn khác, gọi là ColicinV. Vì vậy, yếu tố này cũng được coi là 1 trong các yếu tố độc lực của vi khuẩn E. coli gây bệnh (Smith.H.W và cs, 1967) [91]). * Yếu tố bám dính: Để gây bệnh, các chủng ETEC phải bám dính lên trên tế bào biểu mô của ruột non. Hầu hết các chủng ETEC đều có mang 1 hoặc nhiều các yếu tố bám dính như: F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P), F17, F18, F41, F42 và F165. Ở lợn, các chủng vi khuẩn ETEC gây tiêu chảy thường mang các yếu tố bám dính sau đây: - F4 (K88): F4 hay còn gọi là K88 và là một kháng nguyên không chịu nhiệt. Bằng việc sử dụng các kháng huyết thanh đặc hiệu, Orskov và cs (1964) [92] đã phân biệt được hai loại khác nhau của F4 là F4ab và F4ac. Loại thứ 3 được phát hiện bởi Guinee và Jansen được đặt tên là F4ad (Guinee và cs, 1979 [76]). Sợi F4 giúp cho vi khuẩn bám được vào receptor tương ứng - 20 - của nó trên tế bào biểu mô của lông nhung ruột non, từ đó vi khuẩn có thể xâm nhập cố định và phát triển được ở thành ruột non. Yếu tố bám dính F4 được mang trong vi khuẩn E. coli thuộc nhóm ETEC, gây bệnh tiêu chảy ở lợn trước và sau cai sữa (Nagy và cs, 1999 [84]). - F5 (K99): F5 trước kia được cho là kháng nguyên bám dính của E. coli chỉ gây bệnh ở bê, nghé và cừu. Tuy nhiên, hiện nay chúng cũng được tìm thấy với tỷ lệ thấp ở các chủng ETEC phân lập từ lợn tiêu chảy (Links và cs, 1985) [85]. Sự sản sinh F5 phụ thuộc vào nhiều yếu tố của vi khuẩn như: Tốc độ sinh trưởng, pha sinh trưởng, nhiệt độ và alanine trong môi trường. Các gen mã hóa cho sự tổng hợp F5 nằm trên ADN của plasmid (Isaacson, 1977) [78]. - F6 (987p): Các nhà khoa học cho rằng fimbriae này đóng vai trò quan trọng trong việc gây bệnh của ETEC. F6 của ETEC ở lợn có thể giúp vi khuẩn bám vào cả các receptor cấu tạo bởi glycoprotein và glycolipid trên riềm bàn chải của các tế bào biểu mô ruột (Dean và cs, 1989, 1994 [69] [70]). F6 bám dính ở màng nhầy để phân phối độc tố đường ruột tối đa đến vật chủ. - F18: F18 là tên đặt cho nhân tố bám dính 8813. Bởi vậy, một loại fimbriae mới đã được đề nghị công nhận là F18ab và F18ac (Rippinger và cs, 1995 [90]). Nghiên cứu của Nagy và cs (1996) [83] thấy rằng F18ab và F18ac khác nhau về mặt sinh học. F18ab ít thấy thể hiện ở cả trong điều kiện thực tế và trong phòng thí nghiệm. Chúng thường thấy cùng với việc sản xuất SLT-2e ở các chủng VTEC, trong khi F18ac thể hiện rất rõ ở cả trong thực tế và trong phòng thí nghiệm, chúng mang các đặc tính của các chủng ETEC. Một đặc điểm đáng chú ý ở F18ac là chúng không bám vào riềm bàn chải của lợn sơ sinh trong điều kiện thực tế và trong phòng thí nghiệm (Nagy và cs, 1996 [83]), cũng không tập trung ở lớp màng nhầy của ruột ở lợn con mới sinh (Casey và cs, 1992 [67]). Điều này là hoàn toàn trái ngược với F5 và - 21 - F6, chúng bám vào các tế bào biểu mô ruột. Khả năng bám này ở lợn cai sữa nhiều hơn so với lợn sơ sinh. Đây chính là lý do xác đáng để giải thích về việc tăng sự mẫn cảm với khả năng bám dính của F18ab và F18ac theo tuổi của lợn vẫn chưa được làm rõ, nhưng có thể là do sự tăng dần các receptor đặc hiệu ở lông nhung của ruột lợn từ sơ sinh đến 21 ngày tuổi. Sự thiếu hụt các receptor của F18ab và F18ac ở lợn sơ sinh có thể giải thích cho lý do vì sao chỉ thấy các chủng VTEC và ETEC ở lợn cai sữa (Nagy và cs, 1999 [84]). * Yếu tố xâm nhập của vi khuẩn E. coli: Là một khái niệm dùng để chỉ quá trình chưa được xác định một cách rõ ràng, mà nhờ đó vi khuẩn E. coli qua được hàng rào bảo vệ của lớp màng nhầy (mucosa) trên bề mặt niêm mạc để xâm nhập vào tế bào biểu mô (Epithel), đồng thời sinh sản và phát triển trong lớp tế bào này. Trong khi đó, những vi khuẩn khác không có khả năng xâm nhập, không thể qua được hàng rào bảo vệ của lớp màng nhầy hoặc khi qua được hàng rào này, sẽ bị giữ lại bởi tế bào đại thực bào của tổ chức hạ niêm mạc (Giannella và cs, 1979 [75]). * Độc tố của vi khuẩn E. coli: Vi khuẩn E. coli sản sinh nhiều loại độc tố: Enterotoxin, Verotoxin, Neurotoxin. Mỗi loại độc tố gắn với một thể bệnh mà chúng gây ra. - Nhóm độc tố đường ruột (Enterotoxin): Gồm hai loại: + Độc tố chịu nhiệt (Heat Stable Toxin - ST): Độc tố này chịu được nhiệt độ 100 o C trong vòng 15 phút. Độc tố ST chia thành hai nhóm STa và STb dựa trên đặc tính sinh học và khả năng hòa tan trong methanol. STa kích thích sản sinh ra cGMP mức cao trong tế bào, ngăn trở hệ thống chuyển Na + và Cl - , làm giảm khả năng hấp thu chất điện giải và nước ở ruột. STa thường thấy ở ETEC gây bệnh ở lợn < 2 tuần tuổi và ở lợn lớn. STb kích thích vòng nucleotid phân tiết dịch độc lập ở ruột, nhưng phương thức tác dụng của STb vẫn chưa được hiểu rõ. STb hoạt động ở ruột - 22 - non lợn, nhưng không hoạt động ở ruột non chuột, bê và bị vô hoạt bởi Trypsin. STb tìm thấy được ở 75% các chủng vi khuẩn E. coli phân lập từ lợn con, 33% phân lập từ lợn lớn (Fairbrother và cs, 1992 [74]). Vai trò của STb trong tiêu chảy chưa được biết đến, mặc dù ETEC sản sinh STb có thể kích thích gây tiêu chảy ở lợn con trong điều kiện thực nghiệm và STb làm teo lông nhung ruột lợn (Carter và cs, 1995 [68]). Cả STa và STb đều có vai trò quan trọng trong việc gây tiêu chảy do các chủng E. coli gây bệnh ở bê, nghé, dê, cừu, lợn con và trẻ sơ sinh. + Độc tố không chịu nhiệt (Heat Labile Toxin - LT): Độc tố này bị vô hoạt ở nhiệt độ 60 o C trong vòng 15 phút. LT cũng có hai nhóm phụ LT1 và LT2, nhưng chỉ có LT1 bị trung hòa bởi Anti-cholerae toxin. LT là một trong những yếu tố quan trọng gây triệu chứng tiêu chảy (Faibrother và cs, 1992) [74]. Cả 2 loại độc tố ST và LT đều bền vững ở nhiệt độ âm, thậm chí cả ở nhiệt độ -20 o C. - Nhóm độc tố tế bào (Shiga /Verotoxin): Konowalchuck và cs (1977) [80] đã phát hiện một loại độc tố hoạt động trong môi trường nuôi cấy tế bào Vero (nên chúng được đặt tên là độc tố tế bào Vero), được sản sinh bởi vi khuẩn E. coli gây bệnh tiêu chảy ở người, tiêu chảy và bệnh phù đầu ở lợn con. Ảnh hưởng gây bệnh ở tế bào của độc tố Vero rất khác so với ảnh hưởng của độc tố đường ruột không chịu nhiệt cổ điển ở nhóm vi khuẩn E. coli gây bệnh đường ruột (ETEC). Độc tố Vero (VTs) hay Shiga (SLTs) là thuật ngữ được sử dụng trước đây. Gần đây, các nhà khoa học đã đề nghị sử dụng tên độc tố Shiga (Stx) cho tất cả những độc tố tế bào này. Stx sản sinh bởi E. coli bao gồm 2 nhóm: Stx1và Stx2. Độc tố Shiga ở lợn là một loại trong nhóm độc tố Stx2 với một số khác biệt trong đặc tính sinh học. Stx1 và Stx2 gây độc cho tế bào Hela. Stx2e kém độc hơn, nhưng gây độc mạnh cho tế bào Vero. - 23 - * Vai trò gây bệnh của các loại kháng nguyên: Theo ý kiến của nhiều tác giả, mặc dù các vi khuẩn E. coli có nhiều loại kháng nguyên, trong đó, có loại tạo miễn dịch phòng vệ cho vật chủ, có loại không tạo miễn dịch phòng vệ cho vật chủ nhưng đều tham gia vào quá trình gây bệnh bằng cách tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhập vào tế bào vật chủ và tham gia vào quá trình kháng lại các yếu tố phòng vệ tự nhiên của vật chủ. Các kháng nguyên tham gia vào quá trình trên phải kể đến là kháng nguyên O, kháng nguyên K, và kháng nguyên F. * Yếu tố dung huyết (Hly): Để phát triển trong cơ thể, vi khuẩn E. coli cần được cung cấp sắt. Hầu hết những chủng E. coli gây bệnh thường có khả năng gây dung huyết. Để chiếm dụng sắt của vật chủ, vi khuẩn E. coli tiết ra men Heamolyzin phá vỡ hồng cầu, giải phóng sắt trong nhân HEM. Có 4 kiểu dung huyết của vi khuẩn E. coli là: -haemolysin, -haemolysin, -haemolysin, -haemolysin, nhưng quan trọng nhất là kiểu -haemolysin và -haemolysin (Ketyle và cs, 1975 [79]). 1.2.4. Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn E. coli Để điều trị bệnh đường ruột, người ta sử dụng nhiều loại kháng sinh. Kháng sinh còn được trộn vào thức ăn với tỷ lệ thấp để phòng bệnh và kích thích tăng trọng. Vì vậy, khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột nói chung và vi khuẩn E. coli nói riêng đang ngày một tăng, làm cho hiệu quả điều trị giảm, thậm chí nhiều loại kháng sinh còn bị vô hiệu hóa hoàn toàn. Sở dĩ khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn nói chung và E. coli nói riêng tăng nhanh, lan rộng vì gen sản sinh yếu tố kháng kháng sinh nằm trong plasmid R (Resistance). Plasmid này có thể di truyền dọc và di truyền ngang cho tất cả quần thể vi khuẩn thích hợp (Falkow, 1975) [73]. - 24 - Sử dụng phương pháp kháng sinh đồ, Lê Văn Tạo (1993) [46] đã xác định được khả năng kháng kháng sinh của các chủng E. coli phân lập từ bệnh phân trắng lợn con và kết luận vi khuẩn E. coli có được khả năng này là do nhận được bằng di truyền dọc và di truyền ngang qua plasmid. Với những ý nghĩa trên, ngày nay việc nghiên cứu khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn không còn đơn thuần là việc lựa chọn kháng sinh mẫn cảm để điều trị bệnh do E. coli gây ra mà là nghiên cứu một yếu tố gây bệnh của vi khuẩn này. Phạm Khắc Hiếu và cs (1999) [17] đã tìm thấy chủng E. coli kháng lại 11 loại kháng sinh, đồng thời chứng minh khả năng di truyền tính kháng thuốc giữa E. coli và Salmonella qua plasmid. Nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Nhiên và cs (2000) [34] cho thấy, hầu hết các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được từ gia súc tiêu chảy có khả năng kháng lại với nhiều loại kháng sinh như: Chloramphenicol, Sulfadimethoxine hoặc Tetracycline, ... Nghiên cứu tính kháng kháng sinh của 106 chủng E. coli phân lập từ lợn con theo mẹ bị tiêu chảy ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam, Đỗ Ngọc Thuý và cs (2002) [57] đã thu được kết quả: Các chủng có xu hướng kháng mạnh với các loại kháng sinh thông thường vẫn dùng để điều trị bệnh: Amoxicillin (76,42%), Chloramphenicol (79,25%), Trimethroprim/ Sulfamethoxazol (80,19%), Streptomycin (88,68%), Tetracyclin (97,17%). Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn với trên 3 loại kháng sinh là phổ biến (chiếm 90,57%) và kiểu kháng thuốc kháng với các loại kháng sinh: Tetracyclin, Trimethroprim/ Sulfamethoxazol, Streptomycin và Chloramphenicol chiếm tỷ lệ cao nhất (76,24%). Có thể dùng Amikacin, Apramycin hay Ceftiofur để điều trị cho lợn con bị tiêu chảy, thay thế cho các loại kháng sinh trước đây vẫn dùng. Bùi Xuân Đồng (2002) [13] đã tiến hành thử kháng sinh đồ với các chủng E. coli phân lập được từ Hải Phòng và cho kết quả mẫn cảm với các - 25 - loại kháng sinh Chloramphenicol, Norfloxacin, Ampicilin; còn với các chủng tại Tiền Giang thì Bùi Trung Trực (2004) [60] cho rằng chúng vẫn mẫn cảm mạnh với Norfloxacin và Colistin. Khi thử nghiệm phòng và trị bệnh E. coli dung huyết cho lợn con ở Thái Nguyên và Bắc Giang, Nguyễn Thị Kim Lan (2004) [21] đã kết luận: Vi khuẩn E. coli phân lập từ lợn bệnh rất mẫn cảm với kháng sinh Amikacin, mẫn cảm kém hơn với Doxycycline, không mẫn cảm với Ampicilin và Cefuroxime. Trương Quang và cs (2006) [43] kiểm tra khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn E. coli gây bệnh tiêu chảy cho bê, nghé đã cho thấy các loại Neomycin, Norfloxacin và Colistin có tác dụng tốt. Như vậy, có thể thấy, qua thời gian và ở các địa điểm khác nhau, tính kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli gây bệnh cũng khác nhau. 1.2.5. Vai trò của vi khuẩn E. coli trong hội chứng tiêu chảy Bệnh tiêu chảy có ở hầu hết các nước trên thế giới cũng như ở Việt Nam, gây thiệt hại đáng kể cho ngành chăn nuôi. Trong chăn nuôi lợn, bệnh xảy ra ở mọi lứa tuổi và đã có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh. Các tác giả trong và ngoài nước đều nhấn mạnh vai trò của vi khuẩn E. coli trong hội chứng tiêu chảy. Theo nhiều nhà nghiên cứu, khoảng 20 - 50% lợn con chết trong những ngày sau sơ sinh là do E. coli gây nên, đôi khi tỷ lệ chết tới 10% (Niconxki.V.V, 1986) [30]. Để xác định vai trò của 1 chủng vi khuẩn E. coli gây ra một bệnh nào đó, cần kiểm tra độc lực và các yếu tố gây bệnh mà chủng E. coli đó có được. Do vậy, kết quả những nghiên cứu về độc lực, yếu tố gây bệnh của E. coli chính là đánh giá khả năng gây bệnh của nó (Lê Văn Tạo và cs, 2003 [50]). Cù Hữu Phú và cs (2004) [41] đã kết luận: Vi khuẩn E. coli là nguyên nhân chính gây bệnh tiêu chảy ở lợn con theo mẹ; các chủng E. coli có thể - 26 - mang tổ hợp các yếu tố gây bệnh như: LT + STa + STb + K88 + Hly + (29.29%); LT + STa + STb + Hly- (8.33%). Khi nghiên cứu về vai trò gây bệnh của E. coli trong hội chứng tiêu chảy ở lợn 1 - 60 ngày tuổi, tác giả Trương Quang (2005) [42] đã có kết luận: 100% mẫu phân của lợn bị tiêu chảy phân lập được E. coli với số lượng gấp 2,46 - 2,73 lần (ở lợn 1 - 21 ngày tuổi) và 1,88 - 2,1 lần (ở lợn 22 - 60 ngày tuổi) so với lợn không tiêu chảy. Tỷ lệ các chủng E. coli phân lập từ lợn bị tiêu chảy có độc lực mạnh và các yếu tố gây bệnh cao hơn rất nhiều so với ở lợn không bị tiêu chảy. Cụ thể: - Yếu tố bám dính: 93,33% so với 33,33%; - Khả năng dung huyết: 53,33% so với 25,92%; - Độc tố chịu nhiệt (LT): 90% - 11,11%, cả 2 loại ST + LT: 73,33% so với 1,4%, độc lực mạnh (giết chết 100% chuột): 90% so với 100%. Tìm hiểu nguyên nhân chủ yếu gây bệnh tiêu chảy lợn con, Hồ Đình Soái và cs (2005) [44] đã nhận xét: 100% mẫu phân lợn tiêu chảy phân lập được E. coli với số lượng nhiều gấp 2,37 lần (1- 45 ngày tuổi) và gấp 2,31 lần (45 - 60 ngày tuổi) so với lợn bình thường không tiêu chảy. Độc lực của vi khuẩn E. coli và Salmonella gây chết chuột từ 50 - 100%, thời gian gây chết 6 - 36 giờ. Độc tố gây bệnh của vi khuẩn E. coli gồm: 60% có độc tố STb, tỷ lệ LT, STa và VT2 là 40%, 20% và 10%, có 4 chủng sinh độc tố EAST1, 2 chủng sản sinh 2 loại độc tố STb và LT, 2 chủng sản sinh 3 loại độc tố STa, STb và LT. 1.3. VI KHUẨN C. PERFRINGENS GÂY BỆNH ĐƢỜNG TIÊU HOÁ Bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn được phát hiện lần đầu tiên ở Anh (Field và Gibson, 1995) và nhiều năm sau, bệnh được phát hiện và nghiên cứu ở Mỹ (Barnes và Moon, 1964)... Đến nay, bệnh đã thấy ở hầu hết các nước trên thế giới (Bergelan, 1993). - 27 - Ở Việt Nam, bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn đã được quan sát thấy ở nhiều cơ sở chăn nuôi lợn tập trung và đã gây nhiều thiệt hại cho lợn con lứa tuổi 1- 4 tuần lễ (Bộ môn vi trùng, Viện thú y, 1985). Vi khuẩn C. perfringens thuộc nhóm vi khuẩn kỵ khí có khả năng hình thành nha bào, giáp mô và chính nhờ những đặc điểm đó mà vi khuẩn có khả năng tồn tại lâu theo thời gian dưới dạng nha bào. Sự phân bố rộng rãi của mầm bệnh trong tự nhiên như các nguồn nước, vật liệu, dụng cụ chăn nuôi, phương tiện vận chuyển... là những nhân tố quan trọng tham gia vào sự phân tán mầm bệnh đi khắp nơi. Ngoài ra, vi khuẩn C. perfringens còn là một trong những nguyên nhân gây ngộ độc thức ăn, tiêu chảy và viêm ruột hoại tử ở trẻ em và nhiều loại động vật, đặc biệt là ở gia súc non ( Roeder và cs, 1987[89]). Trong quá trình nghiên cứu, chiết tách các loại độc tố, Hogh, 1974[77] đã phát hiện thấy: ngoài độc tố  - toxin có hàm lượng cao nhất trong chất chứa ở ruột, còn có một vài loài độc tố khác như:  - toxin (Lecitinase),  - toxin (Collagenase),  - toxin (Hyaluronidase)và  - toxin. Con vật chết trong các ca bệnh viêm ruột hoại tử do C. perfringens type C chính là do vai trò tác động của các độc tố, mà chủ yếu là do độc tố  gây ra. 1.3.1. Đặc điểm hình thái và cấu trúc của vi khuẩn Vi khuẩn C. perfringens là vi khuẩn gram dương, yếm khí, không di động, kích thước từ 0.6-0.8  m x 2-4  m. Nha bào to hơn thân vi khuẩn, có hình oval cân xứng hay lệch tâm. Trong thực tế, ít khi quan sát được nha bào. Trên môi trường thạch máu bò hay cừu 7%, sau 24 giờ nuôi cấy trong điều kiện yếm khí, vi khuẩn phát triển hình thành những khuẩn lạc rõ ràng, có đường kính 3-5 mm, màu xám trong, gây dung huyết hoàn toàn. Vi khuẩn C. perfringens type C sản sinh độc tố  và  , chủ yếu là độc tố  , nhân tố quan trọng nhất trong sinh bệnh học (Taylor và cs, 1986[92]). - 28 - Vi khuẩn C. perfringens có nhiều chủng và có khả năng sản sinh ra nhiều loại độc tố khác nhau. C. perfringens hình thành độc tố dung huyết, gây hoại tử tổ chức phần mềm và gây chết. Theo Quinn và cs, 1994[87] căn cứ vào các loại độc tố, cấu trúc của kháng nguyên và khả năng gây bệnh, vi khuẩn C. perfringens được chia ra một số type như: type A, B C, D và E. - Type A thường gây ra ngộ độc thức ăn, gây viêm ruột hoại tử ở người và động vật, với các độc tố chủ yếu là Alpha (Alpha- toxin) và một số độc tố thứ yếu khác như: Kappa- toxin, Eta- toxin..., trong đó độc tố Alpha có vai trò quan trọng nhất và nó có khả năng gây chết làm tan máu và gây hoại tử tổ chức. - Type B có khả năng sản sinh nhiều loại độc tố như: Alpha, Beta, Epsilon, Muy, Lamda, Theta... gây bệnh chủ yếu ở dê, cừu, ngựa non. - Type C gây viêm ruột hoại tử ở trẻ em, trên gia súc thường gặp ở bê, nghé, dê cừu, lợn con. Type này thường sản sinh ra một số loại độc tố chủ yếu như: Alpha, Beta và các độc tố thứ yếu như: Lamda, Delta, Kappha, Gamma. - Type D sản sinh độc tố chủ yếu là: Alpha và Epsilon và các độc tố thứ yếu như: Beta, Gamma, Muy, Lamda, Kappa... tính gây bệnh thường gặp của type này là nhiễm độc ruột - huyết và nhũn thận ở người và nhiều loài động vật như cừu, trâu bò, dê và 1 số loài khác. Độc tố Epsilon có khả năng tự gia tăng tính thẩm thấu trong đường ruột để hấp thu nhiều nhất vào hệ tuần hoàn và đến cả não. Độc tố phá huỷ vi mạch ở tổ chức, gây thẩm suất dịch và phù cấp tính, vì vậy nên ngoài tên gọi là độc tố đường ruột (Enterotoxin), Epsilon - toxin còn được gọi là độc tố thần kinh (Neurotoxin). - Type E thường gây nhiễm độc ruột ở cừu non và bê, độc tố chủ yếu do type này sản sinh ra là: Alpha, Iota và những độc tố thứ yếu như: Muy, Lamda, Kappa... - 29 - Trong các type vi khuẩn C. perfringens gây bệnh, thì type C có sự phân bố rộng, và khả năng gây bệnh cho người cũng như động vật cao hơn cả so với những type khác. Viêm ruột hoại tử ở những động vật non do vi khuẩn C. perfringens bởi type C được tìm ra ở Anh và Hungari từ năm 1995, sau đó vi khuẩn này được nghiên cứu và tìm ra ở nhiều quốc gia khác trên thế giới như: Mỹ, Đan Mạch, Liên Xô, Hà Lan, Canada, Nhật Bản cũng như hầu khắp các quốc gia trên thế giới (Taylo và cs, 1986 [92]). Với khả năng hình thành giáp mô, nên ngoài kháng nguyên thân, vi khuẩn C. perfringens còn có cả kháng nguyên giáp mô. Vi khuẩn còn có khả năng sản sinh ra nhiều lo¹i độc tố và các enzym khác nhau. Trong mỗi chủng của vi khuẩn này, với những đặc điểm riêng biệt giữa chúng lại có thể sản sinh ra một vài loại độc tố hoặc enzym khác nhau, gây ra quá trình bệnh phong phú và thể loại và phức tạp trong bệnh lý do độc tính gây ra (Roeder và cs, 1987 [89]). 1.3.2. Đặc tính nuôi cấy, sinh vật hoá học 1.3.2.1. Đặc tính nuôi cấy Vi khuẩn C. perfringens là vi khuẩn yếm khí hoàn toàn. Vì vậy, trong quá trình nuôi cấy, vấn đề quan trọng là phải tạo được môi trường yếm khí thích hợp thì vi khuẩn mới có khả năng phát triển được. - Trên môi trường thạch máu: hình thành các khuẩn lạc tròn, trơn, sáng, bao quanh bởi 1 vùng dung huyết kép (double haemolysis). - Khi nuôi cấy vào môi trường sữa quỳ (Litmus milk medium): vi khuẩn phát triển tạo thành dạng vẩn mây điển hình do đường lactose trong môi trường bị lên men, tạo ra acid, làm đông vón casein và làm chuyển màu môi trường, từ màu xanh da trời thành màu hồng. Sau đó thì các đám vẩn acid đó bị vỡ, nứt ra do sự hình thành hơi. - Trên môi trường lòng đỏ trứng: vi khuẩn phát triển, làm phân hủy chất lecithin trong môi trường, tạo ra 1 vùng màu trắng đục ở quanh đường cấy vi khuẩn. - 30 - - Phản ứng CAMP: Khi nuôi cấy vi khuẩn C. perfringens và S. agalactiae trên môi trường thạch máu thành 1 đường vuông góc thì các khuẩn lạc của S. agalactiae sản sinh ra yếu tố có khả năng khuếch tán sẽ làm rõ hơn vùng dung huyết không hoàn toàn tạo ra bởi độc tố alpha của C. perfringens. 1.3.2.2. Đặc tính sinh vật hoá học Vi khuẩn C. perfringens lên men đường glucose, lactose, sucrose, maltose, fructose, mannose, không lên men đường arabinose, xylose. Phản ứng catalase và oxidase âm tính. Phản ứng Indol âm tính. 1.3.2.3. Cơ chế gây bệnh Vi khuẩn C. perfringens cã trong hệ vi sinh vật đường ruột bình thường của động vật và người. Vì vậy thường có 2 yếu tố gây nên bệnh tiêu chảy ở gia súc: thứ nhất do vi khuẩn sẵn có trong đường ruột, thứ hai là do thøc ăn bị nhiễm khuẩn C. perfringens, cùng với một số thay đổi đột ngột về môi trường, khẩu phần thức ăn, thức ăn chứa nhiều protein hoặc do lao t¸c quá mức… dẫn tới cơ thể bị giảm nhu động ruột, giữ lại vi khuẩn trong cơ thể và cuối cùng thì cơ thể hấp thu các độc tố gây bệnh. Cacbon hydrat không tiêu hoá được là môi trường thuận lợi cho vi khuẩn C. perfringens sinh trưởng và phát triển nhanh chóng. Bình thường, vi khuẩn này có nhiều ở ruột già nhưng khi sức đề kháng của cơ thể giảm, vi khuẩn lại xâm nhập lên ruột non và sản sinh ra một lượng lớn độc tố, gây nhiễm độc huyết đường ruột. Trong đường tiêu hoá, với sự bội nhiễm về số lượng, vi khuẩn C. perfringens tấn công vào lớp màng nhày rồi vào lớp biểu mô ruột, dưới tác dụng của độc tố gây xuất huyết, hoại tử tổ chức nhung mao ruột, từ đó lan dần vào sâu tới các lớp niêm mạc ruột. Trong nhiều trường hợp, vi khuẩn xâm nhập sâu vào thành ruột tạo thành những ổ viêm nhiễm, gây khí thũng dưới lớp niêm mạc hoặc lớp cơ hay đi sâu vào trong các tổ chức hay các hạch lympho lân cận. Trong thực tế - 31 - những phát hiện này có ý nghĩa rất quan trọng trong nghiên cứu sản suất giải độc tố để phòng bệnh (Quinn và cs, 1994 [87]). C. perfringens typ C có thể phân lập được trong chất chứa đường ruột của động vật khoẻ. Theo kết quả kiêm tra vi khuẩn học, các mẫu phân lấy từ loài động vật trâu bò, cừu, lợn và gia cầm có thể phát hiện được C. perfringens cũng dễ dàng tìm thấy loài vi khuẩn này trong thức ăn, dụng cụ chăn nuôi, môi trường xung quanh chuồng trại gia súc trong đất và nguồn nước. Ở Việt Nam, theo giáo sư Đào Trọng Đạt và các tác giả như Trần Thị Hạnh, Đặng Phương Kiệt, 1998[12] cũng đã chứng minh được điều đó. 1.3.2.4. Khả năng mẫn cảm với kháng sinh Cũng như vi khuẩn E. coli, vi khuẩn C. perfringens cũng kháng với nhiều loại kháng sinh mà nguyên nhân là do trong quá trình chăn nuôi, trong điều trị bệnh còn có nhiều thiếu sót về kỹ thuật như: dùng không đúng liều lượng, không đủ thời gian... và khả năng di truyền tính kháng thuốc giữa vi khuẩn với nhau. Sử dụng Neomycin, Trimethoprim và Sulfamethoxazol để điều trị có kết quả tốt (Eisenstein và cs,1980 [72]). Có rất nhiều loại kháng sinh sử dụng điều trị bệnh hiệu quả như Ampicillin, Cefalothin, Gentamicin, Neomycin... ngoài ra một số chế phẩm như Sulfamid cũng được sử dụng để điều trị (Đào Trọng Đạt và cs, 1996[11]). Theo Becht, 1986 [69] tác giả khuyến cáo nên sử dụng phối hợp Ampicillin, Trimethoprim và Sulfamethoxazol hoặc Cefalothin và Gentamicin, Amikacin và Arpamycin. 1.3.2.5. Vai trò của vi khuẩn C. perfringens trong hội chứng tiêu chảy Vi khuẩn C. perfringens thuộc họ vi khuẩn đường ruột, gồm nhiều chủng, các chủng này sản sinh ra các loại độc tố khác nhau và có thể nhận biết - 32 - được qua các phản ứng trung hoà độc tố. Căn cứ vào sự sản sinh ra các loại độc tố và cấu trúc kháng nguyên, người ta phân vi khuẩn này ra làm 5 typ: A, B, C, và E (Carter R.G, Chengappa M.M, Roberts A.W, 1995 [112]; Taylor D.G Bergeland M.E, 1992[167]; Damme- Jongsten M- van; Haagsma J, Norterman S, 1990 [115]). Dẫn theo Nguyễn Bá Hiên, (2001)[18]. C. perfringens typ A được phân lập từ ruột lợn trong nhiều năm và được xem như một trong những vi sinh vật bình thường trong đường tiêu hoá của người và động vật (Manson và Smith, 1962- Radostits O.M; Blood D.C and Gay C.C, 1994[149]. Dẫn theo Nguyễn Bá Hiên, (2001)[18] Typ A có công thức kháng nguyên , ,,,  ,, với độc tố chủ yếu là  . Vi khuẩn này phổ biến trong thiên nhiên: đất, cát, không khí, nước hồ, sông, suối và cũng có thể tìm thấy chúng ở rau, sữa, fomat, đồ hộp và thịt tươi… . Vi khuẩn C. perfringens typ A thường gây viêm ruột xuất huyết cho bê, thỏ (Nguyễn Vĩnh Phước, 1974[38]; Nguyễn như Thanh, Nguyễn Bá Hiên, Trần Lan Hương, 1997[55], viêm ruột ở cả lợn mới sinh và lợn lớn hơn trong giai đoạn cai sữa. Ở người, cừu và ngựa, chúng gây trúng độc, viêm ruột tiêu chảy do thức ăn bị ô nhiễm (Carter G.R, Chengappa M.M, Roberts A.W, 1995[68]). Trong số 5 typ huyết thanh của C. perfringens, typ C là một typ phân bố rộng rãi và quan trọng nhất, đặc biệt nhất ở lợn (Roeder B. L, Chengappa M.M. And Nagaraja T. G, 1987 [89]). Viêm ruột hoại tử ở lợn con do C. perfringens typ C được coi là một bệnh quan trọng ở lợn. Những trường hợp mắc bệnh đầu tiên đã được mô tả ở Hungari, Anh (Detrer, 1927) và Đan Mạch (Hogh, 1974). Các tác giả đã cho rằng bệnh đã xảy ra ở lợn con từ cuối những năm 20 của thế kỷ khi mà nguyên nhân bệnh do C. perfringens ở cừu được phát hiện. - 33 - 1.4. TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH TRÊN ĐÀN LỢN CỦA TỈNH HƢNG YÊN 1.4.1. Một số đặc điểm tự nhiên ảnh hƣởng đến bệnh tiêu chảy của lợn Hưng Yên là tỉnh đồng bằng thuộc vùng tả ngạn sông Hồng, cách thủ đô Hà Nội 64 km về phía Tây, có vị trí địa lý tiếp giáp với 6 tỉnh thành trong cả nước: Bắc Ninh, Hải Dương, Thái Bình, Hà Nam, Hà Tây và Hà Nội. - Nhiệt độ: theo số liệu thống kê cho thấy nhiệt độ trung bình trong tháng là 24,7 o C, thấp vào các tháng 1, 2 và 12, cao vào các tháng 6, 7, 8 hàng năm. - Số giờ nắng trung bình trong năm là: 1.413 giờ, cao vào tháng 5, 6, 7 và thấp vào tháng 1, 2, 3. - Lượng mưa trung bình trong năm vào khoảng 1.070 mm, cao vào các tháng 7, 8, 9 và thấp vào các tháng 1, 10, 11, 12. Số giờ mưa trong năm trung bình là 1.296 giờ. - Độ ẩm trung bình trong năm là 86%, sự chênh lệch ẩm độ giữa các tháng trong năm là không lớn. Đặc điểm địa hình và khí hậu ở tỉnh Hưng Yên có nền khí hậu thuận lợi cho sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật, trong đó có tác động đáng kể đến tình hình dịch bệnh trên đàn lợn, đặc biệt là bệnh tiêu chảy. 1.4.2. Vài nét về tình hình dịch bệnh trên đàn lợn của tỉnh Hƣng Yên Tình hình dịch bệnh trên đàn lợn Hưng Yên những năm qua diễn biến khá phức tạp và đã gây tổn thất khá lớn cho sự phát triển của ngành chăn nuôi. Theo tổng hợp các báo cáo của Chi cục Thú y tỉnh Hưng Yên [3] trong 3 năm (từ năm 2005 đến năm 2007) cho thấy dịch bệnh trên đàn lợn: - Trong năm 2005, đàn lợn thường mắc các bệnh chủ yếu là: bệnh tiêu chảy, bệnh viêm phổi, bệnh phù đầu do E.coli ở lợn con, tụ huyết trùng, phó thương hàn, dịch tả, bệnh đậu, cảm nóng v..v. Theo các báo cáo của trạm thú y các huyện, thị xã tổng số lợn mắc bệnh là : 45.300 con, chiếm 7,5% so với - 34 - tổng đàn, đã chết và xử lý giết mổ là 7.718 con, chiếm 1,29% so với tổng đàn, tăng 3.822 con so với năm 2004. - Trong năm 2006, đàn lợn thường mắc bệnh nhiễm khuẩn thông thường như: Hội chứng tiêu chảy, tiêu chảy do E. coli, Salmonella, cầu trùng, viêm phổi do Mycoplasma. Các trường hợp mắc bệnh chủ yếu xảy ra ở những hộ chăn nuôi nhỏ lẻ, kém vệ sinh, mật độ nuôi không hợp lý..v..v..Trong năm toàn tỉnh có 39.547 con lợn mắc bệnh, chết và xử lý giết mổ 5.203 con. - Trong năm 2007, đàn lợn thường mắc các bệnh như: tiêu chảy, phù đầu do E. coli, viêm phổi, tụ huyết trùng, phó thương hàn. Toàn tỉnh có 32.891 lợn mắc bệnh, chết và xử lý giết mổ 1.385 con. Cuối tháng 3 năm 2007, hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn đã xảy ra ở 59 xã với tổng số lợn ốm là 6.132 con (trong đó có: 1.195 lợn nái và đực giống; 2.423 lợn con theo mẹ và 2.514 lợn thịt); đã chết và xử lý giết mổ là: 1.246 con (trong đó có: 221 nái và đực giống; 756 lợn con theo mẹ; 269 lợn thịt). - 35 - Chƣơng 2 ĐỐI TƢỢNG, NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƢỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu Lợn từ sơ sinh ®Õn 60 ngày tuổi nuôi tại 1 số huyện của tỉnh Hưng Yên 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu - Địa bàn nghiên cứu: các trang trại, hộ gia đình tại các huyện Ân Thi, Khoái Châu và thị xã Hưng Yên, thuộc tỉnh Hưng Yên. - Địa điểm xét nghiệm mẫu: Bộ môn vi trùng, Viện Thú y Quốc gia. 2.1.3. Thời gian nghiên cứu - Từ tháng 10/2007 đến tháng 4/2008 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.2.1. Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ hội chứng tiêu chảy ở lợn từ sơ sinh đến 60 ngày tuổi tại tỉnh Hƣng Yên 2.2.1.1. Tỷ lệ lợn tiêu chảy và chết do tiêu chảy tại 3 huyện. 2.2.1.2. Tỷ lệ lợn mắc tiêu chảy và chết do tiêu chảy theo ph•ơng thức chăn nuôi 2.2.1.3. Tỷ lệ lợn mắc tiêu chảy và chết do tiêu chảy theo lứa tuổi 2.2.1.4. Tỷ lệ lợn mắc tiêu chảy và chết do tiêu chảy theo mùa vụ trong năm 2.2.1.5. Triệu chứng, bệnh tích của lợn tiêu chảy 2.2.2. Kết quả xác định vai trò của vi khuẩn E. coli và C. perfringens trong hội chứng tiêu chảy ở lợn 2.2.2.1. Phân lập, xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn từ các mẫu bệnh phẩm và phân lợn tiêu chảy - 36 - 2.2.2.2. Xác định số lượng vi khuẩn E. coli và C. perfringens trong phân lợn tiêu chảy và lợn bình thường 2.2.2.3. Giám định đặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn phân lập được. 2.2.2.4. Xác định serotyp của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được. 2.2.2.5. Xác định các yếu tố gây bệnh (độc tố và yếu tố bám dính) của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được. 2.2.2.6. Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn E. coli và C. Perfringens phân lập được trên chuột bạch. 2.2.2.7. Xác định tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn E. Coli và C. Perfringens phân lập được. 2.2.3. Thử nghiệm phác đồ điều trị tiêu chảy cho lợn 2.3. NGUYÊN LIỆU DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU 2.3.1. Mẫu bệnh phẩm - Mẫu bệnh phẩm là phủ tạng gồm: gan, lách, ruột của lợn từ sơ sinh đến 60 ngày tuổi mắc bệnh tiêu chảy vừa chết hoặc sắp chết. - Mẫu phân lợn tiêu chảy được lấy bằng tăm bông vô trùng ngoáy sâu vào trực tràng. 2.3.2. Các loại môi trƣờng, hoá chất - Các loại môi trường dùng cho phân lập, nuôi cấy vi khuẩn đường ruột, bao gồm: thạch máu, thạch MacConkey, nước thịt BHI, nước thịt thường, nước thịt pepton, và các loại môi trường đường Glucose, Lactose, Mannitol... do hãng Oxoid của Anh sản xuất. - Các loại giấy tẩm kháng sinh của hãng Oxoid (Anh). - Kháng huyết thanh chuẩn của Úc dùng định typ vi khuẩn E. coli phân lập được - 37 - - Các hoá chất và dụng cụ phòng thí nghiệm khác dùng trong nghiên cứu vi khuẩn. 2.3.3. Động vật thí nghiệm - Chuột bạch khoẻ mạnh, có trọng lượng trung bình 18 - 20 g/con. 2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.4.1. Phƣơng pháp nghiên cứu dịch tễ Sử dụng phương pháp nghiên cứu dịch tễ học mô tả (Descriptive study) dịch tễ học phân tích (Analytic study) và dịch tễ học thực nghiệm (Nguyễn Nh• Thanh, 2001 [61], Nguyễn Văn Thiện, 1997 [54]). 2.4.1.1. Chọn mẫu điều tra Chọn mẫu theo phương pháp ngẫu nhiên, mẫu chùm nhiều bậc. Chọn ngẫu nhiên mỗi huyện 3 xã; mỗi xã ngẫu nhiên chọn 3 thôn; trong thôn điều tra các hộ chăn nuôi lợn sinh sản và lợn thịt. - Số huyện được điều tra: 3; số xã là: 9; số thôn, khu là: 27. - Số lần điều tra: 4 lần theo các mùa trong năm 2007. - Số hộ: 1.637 hộ. - Số lợn được điều tra: 36.599 con. 2.4.1.2. Phương pháp thực hiện - Trực tiếp quan sát để phát hiện lợn tiêu chảy. Những lợn phân lỏng được coi là bị tiêu chảy (loại trừ những lợn bị bệnh truyền nhiễm có triệu chứng tiêu chảy). - Phỏng vấn chủ hộ chăn nuôi về những thông tin cần thiết. - Thông tin điều tra được ghi vào các phiếu điều tra. 2.4.1.3. Nội dung điều tra, theo dõi - Số lợn mắc tiêu chảy và chết do tiêu chảy tại các hộ, các trang trại chăn nuôi. - Các triệu chứng thường gặp ở lợn mắc tiêu chảy. - 38 - - Các bệnh tích ở lợn mắc tiêu chảy khi tiến hành mổ khám, lấy mẫu bệnh phẩm. - Phương thức chăn nuôi và việc thực hiện vệ sinh chuồng trại. 2.4.1.4. Các chỉ tiêu theo dõi trong dịch tễ Số lợn tiêu chảy - Tỷ lệ lợn tiêu chảy (%) = x 100 Tổng số lợn điều tra Số lợn tiêu chảy theo từng độ tuổi - Tỷ lệ lợn tiêu chảy theo độ tuổi (%) = x 100 Tổng số lợn điều tra Số lợn chết do tiêu chảy - Tỷ lệ lợn chết do tiêu chảy (%) = x 100 Tổng số lợn mắc tiêu chảy 2.4.2. Thu thập mẫu và phân lập vi khuẩn 2.4.2.1. Thu thập mẫu - Mẫu phân phân lập vi khuẩn: Dùng tăm bông vô trùng ngoáy sâu vào trực tràng lợn mắc tiêu chảy và chưa dùng thuốc (kháng sinh) điều trị. Khi toàn bộ tăm bông thấm ướt phân lợn, lấy ra, cho ngay vào týp, vặn chặt, ghi ký hiệu mẫu. - Mẫu phân để đếm số lượng vi khuẩn: lấy khoảng 2-3 g phân từ hậu môn của các lợn mắc tiêu chảy vào 1 túi nilon sạch, ghi ký hiệu mẫu - 39 - - Mẫu bệnh phẩm gồm: lách, gan, chất chứa ruột non của lợn tiêu chảy. - Tất cả các mẫu, sau khi lấy đều được bảo quản trong điều kiện lạnh 4 o C theo quy trình bảo quản mẫu của Bộ môn Vi trùng, Viện thú Y và được vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm để tiến hành các xét nghiệm tiếp theo. 2.4.2.2. Phân lập và giám định vi khuẩn Các phương pháp nuôi cấy và giám định vi khuẩn được thực hiện theo quy trình nghiên cứu thường quy của Bộ môn Vi trùng, Viện Thú Y. - 40 - Lactose + Lactose - Oxidase âm tính Thạch máu Thạch MacConkey Thạch máu yếm khí E. coli K. pneumoniae Enterobacter aerogenes Salmonella Edwardsiella Proteus Thạch DHL Thạch BG Nước thịt PBW Thạch DHL Thạch BG 37oC/24- 48h/hiếu khí 37oC/24- 48h/hiếu khí Salmonella R/Y/H2S+ Mọc trên thạch MacConkey Trực khuẩn Gram âm KL đen trên DHL KL đỏ trên BG Enterobacteriaceae TSI Dung huyết Trực khuẩn Gram dương 37oC/24-48h/ yếm khí C. perfringens Lên men đường Lên men đường Lên men đường Mẫu (phủ tạng, phân, chất chứa) - 41 - Sơ đồ 2.1: Quy trình phân lập vi khuẩn đƣờng ruột (Bộ môn Vi trùng - Viện Thú Y) 2.4.3. Xác định số lƣợng vi khuẩn E. coli và C. perfringens trong 1 g phân của lợn tiêu chảy hoặc bình thƣờng Mẫu là 1 g phân của lợn bị tiêu chảy hoặc bình thường, được pha loãng trong dung dịch PBS thành các nồng độ 10 -1 , 10 -2 , …, 10 -8 . Lấy 0,1 ml dung dịch ở các nồng độ đã pha loãng 10 -6 , 10 -7 , 10 -8 nhỏ và dàn đều trên bề mặt thạch MacConkey, và thạch yếm khí. Bồi dưỡng ở 37 o C trong điều kiện hiếu khí hoặc yếm khí trong vòng 24 giờ. Mỗi nồng độ pha loãng dùng 3 đĩa thạch. Đếm số khuẩn lạc E. coli và C. perfringens mọc trên đĩa thạch, rồi tính trung bình cho mỗi nồng độ. Số lượng vi khuẩn được tính theo công thức: X = 10 x a x b Trong đó: X: là tổng số lượng vi khuẩn có trong 1 g phân hoặc chất chứa. a: là số lượng vi khuẩn trung bình của 1 nồng độ pha loãng. b: là hệ số pha loãng mẫu Hệ số 10: vì cấy 0,1 ml 2.4.4. Xác định serotyp kháng nguyên O của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập đƣợc bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính Vi khuẩn E. coli có nhiều serotyp O khác nhau, do vậy bước quan trọng đầu tiên là xác định được nhóm serotyp O, sau đó tiến hành các phản ứng ngưng kết với các kháng huyết thanh đơn giá trong nhóm cần xác định. Những nguyên liệu cơ bản cho việc xác định serotyp gồm: + Các chủng E. coli cần định typ được giữ trên thạch máu. - 42 - + Các kháng huyết thanh O chuẩn (đa giá và đơn giá). * Phương pháp tiến hành phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính như sau: Nhỏ lên 2 đầu lam kính sạch, mỗi đầu một giọt nước muối sinh lý, dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc E. coli cần xác định trên môi trường thạch máu trộn đều với 2 giọt nước muối sinh lý thành huyễn dịch vi khuẩn. Nhỏ một giọt kháng huyết thanh chuẩn vào một bên huyễn dịch và một giọt nước muối sinh lý vào bên huyễn dịch còn lại (Đối chứng). Nếu có phản ứng ngưng kết sẽ xuất hiện sau 1 phút. + Phản ứng dương tính khi hình thành ngưng kết giữa kháng nguyên là vi khuẩn với kháng huyết thanh, tạo thành những hạt nhỏ trắng lấm tấm, huyễn dịch tách ra làm 2 phần là các hạt ngưng kết và phần nước trong. Với phản ứng ngưng kết xảy ra nhanh, rõ rệt thì được đánh giá mức ++++. Tuỳ theo khả năng ngưng kết để có thể đánh giá mức ngưng kết ở các mức độ khác nhau +, ++, +++. + Phản ứng là âm tính khi hỗn dịch vi khuẩn với kháng huyết thanh đục đều như bên đối chứng. * Với những chủng có ngưng kết với kháng huyết thanh nhóm, tiếp tục thực hiện như vậy với các kháng huyết thanh đơn giá thuộc nhóm để xác định rõ từng serotyp. Trong trường hợp các chủng có hiện tượng ngưng kết chéo với nhiều nhóm hoặc ngưng kết với nhiều đơn giá khác nhau, thì phải pha loãng kháng huyết thanh theo cấp số 2, kết quả sẽ lấy ngưng kết ở cấp số pha loãng cao nhất. 2.4.5. Phƣơng pháp xác định các yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập đƣợc 2.4.5.1. Xác định khả năng dung huyết - 43 - Vi khuẩn E. coli phân lập được cấy trực tiếp lên môi trường thạch máu cừu, bồi dưỡng ở 37 o C/24 giờ. Căn cứ vào mức độ dung huyết để đánh giá kiểu dung huyết: - Dung huyết  là dạng dung huyết mờ, không hoàn toàn. - Dung huyết  là dạng dung huyết trong hoàn toàn. - Không dung huyết hay dung huyết . 2.4.5.2. Xác định các yếu tố gây bệnh (độc tố và yếu tố bám dính) của vi khuẩn: bằng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction). * Cách tiến hành: - DNA mẫu: Khuẩn lạc vi khuẩn E. coli mọc trên môi trường thạch máu ở 37 o C/24h. - Hỗn hợp phản ứng PCR: gồm Primers: 1 l mỗi loại Dung dịch đệm (5X): 5.0 l Enzyme (Taq polymerase): 0.05 l Nước khử ion vừa đủ để đạt được thể tích cuối cùng là 25 l cho 1 phản ứng. - Chu trình của phản ứng PCR: Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước và được thực hiện trong máy nhân gen tự động Perkin Elmer, theo sơ đồ sau: Loại yếu tố gây bệnh cần xác ®Þnh Chu trình thứ nhất 30 chu trình tiếp theo Chu trình cuối Biến tính ( o C/phút) Biến tính ( o C/phút) Gắn mồi ( o C/phút) Tổng hợp ( o C/phút) Tổng hợp ( o C/phút) - 44 - STa, STb, LT, F4 94/5 94/1 55/1 72/1 72/7 VT2e, F18 94/5 94/1 50/1 72/1 72/7 - Chạy điện di: Sản phẩm PCR thu được sau chu trình phản ứng được nhuộm bằng chất nhuộm nhỏ mẫu (loading dye) với mẫu theo tỷ lệ 1: 5. Sau khi nhuộm, sản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch agarose 2% trong dung dịch đệm TAE (Tris - agartate - EDTA) với hiệu điện thế 100V trong vòng 40 phút. Đây là cách để cho các đoạn acid nucleic hiển thị trực tiếp. Phương pháp này dựa trên nguyên lý là các phân tử acid nucleic trong môi trường pH trung tính thì tích điện âm nhờ các nhóm phốt phát nằm trên khung phosphodiester của các sợi nucleic. Khi đặt chúng vào điện trường, các phân tử acid nucleic sẽ chuyển dịch về cực dương. Khi tiến hành phân tích trên thạch agarose, các phân tử acid nucleic tùy theo kích thước sẽ chuyển dịch với tốc độ khác nhau: loại phân tử có kích thước lớn chạy chậm, loại có kích thước bé chuyển dịch nhanh hơn. - Nhuộm: Gel thạch sau khi chạy điện di được nhuộm màu bằng chất nhuộm màu huỳnh quang ethidium bromide (BEt 1l/ml) trong vòng 15 phút. BEt là một loại chất nhuộm huỳnh quang, phân tử của nó chui vào liên kết giữa các bazơ. Vị trí cố định của các nhóm có khoảng cách gần với bazơ, tạo ra một lượng huỳnh quang lớn hơn rất nhiều so với các phân tử BEt tự do. - Đọc kết quả: bằng cách quan sát dưới ánh đèn UV (300nm) và chụp ảnh bằng hệ thống GelDoc. Trên ảnh chụp nền đen, các đoạn axit nucleic hiện lên ở dạng băng màu trắng và có thể chụp ảnh được và ghi nhận lại. Kích thước các băng DNA được so sánh với DNA chuẩn (DNA marker), được cho vào cùng lúc với sản phẩm PCR ở một giếng riêng biệt, cạnh các giếng dùng phát hiện các sản phẩm PCR. Nhờ chỉ thị dây chuyền này mà người ta có thể xác định được độ dài của đoạn sản phẩm PCR. - 45 - 2.4.6. Kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn phân lập trên chuột bạch Để xác định độc lực của các vi khuẩn gây bệnh, có thể thực hiện bằng phương pháp tiêm truyền qua động vật thí nghiệm. Các bước thực hiện như sau: Canh trùng BHI/37 o C/24 giờ đối với vi khuẩn E. coli và chất dịch đã qua lọc của nước thịt gan yếm khí/37 o C/24 giờ đối với vi khuẩn C. perfringens được tiêm vào phúc xoang cho các chuột bạch khỏe mạnh. Mỗi chủng dùng 2 chuột. Theo dõi thời gian chuột chết, số chuột chết trong vòng 7 ngày. Căn cứ vào số lượng chuột chết, giờ chuột chết bình quân của mỗi lô để đánh giá độc lực của vi khuẩn. Mổ khám, phân lập vi khuẩn từ máu tim của các chuột chết. 2.4.7. Xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được kiểm tra bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch và đánh giá kết quả theo Hội đồng quốc gia Hoa Kỳ về các tiêu chuẩn lâm sàng phòng thí nghiệm (NCCLS) (1999) [82]. * Phương pháp tiến hành như sau: Bảng 2.1: Tiêu chuẩn đánh giá mức độ mẫn cảm và kháng kháng sinh theo NCCLS (1999) Kháng sinh Vòng vô khuẩn (đƣờng kính mm) Kháng Mẫn cảm trung bình Mẫn cảm Trimethoprim-Sulphamethoxazole < 10 11 - 15 ≥16 Streptomycin < 11 12 - 14  15 Gentamicin < 12 13 - 17  18 - 46 - Neomycin < 12 13 - 14  15 Cephalothin (KF 30) < 14 15 - 17 18 Amikacin (AK30) < 14 15 - 16 17 Apramycin (APR 15) < 10 11 - 14 15 Ceftiofur (EFT 30) < 17 18 - 20 21 Lincospectinomycin < 10 11 - 13 14 Enrofloxacin (Batril) < 16 17 - 19 20 Ampicillin < 11 12 - 14  15 Tetracyclin < 14 15 - 18  19 - Bước 1: Chuẩn bị môi trường thạch đĩa Muller Hinton. - Bước 2: Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường thạch máu ở 37 o C. Lấy 1 khuẩn lạc, hoà vào 1,5 ml nước sinh lý để đạt được độ đục 0,5 trong dãy so màu McFarland. Dùng tăm bông vô trùng, tẩm dung dịch đã pha loãng và dàn đều lên thạch đĩa Muller Hinton. - Bước 3: Dùng máy tự động đặt các khoanh giấy tẩm kháng sinh của hãng Oxoid (Anh) lên mặt đĩa thạch. - Bước 4: Bồi dưỡng đĩa thạch ở 37 o C/18 - 24 giờ. Đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn và so sánh với bảng chuẩn để đánh giá mức độ mẫn cảm hay kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn kiểm tra. 2.4.8. Thử nghiệm một số phác đồ điều trị tiêu chảy cho lợn Từ kết quả xác định khả năng mẫn cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được, chúng tôi đã tiến hành lựa chọn một số phác đồ để điều trị thử nghiệm cho các lợn bị tiêu chảy. Để đánh giá được hiệu quả - 47 - một cách khách quan, các phác đồ được thực hiện có sự đồng đều tương đối về các tiêu chí cơ bản sau: - Số lợn tiêu chảy ở cùng một địa phương được phân ra làm 2 lô tương ứng với 2 phác đồ điều trị bệnh. - Số lần và ngày điều trị bệnh được dùng đồng đều trong các phác đồ. - Đánh giá hiệu quả của các phác đồ điều trị căn cứ vào sự ổn định dần trạng thái phân, tình trạng ăn, uống... sau 4 - 7 ngày, kể từ khi dùng thuốc. 2.4.9. Phƣơng pháp xử lý số liệu Số liệu thu thập được xử lý theo phương pháp nghiên cứu trong chăn nuôi của Nguyễn Văn Thiện và cs (2002) [58], sử dụng phần mềm của chương trình Excel. Các tham số cơ bản: - Giá trị trung bình : + Trường hợp mẫu < 30: n x X i   (với n từ 1 đến i). + Trường hợp mẫu > 30 : n S KAX i0  - Độ lệch tiêu chuẩn : 1 )( 2       n xx xS - Sai số của số trung bình: + Trường hợp mẫu < 30: 1    n s m x x + Trường hợp mẫu > 30: n S m x x    - 48 - - Tính sai số cho tính trạng định tính: n qp mm qp .  (với q = 1 - p). - So sánh sự sai khác giữa các lô thí nghiệm: 2 2 2 1 21 xx TN mm XX t     - 49 - Chƣơng 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỘI CHỨNG TIÊU CHẢY Ở LỢN TỪ SƠ SINH ĐẾN 60 NGÀY TUỔI TẠI HƢNG YÊN 3.1.1. Tỷ lệ lợn tiêu chảy và chết do tiêu chảy tại một số huyện thuộc tỉnh Hƣng Yên Lợn trong giai đoạn từ sơ sinh đến 60 ngày tuổi, các hệ cơ quan trong cơ thể của lợn chưa hoàn thiện. Hệ tiêu hoá chưa có men Pepsin, khả năng tiết dịch vị chậm nên rất dễ bị nhiễm khuẩn qua đường tiêu hoá. Khả năng điều tiết thân nhiệt kém do lớp mỡ duới da còn mỏng, nên lợn con rất dễ bị tác động bởi các yếu tố nhiệt độ và ẩm độ. Hệ miễn dịch chưa hoàn thiện, lúc mới đẻ ra trong huyết thanh lợn hầu như chưa có kháng thể, lượng kháng thể được tăng nhanh khi lợn con được bú sữa đầu, nên khả năng miễn dịch của lợn con là thụ động, phụ thuộc hoàn toàn vào lượng kháng thể nhận được từ mẹ qua sữa đầu. Các yếu tố khí hậu, thời tiết, điều kiện chuồng trại, kỹ thuật, chăm sóc, nuôi dưỡng, chất lượng thức ăn của lợn mẹ là các yếu tố stress tác động vào nhóm lợn ở lứa tuổi này. Để đánh giá được tình hình tiêu chảy ở lợn từ sơ sinh đến 60 ngày tuổi nuôi tại Hưng Yên, chúng tôi đã phối hợp với trạm thú y chọn 2 huyện và 1 thị xã. Trong mỗi huyện, chọn 3 xã có chăn nuôi lợn nái sinh sản (qui mô gia đình và trang trại) điều tra tình hình tiêu chảy của lợn từ sơ sinh đến 60 ngày tuổi. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1 và minh họa ở biểu đồ 3.1 . - 50 - Bảng 3.1. Tỷ lệ lợn tiêu chảy và chết do tiêu chảy tại một số huyện HuyÖn Tổng số lợn điều tra (con) Tỷ lệ lợn tiêu chảy Tỷ lệ lợn chết do tiêu chảy Số lƣợng (con) Tỷ lệ (%) Số lƣợng (con) Tỷ lệ (%) Ân Thi 9.753 2.973 30,48 186 6,25 Thị xã Hưng Yên 11.861 3.981 33,60 181 5,54 Khoái Châu 14.985 4.136 27,60 196 4,73 Tính chung 36.599 11.090 30,30 563 5,07 Biểu đồ 3.1: Tỷ lệ lợn tiêu chảy và chết do tiêu chảy tại một số huyện Héi chøng tiêu chảy ở lợn sơ sinh đến 60 ngày tuổi xuất hiện ở tất cả các huyện, thị xã trên địa bàn của tỉnh Hưng Yên. Tỷ lệ tiêu chảy ở lợn từ sơ sinh đến 60 ngày tuổi mắc bệnh là khá cao, trung bình là 30,30% và ít nhiều có sự chênh lệch giữa các huyện. Trong đó, nơi có tỷ lệ lợn mắc tiêu chảy cao nhất là Thị xã Hưng Yên với tỷ lệ là 33,60% và thấp nhất là tại huyện Khoái 0 5 10 15 20 25 30 35 Ân Thi Thị xã Hưng Yên Khoái Châu 30.48 33.6 27.6 6.25 5.54 4.73 Huyện Tỷ lệ (%) Tỷ lệ lợn tiêu chảy Tỷ lệ lợn chết do tiêu chảy - 51 - Châu (27,60%). Tại huyện Ân Thi, là nơi có tỷ lệ mắc tiêu chảy thấp hơn ở thị xã Hưng Yên, nhưng lại là nơi có tỷ lệ chết do tiêu chảy là cao nhất 6.25%. Do Ân Thi là một vùng trũng, chuồng trại chật hẹp, ẩm thấp, có tập quán chăn nuôi còn nghèo nàn lạc hậu, chăn nuôi chưa đưa vào qui mô trang trại, họ chỉ chăn nuôi với hình thức nhỏ lẻ nên khi lợn bị mắc bệnh tiêu chảy thì thường bị nặng và dẫn đến chết, nên tỷ lệ chết ở đây là cao hơn so với huyện Khoái Châu và Thị xã Hưng Yên. Với tỷ lệ mắc bệnh và chết cao như vậy cho thấy mức độ thiệt hại về kinh tế do bệnh gây ra cho chăn nuôi lợn nái sinh sản là rất nghiêm trọng và viÖc tìm các biện pháp phòng chống có hiệu quả bệnh này là rất cần thiết. Tuy nhiên, tỷ lệ chết do tiêu chảy phụ thuộc vào ngày tuổi mắc bệnh, sự theo dõi can thiệp và phát hiện kịp thời với thể bệnh của con vật. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi thấp hơn so với kết quả nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Nội (1985)[28] điều tra ở một số tỉnh miền Bắc thấy tỷ lệ nhiễm bệnh rất cao, lên tíi 95,4%. Cù Hữu Phú và cs (2003)[40] qua tiến hành điều tra tình hình lợn con giai đoạn còn đang bú sữa mẹ tại 05 trại chăn nuôi lợn sinh sản ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam cho thấy lợn bị mắc bệnh tiêu chảy với tỷ lệ trung bình là 28,36% và tỷ lệ lợn chết so với tổng số lợn điều tra là 4,45%. Theo Nguyễn Thị Ngữ (2005)[33] tại Hà Tây, lợn từ lứa tuổi 1- 60 ngày tuổi, tỷ lệ bị bệnh là 38,61%, tỷ lệ chết do tiêu chảy là 5,36%. Sự khác nhau về tỷ lệ lợn mắc bệnh và chết do tiêu chảy ở các huyện, thị xã trong nghiên cứu này ít nhiều có sự sai khác, có thể do thời điểm điều tra khác nhau, điều kiện, phương thức chăn nuôi, công tác phòng chống dịch bệnh ở mỗi vùng khác nhau. 3.1.2. Tỷ lệ lợn m¾c tiêu chảy và chết do tiêu chảy theo mùa vụ Bệnh tiêu chảy do nhiều nguyên nhân gây nên, trong đó tổ hợp các yếu tố khí hậu (nhiệt độ và độ ẩm không khí) đóng 1 vai trò quan trọng. Do đó việc tìm hiểu mối quan hệ giữa các yếu tố trên và bệnh này có ý nghĩa lớn trong công tác phòng chống bệnh. - 52 - Nhiệt độ lạnh và độ ẩm là yếu tố mẫn cảm quan trọng của lợn con theo mẹ, yếu tố stress này làm giảm sức đề kháng của lợn với các bệnh, kể cả E. coli. Độ ẩm không khí cao làm tăng sự lan truyền của các vi khuẩn gây bệnh. Để làm rõ ảnh hưởng của nhiệt độ và ẩm độ của các mùa trong năm 2007 đến tình hình mắc bệnh tiêu chảy của lợn từ sơ sinh đến 60 ngày tuổi trên địa bàn tỉnh Hưng Yên, chúng tôi đã tiến hành điều tra tỷ lệ lợn mắc tiêu chảy và chết do mùa vụ, kết quả được trình bày ở bảng 3.2 và biểu đồ 3.2. Bảng 3.2: Tỷ lệ lợn mắc tiêu chảy và chết theo mùa vụ Mùa vụ Tổng số lợn điều tra (con) Tỷ lệ lợn mắc tiêu chảy Tỷ lệ lợn chết do tiêu chảy Số lƣợng (con) Tỷ lệ (%) Số lƣợng (con) Tỷ lệ (%) Xu©n 7.819 1.719 21,98 173 10,06 HÌ 8.125 3.078 37,88 121 3,93 Thu 10.096 1.558 15,43 143 9,17 Đông 10.559 4.735 44,88 126 2,66 Tính chung 36.599 11.090 30,30 563 5,07 Biểu đổ 3.2: Tỷ lệ lợn mắc tiêu chảy và chết theo mùa vụ 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Xuân Hè Thu Đông 21.98 37.88 15.43 44.88 10.06 3.93 9.17 2.66 Mùa T ỷ lệ ( % ) Tỷ lệ lợn mắc tiêu chảy Tỷ lệ lợn chết do tiêu chảy - 53 - Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy: - Tỷ lệ lợn mắc tiêu chảy cao nhất là vào vụ đông (44,88%), cao hơn tỷ lệ chung là 1,48 lần (44,88% so với 30,30%) và thấp nhất vào vụ thu (15,43%), thấp hơn tỷ lệ chung là 1,96 lần (30,30% so với 15,43%). - Mùa xuân, khi thời tiết có những thay đổi mạnh, nhiệt độ thấp và sự chênh lệch giữa ngày và đêm cao (5-10 o C), về đêm nhiệt độ xuống rất thấp, ban ngày trời âm u, số giờ nắng ít, mưa phùn kéo dài làm cho độ ẩm luôn luôn cao. Số lợn bị tiêu chảy trong thời gian này là rất cao (1.719 con), chiếm tỷ lệ 21,98% với tỷ lệ chết là cao nhất (10,06%) so với các mùa còn lại. - Tỷ lệ mắc bệnh thấp nhất là vào mùa thu, có 1.558 con mắc bệnh (chiếm tỷ lệ 15,43%), với 143 con chết (9,17%). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với 1 số nghiên cứu của các tác giả khác đã công bố trước đây như nghiên cứu của Đào Trọng Đạt và cs (1996)[11], Phạm Khắc Hiếu (1998)[17]. Các tác giả này đã kết luận: lạnh và ẩm là 2 yếu tố tác động mạnh đến sức khoẻ vật nuôi, trong đó lợn sơ sinh và lợn con theo mẹ là đối tượng bị tác động mạnh nhất. Nghiên cứu của Hoàng Văn Tuấn và cs (1998) [58] cho rằng, tỷ lệ lợn mắc tiêu chảy cao nhất vào tháng 5 - 8 (tức là vào vụ hè), còn Nguyễn Thị Kim Lan và cs (2006b) [25] thì kết luận: lợn nuôi vào mùa xuân và mùa hè mắc tiêu chảy cao hơn so với hai mùa còn lại. Theo kết quả của nghiên cứu này thì mùa đông và mùa hè có tỷ lệ lợn mắc tiêu chảy cao hơn hẳn. Sở dĩ có kết quả như vậy, theo chúng tôi là do đặc điểm khí hậu thời tiết của các vùng có sự khác nhau. Tại Hưng Yên, vụ đông có nhiệt độ trung bình và số giờ nắng thấp nhất trong năm, đặc biệt vào tháng 1 (dao động từ 15,7 - 15,9 o C), đây cũng là thời gian có những đợt rét kéo dài, kèm theo mưa phùn. Mùa hè thì nhiệt độ lại cao nhất trong năm, đặc biệt là vào các tháng 6, 7, nhiệt độ trung bình có khi lên đến trên 30 o C. Đồng thời, cũng vào thời gian này thường có mưa rào đột ngột (sáng nắng, chiều mưa), tạo bầu không khí oi bức. Tất cả - 54 - các yếu tố này đã tác động, gây hiệu ứng stress cho lợn, nhất là lợn vừa mới cai sữa. Với vụ xuân, khi đó trời đã ấm dần lên, nhiệt độ tăng đáng kể và sự thay đổi của thời tiết ít có sự đột biến gây stress. Vụ thu, thời tiết ôn hoà hơn và đặc biệt vào thời gian này, thời tiết khô (ẩm độ không khí thấp) và ổn định nhất trong năm. Vì vậy, tỷ lệ lợn mắc tiêu chảy vào 2 vụ xuân và thu thấp hơn so với vụ đông và hè, những tỷ lệ lợn chết vì mắc tiêu chảy ở 2 vụ này cao hơn. Vấn đề này, theo chúng tôi là do vào cuối những đợt mắc dịch bệnh, hoặc cuối vụ dịch thì tỷ lệ nhiễm khuẩn và độc lực vi khuẩn đã tăng, đồng thời vi khuẩn có hiện tượng kháng thuốc nên hiệu quả điều trị giảm, làm tăng tỷ lệ chết. Đây cũng là một vấn đề cần có các nghiên cứu chuyên sâu hơn nữa. Theo Phạm Khắc Hiếu (1998)[17], để phòng bệnh tiêu chảy, trước hết cần hạn chế, loại trừ các yếu tố stress xấu sẽ đem lại hiệu quả tích cực, đồng thời khắc phục những yếu tố khí hậu, thời tiết bất lợi để tránh rối loạn tiêu hoá, giữ ổn định trạng thái cân bằng giữa cơ thể và môi trường. Lợn con đẻ ra phải được sưởi ấm ở nhiệt độ 34 o C trong 7 ngày đầu, sau đó giảm nhiệt độ dần, nhưng không được thấp hơn 30 o C. Từ những kết quả trên cho thấy: Điều kiện thời tiết khí hậu có ảnh hưởng rất lớn đến tỷ lệ tiêu chảy của lợn. Vì vậy, đối với các hộ chăn nuôi lợn nái sinh sản, cần phải có kế hoạch điều chỉnh lịch phối giống cho lợn phù hợp, nắm chắc dự báo tình hình thời tiết để có biện pháp che chắn chuồng trại và giữ ấm cho lợn, phòng bệnh tiêu chảy cho lợn con. 3.1.3. Tỷ lệ lợn mắc tiêu chảy và chết do tiêu chảy theo ph•ơng thức chăn nuôi Phương thức chăn nuôi thể hiện trình độ thâm canh, đầu tư, trình độ kỹ thuật trong sử dụng và chế biến thức ăn, trong việc thực hiện các quy trình vệ sinh, chăm sóc nuôi dưỡng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành điều tra, đánh giá hội chứng tiêu chảy của lợn theo các phương thức chăn nuôi: công nghiệp, bán công nghiệp và truyền thống. Kết quả điều tra được trình bày ở bảng 3.3 và biểu đồ 3.3. - 55 - Bảng 3.3. Tỷ lệ lợn tiêu chảy và chết do tiêu chảy theo ph•ơng thức chăn nuôi Phƣơng thức chăn nu«i Tổng số lợn điều tra (con) Tỷ lệ lîn tiªu ch¶y Tỷ lệ lợn chết do tiªu ch¶y Số lƣợng (con) Tỷ lệ (%) Sè l•îng (con) Tû lÖ (%) Công nghiệp 14.796 2.976 20,11 109 3,66 Bán công nghiệp 9.867 4.111 41,66 235 5,71 Truyền thống 11.936 4.003 33,53 219 5,47 Tính chung 36.599 11.090 30,30 563 5,07 Bảng 3.3 cho thấy: Ph•ơng thức chăn nuôi bán công nghiệp có tỷ lệ lợn mắc và chết do tiêu chảy cao nhất (41,66% và 5,71%); còn chăn nuôi công nghiệp có tỷ lệ lợn mắc và chết do tiêu chảy thấp nhất (20,11% và 3,66%), thấp hơn cả tỷ lệ chung (30,30% và 5.07%). Tỷ lệ lợn mắc và chết do tiêu chảy ở hai ph•ơng thức chăn nuôi bán công nghiệp và truyền thống đều cao hơn tỷ lệ chung (41,66% và 33,53% so với 30,30%; 5,71% và 5,47% so với 5,07%). Biểu đồ 3.3: Tỷ lệ lợn tiêu chảy và