Tài liệu Luận văn Xác định hàm lượng cholesterol trong trứng và so sánh trình tự vùng điều khiển D-Loop DNA ty thể của gà ri, gà ác, gà tre: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
................ ...................
VŨ THỊ NHƢ TRANG
XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CHOLESTEROL TRONG TRỨNG VÀ
SO SÁNH TRÌNH TƢ̣ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP DNA TY
THỂ CỦA GÀ RI, GÀ ÁC, GÀ TRE
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
THÁI NGUYÊN, 2009
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
................ ...................
VŨ THỊ NHƢ TRANG
XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CHOLESTEROL TRONG TRỨNG VÀ SO
SÁNH TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP DNA TY THỂ CỦA
GÀ RI, GÀ ÁC, GÀ TRE
Chuyên ngành : SINH HỌC THƢ̣C NGHIỆM
Mã số: 60.42.30
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học : PGS. TS Nguyễn Trọng lạng
THÁI NGUYÊN, 2009
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi . Các ...
62 trang |
Chia sẻ: hunglv | Lượt xem: 1332 | Lượt tải: 2
Bạn đang xem trước 20 trang mẫu tài liệu Luận văn Xác định hàm lượng cholesterol trong trứng và so sánh trình tự vùng điều khiển D-Loop DNA ty thể của gà ri, gà ác, gà tre, để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
................ ...................
VŨ THỊ NHƢ TRANG
XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CHOLESTEROL TRONG TRỨNG VÀ
SO SÁNH TRÌNH TƢ̣ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP DNA TY
THỂ CỦA GÀ RI, GÀ ÁC, GÀ TRE
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
THÁI NGUYÊN, 2009
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
................ ...................
VŨ THỊ NHƢ TRANG
XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CHOLESTEROL TRONG TRỨNG VÀ SO
SÁNH TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP DNA TY THỂ CỦA
GÀ RI, GÀ ÁC, GÀ TRE
Chuyên ngành : SINH HỌC THƢ̣C NGHIỆM
Mã số: 60.42.30
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học : PGS. TS Nguyễn Trọng lạng
THÁI NGUYÊN, 2009
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi . Các kết quả , số
liệu nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ
công trình nào khác .
Tác giả luận văn
Vũ Thị Nhƣ Trang
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
LỜI CẢM ƠN
Tác giả chân thành cảm ơn sự hướng dẫn tận tình của PGS .TS Nguyễn
Trọng Lạng trong suốt quá trình hoàn thành luận văn này .
Tác giả xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô giáo Khoa
Sinh trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên , phòng thí nghiệm của Khoa Hóa
an toàn vệ sinh thực phẩm- Viện dinh dưỡng Việt Nam, phòng thí nghiệm
công nghệ DNA ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Khoa học
và Công nghệ Việt Nam và một số gia đình ở Cao Thượng - Tân Yên - Bắc
Giang đã tạo điều kiện giúp đỡ tận tình trong việc nghiên cứu t hực nghiệm
của đề tài.
Cuối cùng tác giả xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của Ban giám
hiệu, Khoa Sau đại học , Ban chủ nhiệm Khoa Sinh trường Đại học Sư phạm
Thái Nguyên đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để tác giả hoàn thành bản
luận văn này .
Tác giả
Vũ Thị Nhƣ Trang
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Nhƣ̃ng tƣ̀ viết tắt
DNA Deoxyribonucleotide acid
RNA Ribonucleotide acid
dNTP Deoxynucleoside triphosphate
ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate
bp Base pair
EDTA Ethylene diamine tetra – acetic acid
EtBr Ethidium bromide
Kb Kilo base
PCR Polymerase Chain Reaction
RNase Ribonuclease
SDS Sodium Dodecyl Sulphate
TAE Tris- acetate-EDTA
COI Cytochrome oxidase I
PBS Phosphate Buffer Saline
epp eppendorf
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Danh mục các bảng
Bảng Tên bảng Trang
2.1 Kết quả c hiều cao và diện tích peak cholesterol chuẩn ở
các nồng độ khác nhau
20
3.1 Kết quả chiều cao và diện tích peak cholesterol trong trứng
của các mẫu nghiên cứu
32
3.2 Hàm lượng cholesterol trong trứng của các mẫu nghiên cứu 33
3.3 Các điểm nucleotide khác biệt giữa 2 mẫu gà Ác và Tre so
với gà Ri
43
3.4 Thống kê các điểm đa hình ở 3 mẫu gà nghiên cứu so với
gà Gallus gallus gallus mã số NC 007236 và gà Gallus
gallus gốc Nhật mã số AB114078
43
3.5 Hệ số tương đồng về tr ình tự nucleotide vùng D -loop ở
mẫu nghiên cứu với một số mẫu trên GenBank
45
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Danh mục các hình
Hình Tên hình Trang
1.1 Cấu trúc hoá học của cholesterol 6
1.2 Bản đồ gen mtDNA của gà nhà Gallus gallus 12
2.1 Đường chuẩn cholesterol dựa theo diện tích các peak
chuẩn cholesterol
20
2.2 Đường chuẩn cholesterol dựa theo chiều cao các peak
chuẩn cholesterol
21
3.1 Biểu đồ hàm lượng cholesterol trong trứng của các mẫu
nghiên cứu
33
3.2 Kết quả điện di DNA tổng số 35
3.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR 36
3.4 So sánh trình tự đoạn D -loop của 3 mẫu gà Ri, Ác, Tre
với gà Gallus gallus gallus mã số NC 007236 và gà
Gallus gallus gốc Nhật mã số AB114078
41
3.5 Quan hệ di truyền của một số giống gà 46
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
MỤC LỤC
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
Mở đầu .......................................................................................................... 1
1.Đặt vấn đề .................................................................................................. 1
2. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................. 2
3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Nguồn gốc gia cầm ................................................................................. 3
1.1.1 Gà Á ............................................................................................. 4
1.1.2 Gà Ri............................................................................................. 5
1.1.3 Gà Tre. .......................................................................................... 6
1.2 Cholesterol .............................................................................................. 6
1.2.1 Tính trạng chất lượng cholesterol của trứng gà ............................. 6
1.2.2 Nhu cầu cholesterol ở người ......................................................... 7
1.2.3 Vai trò cholesterol trong cơ thể ..................................................... 7
1.2.4 Tác hại cholesterol trong cơ thể khi vượt quá mức bình
thường. .......................................................................................................... 8
1.3 Đặc điểm DNA ty thể .............................................................................. 10
1.3.1 Đặc điểm cấu trúc và trình tự của DNA ty thể ............................... 10
1.3.2 Ý nghĩa về mặt tiến hoá của DNA ty thể ...................................... 11
1.4 Đặc điểm cấu trúc và di truyền hệ gen ty thể gà....................................... 12
1.5 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới và ở Việt Nam ........... 14
1.5.1 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới ........................ 14
1.5.2 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam ........................ 16
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu .................................................................................................. 18
2.1.1 Nguồn gốc mẫu ........................................................................... 18
2.1.2 Địa điểm thí nghiệm .................................................................... 18
2.2 Hoá chất và thiết bị ................................................................................. 18
2.2.1 Hóa chất ....................................................................................... 18
2.2.2 Thiết bị sử dụng .................................................................... 18
2.3 Phương pháp nghiên cứu........................................................................ 19
2.3.1 Phương pháp hoá sinh xác định hàm lượng cholesterol ................ 19
2.3.2 Phương pháp sinh học phân tử ..................................................... 22
2.3.2.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu động vật ......... 22
2.3.2.2 Kỹ thuật điện di DNA trên gel agarose ................................. 25
2.3.2.3 Nhân vùng điều khiển D- loop bằng kỹ thuật PCR ............... 26
2.3.2.4 Tinh sạch sản phẩm PCR ...................................................... 29
2.3.2.5 Phương pháp xác định trình tự DNA. ................................... 31
2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu ............................................................ 31
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Hàm lượng cholesterol trong trứng của các mẫu nghiên cứu .................. 33
3.2 Xác định trình tự nucleotide của vùng D-loop và đánh giá đa dạng
di truyền của 3 mẫu gà nghiên cứu ............................................................... 35
3.2.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà ........................... 35
3.2.2 Nhân vùng điều khiển D-loop của DNA ty thể ............................. 36
3.2.3 Xác định trình tự vùng điều khiển D-loop của DNA ty thể ........... 37
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận .................................................................................................... 48
2. Đề nghị ..................................................................................................... 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................. 50
PHỤ LỤC .............................................. 54
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
1
Mở đầu
1. Đặt vấn đề
Hiện nay, ngành chăn nuôi có những bước phát triển mạnh mẽ với xu
hướng chăn nuôi theo con đường công nghiệp hoá. Đặc biệt, ngành chăn nuôi
gia cầm đang được quan tâm hàng đầu vì nó có khả năng cung cấp một lượng
lớn sản phẩm trứng, thịt giàu chất dinh dưỡng, dễ chế biến và phù hợp với
nhu cầu của tuyệt đại đa số người dân.
Sự phát triển nhanh chóng của ngành chăn nuôi gia cầm trên thế giới đã
tác động đến ngành chăn nuôi gia cầm ở nước ta về cơ cấu, quy mô, loại
hình...chăn nuôi. Số đàn gia cầm có số lượng lớn và cơ sở chăn nuôi tập trung
với quy mô lớn tăng lên. Một số giống gà nước ta có nhiều ưu điểm như phẩm
chất thịt, trứng thơm ngon, giá trị dinh dưỡng cao, có khả năng thích nghi cao
với nhiều điều kiện sống của địa phương, chống chịu tốt với điều kiện khí hậu
khắc nghiệt.
Trong những năm gần đây, xã hội ngày càng phát triển, đời sống vật chất
và tinh thần của con người được nâng cao. Chất lượng bữa ăn trong gia đình
đã được cải thiện rất nhiều. Cũng chính vì lí do đó, hiện nay con người đã
mắc rất nhiều bệnh khác nhau. Trong đó, một trong những bệnh điển hình khi
chất lượng bữa ăn nâng cao đó là bệnh về tim mạch, xơ vỡ động mạch, huyết
áp cao, thiểu năng mạch vành, nhồi máu cơ tim, tai biến mạch máu não...
Những bệnh đó chiếm khoảng 25% tổng số nguyên nhân tử vong ở các nước
phát triển thuộc thế giới tây phương. Có nhiều nguyên nhân k hác nhau dẫn tới
nhưng căn bệnh như trên , nhưng một nguyên nhân rất quan trọng đó là do
hàm lượng cholesterol trong cơ thể cao. Khi chế độ ăn uống thay đổi thì hàm
lượng cholesterol cũng thay đổi theo. Những nguồn thực phẩm giàu
cholesterol đó là những loại thức ăn có nguồn gốc động vật nhất là bầu dục,
não, tim, lòng đỏ trứng... Do sở thích và tình hình kinh tế, nhiều người rất
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
2
thích ăn trứng gà và coi đó là nguồn thực phẩm chính trong gia đình. Trong
trứng, đặc biệt là lòng đỏ có hàm lượng cholesterol rất cao. Có nhiều loại
trứng khác nhau như trứng gà, trứng chim, trứng vịt... Mỗi giống gà khác
nhau thì trứng có hàm lượng cholesterol cũng khác nhau. Như vậy việc lựa
chọn loại trứng vừa đảm bảo dinh dưỡng vừa đáp ứng nhu cầu, sở thích của
mỗi cá nhân mà vẫn bảo vệ sức khoẻ là rất quan trọng.
Đồng thời cùng với sự phát triển của kĩ thuật sinh học phân tử, chúng tôi
muốn xác định sự đa dạng di truyền ở mức phân tử của các giống gà qua
nghiên cứu trình tự vùng điều khiển D-loop ty thể của các giống gà đó.
Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã tiến hành đề tài : “ Xác định
hàm lượng cholesterol trong trứng và so sánh trình tự vùng điều khiển D-
loop DNA ty thể của gà Ri, gà Tre, gà Ác nuôi tại Bắc Giang”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định hàm lượng cholesterol trong trứng của 3 giống gà.
- Xác định và so sánh trình tự vùng điều khiển D-loop DNA ty thể của
3 giống gà.
- Đánh giá quan hệ di truyền giữa các giống gà.
3. Nội dung nghiên cứu
- Xác định hàm lượng cholesterol trong trứng gà Ri, gà Ác, gà Tre.
- Xác định và so sánh trình tự vùng điều khiển D-loop ty thể của gà Ri, gà Ác,
gà Tre.
+ Tách DNA tổng số từ máu của các giống gà trên.
+ Nhân vùng D-loop bằng kĩ thuật PCR.
+ Xác định trình tự vùng D-loop và so sánh trình tự đó giữa 3 giống gà
trên.
- Xác định mối quan hệ di truyền giữa các giống gà nghiên cứu với một số
giống gà đã được công bố trình tự vùng D-loop.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
3
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Nguồn gốc gia cầm
Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu về nguồn gốc gia cầm và đưa ra kết
luận rằng: gà nhà hiện nay có chung nguồn gốc từ gà rừng Gallus gallus. Gà
rừng có thân hình nhỏ bé, đẻ dồn theo mùa, trứng bé, có khả năng bay xa. Cơ
sở của kết luận trên là gà nhà có nhiều đặc điểm giống gà rừng về đặc điểm
hình thái đến cấu tạo giải phẫu các bộ phận bên trong cơ thể, tiếng gáy, tập
tính hoạt động.
Theo loại hình gà có thể chia thành 3 kiểu:
Kiểu Bakira (gà nguyên thuỷ): nhiều lông, mào và dái tai lớn, mỏ hơi
cong và nhọn.
Kiểu Malaysia (gà chọi): ít lông và cứng, mào và dái tai nhỏ, đầu nhỏ,
mắt lõm vào hốc mắt, mỏ ngắn khoẻ.
Kiểu Cochin: nhiều lông bồng, lông tơ, mào và dái tai vừa, tai nhỏ màu
đỏ, mỏ tương đối ngắn.
Từ 3 loại hình trên, người ta chọn lọc, dần dần hình thành nên các
giống gà chuyên thịt, chuyên trứng hay kiêm dụng ngày nay.
Theo Nguyễn Ân (1983) [1], vị trí của gà nhà được sắp xếp trong hệ
thống giới động vật như sau:
Giới động vật (Animal)
Ngành động vật có xương sống (Chordata)
Lớp chim (Aves)
Bộ gà (Galliformes)
Họ Trĩ (Fasianidea)
Chủng Gallus (giống gà Bankip )
Loài Gallus gallus.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
4
Gà được thuần hoá đầu tiên ở Ấn Độ cách đây 5000 năm, sau đó là Ba
Tư. Nhờ sự tiến bộ trong công tác chọn giống, từ các giống gà địa phương của
châu Á, sau khi nhập vào châu Âu thế kỷ XVIII và XIX, đầu tiên là ở nước
Anh, sau đó là Mỹ, các giống gà này được lai tạo thành nhiều giống gà có
năng suất cao hơn.
Ở nước ta, gà rừng được thuần hoá và nuôi sớm nhất ở vùng Vĩnh Phú,
Hà Bắc, Hà Tây… Từ giống gà nuôi ban đầu là tiền thân của gà Ri hiện nay
nhân dân ta đã tạo được nhiều giống gà: gà Mía, gà Ác, gà Ri, gà Tre, gà
Đông Tảo, gà Vàng …
1.1.1 Gà Ác
Gà Ác có tên khoa học là Gallus domestices brisson. Đây là loại gà cỡ
nhỏ đặc biệt được thuần hoá và nuôi dưỡng như các giống gà khác, lông trắng
mượt, toàn bộ da, mắt, thịt và xương, nội tạng đều đen, chân đen có 5 ngón.
Trước đây, gà Ác được nuôi chủ yếu ở đồng bằng sông Cửu Long và
miền tây Nam Bộ vì mặc dù là giống gà được coi là vị thuốc quý có thể chữa
nhiều bệnh, nhưng không ai dám nuôi tràn lan vì khả năng cho thịt thấp mà
giá thành lại cao. Nhưng cuộc sống ngày càng đi lên, những đặc sản quý mới
được biết hết giá trị của nó. Gà Ác đã được nuôi nhiều ở miền Trung và miền
Bắc như Nghệ An, Hải Phòng, Bắc Ninh, Bắc Giang, Đông Anh, Hưng
Yên...Lúc này thì người nuôi mới thấy rằng đây là giống gà nhanh nhẹn, chăm
chỉ chịu khó nhặt nhạnh kiếm mồi, chịu lạnh tốt và có sức sống cao. Như thế
có thể nuôi được cả quảng canh (nuôi chăn thả) hay nuôi thâm canh (nuôi
chuồng) đều được cả. Phân tích dưới góc độ khoa học, thịt gà Ác rất giàu axit
amin, nhiều canxi, photpho, sắt, protit, lipit. Trứng của chúng tuy nhỏ (chỉ
khoảng 29-30 g) nhưng tỉ lệ lòng đỏ lại rất cao, đến 34,2% [12].
Theo y học cổ truyền, thịt và xương gà Ác có vị ngọt, tính ấm, không
độc, có tác dụng bổ dưỡng cao. Thịt gà Ác đặc trị các bệnh về phổi, thận, đau
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
5
lưng, ra mồ hôi trộm, chân tay yếu mỏi, tạng yếu, rất tốt cho người ốm dậy và
sau khi sinh.
Người ta đã thụ tinh nhân tạo thành công trên gà Ác để tạo ra giống gà
cho nhiều trứng trong thời gian sớm nhất. Theo PGS.TS Trịnh Công Thành,
Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, đây là lần đầu tiên người ta áp
dụng biện pháp thụ tinh nhân tạo trên giống gà Ác giữa dòng gà Ác có lông
chân và dòng gà Ác không có lông chân. Kết quả, qua 5 thế hệ chọn lọc và tạo
dòng, nhóm nghiên cứu đã tạo ra 2 dòng gà Ác mới là gà Ác có lông chân và
gà Ác không có lông chân cho sản lượng trứng cao (38/100 con cho trứng) mà
trước kia là 29/100 con cho trứng).
1.1.2 Gà Ri
Gà Ri là giống gà nội phổ biến nhất ở nước ta chiếm 70% tổng số gà
trong nước, có nguồn gốc thuộc nhóm gà rừng Gallus Bankiva hay Gallus
gallus. Gà có ngoại hình thon, nhỏ, mỏ nhỏ, mào cờ có răng cưa, mào đỏ tươi
rất phát triển ở con trống; dái tai có xen lẫn ánh bạc trắng. Cổ thanh dài vừa
phải, ngực lép, bụng thon, mềm, chân có hai hàng vải màu vàng có khi xen
lẫn màu đỏ tươi. Bàn chân có 4 ngón, cựa phát triển sớm ở gà trống. Màu
lông khác nhau ở con mái và con trống. Con mái có màu lông màu vàng rơm,
vàng đất, nâu nhạt và đốm. Con trống có màu lông đỏ sẫm, ở đầu lông cánh
và lông đuôi, lông bụng đỏ nhạt hoặc vàng đất. Ngoài ra còn có màu lông
khác như lông trắng, hoa mơ, đốm trắng...
Gà Ri mọc lông sớm, tốc độ mọc nhanh hơn gà Mía, Đông Tảo nên có
khả năng chịu đựng tốt hơn khi nuôi ở điều kiện thời tiết lạnh. Gà Ri đẻ trứng
sớm, tuổi đẻ đầu lúc 123 ngày tuổi. Sản lượng trứng của gà mái trong một
năm từ 80-120 quả. Khối lượng trứng bình quân là 38 – 42 g. Gà Ri có khối
lượng cơ thể ở tuổi trưởng thành như sau: con trống từ 1,800 g đến 2,500 g,
con mái từ 1,300 g đến 1,800 g.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
6
Đây là giống gà thích hợp với khí hậu và điều kiện chăn nuôi quảng
canh ở nước ta. Gà chịu khó kiếm ăn khi nuôi trong điều kiện chăn thả trong
vườn hay ngoài đồng. Hàng ngày người nuôi chỉ phải cho ăn rất ít, một vài
nắm thóc vãi cho cả đàn khi gọi chúng về chuồng, ngoài ra chúng tự kiếm đủ
khi được thả ngoài vườn [4], [7], [8].
1.1.3 Gà Tre
Là giống gà địa phương được nuôi ở một số tỉnh Nam Bộ ở Việt Nam.
Kích thước của gà nhỏ con, gà trống có lông màu trắng, đuôi và cổ đen. Gà
mái màu vàng, thấp chân. Gà trống và gà mái nhỏ hơn gà Ri. Gà Tre có tập
tính là hay bay và đậu trên hàng rào. Người nuôi chủ yếu là nuôi làm cảnh.
Trong những năm gần đây, nhà nước có nhiều dự án nhằm gìn giữ và bảo tồn
quỹ gen của các loại gia cầm của nước ta.
1.2 Cholesterol
1.2.1 Tính trạng chất lƣợng cholesterol của trứng gà
Cholesterol là chất béo steroid, nó kém tan trong nước nhưng tan nhiều
trong mỡ và có thể tạo este với axit béo, nó không thể tan và không di chuyển
ở dạng tự do ở trong máu. Cholesterol có công thức cấu tạo như sau:
Hình 1.1. Cấu trúc hoá học của cholesterol
Nhìn vào công thức cấu tạo ta thấy, cấu trúc cơ bản của cholesterol là
nhân sterol được tổng hợp từ các phân tử axetyl - CoA và một phần phân tử
của cholesterol là rượi cồn (alcohol). Cholesterol có ở nhiều loại thực phẩm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
7
khác nhau như nội tạng động vật: tim, gan... và đặc biệt trứng gà là loại thực
phẩm có chứa nhiều cholesterol, trong đó chủ yếu là lòng đỏ trứng gà còn
lòng trắng thì tuyệt nhiên không có hoặc rất ít [15], [18], [28].
1.2.2 Nhu cầu cholesterol ở ngƣời
Cholesterol là chất béo steroid rất cần thiết cho cơ thể, có ở màng tế bào
của tất cả các mô trong cơ thể và được vận chuyển trong huyết tương của mọi
động vật cũng như cơ thể người. Cholesterol trong cơ thể người có 2 nguồn
gốc:
- Cholesterol hấp thụ qua đường tiêu hoá (cholesterol từ thức ăn) hay còn
gọi là cholesterol ngoại sinh (exogenous cholesterol).
- Cholesterol hình thành trong tế bào hay cholesterol nội sinh
(endogenous cholesterol) và chủ yếu được hình thành từ gan [15], [28].
Tuy vậy, tất cả các tế bào trong cơ thể có khả năng tổng hợp một lượng
nhỏ cholesterol. Chất này tham gia hình thành cấu trúc tế bào. Khi lượng
cholesterol hấp thu qua đường tiêu hoá tăng sẽ dẫn đến tăng nhẹ nồng độ
cholesterol huyết tương. Tuy nhiên, khi lượng cholesterol hấp thụ tăng sẽ ức
chế một trong những enzyme xúc tác cho quá trình tổng hợp cholesterol nội
sinh. Đây là một yếu tố trong cơ chế điều hoà ngược để điều chỉnh nồng độ
cholesterol trong máu. Chính vì vậy nồng độ cholesterol trong máu dao động
khoảng 15% do ảnh hưởng của cholesterol trong thức ăn. Sự thay đổi lớn của
hàm lượng cholesterol trong khẩu phần có thể dẫn đến làm thay đổi nồng độ
cholesterol trong máu tới 30%. Đồng thời các chất béo bão hoà trong khẩu
phần ăn cũng làm tăng cholesterol từ 15 - 25%.
1.2.3 Vai trò cholesterol trong cơ thể
Khoảng 80% lượng cholesterol trong cơ thể được chuyển thành cholic
axit tại gan. Cholic axit sẽ kết hợp với các thành phần khác hình thành muối
mật có tác dụng xúc tác trong quá trình tiêu hoá và hấp thụ các chất béo.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
8
- Một tỷ lệ nhỏ cholesterol được sử dụng theo các con đường:
+ Được tuyến thượng thận sử dụng để tổng hợp hormon vỏ tuyến
thượng thận.
+ Hình thành estrogen và progesterol tại buồng trứng.
+ Được dịch hoàn sử dụng để tổng hợp testostereone.
+ Cholesterol tham gia cấu trúc màng tế bào.
+ Một lượng nhỏ cholesterol có mặt tại biểu bì của da. Cùng với các
chất béo khác, cholesterol tạo cho da các chức năng:
+) Kháng lại việc hấp thu các chất hoà tan trong nước
+) Kháng tác động của nhiều hoá chất.
+) Ngăn cản quá trình bốc hơi nước của da [15],[19], [28].
Như vậy cholesterol có vai trò rất quan trọng trong cơ thể khi hàm lượng
của nó trong cơ thể ở mức phù hợp. Ở người trưởng thành, cholesterol toàn
phần ở mức bình thường vào khoảng 4-5,6 mmol/lít. Những người có mức
cholesterol cao hơn mức này sẽ dẫn đến nhiều bệnh khác nhau.
1.2.4 Tác hại cholesterol trong cơ thể khi vƣợt quá mức bình thƣờng
Người ta thấy rằng, cholesterol là nguyên nhân gây nên các bệnh tim
mạch, xơ động mạch, huyết áp cao, thiểu năng mạch vành, nhồi máu cơ tim,
tai biến mạch máu não... Trên thế giới cũng như ở nước ta, các bệnh về tim
mạch ngày càng tăng và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở nhiều nước.
Đàn ông có nguy cơ bị bệnh tim cao hơn đàn bà. Ở Mỹ, hàng năm có khoảng
6 triệu người bị bệnh tim và trong số này có khoảng 1,5 triệu bị đau tim và
trong số này có khoảng 1/3 bị chết. Khoảng 1/5 trong số các trường hợp đau
tim không hề có triệu trứng hay cảnh báo trước. Tần suất đàn ông Mỹ bị chết
vì bệnh tim là khoảng 200/100.000 dân số. Ở Anh, tỉ suất này là khoảng
250/100.000 dân số [16], [21].
*Cơ chế gây bệnh xơ vữa động mạch của cholesterol
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
9
Xơ vữa thành mạch (xơ vữa động mạch) là hiện tượng bệnh lý của lớp
nội mạc động mạch, đặc biệt là các động mạch lớn dẫn đến sự hình thành các
mảnh có nguồn gốc chất béo, phá vỡ cấu trúc thành mạch, làm hẹp mạch máu
và ngăn cản sự lưu thông của dòng máu . Các biểu hiện bệnh lý trong giai
đoạn đầu là tổn thương các tế bào nội mạc và lớp tế bào dưới nội mạc. Sự tổn
thương thành mạch còn có thể do tác động cơ học của dòng máu và áp lực của
động mạch nên vùng tổn thương.
Khi có hiện tượng tổn thương, các tế bào nội mạc sẽ giãn, sưng, phân
chia. Các tế bào cơ trơn thành mạch cũng có thể có phản ứng tương tự. Tại
thành mạch máu có hiện tượng tập trung nhiều tế bào do sự di chuyển của các
tế bào bình thường đến vùng tổn thương. Ngay sau đó, các thành phần lipit
trong máu, đặc biệt là cholesterol sẽ tích tụ lại trong các tế bào đang phân
chia, hình thành các mảnh xơ. Vì các mảnh này chứa một lượng lớn
cholesterol nên chúng thường được gọi là chất cholesterol lắng đọng.
Tiếp theo sau của quá trình bệnh lý , các tế bào xơ xâm nhập vùng tổn
thương và hình thành các mảnh xơ trong mạch máu.
Tiếp theo là quá trình lắng đọng canxi làm canxi hoá các mảnh xơ. Đến
giai đoạn này, các tổ chức mạch vùng tổn thương trở nên cứng nên được mô
tả bởi từ “xơ cứng động mạch” hoặc gọi đơn giản hơn là “hiện tượng cứng
mạch máu”
Các động mạch bị xơ cứng gần như mất hoàn toàn khả năng tăng kích
thước (mất khả năng căng phồng) và dễ bị làm rách , làm thủng . Các phần tử
mảnh xơ (có bề mặt thô nhám) có thể di chuyển theo dòng máu dẫn đến nguy
cơ hình thành các cục máu và huyết khối. Khi các huyết khối có mặt trong
động mạch vành của tim hay các động mạch của não sẽ dẫn đến tắc động
mạch, rối loạn hoạt động của tim, não và gây tổn thương nặng nề cho cơ thể
thậm chí gây tử vong. Các ảnh hưởng tương tự cũng có thể xảy ra khi huyết
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
10
khối hình thành trong động mạch gan, động mạch thận, động mạch các chi,
động mạch dạ dày, ruột... [16], [21].
*Biện pháp điều chỉnh cholesterol trong máu
Để giảm hàm lượng cholesterol trong máu có nhiều biện pháp khác nhau
như sử dụng các loại thuốc có chứa chất Simvastatine và chất Ezetimibe hay
các loại thuốc có chứa Statin. Nhưng một biện pháp hữu hiệu để điều chỉnh
cholesterol trong máu là bằng chế độ ăn uống hợp lý.
Do sở thích và sự thiếu hiểu biết về thành phần dinh dưỡng của các loại
thực phẩm, một số người thường xuyên sử dụng một số lượng lớn các thực
phẩm có chứa nhiều cholesterol như óc, gan, các loại thịt có chứa nhiều chất
béo (thịt heo, gà, vịt, cá) và đặc biệt là trứng. Có những người ăn thường
xuyên một lượng lớn trứng trong một thời gian dài mà không biết tới hậu quả
mà nó sẽ gây ra. Trứng là thức ăn rất bổ dưỡng cho cơ thể. Tuy nhiên, chúng
ta chỉ nên ăn với một lượng hợp lý để góp phần đề phòng và giảm lượng
cholesterol trong máu để tránh các bệnh về tim mạch.
1.3 Đặc điểm DNA ty thể
1.3.1 Đặc điểm cấu trúc và trình tự của DNA ty thể
DNA ty thể (mtDNA) ở dạng chuỗi kép, trần, mạch vòng. Kích thước
của bộ gen ty thể thay đổi khác nhau ở mức phân loại Bộ trở lên.
Ở tế bào động vật kích thước của mtDNA nhỏ, cho tới nay đã xác định
được trình tự đầy đủ của bộ gen ty thể người, chuột, bò, tất cả đều có kích
thước khoảng 16,5 kb. Mỗi tế bào có vào khoảng vài trăm ty thể. Mỗi ty thể
có nhiều bản sao của DNA. Nấm men có kích thước bộ gen ty thể khoảng 84
kb (ở S.cerevisiae), trong đó rất nhiều vùng không mang intron dài xen kẽ
giữa các vùng exon. Ở thực vật thì có sự biến động rất lớn về kích thước bộ
gen ty thể, mtDNA của thực vật có kích thước tối thiểu khoảng 100 kb. Chức
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
11
năng của những vùng DNA được tăng thêm này chưa được xác định rõ ràng,
nhưng dường như chúng chỉ là những vùng không mã hoá.
Kích thước của mtDNA ở động vật rất nhỏ nhưng tổ chức lại rất chặt
chẽ. mtDNA ở động vật không có vùng intron, có một số gen gối lên nhau và
hầu hết mỗi cặp bazơ đều có thể nằm trong một gen nào đó ngoại trừ vùng D-
loop. D-loop là vùng điều khiển của mtDNA trên đó có các promotor của quá
trình sao chép và phiên mã của mtDNA [25].
1.3.2 Ý nghĩa về mặt tiến hoá của DNA ty thể
DNA ty thể là vật chất di truyền nằm ngoài nhân di truyền theo dòng
mẹ. Ở hầu hết động vật có xương sống bộ gen này có chiều dài khoảng 16800
nucleotid, trong đó bao gồm những gen mã hoá protein, gen tRNA, gen rRNA
và vùng điều khiển – vùng không mã hoá duy nhất với các promoter để tái
bản và phiên mã mtDNA. DNA ty thể có những đặc tính đáng quan tâm như
sau:
(1) Tỷ lệ tiến hoá phân tử của chúng nhanh hơn khoảng 5 lần so với
bất kỳ một gen nhân nào.
(2) mtDNA là một phân tử đơn bội mà không tái tổ hợp.
Vùng điều khiển mtDNA là vùng tiến hoá nhanh nhất của mtDNA:
chúng tích luỹ các đột biến với tỷ lệ cao hơn gấp 5 – 10 lần so với các gen
khác của mtDNA. Trình tự nucleotide của vùng điều khiển mtDNA là một
công cụ rất hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng di truyền và sự phân hướng tiến
hoá bên trong và giữa các quần thể cùng loài [29].
1.4 Đặc điểm cấu trúc và di truyền hệ gen ty thể gà
* Đặc điểm cấu trúc ty thể gà
Năm 1990, Desjadins và Morais [17] đã công bố trình tự đầy đủ của
mtDNA của gà nhà (Gallus gallus) gồm 16775 bp, chúng mã hóa cho 13
protein, 2 rRNA và 22 tRNA (trình tự này đã được lưu trữ GenBank). Các
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
12
protein tạo ra được sử dụng để vận chuyển điện tử và phosphoril hóa trong ty
thể. Gen ty thể gà có các đặc điểm riêng, khác với lớp thú và lưỡng cư đó là:
một điểm khởi đầu sao chép của chuỗi nhẹ tương đương với trình tự nằm giữa
hai gen tRNA (Cys) và tRNA (Asn) đều có ở tất cả động vật có xương sống
đã được giải trình tự genome ty thể, riêng ở gà lại không có đặc điểm này.
Đồng thời gen COI (cytochrome oxidase I) có mã mở đầu là GTG thay vì
ATG.
Trình tự đầy đủ này của hệ gene ty thể gà nhà là cơ sở cho nhiều công
trình nghiên cứu về DNA ty thể của các giống, các loài thuộc bộ gà
(Galliormes). Toàn bộ DNA ty thể gà nhà được lập thành sơ đồ như sau:
Hình 1.2. Bản đồ gen mtDNA của gà nhà Gallus gallus
(Desjadins và Morais, 1990)
ND: NADH đehidrogenaza
CO: cytocrom oxidaza
H (Heavy strand): chuỗi nặng
L (Light strand): chuỗi nhẹ.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
13
* Đặc điểm di truyền của ty thể: Di truyền ty thể là di truyền theo
dòng mẹ. Trong thực tế có đến 99% ty thể của tế bào con thừa hưởng từ tế
bào mẹ. Đó là do bào quan này nằm trong tế bào chất, khi có sự kết hợp giữa
trứng và tinh trùng tạo thành hợp tử (tế bào con) thì tế bào con nhận chủ yếu
tế bào chất từ trứng của mẹ, trong đó có chứa ty thể, còn ty thể của tinh trùng
khi tham gia thụ tinh được loại bỏ nhờ cơ chế phân giải protein phụ thuộc vào
ubiquitin. Đôi khi cơ chế này diễn ra không hoàn toàn dẫn đến sự có mặt hai
dòng ty thể của cả bố và mẹ trong cơ thể con, hiện tượng này gọi là dị tế bào
chất. DNA ty thể không có intron, trong phân tử không có sự tái tổ hợp. Tốc
độ biến đổi của DNA ty thể nhanh hơn nhiều so với DNA trong nhân, có thể
là do ty thể thiếu hụt cơ chế sửa chữa DNA. Tốc độ đột biến cao dẫn đến
nhiều biến dị trong ty thể. Đặc biệt là vùng điều khiển D-loop của mtDNA là
vùng tiến hoá nhanh nhất của mtDNA: chúng tích luỹ các đột biến với tỷ lệ
cao hơn gấp 5–10 lần so với các gen khác của mtDNA. Trình tự nucleotit của
vùng điều khiển mtDNA là một công cụ rất hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng
di truyền và sự phân hướng tiến hoá bên trong và giữa các quần thể cùng loài
[29].
* Vai trò vùng D-loop trong phân loại gà
Về mặt cấu trúc, vùng D-loop của gia cầm có thể được chia làm 3 đoạn:
đoạn I, II và III. Trong đó đoạn II là đoạn bảo thủ nhất, có chứa một số đơn vị
cấu trúc mà trình tự sắp xếp của chúng không thay đổi ngay cả ở bậc phân
loại họ. Thông thường, vùng biến đổi nhiều nhất trong D-loop là đoạn III.
Chính điều này đã làm cho vùng điều khiển của mtDNA có tốc độ tiến hóa
nhanh gấp 5-10 lần so với các gen khác của ty thể. Vì vậy mà trình tự
nucleotid của vùng D-loop là công cụ rất hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng di
truyền và sự phân hóa bên trong loài cũng như giữa các quần thể cùng loài.
1.5 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới và ở Việt Nam
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
14
1.5.1 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới
Hiện nay, trên thế giới ngành chăn nuôi gia cầm phát triển nhanh cả về
số lượng và chất lượng. Mỹ là nước đi đầu thế giới về ngành chăn nuôi gia
cầm, đặc biệt trong lĩnh vực tạo ra những giống gà cơ bản. Sau Mỹ là Pháp,
Trung Quốc, Anh, Đức, Hà Lan… Ở các nước Đông Âu, chăn nuôi gia cầm
cũng phát triển, điển hình là Hungari và Bungari.
Dưới đây là một vài nghiên cứu cụ thể trên một số loài thuộc bộ Gà:
Năm 1990, Desjadins và Morais [17] đã công bố trình tự đầy đủ của
mtDNA của gà nhà (Gallus gallus) gồm 16775 bp. Với trình tự này, các nhà
khoa học đã có cơ sở để tiến hành nghiên cứu mối quan hệ chủng loại giữa
các đối tượng thuộc bộ gà.
Năm 1994-1995, Fumihito và cộng sự [20] đã nghiên cứu mối quan hệ
chủng loại giữa các loài gà rừng, công, trĩ, ... dựa trên phân tích đoạn điều
khiển ty thể. Kết quả phân tích đa hình chiều dài các đoạn giới hạn (RFLP)
trên vùng điều khiển mtDNA cho phép các tác giả này đưa ra một sơ đồ phân
loại giữa các loài trên. Đồng thời họ đã xác định được trình tự của 400
nucleotid đầu tiên trên vùng điều khiển của mtDNA. Kết quả nhận được đã
chỉ ra sự lặp lại của một đoạn khoảng 60 nucleotide trên vùng điều khiển của
mtDNA là điểm đặc trưng của giống Gallus.
Randi và cộng sự (1997) [29] đã phân tích trình tự của một phần đoạn
điều khiển ty thể (đoạn D-loop) của 2 loài gà Lôi đặc hữu ở Việt Nam và đã
chỉ ra sự khác biệt rất ít ở mức độ phân tử giữa hai giống này.
Năm 1999, Kimball và cộng sự [23] cũng dựa trên sự phân tích đầy đủ
của gen cytocrom b (1143bp) và đoạn siêu biến (350bp) của vùng điều khiển
mtDNA để xác định mối quan hệ chủng loại của một số loài Trĩ và gà Gô. Hai
cây phân loại được xây dựng từ hai hệ thống số liệu nhận được trên hai đoạn
gen cho thấy sự khác nhau là rất ít.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
15
Zhang và đồng tác giả (2002) [31] đã giải trình tự 539 nucleotid đầu
tiên trong vùng D-loop của sáu chủng gà nhà (Gallus gallus domesticus)
Trung Quốc và so sánh dữ liệu này với trình tự DNA của 4 loài khác: Gallus
gallus, Gallus sonneratii, Gallus varius, Gallus lafayettei đã được công bố
trên ngân hàng gen quốc tế. Ông đã thiết lập được mối quan hệ nguồn gốc của
chúng dựa trên trình tự vùng D-loop.
Komiyama T và đồng tác giả (2004) [24] đã tiến hành phân tích trình tự
vùng D-loop ty thể từ máu của 9 con gà cảnh đuôi dài và 74 con thuộc gà địa
phương của Nhật Bản, đồng thời chọn trình tự DNA của 2 loài gà nhà lông đỏ
(Jungle Fowl) đã được công bố trên Ngân hàng gen quốc tế làm nhóm ngoại.
Trên cơ sở đó họ đã lập được cây phát sinh và kết quả cho thấy 3 chủng
Naganakidori có nguồn gốc từ gà chọi Shamo. Các kết quả này đã gợi ý rằng
3 mẫu gà cảnh đuôi dài đều có chung nguồn gốc mặc dù đặc điểm hình thái
bên ngoài rất khác nhau. Hơn thế 3 chủng gà đuôi dài đầu tiên đã phân ly từ
các con gà chọi Okinawa vốn có nguồn gốc địa lý gần với Nam Trung Quốc
và Đông Nam Á hơn so với Honshu/Kyushu Nhật Bản. Điều này dẫn đến giả
thiết rằng gà đuôi dài Nhật Bản đầu tiên được đưa đến Nhật Bản là gà chọi
các vùng lân cận của vùng Nam Trung Quốc hoặc Đông Nam Á. Như vậy có
thể thấy trình tự nucleotide của vùng D-loop là một công cụ rất hữu hiệu để
đánh giá tính đa dạng di truyền và sự phân hóa bên trong loài cũng như giữa
các quần thể địa lý.
1.5.2 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam
Cho đến nay, ở Việt Nam việc sử dụng phương pháp phân loại phân tử
trên đối tượng gà mới chỉ bắt đầu. Năm 1999, Kim Thị Phương Oanh và cộng
sự [11] đã tiến hành phân tích vị trí nhận biết của một số enzyme giới hạn trên
vùng điều khiển D-loop của 3 loài gà Lôi Việt Nam gồm: gà Lôi lam đuôi
trắng (L. hatinhensis), Trĩ bạc (L. nycthemera) và gà Lôi hông tía (L. diardi).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
16
Từ đó xác định bước đầu được sự khác biệt trên vùng điều khiển D-loop của
mtDNA của 3 loài gà Lôi. Tuy nhiên, để có những kết luận chính xác về vấn
đề này cần phải xác định trình tự vùng điều khiển của 3 dòng gà Lôi nói trên.
Năm 2000, Nguyễn Hải Hà và cộng sự [3] đã tạo dòng phân tử đoạn
gen điều khiển DNA ty thể của 2 loài gà Lôi đặc hữu Việt Nam trong vector
pBluescript KS(-) để chuẩn bị cho việc đọc và so sánh trình tự nucleotide
vùng D-loop.
Năm 2006, Địch Thị Kim Hương và cộng sự [5] đã xác định được trình
tự vùng D-loop gồm 1227 nucleotide của 2 mẫu gà Ác Tiềm và Lương
Phượng, đã phát hiện được 22 vị trí khác biệt về nucleotide giữa 2 đại diện
trên.
Năm 2007, Lê Đức Long và cộng sự [6] đã giải trình tự và so sánh trình
tự nucleotide vùng D-loop của 3 đại diện gà Mông có nguồn gốc từ Điện
Biên, Hà Giang và Yên Bái được nuôi tại trại gà Nông Lâm Thái Nguyên theo
dự án gà sạch. Kết quả nghiên cứu đã xác định trình tự vùng D-loop gồm
1227 nucleotide của 3 mẫu gà nghiên cứu và đã xác định được 10 vị trí khác
biệt về nucleotide giữa các đại diện của 3 mẫu gà này.
Năm 2008, Bùi Thị Kiều Vân và cộng sự [14] đã giải trình tự và so
sánh trình tự nucleotide vùng D-loop của 3 giống gà Ri, gà Mông, gà Sao
nuôi tại Thái Nguyên. Kết quả nghiên cứu đã xác định trình tự vùng D-loop
gồm 1220 nucleotide của 3 mẫu gà nghiên cứu và đã xác định được 16 vị trí
khác biệt về nucleotide giữa các đại diện của 3 mẫu gà này.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
17
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu
2.1.1 Nguồn gốc mẫu
Các mẫu trứng, máu được lấy từ các giống gà Ri, gà Ác, gà Tre được
nuôi tại gia đình ông Nguyễn Văn Vân , thôn Đình Giã , Cao Thượng , Tân
Yên, Bắc Giang.
2.1.2 Địa điểm thí nghiệm
Các nghiên cứu về cholesterol được tiến hành tại phòng thí nghiệm của
Khoa Hóa an toàn vệ sinh thực phẩm- Viện dinh dưỡng Việt Nam.
Các thí nghiệm sinh học phân tử tiến hành tại phòng thí nghiệm công
nghệ DNA ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Khoa học và
Công nghệ Việt Nam.
2.2 Hoá chất và thiết bị
2.2.1 Hóa chất
Các hoá chất tinh khiết sử dụng có nguồn gốc từ các nước Anh , Mỹ,
Trung Quốc , Thụy Điển, Nga… như Phosphate buffer saline (PBS), protein
K (20mg/ml), SDS, Tris HCl, EDTA, NaCl, CH3COONa, phenol:
chloroform: isoamyl alcohol (25:24:1), chloroform: isoamyl alcohol (24:1),
agarose 0,8%...
2.2.2 Thiết bị sử dụng
Máy li tâm lạnh của hãng Hettich (Đức), tủ sấy của hãng Carbolite
(Anh), cân điện tử (Thuỵ Sỹ, Anh), máy Gerhardht, tủ lạnh sâu – 20oC
Sanyo (Nhật), lò vi sóng Samsung (Hàn Quốc), máy PCR MJ Reseach, Inc
(Mỹ), máy xác định trình tự tự động ABI PRISM® 3100 Genetic Analyser
(Applied Biosystems, Mỹ), bể ổn nhiệt (Tempette Junior Tech), hệ thống
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
18
sắc ký Alliance (hãng Waters, Mỹ), máy hút chân không Speed Vac Sc
110A- Savant (Mỹ), pipetman và một số máy móc thiết bị khác.
2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1 Phƣơng pháp hoá sinh xác định hàm lƣợng cholesterol
* Cơ sở của phương pháp: chất béo trong thực phẩm (gồm cả cholesterol)
được chiết bằng chloroform. Sau khi thủy phân lipit bằng KOH trong cồn,
cholesterol được chiết lại bằng petroleum ether. Dịch chiết được cô cạn bằng
máy cất quay chân không, sau đó được hòa tan lại bằng methanol. Cholesterol
trong dịch chiết methanol được định lượng trên sắc ký lỏng (HPLC) bằng
cách so sánh diện tích (hoặc chiều cao) của pic cholesterol trong mẫu với diện
tích (hoặc chiều cao) của pic cholesterol chuẩn (John Wiley and Sons, 2005)
[22].
* Xác định hàm lượng cholesterol theo quy trình sau: Lấy ngẫu nhiên trứng
ở các giống gà thí nghiệm ở các lứa đẻ khác nhau và ở các con gà mái khác
nhau trong cùng một giống. Sau khi lấy được mẫu, ở mỗi mẫu: đập 5 quả
trứng vào cốc thủy tinh. Sau đó đồng nhất lòng đỏ và lòng trắng. Tiếp theo là
các bước:
+ Cân 0,5 g mẫu vào ống ly tâm 25 ml.
+ Thêm 5 ml methanol, vortex 5 phút.
+ Thêm 10 ml chloroform, vortex 3 phút.
+ Ly tâm, gạn lấy dịch trong bình gạn 250 ml.
+ Chiết lại mẫu bằng 5 ml methanol và 10 ml chloroform trong 3 phút.
+ Gộp dịch chiết vào bình gạn.
+ Thêm 7 ml KCl 0,88%, lắc nhẹ và để tách lớp.
+ Lọc lớp chloroform qua phễu chứa Na2SO4 khan vào bình cô quay.
+ Cô quay đến khô ở 300C.
+ Thêm 20 ml KOH 0,5M trong ethanol.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
19
+ Đun hồi lưu 30 phút trong cách thủy ở 600C.
+ Thêm 10ml n- heptane, đun hồi lưu thêm 2-3 phút, để nguội đến nhiệt
độ phòng.
+ Chuyển toàn bộ dịch chiết sang một bình gạn, thêm 5 ml NaCL bão
hòa, 10 ml nước.
+ Chiết 2 lần cùng với 10 ml petroleum ether.
+ Gộp dịch chiết và rửa 2 lần với 20 ml nước cất.
+ Loại nước bằng Na2SO4 khan, cô quay ở 30
0C đến khô.
+ Hòa tan và định mức 10 ml bằng methanol.
+ Lọc qua màng lọc 0,45 m và bơm vào sắc kí lỏng.
Cột sắc ký LunaC18 với nhiệt độ cột là 300C, tốc độ dòng là 1 ml/ phút,
lượng mẫu bơm 10 l. Bộ phận phát hiện (detector) đo độ hấp thụ tia UV ở
bước sóng 208 nm của cholesterol chuyển thành tín hiệu ra máy tính đó là các
peak, mỗi peak có độ cao và diện tích khác nhau, từ đó tính được hàm lượng
cholesterol của mỗi mẫu [22].
Công thức tính hàm lượng cholesterol của mẫu nghiên cứu như sau :
X =
m
D
A
CA
s
sm 100
Trong đó:
X: Hàm lượng cholesterol (mg/ 100 g)
Am: Diện tích pic mẫu
As: Diện tích pic chuẩn
Cs: Nồng độ chuẩn
D: Độ pha loãng
m: khối lượng mẫu cân (g)
100: Tính hàm lượng cholesterol trong 100 g mẫu [22].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
20
Như vậy, để xác định được hàm lượng cholesterol ở các mẫu thí
nghiệm thì trước hết ta phải xây dựng đường chuẩn cholesterol ở các nồng độ
khác nhau: 2,04 ppm, 20,4 ppm, 204 ppm, 1 mg/ml, 2,04 mg/ml. Để xây dựng
được đường chuẩn cholesterol thì ta phải xác định chiều cao và diện tích của
các peak cholesterol chuẩn ở các nồng độ khác nhau đó.
Kết quả về chiều cao và diện tích của peak cholesterol chuẩn ở các
nồng độ khác nhau được thể hiện qua bảng 2.1.
Bảng 2.1. Kết quả chiều cao và diện tích peak cholesterol chuẩn ở
các nồng độ khác nhau
Nồng độ cholesterol
(ppm)
Thời gian chạy máy
(phút)
Diện tích Chiều cao
2,04 33,159 19502 543
20,4 33,190 69573 1946
204 33,178 715249 17001
1000 33,054 3309741 91236
2040 33,329 7396448 181428
Từ các kết quả về chiều cao và diện tích của các peak cholesterol chuẩn
chúng ta có thể xây dựng đường chuẩn cholesterol theo diện tích hoặc theo
chiều cao như sau:
1000000
2000000
3 00 00
4000000
5000000
6000000
7000000
8000000
500 1000 1500 2500
DiÖ
n tÝ
ch
cña
pic
ch
ole
ste
rol
0
204 204020,4
Nång ®é cholesterol (ppm)
Hình 2.1. Đƣờng chuẩn cholesterol dựa theo diện tích các peak chuẩn
cholesterol
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
21
Ch
iÒu
ca
o c
ña
pic
ch
ole
ste
rol
2500204015001000500
200000
180000
160000
140000
120000
100000
80000
60000
40000
20000
0
20420,4
Nång ®é cholesterol (ppm)
Hình 2.2. Đƣờng chuẩn cholesterol dựa theo chiều cao các peak chuẩn
cholesterol
Như vậy, dựa vào đường chuẩn cholesterol chúng ta có thể xác định
được lượng cholesterol có trong các mẫu nghiên cứu cần xác định.
2.3.2 Phƣơng pháp sinh học phân tử
2.3.2.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu động vật
* Nguyên tắc chung
Màng tế bào được phá vỡ bằng các chất tẩy mạnh kết hợp với biện
pháp cơ học, DNA trong và ngoài nhân được giải phóng cùng với các protein.
Sau đó DNA được tinh sạch nhờ proteinase K và phenol trong hỗn hợp
phenol: chloroform: isoamylalcohol với tỷ lệ thích hợp. Cuối cùng DNA được
kết tủa bằng cồn tuyệt đối 100% và để lạnh sau đó thu lại bằng ly tâm.
* Quy trình tách chiết
Một trong các mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết DNA
là làm thế nào để giảm tối đa sự phân hủy của chúng. Các phân tử DNA có
thể bị phân hủy hay đứt gãy do tác nhân cơ học (nghiền, lắc mạnh) hoặc hóa
học (bị thủy phân bởi các enzyme phân giải thoát ra môi trường khi màng tế
bào bị phá vỡ). Để đạt hiệu suất và độ tinh sạch nhất thì việc lựa chọn một
phương pháp tách chiết có nhiều ưu điểm và phù hợp với đối tượng nghiên
cứu là rất quan trọng. Vì mẫu sử dụng trong thí nghiệm là mẫu máu, nên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
22
chúng tôi đã lựa chọn phương pháp tách chiết DNA tổng số của Sambrook và
Russell [30].
Máu đông được làm tan trong bể ổn nhiệt ở 370C trong một giờ. Trong
điều kiện về nhiệt độ và thời gian như vậy, plasminogen trong huyết tương sẽ
được chuyển sang dạng hoạt động là plasmin, chất này phân hủy các protein
như fibrin, fibrinopeptit, prothrombin, nhờ đó mà các tế bào được giải phóng.
Sau đó hút máu ra các eppendorf 1,5 ml rồi bổ sung đệm phosphate buffer
saline (PBS) và ly tâm. Dung dịch muối này có tác dụng duy trì pH của máu.
Các tế bào thu được đem hòa tan trong dung dịch đệm tách có chứa EDTA và
SDS. Sự có mặt của SDS làm cho màng tế bào bị phá vỡ và giải phóng DNA
ra ngoài môi trường. Thành phần EDTA sẽ liên kết với ion Mg2+, nhờ vậy mà
hoạt động của các nulease bị ức chế để bảo vệ DNA khỏi sự phân giải của các
nuclease. Ngoài ra, protease K có trong đệm chiết sẽ cắt đứt các liên kết
peptid trong phân tử protein làm cho protein bị phân hủy. Hơn nữa pH kiềm
của dung dịch đệm chiết làm DNA trở lên ổn định cấu trúc hơn do bản chất
tích điện âm của nó, đồng thời làm giảm tương tác tĩnh điện giữa DNA với
protein histon.
Để loại bỏ protein trong hỗn hợp, mẫu được lắc mạnh với hỗn hợp
phenol: chloroform: isoamyl alcohol. Chloroform làm tăng cường hoạt động
của phenol trong việc biến tính protein nhưng không làm ảnh hưởng đến cấu
trúc của DNA. Đồng thời nó còn tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách pha
nước với pha hữu cơ. Isoamyl alcohol có tác dụng làm giảm bọt trong quá
trình tách chiết. Sau khi lắc mạnh và đem ly tâm, hỗn hợp được phân làm 3
pha: pha trên cùng là pha nước có chứa DNA, pha giữa là protein bị biến tính
và pha cuối cùng là hỗn hợp phenol, choloroform, isoamyl alcohol. Pha nước
được hút nhẹ nhàng sang ống mới. Dịch chiết này sau đó được xử lý bằng hỗn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
23
hợp chloroform: isoamyl alcohol nhằm loại bỏ hoàn toàn phenol có lẫn trong
dịch chiết và một lần nữa làm sạch DNA. Bước này có thể lặp lại 1-2 lần.
Thu tủa bằng cách bổ sung vào dịch chiết 50l CH3COONa3M,
pH=5,2 và 1 ml ethanol 100%. Ethanol có tác dụng hút lớp nước bao quanh
phân tử DNA, để lộ ra các gốc phosphate tích điện âm. Khi đó các ion Na+ sẽ
kết hợp với các gốc phosphate này khiến cho lực đẫy giữa các chuỗi
nucleotide giảm, do đó DNA bị kết tủa. Trong điều kiện -200C trong 15 giờ
thì DNA kết tủa gần như hoàn toàn. Rửa tủa bằng ethanol 70%, làm khô tủa
trong máy sấy và hòa tan tủa trong nước cất 2 lần. Trong dung dịch này có
nhiều RNA, vì thế chúng tôi đã loại bỏ RNA bằng RNAase, ủ ở 370C trong 2-
3 giờ.
Quy trình tách chiết DNA tổng số theo Sambrook và Russell [30] có
thể được tóm tắt như sau :
(1): Ủ máu đông lạnh trong 37oC trong 1 giờ cho máu tan.
(2): Hút vào mỗi eppendorf (epp, loại 1,5 ml) 500 l máu.
(3): Bổ sung 500 l dung dịch PBS 1X, sau đó vortex và li tâm 6000
vòng/phút trong 15 - 20 phút, 4
0C, đổ dịch và thu cặn.
(4): Bổ sung 1ml dịch đệm tách (buffer lysis) và 10 l protease K (20
mg/ml). Mẫu được ủ ở 650C trong 1 giờ, sau đó để ở nhiệt độ phòng.
(5): Chia vào mỗi epp 500 l dịch.
(6): Bổ sung một lượng tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol
(tỷ lệ 25:24:1), vortex kỹ, sau đó ly tâm ở 12000 vòng/ phút, 15 phút, 40C. Hút
pha trên cùng sang ống mới.
(7): Thêm một thể tích tương đương chloroform: isoamyl alcohol (tỷ lệ
24:1), vortex kỹ, sau đó ly tâm ở 12000 vòng/ phút, 15 phút, 40C. Hút pha trên
cùng sang ống mới.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
24
(8): Bổ sung 1/10 thể tích CH3COONa3M, pH 5,2 và 1ml cồn 100%, ủ
qua đêm ở - 20oC.
(9): Thu tủa bằng cách li tâm ở 12000 vòng/phút trong 15-20 phút, 4oC.
Bổ sung 500 l cồn 70% để rửa vào mỗi epp.
(10): Li tâm ở 12000 vòng/phút trong 15 phút, 4oC. Bỏ dịch và thu cặn.
(11): Làm khô tủa trong máy sấy và hòa tủa vào 50 l nước khử ion vô
trùng, búng nhẹ.
Kiểm tra sản phẩm tinh sạch DNA trên gel agarose 0,8%.
2.3.2.2 Kỹ thuật điện di DNA trên gel agarose
* Nguyên tắc chung
Điện di là kỹ thuật để tách và định lượng axit nucleic với các kích thước
và hàm lượng khác nhau. Kỹ thuật này dựa trên một đặc tính cơ bản của axit
nucleic là các đại phân tử tích điện âm do có sự có mặt của gốc PO4
3-
trên bề
mặt. Do đó, khi đặt axit nucleic trong điện trường với cường độ dòng điện và
hiệu điện thế thích hợp, chúng sẽ di chuyển dần về phía cực dương. Gel được
sử dụng trong kỹ thuật điện di là gel agarose (với các phân tử DNA có kích
thước lớn) hoặc polyacryamid (với các phân tử DNA có kích thước nhỏ).
Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng gel agarose với nồng độ 0,8% bởi gel
agarose với nồng độ này phù hợp với kích thước trung bình của các đoạn
DNA cần phân tích (1- 20kb) [2].
* Quy trình kỹ thuật
- Chuẩn bị gel agarose: Cân 0,8 gam agarose vào 100 ml dung dịch TAE
1X. Đun trong lò vi sóng đến tan hoàn toàn. Để nguội xuống khoảng 50 – 60oC,
đổ dung dịch agarose vào khay điện di có cài sẵn răng lược. Sau 30 phút, khi gel
đông cứng thì rút răng lược ra và đặt vào bể điện di có chứa sẵn dung dịch TAE
1X sao cho dung dịch TAE 1X ngập mặt gel từ 1 – 2 mm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
25
- Tra mẫu và điện di: mẫu DNA với một lượng thích hợp (3 - 8 l) được
trộn với 2,5 l đệm màu và được tra vào các giếng nhỏ trên gel. Chạy điện di
với dòng điện một chiều có cường độ dòng điện 60 – 80 mA, hiệu điện thế
100-120 V. Quan sát sự di chuyển băng màu bromophenol blue để biết lúc
nào cần ngừng điện di.
Sau khi kết thúc điện di, lấy bản gel ra khỏi khuôn và ngâm bản gel
trong dung dịch EtBr (ethidium bromide) với nồng độ 0,5 l/ml. Sau khi
ngâm 10-15 phút, lấy bản gel ra, rửa trong nước sạch và chụp ảnh dưới ánh
sáng tử ngoại 254 nm (trên máy Bio-Rad).
2.3.2.3 Nhân vùng điều khiển D- loop bằng kỹ thuật PCR
Vào năm 1985, K.Mullis đã phát minh ra phương pháp đơn giản khuếch
đại nhanh nhiều bản sao (amplification) của các đoạn DNA mà không qua tạo
dòng. Kỹ thuật này được gọi là Polymerase Chain Reaction, viết tắt là PCR,
được hiểu là phản ứng polymerase dây chuyền. Kỹ thuật này được ứng dụng
nhanh và có ý nghĩa cách mạng đối với sự phát triển của sinh học phân tử và
kỹ thuật di truyền [26].
* Nguyên tắc chung
PCR là quá trình khuếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro
do sự xúc tác của enzyme DNA taq polymerase. Enzyme này được chiết từ vi
khuẩn Thermus aquaticus. Sự khuếch đại này được thực hiện nhờ các chu
trình nhiệt lặp lại (có thể đến 35 lần) gồm đun nóng (950C), làm nguội (37-
65
0
C) và ủ lâu ở 720C. Trong dung dịch có chứa 4 loại deoxynucleotide
(dNTPs) và các cặp mồi chuyên biệt. Mồi được sử dụng ở đây là các
oligonucleotide, mỗi mồi sẽ bắt cặp bổ sung với đầu mạch đơn của DNA
khuôn tương ứng, từ đó mạch được tổng hợp kéo dài.
* Nguyên liệu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
26
- DNA khuôn phải được tinh sạch và ít bị đứt gãy , có chứa trình tự đích
cần nhân lên . Nồng độ DNA khuôn trong mỗi hỗn hợp phản ứng là 10 - 100
ng/phản ứng.
- Mồi: là yếu tố quan trọng trong phản ứng PCR bởi việc điều chỉnh nhiệt
độ gắn mồi và nồng độ mồi có ảnh hưởng lớn đến lượng sản phẩm và chất
lượng sản phẩm PCR. Nồng độ mồi xuôi và mồi ngược sử dụng trong thí
nghiệm này là 10 pmol/l (pM/l). Cặp mồi được sử dụng đó là :
+ Mồi xuôi H1255: 5’- CATCTTGGCATCTTCACTGCC - 3’.
+ Mồi ngược L16725: 5’- AGGACTACGGCTTGAAAGC - 3’.
H, L là chữ viết tắt cho chuỗi nặng (Heavy) và chuỗi nhẹ (Light), chữ
số là vị trí nucleotide trên mtDNA trong trình tự đầy đủ của gà mà đầu 3’ của
mồi tiếp hợp vào (Desjadins và Morais, 1990) [17]. Cặp mồi H1255- L16725
được lựa chọn vì đây là cặp mồi “bảo thủ”, nó có thể được dùng cho nhiều
loài, giống khác nhau trong bộ gà.
- Dung dịch đệm: PCR được thực hiện trong môi trường đệm phù hợp với
hoạt động của enzyme và nó có giá trị pH là 7,2. Trong thí nghiệm này, chúng
tôi sử dụng đệm là buffer dream taq. Nó phù hợp với hoạt động của emzyme
taq polymerase và trong dung dịch đệm này có chứa Mg2+. Vai trò của ion
Mg
2+
là tạo phức với các dNTPs và gắn chúng với enzyme, kích hoạt và tăng
cường sự kết hợp giữa mồi và khuôn. Nồng độ Mg2+ quá thấp sẽ làm giảm
hoạt tính của enzyme. Tuy nhiên, nếu nồng độ quá cao sẽ ức chế hoạt động
của enzyme. Sau khi khảo sát chúng tôi sử dụng nồng độ Mg2+ là 10 mM cho
kết quả PCR tốt nhất.
- 4 loại dNTPs: nồng độ của 4 loại dNTPs phải bằng nhau và phụ thuộc
nhiều vào kích thước của đoạn DNA đích, nồng độ của mồi và MgCl2. Nồng
độ các dNTPs lớn hơn 4mM sẽ ức chế phản ứng PCR do ion Mg2+ bị cô lập,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
27
dễ dẫn đến sự nhân lên của các đoạn không cần thiết. Qua thử nghiệm, chúng
tôi thấy, nồng độ của các dNTPs là 1mM là phù hợp.
- Taq DNA polymeaza của hãng Fermentas
- Nước khử ion vô trùng.
Thông thường phản ứng PCR cho một mẫu với tổng thể tích là 25 l, gồm
các thành phần sau:
Nước 14,8 l
Buffer dream taq 2,5 l
dNTPs 2,5 l
H1255 (mồi xuôi ) 1 l
L16725 (mồi ngược) 1 l
Taq DNA polymeraza 0,2 l
DNA khuôn 3 l
Tổng thể tích 25 l
PCR là một quá trình lặp lại gồm nhiều chu kỳ (tổng số chu kỳ chúng
tôi tiến hành là 35 chu kì), mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:
- Giai đoạn biến tính: DNA khuôn bị biến tính ở nhiệt độ 94-950C trong
khoảng một phút để tách phân tử DNA thành hai sợi đơn. Mỗi sợi đơn sẽ trở
thành một sợi khuôn cho mồi bám vào. Thời gian biến tính tùy thuộc vào
hàm lượng G-C và chiều dài của phân tử DNA. Chúng tôi chọn nhiệt độ biến
tính là 94
0C trong một phút. Trước khi bước vào chu kì thứ nhất, nhiệt độ
biến tính được đặt ở 940C trong 4 phút để đảm bảo phân tử DNA được biến
tính hoàn toàn.
- Giai đoạn gắn mồi: ở giai đoạn này, nhiệt độ của phản ứng được hạ
xuống trong khoảng 37- 650C để cho mồi kết hợp vào sợi khuôn. Nhiệt độ và
thời gian của bước này thay đổi, phụ thuộc vào trình tự mồi. Chúng tôi đã thử
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
28
chạy phản ứng ở một số giá trị nhiệt độ khác nhau trong khoảng nhiệt độ này
và chọn được nhiệt độ gắn mồi là 550C.
- Giai đoạn kéo dài mạch: nhiệt độ tăng lên 720C để cho enzyme Taq
polymerase hoạt động tốt nhất. Bước này cần 1-5 phút tùy thuộc chiều dài
đoạn DNA cần khuếch đại. Tốc độ tổng hợp của phản ứng khoảng 1000
nuleotide/ phút. Trình tự vùng D-loop quan tâm có kích thước khoảng 1,3 kb
nên thời gian giai đoạn kéo dài chuỗi là 1 phút 20 giây.
Sản phẩm cuối cùng của chu kỳ trước sẽ là khuôn mẫu cho chu kỳ tiếp
theo. Sau mỗi chu kỳ, số lượng DNA được tăng lên gấp đôi. Sau một thời
gian, lượng DNA được tăng lên theo cấp số nhân nhờ đó mà có đủ lượng
DNA phục vụ cho thí nghiệm tiếp theo. Sau khi kết thúc 35 chu kì, chúng tôi
đặt nhiệt độ ở 720C trong mười phút để đảm bảo sự tổng hợp được kết thúc
hoàn toàn. Sản phẩm PCR được giữ 40C.
* Quy trình nhiệt của phản ứng PCR có thể được tóm tắt như sau:
Bước 1: 94oC - 4 phút
Bước 2: 94oC - 1 phút
Bước 3: 55oC - 1 phút
Bước 4: 72oC - 1 phút 20 giây
Từ bước 2 đến bước 4 lặp lại 34 lần.
Bước 5: 72oC - 10 phút.
Sản phẩm PCR được giữ ở 4oC.
Sau khi phản ứng kết thúc, lấy 8 l sản phẩm PCR điện di kiểm tra trên
gel agarose 0,8% để kiểm tra sản phẩm PCR.
2.3.2.4 Tinh sạch sản phẩm PCR
Sau khi điện di kiểm tra phản ứng PCR đã thành công, chúng tôi tiến
hành tinh sạch sản phẩm PCR. Để tinh sạch sản phẩm PCR, chúng tôi tiến
hành điện di toàn bộ sản phẩm PCR thu được ở mỗi mẫu. Sau đó chúng tôi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
29
tiến hành thôi gel theo protocol của hãng Promega để thu sản phẩm PCR tinh
sạch. Quy trình được tiến hành như sau:
- Đổ gel và chạy điện di sản phẩm PCR.
- Cân ống eppendorf (epp) loại 1,5 ml.
- Cắt băng chứa sản phẩm PCR cho vào epp đã cân.
- Cân lại epp có chứa gel (mang sản phẩm PCR để biết được trọng lượng
của băng gel ta vừa cắt).
- Bổ sung dung dịch mambrane binding (dung dịch 1) với tỷ lệ 1 mg gel:
1 l dung dịch 1.
- Ngâm trong nước nóng (nhiệt độ khoảng 50-650C) để gel tan hết.
- Chuyển sang cột và để ở nhiệt độ phòng khoảng 1 phút.
- Ly tâm 12000 vòng/phút, 4
0
C, trong 1 phút, sau đó loại bỏ dịch phía
dưới.
- Bổ sung 700 l manbrane wash (dung dịch 2) và ly tâm 12000 vòng/
phút, 4
0C, trong một phút, sau đó cũng loại bỏ dịch phía dưới.
- Bổ sung thêm 500 l dung dịch 2 và ly tâm 12000 vòng/phút, 40C,
trong 5 phút, sau đó cũng loại bỏ dịch phía dưới.
- Ly tâm lại một phút, 12000 vòng/ phút, 40C.
- Cho vào máy sấy 5 phút.
- Bổ sung thêm khoảng 30-50 l nước cất 2 lần, để ở nhiệt độ phòng
trong khoảng một phút.
- Ly tâm 12000 vòng/phút, 4
0C, trong một phút.
Sau khi đã thôi gel tinh sạch sản phẩm PCR, chúng tôi tiến hành điện di
để kiểm tra sản phẩm thôi gel trên gel agarose 0,8%. Nếu điện di xuất hiện
băng sáng rõ, tập trung, không bị smear, có kích thước trùng với kích thước
đoạn DNA cần nhân trong phản ứng PCR thì sản phẩm thôi gel đủ chất lượng
để tiến hành đọc trình tự.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
30
2.3.2.5 Phƣơng pháp xác định trình tự DNA
*Nguyên tắc chung
Trình tự vùng D-loop được xác định dựa trên nguyên tắc chung của
phương pháp Sanger [2], [10] tạo ra các đoạn oligonucleotide hơn kém nhau
một nucleotide, kết thúc bởi các ddNTP được đánh dấu huỳnh quang. Để tạo
ra các đoạn kết thúc bằng các loại ddNTP khác nhau, chúng tôi tiến hành phản
ứng PCR sử dụng BigDye Terminaor v3.1 Cycle Sequencing Kit đã có chứa
sẵn các hóa chất cần thiết của phản ứng nhân gen để đọc trình tự như: dNTPs,
ddNTPs, DNA polymerase... Do đó chỉ cần bổ sung thêm DNA khuôn (sử
dụng sản phẩm thôi gel của phản ứng PCR) và mồi phù hợp (cặp mồi H1255-
L16725). Phản ứng được thực hiện trong một ống vì 4 loại ddNTP đã được
đánh dấu bằng các màu khác nhau. Thành phần của phản ứng khuyếch đại
gene để đọc trình tự bao gồm: mồi 3.2 pM, DNA của sản phẩm PCR và nước
với tổng thể tích 15l. Vì đoạn gen cần xác định có chiều dài khoảng 1,3 kb
nên chúng tôi đã xác định trình tự nucleotide từ hai chiều của tất cả các đoạn
DNA có trong sản phẩm PCR nhờ cặp mồi H1255- L16725 và nhờ máy xác
định trình tự ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer, sau đó sử dụng các phần
mềm Seqscape và Bio Edit để kết hợp số liệu của hai chiều đọc, chúng tôi thu
được trình tự hoàn chỉnh của vùng D-loop của 3 giống gà Ri, Ác, Tre.
* Chu trình nhiệt
Chu trình nhiệt cho máy PCR trong máy luân nhiệt Genamp PCR
System 9700 như sau: 940C- 1 phút; (960C- 10 giây, 500C- 5 giây, 600C- 4
phút) x 25 chu kỳ. Sau đó sản phẩm được giữ ở 4 0C.
2.3.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu
Những số liệu thu được, được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học
trên máy vi tính bằng chương trình Excel theo hướng dẫn của Chu Văn Mẫn
[9] với các thông số:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
31
Giá trị trung bình mẫu
n
i
Xi
n
X
1
1
Độ lệch chuẩn:
2
1
)(
1
n
i
X
XXi
n
S
với n
30
2
1
)(
1
1
n
i
X
XXi
n
S
với n < 30
m
X
=
n
S
X
( với n
30)
m
X
=
1n
S
X
( với n < 30)
Trong đó:
X
S
: Độ lệch chuẩn.
X
: Là giá trị trung bình mẫu.
Xi: Là giá trị của từng mẫu.
n: Là số lần lặp lại thí nghiệm.
m
X
: Sai số trung bình
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
32
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Hàm lƣợng cholesterol trong trứng của các mẫu nghiên cứu
Chúng tôi thu thập mẫu trứng của các giống gà nghiên cứu đồng thời
chúng tôi cũng thu thập thêm trứng của vịt Bầu và trứng gà Tam Hoàng mà
chúng ta hay sử dụng hàng ngày. Mục đích là để có thể so sánh hàm lượng
cholesterol của các mẫu gà nghiên cứu với hàm lượng cholesterol của các loại
trứng mà chúng ta hay sử dụng trong các bữa ăn hàng ngày để có thể rút ra kết
luận về việc sử dụng loại trứng mà không lo hàm lượng cholesterol cao. Sau
đó, chúng tôi tiến hành phân tích theo các bước trình bày ở chương 2 và cuối
cùng dung dịch chứa cholesterol được định lượng trên sắc ký lỏng (HPLC)
bằng cách so sánh diện tích (hoặc chiều cao) của peak cholesterol trong mẫu
với diện tích (hoặc chiều cao) của peak cholesterol chuẩn. Kết quả c hiều cao
và diện tích của các peak cholesterol trong trứng của các mẫu gà nghiên cứu
được thể hiện qua bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả chiều cao và diện tích peak cholesterol trong trứng của các
mẫu nghiên cứu
Mẫu nghiên cứu Thời gian chạy máy
(phút)
Diện tích Chiều cao
gà Ri 31,508 1017035 25295
gà Ác 32,233 845304 20628
gà Tam Hoàng 31,836 819183 20477
gà Tre 32,418 1105818 26763
vịt Bầu 31,632 1195163 29586
Chúng tôi đã lặp lại thí nghiệm 3 lần. Dựa vào công thức xác định hàm
lượng cholesterol đã trình bày ở chương 2 thì hàm lượng cholesterol tỷ lệ
thuận với diện tích (hoặc chiều cao) của peak mẫu nghiên cứu . Nếu diện tích
(chiều cao) peak mẫu nghiên cứu càng lớn thì hàm lượng cholesterol của mẫu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
33
nghiên cứu càng cao. Chúng tôi đã xác định được hàm lượng cholesterol ở
các mẫu thí nghiệm và được thể hiện qua bảng 3.2 và hình 3.1.
Bảng 3.2. Hàm lượng cholesterol trong trứng của các mẫu nghiên cứu
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
Trung ga Ri
Trung ga Ac
Trung Ga Tre
Trung ga Tam
Hoang
Trung vit Bau
Hình 3.1. Biểu đồ hàm lượng cholesterol trong trứng của các mẫu nghiên
cứu
Qua bảng 3.2 và hình 3.1, chúng tôi nhận thấy hàm lượng cholesterol
trong trứng vịt Bầu là lớn nhất 477,7 mg/100 g, sau đó là trứng gà Tre 465,9
mg/100 g, trứng gà Ri 438 mg/100 g, trứng gà Ác 340 mg/100 g. Hàm lượng
cholesterol thấp nhất là trứng gà Tam Hoàng 318,8 mg/100 g. Tuy nhiên, hàm
Các mẫu nghiên cứu Hàm lượng cholesterol
(mg/100 g)
X
mX
Trứng gà Ri 438,1 0,09
Trứng gà Ác 340,6 0,11
Trứng gà Tre 465,9 0,15
Trứng gà Tam Hoàng 318,8 0,1
Trứng vịt Bầu 477,7 0,13
Mẫu nghiên cƣ́u
H
à
m
l
ƣ
ợ
n
g
ch
o
le
st
er
o
l
(m
g
/1
0
0
g
)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
34
lượng cholesterol trong một quả trứng thì chủ yếu tập trung ở lòng đỏ, còn ở
lòng trằng không đáng kể. Nhu cầu cholesterol tối đa của một người bình
thường/một ngày là 300 mg/một ngày. Như vậy, chúng ta thấy rằng hàm
lượng cholesterol trong trứng gà là khá cao. Chính vì vậy , người sử dụng cần
phải c ăn cứ vào tình hình sức khỏe của bản thân (có hay không có những
bệnh về tim mạ ch liên quan đến cholesterol ) và dựa vào hàm lượng
cholesterol của các loại trứng mà chúng tôi đã xác định để ch ọn loại trứng và
số lượng trứng phù hợp để đảm bảo một ngày cung cấp cho cơ thể tối đa 300
mg cholesterol/một ngày . Đồng thời những người mà có hàm lượng
cholesterol trong máu cao hơn 5,6 mmol/lít thì mỗi tuần chỉ nên ăn tối đa 4
quả trứng/một tuần và cũng nên lựa chọn trứng gà Tam Hoàng để ăn, hạn chế
ăn các loại trứng vịt Bầu, trứng gà Tre và gà Ri để đảm bảo sức khỏe , ngăn
ngừa và hạn chế các bệnh về tim mạch .
3.2 Xác định trình tự nucleotide của vùng D-loop và đánh giá đa dạng di
truyền của 3 mẫu gà nghiên cứu
Để xác định trình tự nucleotide của vùng D-loop và đánh giá đa dạng di
truyền của 3 mẫu gà nghiên cứu là gà Ri, Ác, Tre, chúng tôi tiến hành tách
chiết DNA tổng số, dùng kỹ thuật PCR để nhân vùng điều khiển trong ty thể
nhằm xác định trình tự của vùng D-loop. So sánh các trình tự này với mộ t số
trình tự công bố trên GenBank để tìm ra sự đa dạng di truyền của chúng .
3.2.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà
Hầu hết các nghiên cứu về sinh học phân tử đều bắt đầu từ việc thu
nhận và tinh sạch DNA đủ lớn và ở trạng thái tương đối nguyên vẹn cho các
thí nghiệm tiếp theo. Một trong các mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật
tách chiết DNA là làm thế nào để giảm tối đa sự phân hủy của chúng. Để đạt
hiệu suất và độ tinh sạch nhất thì việc lựa chọn một phương pháp tách chiết có
nhiều ưu điểm và phù hợp với đối tượng nghiên cứu là rất quan trọng. Vì mẫu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
35
sử dụng trong thí nghiệm là mẫu máu, nên chúng tôi đã lựa chọn phương pháp
tách chiết DNA tổng số của Sambrook và Russell [30]. Kiểm tra sản phẩm
tinh sạch trên gel agarose 0,8%. Kết quả được thể hiện trên hình 3.2.
Hình 3.2. Kết quả điện di DNA tổng số
M: marker; 1. Gà Ri; 2. Gà Ác; 3. Gà Tre
Kết quả cho thấy, cả 3 băng DNA tổng số của mẫu gà Ri, Ác, Tre đều
sáng tập trung và tương đối rõ nét. Ba băng DNA thu được có kích thước
khoảng 21kb. Như vậy, có thể đánh giá DNA tổng số thu được đã đạt yêu cầu
về nồng độ và độ tinh sạch để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2 Nhân vùng điều khiển D-loop của DNA ty thể
Bằng kỹ thuật PCR, chúng tôi đã khuyếch đại được vùng điều khiển D-
loop. Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 0,8% với thể tích là 8 l.
Kết quả PCR được thể hiện trên hình 3.3.
M 1 2 3
21kb
5,1kb
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
36
Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR
M:Marker; 1. Gà Ri; 2. Gà Ác; 3.Gà Tre
Kết quả cho thấy, cả 3 mẫu đều xuất hiện băng DNA có kích thước khoảng
1,3 kb, phù hợp với tính toán lý thuyết. Các băng sáng đậm, rõ nét, tập trung,
chứng tỏ sản phẩm PCR đặc hiệu, chúng tôi đã nhân được vùng D-loop. Sản
phẩm PCR sẽ được sử dụng ở các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.3 Xác định trình tự vùng điều khiển D-loop của DNA ty thể
Sau khi tinh sạch sản phẩm PCR (thôi gel sản phẩm PCR), chúng tôi
tiến hành xác định trình tự đoạn D-loop trên máy đọc trình tự tự động trên cơ
sở của phương pháp Sanger. Nguyên tắc và cách thức đọc đã được mô tả
trong mục 2.3.2.5.
Xác định trình tự nucleotide từ hai chiều của tất cả các đoạn DNA có
trong sản phẩm PCR nhờ cặp mồi H1255- L16725 và nhờ máy xác định trình
tự ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer, sau đó sử dụng các phần mềm
Seqscape và Bio Edit để kết hợp số liệu của hai chiều đọc, chúng tôi thu được
trình tự hoàn chỉnh của vùng D-loop của 3 giống gà Ri, Ác, Tre.
Sau khi đã xác định được trình tự vùng D-loop của 3 mẫu gà nghiên
cứu là gà Ri, Ác ,Tre, chúng tôi tiến hành so sánh trình tự vùng D -loop của
chúng với nhau và với hai trình tự D-loop đã được công bố trên GenBank là
3
1.3kb
M 1 2
1.5kb
1.0 kb
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
37
trình tự D-loop của gà Gallus gallus (gà rừng đỏ ) gốc Nhật mã số AB114078
[24] và gà Gallus gallus gallus (Cochin-Chinese Red Jungle Fowl) mã số
NC007236 [27], chúng tôi thu được kết quả hình 3.4.
10 20 30 40 50 60
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AB114078 aattttattt tttaacctaa ctcccctact aagtgtaccc cccctttccc ccccaggggg
AC -......... .......... .......... .......... .......... ..........
RI C......... .......... .......... .......... .......... ..........
TRE C......... .......... .......... .......... .......... ..........
NC007236 .......... .......... .......... .......... .......... ..........
70 80 90 100 110 120
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AB114078 ggtatactat gcataatcgt gcatacattt atataccaca tatattatgg taccggtaat
AC .......... .......... .......... .......... .......... ..........
RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........
TRE .......... .......... .......... .......... .......... ..........
NC007236 .......... .......... .......... .......... .......... ..........
130 140 150 160 170 180
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AB114078 atatactata tatgtactaa acccattata tgtatacggg cattaaccta tattccacat
AC .......... .......... .......... .......... ......t... ..........
RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........
TRE .......... .......... .......... .......... ......t... ..........
NC007236 .......... .......... .......... .......... ......t... ..........
190 200 210 220 230 240
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AB114078 ttctcccaat gtccattcta tgcatgatcc aggacatact catttaccct ccccatagac
AC .......... .......... .......... .a........ ....c..... ..........
RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........
TRE .......... .......... .......... .a......T. ....c..... ..........
NC007236 .......... .......... .......... .......... ....c..... ..........
250 260 270 280 290 300
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AB114078 agttccaaac cactatcaag ccacctaact atgaatggtt acaggacata aatctcactc
AC .....t.... .......... .......... .......... .......... ..........
RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........
TRE .....t.... .......... .......... .......... .......... ..........
NC007236 ..c....... .....c.... t......... .......... g......... .....t....
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
38
310 320 330 340 350 360
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AB114078 tcatgttctc cccccaacaa gtcacctaac tatgaatggt tacaggacat acatctaact
AC .......... ....t..... .......... .......... .......... ....T.....
RI .......... .......... .......... .......... .......... ....T.....
TRE .......... ....t..... .......... .......... .......... ....T.....
NC007236 .....c...t .......... .......... .......... .......... ....T.....
370 380 390 400 410 420
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AB114078 accatgttct aacccatttg gttatgctcg ccgtatcaga tggatttatt gatcgtccac
AC .......... .......... .......... .......... .......... ..........
RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........
TRE .......... .......... .......... .......... .......... ..........
NC007236 .......... .......... .......... .......... .......... ..........
430 440 450 460 470 480
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AB114078 ctcacgagag atcagcaacc cctgcctgta atgtacttca tgaccagtct caggcccatt
AC .......... .......... .......... .......... .......... ..........
RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........
TRE .......... .......... .......... .......... .......... ..........
NC007236 .......... .......... .......... .......... .......... ..........
490 500 510 520 530 540
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AB114078 ctttccccct acacccctcg cccaacttgc cttccaccgt acctctggtt cctcggtcag
AC .......... .......... ...t...... .......... .......... ..........
RI .......... .......... ...t...... .......... .......... ..........
TRE .......... .......... ...t...... .......... .......... ..........
NC007236 .......... .......... ...t...... .......... .......... ..........
550 560 570 580 590 600
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AB114078 gcacatccca tgcataactc ctgaactttc tcacttttca cgaagtcatc tgtggattat
AC .......... .......... .......... .......... .......... ..........
RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........
TRE .......... .......... .......... .......... .......... ..........
NC007236 .......... .......... .......... .......... .......... ..........
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
39
610 620 630 640 650 660
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AB114078 cttcccctct ttagtccgtg atcgcggcat cttctctctt ctattgctgt tggttccttc
AC .......... .......... .......... .......... .......... ..........
RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........
TRE .......... .......... .......... .......... .......... ..........
NC007236 .......... .......... .......... .......... .......... ..........
670 680 690 700 710 720
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AB114078 tctttttggg gcttcttcac aggttgccct tcacagtgcg ggtgcggagt gctattcaag
AC .......... .......... .......... .......... .......... ..........
RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........
TRE .......... .......... .......... .......... .......... ..........
NC007236 .......... .......... .....a.... .......... .......... ..........
730 740 750 760 770 780
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AB114078 tgaagcctgg actacacctg cgttgcgtcc tatcctagtc ctctcgtgtc cctcgatgag
AC .......... .......... .......... .......... .......... ..........
RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........
TRE .......... .......... .......... .......... .......... ..........
NC007236 .......... .......... .......... .......... .......... ..........
790 800 810 820 830 840
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AB114078 acggtttgcg tgtatgggga atcatcttga cactgatgca ctttggatcg catttggtta
AC .......... .a........ .......... .......... .......... ..........
RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........
TRE .......... .......... .......... .......... .......... ..........
NC007236 .......... .......... .......... .......... .......... ..........
850 860 870 880 890 900
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AB114078 tggttcttcc accccccc-g gtaaatggtg ctatttagtg aatgcttgtc ggacatattt
AC .......... ........-. .......... .......... .......... ..........
RI .......... ........-. .......... .......... .......... ..........
TRE .......... ........c. .......... .......... .......... ..........
NC007236 .......... ........c. .......... .......... .......... ..........
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
40
910 920 930 940 950 960
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AB114078 ttatcaattt tcacttcctc tattttcttc acaaaactag gaaattcacc acaatttttt
AC .......... .......... .......... .......... .......... ..........
RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........
TRE .......... .......... .......... .......... .......... ..........
NC007236 .......... .......... .......... .......... .......... ..........
970 980 990 1000 1010 1020
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AB114078 c-tttgttat tttttaattt tttttttatt tattaaaaac attttttaaa aaactaaatt
AC .-........ .......... .......... .T........ .......... ..........
RI .-........ .......... .......... .T........ .......... ..........
TRE .-........ .......... .......... .T........ .......... ..........
NC007236 .t........ .......... .......... .T........ .......... ..........
1030 1040 1050 1060 1070 1080
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AB114078 acatacaaac taccgcataa aatccctcaa actatacaaa cgtttatcgt ataatatata
AC .......... .g........ .......... .......... .......... ..........
RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........
TRE .......... .......... .......... .......... .......... ..........
NC007236 .......... .......... .......... .......... .......... ..........
1090 1100 1110 1120 1130 1140
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AB114078 tacattattg tttattctat cattattaga gaaactccac taccaaaacc atcattaaaa
AC .......... .......... .......... .......... .......... ..........
RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........
TRE .......... .......... .......... .......... .......... ..........
NC007236 .......... .......... .......... .......... .......... ..........
1150 1160 1170 1180 1190 1200
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AB114078 caaaaattta catgccactt aactcccctc acaaacaatc gttatttata ttgttaatta
AC .......... .......... .......... .......... .......... ..........
RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........
TRE .......... .......... .......... .......... .......... ..A.......
NC007236 .......... .......... .......... .......... .......... ..........
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
41
1210 1220
....|....| ....|....| ...
AB114078 gcaaacacaa aacccgcctt cta
AC .......... .....A.... ...
RI .......... .......... ...
TRE .......... .....A.... ...
NC007236 .......... .......... ...
Hình 3.4. So sánh trình tự đoạn D-loop của 3 mẫu gà Ri, Ác, Tre với gà
Gallus gallus gallus mã số NC007236 và gà Gallus gallus gốc Nhật mã số
AB114078
* So sánh trình tự của gà Ri, gà Ác, gà Tre nuôi tại Bắc Giang với trình
tự tham khảo mã số NC007236, chúng tôi nhận thấy có 21 điểm đa hình/đột
biến (tức là khác biệt nucleotide). Mẫu gà Ác có 17 điểm (chiếm 1,39%), mẫu
gà Ri có 13 điểm (chiếm 1,06 %) và mẫu gà Tre có 15 điểm khác biệt so với
NC007236 (chiếm 1,23 %). Trong 21 điểm khác biệt này, phần lớn là đột biến
thay thế. Ngoài ra còn có đột biến mất nucleotid e tại 3 vị trí đó là : tại vị trí số
1 bị mất nucleotide A ở gà Ác , tại vị trí 859 mất nucleotid e C ở gà Ác và gà
Ri, tại vị trí 962 mất nucleotid e T ở gà Ri, Ác, Tre. Những đột biến thay thế
làm cho trình tự nucleotide của các mẫu gà nghiên cứu khác với NC007236
như sau: thay thế A bằng C (AC) tại vị trí nucleotide số 1 của mẫu gà Ri và
gà Tre; thay thế T thành C (TC) tại vị trí 167 ở gà Ri, ở vị trí 261, 296, 310
ở gà Ri, Ác, Tre; thay thế G thành A (GA) tại vị trí 212, 1216 của gà Ác và
gà Tre, tại vị trí 281 ở gà Ri , Ác, Tre, tại vị trí 792 của mẫu gà Ác và 1193
của mẫu gà Tre; thay thế C thành T (CT) tại vị trí 219 của gà Tre , tại vị trí
225 của gà Ri, tại vị trí 246, tại vị trí 315 của gà Ác và Tre , tại vị trí 243, tại vị
trí 306 ở gà Ri, Ác, Tre; thay thế A thành G (AG) tại vị trí 686 của gà Ác,
Ri, Tre, tại vị trí 1032 ở gà Ác.
* So sánh trình tự gà Ri, gà Ác, gà Tre với trình tự tham khảo mã số
AB114078 chúng tôi nhận thấy có 15 điểm đa hình/đột biến. Mẫu gà Ác có 11
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
42
điểm (chiếm 0,9%), mẫu gà Ri có 4 điểm (chiếm 0,33%) và mẫu gà Tre có 13
điểm khác biệt so với trình tự tham khảo (chiếm 0,98%). Trong 15 điểm khác
biệt này, phần lớn là đột biến thay thế. Riêng ở mẫu gà Ác, tại vị trí
nucleotide số 1 bị mất nucleotide A so với trình tự tham khảo, đồng thời ở
mẫu gà Tre tại vị trí nucleotide số 859 có thêm nucleotide là C trong khi trình
tự tham khảo, mẫu gà Ri và mẫu gà Ác không có nucleotide này. Còn lại là
các đột biến thay thế làm cho trình tự nucleotide của các mẫu gà nghiên cứu
khác với trình tự tham khảo như sau: thay thế A bằng C (AC) tại vị trí
nucleotide số 1 của mẫu gà Ri và gà Tre; thay thế C thành T (CT) tại vị trí
167, 246, 315 của mẫu gà Ác và gà Tre, tại vị trí 355 của cả 3 mẫu gà Ri, Ác
và Tre, tại vị trí 219 của mẫu gà Tre; thay thế G thành A (GA) tại vị trí
212, 1216 của 2 mẫu gà Ác và gà Tre, tại vị trí 792 của mẫu gà Ác và 1193
của mẫu gà Tre; thay thế T thành C (TC) tại vị trí 225 của mẫu gà Ác và
Tre; thay thế A thành T (AT) tại vị trí 504, 992 của cả 3 mẫu gà Ri, Ác và
Tre; thay thế A thành G (AG) tại vị trí 1032 của mẫu gà Ác.
Ngoài ra giữa 3 mẫu gà Ri, Ác, Tre còn khác biệt nhau ở 11 điểm đa
hình (chiếm 0,9%). Cụ thể : giữa gà Ác và gà Tre khác nhau 6 điểm, giữa gà
Ác và gà Ri khác nhau 9 điểm và giữa gà Tre và gà Ri khác nhau 9 điểm đa
hình. Như vậy , trình tự nucleotide của 2 mẫu gà Ác và Tre tương đối giống
nhau nhưng lại có nhiều điểm khác biệt so với mẫu gà Ri . Sự khác biệt
nucleotide giữa 2 mẫu gà Ác và gà Tre so với gà Ri được thể hiện trên bảng
3.3.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
43
Bảng 3.3. Các điểm nucleotide khác biệt giữa 2 mẫu gà Ác và Tre so với gà
Ri
Vị trí nucleotide trên ty thể gà Ri gà Ác và Tre
167 C T
212 G A
225 T C
246 C T
315 C T
1216 G A
Sự sai khác nucleotid e giữa 3 mẫu gà Ri , Ác, Tre với 2 trình tự tham
khảo là NC007236 và AB114078 được thống kê ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Thống kê các điểm đa hình ở 3 mẫu gà nghiên cứu so với gà
Gallus gallus gallus mã số NC007236 và gà Gallus gallus gốc Nhật mã số
AB114078
STT
So với gà Gallus gallus gallus mã số
NC007236
So với gà Gallus gallus gốc Nhật mã
số AB114078
Mẫu
gà
Thay đổi
nucleotide
Vị
trí
trên
ty
thể
Kiểu biến
dị
Mẫu
gà
Thay đổi
nucleotide
Vị trí
trên
ty thể
Kiểu biến
dị
1
Ác del A 1 Mất 1
nucleotide
Ác del A 1 Mất 1
nucleotide
2
Tre, Ri AC 1 Dị hoán Tre,
Ri
AC 1 Dị hoán
3
Ri TC 167 Đồng
hoán
Ác,
Tre
CT 167 Đồng
hoán
4
Ác,
Tre
GA 212 Đồng
hoán
Ác,
Tre
GA 212 Đồng
hoán
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
44
5
Tre CT 219 Đồng
hoán
Tre CT 219 Đồng
hoán
6
Ri CT 225 Đồng
hoán
Ác,
Tre
TC 225 Đồng
hoán
7
Ác,
Tre, Ri
CT 243 Đồng
hoán
Ác,
Tre
CT 246 Đồng
hoán
8
Ác,
Tre
CT 246 Đồng
hoán
Ác,
Tre
CT 315 Đồng
hoán
9
Ác,
Tre, Ri
CT 256 Đồng
hoán
Ác,
Tre,
Ri
CT 355 Đồng
hoán
10
Ác,
Tre, Ri
TC 261 Dị hoán Ác,
Tre,
Ri
AT 504 Dị hoán
11
Ác,
Tre, Ri
GA 281 Đồng
hoán
Tre Thêm C 859 Thêm 1
nucleotide
12
Ác,
Tre, Ri
TC 296 Đồng
hoán
Ác GA 792 Đồng
hoán
13
Ác,
Tre, Ri
CT 306 Đồng
hoán
Ác,
Tre,
Ri
TC 992 Đồng
hoán
14
Ác,
Tre, Ri
TC 310 Đồng
hoán
Ác TC 1032 Đồng
hoán
15
Ác,Tre CT 315 Đồng
hoán
Tre GA 1193 Đồng
hoán
16
Ác,
Tre, Ri
AG 686 Đồng
hoán
17
Ác GA 792 Đồng
hoán
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
45
18
Ác, Ri del C 859 Mất 1
nucleotide
19
Ác,
Tre, Ri
del T 962 Mất 1
nucleotide
20
Ác AG 103
2
Đồng
hoán
21
Tre GA 119
3
Đồng
hoán
Để đánh giá sự đa dạng di truyền của vùng D -loop nhằm xác định mối
quan hệ di truyền giữa các mẫu gà nghi ên cứu , chúng tôi đã sử dụng phần
mềm Mega để so sánh trình tự vùng điều khiển D-loop của 3 mẫu gà nghiên
cứu với trình tự các chủng gà đã được công bố đó là: gà Gallus gallus gallus
(Cochin-Chinese Red Jungle Fowl) mã số NC 007236 [27] và Gallus gallus
(gà rừng đỏ) gốc Nhật lấy trình tự GenBank mang mã số AB114078 [24] để so
sánh mức sai khác về trình tự nucleotide và đánh giá mối quan hệ di truyền
giữa chúng, kết quả được thể hiện qua bảng 3.5 và hình 3.5.
Bảng 3.5. Hệ số tương đồng về trình tự nucleotide vùng D-loop ở mẫu
nghiên cứu với một số mẫu trên GenBank
1 2 3 4 5
1 99,67 99,1 99,02 98,77 1 AB114078
2 0,33 99,26 99,26 98,94 2 Ri
3 0,9 0,74 99,51 98,61 3 Ác
4 0,98 0,74 0,49 98,77 4 Tre
5 1,23 1,06 1,39 1,23 5 NC007236
1 2 3 4 5
Qua bảng 3.5 thấy rằng, các mẫu nghiên cứu có độ tương đồng cao so
với các mẫu trên Ngân hàng gen NCBI (98,61 - 99,67 %), mẫu gà Ri có độ
tương đồng cao nhất với mẫu có mã số AB 114078 (99,67%), sau đó là mẫu
gà Ác và mẫu gà Tre có độ tương đồng với nhau là 99,51%, cặp có hệ số
tương đồng thấp nhất là mẫu gà Ác so với NC007236 (98,61 %).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
46
Từ các kết quả so sánh trình tự nucleotid e vùng D -loop của các mẫu gà
ở trên, chúng tôi thể hiện kết quả trên biểu đồ hình cây (hình 3.5).
Hình 3.5. Quan hệ di truyền của một số giống gà
Kết quả thu được hình 3.5 cho thấy các giống gà trên được chia thành 2
nhánh lớn: nhánh I gồm AB 114078, gà Ri, gà Ác, và gà Tre ; nhánh II chỉ có
gà NC 007236. Trong nhánh I lại chia thành 2 nhánh: nhánh I 1 gồm gà
AB114078 và gà Ri có mức độ đồng nhất về mặt di truyền rất cao là 99,67%.
Nhánh I2 gồm 2 giống gà Ác và gà Tre, mức độ đồng nhất về mặt di truyền
giữa chúng là 99,51 %. Nhìn chung, sự sai khác giữa các giống gà này không
nhiều.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
47
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận
1.1 Hàm lượng cholesterol trong trứng vịt Bầu là lớn nhất 477,7 mg/100g,
sau đó là trứng gà Tre 465,9 mg/100g, trứng gà Ri 438 mg/100g, trứng gà Ác
340 mg/100g. Hàm lượng cholesterol thấp nhất là trứng gà Tam Hoàng 318,8
mg/100g.
1.2 Tách chiết và tinh sạch được DNA tổng số từ máu gà thuộc 3 mẫu nghiên
cứu là gà Ri, Ác, Tre. Nhân bản thành công vùng D-loop của 3 mẫu gà này
với kích thước khoảng 1,3 kb bằng kỹ thuật PCR nhờ cặp mồi chuyên biệt là
H1255-L16725.
1.3 Xác định được trình tự vùng điều khiển D-loop gồm 1223 nucleotide của
3 mẫu gà nghiên cứu Ri, Ác, Tre và phát hiện được 15 điểm đa hình về
nucleotide giữa 3 mẫu gà nghiên cứu với trình tự tham khảo mang mã số
AB114078 và 21 điểm đa hình giữa 3 mẫu gà nghiên cứu với trình tự tham
khảo mang mã số NC007236.
1.4 Đánh giá mối quan hệ di truyền giữa 3 mẫu gà nghiên cứu với một số
chủng gà đã được công bố đó là gà Gallus gallus (gà rừng đỏ ) gốc Nhật Bản
(mã số AB114078) lấy trình tự GenBank quốc tế, Gallus gallus gallus
(Cochin-Chinese Red Jungle Fowl) mã số NC007236 lấy trình tự GenBank và
thấy rằng giữa gà Gallus gallus (gà rừng đỏ) gốc Nhật Bản mã số AB114078
và gà Ri có mức độ đồng nhất về mặt di truyền rất cao là 99,67%. Hai mẫu gà
Ác và gà Tre có mức độ đồng nhất về mặt di truyền là 99,51%. Nhìn chung,
sự sai khác giữa các giống gà này không nhiều.
2. Đề nghị
2.1 Chúng tôi mới chỉ xác định hàm lượng cholesterol trong trứng của 5 mẫu
nghiên cứu là gà Ri, Ác, Tre, vịt Bầu, Tam Hoàng trong cùng điều kiện nuôi
dưỡng. Vậy để đánh giá một cách toàn diện về hàm lượng cholesterol trong
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
48
các mẫu nghiên cứu trên, chúng tôi đề nghị xác định hàm lượng cholesterol
trong các mẫu nghiên cứu ở các điều kiện nuôi dưỡng khác nhau.
2.2 Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài, chúng tôi mới chỉ lấy mẫu máu từ
một cá thể thuộc mỗi giống, do đó chúng tôi chỉ đưa ra được số liệu ban đầu
về các điểm đa hình của vùng D-loop trên ty thể của 3 mẫu nghiên cứu là gà
Ri, Ác, Tre thuộc loài Gallus gallus domesticus. Để có thể đánh giá được toàn
diện hơn về các điểm đa hình trên vùng D-loop hoặc có thể đưa ra các kết
luận đầy đủ về mối quan hệ di truyền giữa các mẫu nghiên cứu, cần phải tiến
hành nghiên cứu và phân tích trên một số lượng mẫu lớn hơn.
CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ
Vũ Thị Như Trang , Nguyễn Trọng lạng : Xác định trình tự vùng điều khiển
D-loop DNA ty thể của gà Ri , gà Tre, gà Ác đƣợc nuôi tại Bắc Giang. Tạp
chí Khoa học và Công nghệ Đại học Thái Nguyên , 2009 tập 58, số 10, trang
86-89.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
49
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Ân (1983), Di truyền học động vật, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
2. Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (1997), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục.
3. Nguyễn Hải Hà (2000), Tạo dòng phân tử đoạn gen điều khiển DNA ty thể
của hai loài gà Lôi đặc hữu Việt Nam, Khóa luận tốt nghiệp nghành công
nghệ sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
4. Nguyễn Duy Hoan (1999), Chăn nuôi gia cầm (giáo trình dùng cho cao
học và nghiên cứu sinh), NXB Nông nghiệp Hà Nội.
5. Địch Thị Kim Hương (2006), Phân định một số chủng gà nhà (Gallus
gallus domesticus) qua DNA ty thể, Khóa luận tốt nghiệp, Trường
ĐHKHTN Hà Nội.
6. Lê Đức Long (2007), Nghiên cứu khả năng sinh trưởng, thành phần hóa
sinh thịt và đánh giá sự sai khác di truyền của gà Mông nuôi tại Thái
Nguyên, Luận văn thạc sĩ sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thái
Nguyên
7. Lê Viết Ly (2001), gà Ri-chuyên khảo bảo tồn nguồn gen vật nuôi ở Việt
Nam, tập II phần gia cầm, NXB Nông nghiệp Hà Nội.
8. Nguyễn Thị Mai (2007), Giáo trình chăn nuôi gia cầm dùng trong các
trường THCN, NXB Hà Nội.
9. Chu Văn Mẫn (2003), Ứng dụng tin học trong sinh học, NXB ĐHQG Hà Nội.
10. Chu Hoàng Mậu (2005), Cơ sở và phương pháp sinh học phân tử, NXB
ĐHSP.
11. Kim Thị Phương Oanh (1999), Ứng dụng các phương pháp sinh học
phân tử trong nghiên cứu sự khác biệt di truyền ở một số loài gà Lôi Việt
Nam, Luận văn thạc sĩ sinh học, Trường ĐHSP Hà Nội.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
50
12. Trần Thị Mai Phương (2004), Nghiên cứu khả năng sinh sản, sinh trưởng
và phẩm chất thịt của giống gà Ác Việt Nam, luận án tiến sĩ chuyên
nghành chăn nuôi, Viện Chăn nuôi, Hà Nội.
13. Tôn Thất Sơn, Đặng Vũ Bình, Nguyễn Quang Mai (2001), Chăn nuôi- tập
I, NXB Giáo dục.
14. Bùi Thị Kiều Vân (2008), So sánh đặc điểm hóa sinh trứng và trình tự
vùng điều khiển D-loop của 3 giống gà Ri, gà Mông và gà Sao nuôi tại
Thái Nguyên, Luận văn thạc sĩ sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thái
Nguyên
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
15. Anderson RG., Joe Goldstein and Mike Brown (2003), “from cholesterol
homeostasis to new paradigms in membrane biology”, Trends cell Biol,
13: 534-539, PMID (PubMed - indexed for MEDLINE): 14507481.
16. Ascherio A, Willett WC (1995), “New directions in dietary studies or
coronary heart disease”, Journal of Nutrition.
17. Desjardins P., Morais R., (1990), “Sequence and gene ogranization of the
chicken mitochondrial genome”, J. Mol. Biol, 212: 599-635.
18. E. Moyer (1998), Cholesterol, London: Thorston.
19. E.M.Roth (1995), Good cholesterol, bad cholesterol, New York: Prima
Publications.
20. Fumihito A., Miyake T., Takada M., Shingu R., Endo T., Gojobori T.,
Kondo N., Ohno S. (1996), Monophylectic origin DNA unique dispersal
patterns of domestic fowls, Pro. Natl. Acad. Sci.USA, 93 (13), pp.6792-
6795.
21. Hu FB, Manson JE, Willett WC (2001), “Types of dietary fat anh risk of
coronary heart: acritical review”, Journal of the American College of
Nutrition.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
51
22. John Wiley and Sons, Inc (2005), Ref. Current proticol in food analytical
chemistry, D1.3.
23. Kimball R.T., Braun E.L., Zwarrtjes P.W., Crowe T.M. (1999), Ligon
J.D.A Molecula phylogeny of the pheasants and partridges suggest that
these lineages are not monophyletic, Mol. Phylogenet. Evol., 11(1) tr.38-
54.
24. Komiyama T., Ikeo K., Gojobori T. (2004), “The evolutionary origin of
long- crowing chicken: its evolutionary relationship with fighting cocks
disclosed by the mtDNA sequence analysis”, Gene 333, pp. 91-99,
GenBank, Accession AB114078.
25. Lewin B. (1997), Gene VI, Oxford University Press, 713-723& 1222.
26. McPherson M.J., Quirke P., Taylor G.R. (1991), PCR – A Pratical
Approach, IRL Press at Oxford University Press.
27. Nishibori M., Shimogiri T., HayashiT. and Yasue H. (2005), “Molecular
evidence for hybridization of species in the genus Gallus except for
Gallus varius”, Anim. Genet. 36 (5), 367-375, GenBank, Accession
NC007236, D-loop region: 1..1232.
28. Ockene IS, Chiriboga DE, Stanek EJ 3rd, Harmatz MG, Nicolosi R,
Saperia G, Well AD, Freedson P, Merriam PA, Reed G, Ma Y, Matthews
CE, Hebert JR., (2004), “Seasonal variation in serum cholesterol levels:
treatment implications and possible mechanisms”, Arch Intern Med Arch
Intern Med, 164: 863-870, PMID (PubMed - indexed for MEDLINE):
15111372.
29. Randi E., Lucchini V., Hennache A . (1997), Searching for mtDNA
genetic diversity in captive Edwards’ pheasants, The Internation
Studybook For The Edwards’ Pheasant (Lophura edwardsi) And Its
Conservation, Paris: 117-120.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
52
30. Sambrook J., Russell D. W (2001), Molecular Cloning: A labroratory
manual, Cold Spring Harbor labroratory press, New York.
31. Zhang Y., Wang J., He z., Ruan J., Dai M., Chen J., Hu C., Li S., Cong L.,
Fang L., Liu B., Li S., Wang L., Burt D.W., Ka G., Wong S., Yu J., Yang
H., Wang J. (2005), “Chick VD: A sequence variation database for the
chicken genome”, Nucleic Acids Res., 33 (5), pp. 438-441.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
53
PHỤ LỤC
Ảnh 1: Gà Ri Ảnh 2: Gà Ác
Ảnh 3: Gà Tre Ảnh 4: 1. Trứng gà Ác
2. Trứng gà Tre
3. Trứng gà Ri
4. Trứng gà Tam Hoàng
5. Trứng vịt Bầu
1 2 3 4 5
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- doc225.pdf