Luận văn Vi khuẩn oxy hóa fe(II) và khử nitrate ở Việt Nam: tính đa dạng và tiềm năng ứng dụng

đại học quốc gia hà nội Trường đại học khoa học tự nhiên -------------------- Nguyễn Thị Tuyền Vi khuẩn oxy hóa fe(ii) và khử nitrate ở việt nam: tính đa dạng và tiềm năng ứng dụng Luận văn thạc sĩ khoa học Hà Nội - 2009 đại học quốc gia hà nội Trường đại học khoa học tự nhiên -------------------- Nguyễn Thị Tuyền Vi khuẩn oxy hóa fe(ii) và khử nitrate ở việt nam: tính đa dạng và tiềm năng ứng dụng Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 Luận văn thạc sĩ khoa học Người hướng dẫn khoa học: ts. đinh thúy hằng Hà Nội - 2009 Lời cảm ơn Đề tài luận văn được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài Đặc biệt cấp Đại học Quốc gia Hà Nội, mã số QG.07.23. Để có thể hoàn thành luận văn này, trước tiên, tôi muốn bày tỏ lỏng biết ơn sâu sắc tới Tiến sĩ Đinh Thúy Hằng, Trưởng phòng Sinh thái Vi sinh vật, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã định hướng nghiên cứu, trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu. Tôi cũng mong muốn được gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Ban lãnh đạo và các cán bộ Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi về trang thiết bị và cơ sở vật chất cho tôi hoàn thành nghiên cứu này. Qua đây, tôi cũng muốn được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô giáo, cán bộ Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã giúp đỡ và trang bị những kiến thức hữu ích cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè thân thiết, những người đã luôn cổ vũ, động viên tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày tháng năm Học viên Nguyễn Thị Tuyền mục lục danh mục các chữ viết tắt ARDRA Amplified ribosomal DNA Restriction Analysis bp Base pair BSA Bovin serum albumin DNA Deoxyribonucleic acid CI Chloroform-isoamyl alcohol CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide DAPI 4’6-diamidino-2-phenylindole ddNTP Dideoxyribonucleotide triphosphate DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid FISH Fluorescence in situ hydridization MQ Mili-Q MPN Most probable number OD Optical density PBS Phosphate-buffered saline PCI Phenol-Chloroform-isoamyl alcohol PCR Polymerase chain reaction rDNA Ribosomal deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosomal ribonucleic acid SDS Sodium dodecyl sulfate TAE Tris-Acetic-EDTA (đệm) TE Tris-EDTA (đệm) Taq Thermus aquaticus DNA UV Ultraviolet Mở đầu Sắt là một trong những kim loại phổ biến trên trái đất. Thông thường sắt tồn tại ở dạng Fe2O3 ít tan trong nước và có màu vàng nâu. Trong môi trường pH trung tính, dạng hòa tan trong nước, Fe(II), chỉ tồn tại ở điều kiện không có oxy, ví dụ như ở đáy các thủy vực, nơi oxy hòa tan trong nước đã bị các vi sinh vật hiếu khí sử dụng để phân hủy các hợp chất hữu cơ. Với hiệu điện thế oxy hóa khử Fe(III)/Fe(II) tại pH 7 vào khoảng +200 mV, ion Fe(II) có thể trở thành nguồn điện tử cho các quá trình hô hấp kỵ khí, điển hình là khử nitrate thành N2 do một số nhóm vi khuẩn đảm nhiệm (Straub và cs, 1996; Benz và cs, 1998; Weber và cs, 2006 c). Quá trình oxy hóa Fe(II), khử nitrate được tóm tắt như sau: 10 Fe2+ + 2 NO3- + 24 H2O = 10 Fe(OH)3 ↓ + N2 ↑ + 9 H2 ↑ Trong tự nhiên, quá trình oxy hóa Fe(II) với chất nhận điện tử là nitrate chủ yếu diễn ra ở ranh giới hiếu khí (có oxy) và kỵ khí (không có oxy) trong lớp trầm tích ở đáy các thủy vực. Oxy hóa Fe(II) kết hợp với khử nitrate có thể đóng vai trò quan trọng trong môi trường ô nhiễm với nồng độ Fe(II) cao (do thiếu oxy) và nitrate cao (do chất hữu cơ bị phân hủy tạo thành) (Weber và cs, 2006 c). Các loài vi khuẩn với khả năng tiến hành phản ứng oxy hóa khử này có thể cùng một lúc thực hiện được hai nhiệm vụ, thứ nhất là chuyển Fe(II) hòa tan trong nước về dạng Fe(III) kết tủa, và hai là loại bỏ nitrate, chuyển thành dạng N2 không độc hại. Vi khuẩn dùng ion Fe(II) làm nguồn cho điện tử để khử nitrate được phân lập đầu tiên từ các lớp trầm tích ao, hồ nước ngọt tại Bremen, Đức năm 1996 (Straub và cs, 1996). Một số công trình nghiên cứu tiếp sau cho thấy sự có mặt khá phổ biển của nhóm vi khuẩn này với mật độ khá cao (106 tế bào/g trầm tích) trong các điều kiện môi trường khác nhau, bao gồm cả nước ngọt, nước lợ và nước mặn và tại nhiều vi trí địa lý khác nhau trên thế giới (Straub và Buchholz-Cleven, 1998). Các loài vi khuẩn phổ biến nhất trong nhóm này được biết đến hiện nay là các loài thuộc chi Chromobacterium và Klebsiella (Benz và cs, 1998; Senko và cs, 2005; Weber và cs, 2006 b). Các nghiên cứu về nhóm vi khuẩn này ở châu Âu với điều kiện sinh thái hoàn toàn khác biệt với nước ta. Hiện nay, ở Việt Nam cũng như trên thế giới, tình trạng ô nhiễm các kim loại nặng và nitơ trong nguồn nước sinh hoạt và nước thải đang là vẫn đề được quan tâm hàng đầu. Nồng độ ammonium hay nitrate cao trong nước uống cũng như nước thải có thể gây ra nhiều vấn đề nghiêm trọng liên quan đến môi trường sinh thái và sức khỏe cộng đồng (Avery, 1999; Lundgerg và cs, 2004; Tricker và Preussmann, 1991). Thừa sắt trong cơ thể được cho là một trong những nguyên nhân gây ra các bệnh về thần kinh và ung thư (Moon, 2008). Các kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong nghiên cứu sinh thái vi sinh vật đã có nhiều bước tiến đáng kể trong những năm gần đây. Trong số các phương pháp đó, có thể kể đến PCR-DGGE và FISH (không cần phân lập và nuôi cấy) hay ARDRA và giải trình tự gen (thông qua bước phân lập và nuôi cấy) là các phương pháp hữu hiệu được sử dụng phổ biến trong đánh giá tính đa dạng, phân tích cấu trúc di truyền các nhóm loài của các vi sinh vật trong các môi trường sinh thái khác nhau. Từ những thực tế kể trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Vi khuẩn oxy hóa Fe(II) và khử nitrate ở Việt Nam: Tính đa dạng và tiềm năng ứng dụng” với mục đích đánh giá tính đa dạng di truyền của vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate ở Việt Nam và tìm hiểu khả năng ứng dụng của chúng trong xử lý nguồn nước nhiễm ion sắt kim loại và các hợp chất chứa nitơ. Chương 1- Tổng quan tài liệu 1.1. Quá trình oxy hóa Fe(II) nhờ vi khuẩn 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu vi khuẩn oxy hóa Fe(II) (FOM) Khái niệm vi sinh vật liên quan đến oxy hóa sắt có từ nửa đầu thế kỉ 19, khi Ehrenberg cho rằng các quặng sắt có thể được hình thành do kết quả của hoạt động sinh học. Vi khuẩn liên quan trực tiếp đến sắt oxit, Gallionella ferruginea, cũng đã được ông mô tả một cách chi tiết (Ehrenberg, 1919). Trong suốt thời gian sau đó, nhiều đối tượng vi sinh vật đã được sử dụng để chứng minh rằng vi khuẩn có khả năng oxy hóa sắt ở pH trung tính ví dụ như Leptothrix ochracea (Kỹtzing, 1919). Tuy nhiên vào thời điểm đó các bằng chứng đưa ra vẫn chưa được hoàn toàn xác thực. Cũng vào thời điểm này, Harder, một giáo viên địa chất người Mỹ đã công bố một công trình nghiên cứu về vi khuẩn sắt (Harder, 1919), trong đó vi khuẩn được chứng minh là một trong các yếu tố địa hóa của chu trình sắt. Những vi khuẩn mà Harder đề cập này sau đó được phát hiện trong một vài môi trường nước ngọt và phương pháp làm giàu cũng được sử dụng để cung cấp các bằng chứng cụ thể về hình thức sinh trưởng tự dưỡng vô cơ của nhóm vi khuẩn này. Tuy nhiên vào thời điểm đó, chủng đơn vẫn chưa phân lập được. 75 năm sau đó, nhiều nghiên cứu đã cung cấp các hiểu biết về tập tính của vi sinh vật oxy hóa Fe(II) (FOM- Ferrous oxidizing Microbiology) cũng như vai trò quan trọng của chúng trong phản ứng địa hóa và ăn mòn sinh học. Mặc dù vậy số chủng phân lập được còn giới hạn, do đó mức độ đa dạng, phân loại, hình thái cũng như sinh lý của nhóm vi khuẩn này vẫn chưa được mô tả chi tiết (Emerson, 2000). Năm 1984, tổng quan của Ghiorse đã thảo luận nhiều vấn đề về pháp danh và phân loại của nhóm vi khuẩn này (Ghiorse, 1984). Quá trình oxy hóa Fe(II) kỵ khí mới được biết đến nhờ việc phân lập được vi khuẩn tía quang hợp không lưu huỳnh, có khả năng sử dụng Fe(II) làm chất cho điện tử (Widdel và cs, 1993). Tiếp sau đó, vào năm 1996 Straub và cộng sự lần đầu tiên phân lập được vi khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe(II), khử nitrate (Straub và cs, 1996). Năm 1997 lần đầu tiên vi khuẩn vi hiếu khí ở pH trung tính có khả năng oxy hóa Fe(II) được phân lập và mô tả đặc điểm bởi Emerson và Moyer năm 1997 (Emerson và Moyer, 1997). Cho đến nay nhiều nghiên cứu tập trung về nhóm vi khuẩn có khả năng oxy hóa Fe(II) cho thấy chúng có mặt phổ biến ở hầu hết các môi trường từ nước ngọt, nước lợ đến nước mặn, trong đất, nước và trầm tích, ở pH acid đến pH trung tính với số lượng tương đối lớn (Ehrenreich và Widdel, 1994; Straub và cs, 1996, 1998; Emerson và Moyer, 1997; Benz và cs, 1998; Heising và cs, 1999; Hauck và cs, 2001; Ratering và Schnell, 2001; Edwards và cs, 2003; Emerson và Weiss, 2004; Weber và cs, 2006 b, c). 1.1.2. Vai trò của vi khuẩn trong chu trình oxy hóa - khử sắt Quá trình oxy hóa - khử giữa Fe(II) và Fe(III) (hình 1) có vai trò thiết yếu trong chu trình sinh địa hóa môi trường và là quá trình sinh địa hóa quan trọng có mặt từ rất sớm trên trái đất. Fe(II) là thành phần của các dạng khoáng phổ biến như siderite (khoáng chất có chứa FeCO3), vivianite (Fe3(PO4)2.8H2O) hoặc Pyrite (FeS2) trong môi trường kỵ khí có tính acid yếu đến môi trường trung tính (Straub và cs, 2001). Trước khi phản ứng oxy hóa khử nhờ vi khuẩn được phát hiện ra thì cơ chế vô sinh đã được cho là chi phối quá trình oxy hóa khử sắt trong môi trường. Tuy nhiên, đến nay thì rõ ràng là sự chuyển hóa sắt chủ yếu là do vi khuẩn điều khiển trong hầu hết các điều kiện môi trường. Nhiều loài vi khuẩn, kể cả vi khuẩn cổ, có khả năng sử dụng thế oxy hóa khử của cặp Fe(II)/Fe(III) (+770 mV đối với môi trường acid; +200 mV đối với môi trường trung tính) và các cặp oxy hóa - khử khác để trao đổi điện tử, tạo năng lượng. ở đây, Fe(II) được sử dụng như là chất cho điện tử để cung cấp đương lượng khử cho các quá trình đồng hóa carbon thành sinh khối nhờ các vi khuẩn oxy hóa Fe(II) trong cả điều kiện kỵ khí và hiếu khí, còn Fe(III) có thể được sử dụng như là chất nhận điện tử cuối cùng trong điều kiện kỵ khí cho các vi khuẩn tự dưỡng vô cơ và tự dưỡng hữu cơ khử Fe(III) (Weber và cs, 2006 a). Mặc dù vai trò của quá trình chuyển hóa sắt nhờ vi khuẩn trong môi trường là rất lớn nhưng những hiểu biết của chúng ta về sinh lý, sinh hóa của chúng vẫn còn giới hạn. Hầu hết các nghiên cứu và công bố về quá trình oxy hóa Fe(II) đều tập trung vào các vi khuẩn hiếu khí, ưa acid như Thiobaccillus ferrooxidans (Temple và Colmer, 1951; Yamanaka và Fukumori, 1995), là vi khuẩn phát triển trong môi trường có pH 1-2 và tồn tại Fe(II) và Fe(III) ở dạng ion hòa tan. Tuy nhiên, ở pH trung tính cơ chất và sản phẩm của quá trình chuyển hóa sắt lại ít hòa tan, điều này gây khó khăn cho việc nghiên cứu (Straub và cs, 2001). Hình 1. Chu trình sắt trong tự nhiên (Ehrlich và Newman, 2008). 1 - Vi sinh vật trong môi trường acid; 2 - Vi sinh vật kỵ khí ở môi trường trung tính (khử nitrate, quang hợp kỵ khí); 3 - Quá trình hóa học trong môi trường trung tính với nồng độ O2 cao; 4 - Quá trình hóa học; 5 - Quá trình sinh học; 6 - H2S từ vi sinh vật; 7 - +O2, quá trình sinh học hoặc hóa học; 8 - +CO32−, quá trình hóa học; 9 - chuyển H+, quá trình sinh học hoặc hóa học; 10 - Quá trình sinh học hoặc hóa học. 1.1.3. Vi khuẩn hiếu khí oxy hóa Fe(II) ở pH trung tính Sự cạnh tranh của các vi khuẩn hiếu khí có khả năng oxy hóa Fe(II) (FOM) với động học của quá trình oxy hóa vô sinh Fe(II) bằng O2 đã được chứng minh là góp phần hoàn thiện chu trình sắt trong môi trường hiếu khí (Emerson và Moyer, 1997; Sobolev và Roden, 2001; Edwards và cs, 2003). Quá trình oxy hóa Fe(II) nhờ vi khuẩn đi kèm với khử oxy ở pH trung trính và acid đã được biết đến trong hơn một thế kỷ nay. ở thời điểm đầu vai trò của oxy hóa Fe(II) ở pH trung tính nhờ vi khuẩn hiếu khí đã bị xem nhẹ vì phản ứng hóa học oxy hóa Fe(II) bằng oxy không khí xảy ra rất nhanh. Cho đến nay, mức độ đa dạng của FOM trong môi trường hiếu khí đã được nghiên cứu chi tiết, các loài được phát hiện đều thuộc 3 chi Gallionella, Leptothrix và Marinobacter (Kỹtzing, 1919; Ehrenberg, 1919). Một số FOM hiếu khí ưa pH trung tính gần đây đã được xác định thuộc vào các phân lớp α-, β-, γ- Proteobacteria (Edwaras và cs, 2003; Emerson và Weiss, 2004; Dhillon và cs, 2005; Rentz và cs, 2007). 1.1.4. Vi khuẩn quang hợp kỵ khí oxy hóa Fe(II) Trong những khu vực có ánh sáng, Fe(III) có thể cũng được tạo thành thông qua hoạt tính oxy hóa Fe(II) của vi khuẩn quang hợp có khả năng sử dụng Fe(II) như một nguồn cho điện tử để tạo các đương lượng khử cho quá trình đồng hóa carbon vô cơ (Weber và cs, 2006 a). Vi khuẩn quang hợp kỵ khí là vi khuẩn oxy hóa Fe(II) bằng con đường kỵ khí được biết điến đầu tiên (Widdel và cs, 1993). Vi khuẩn này phổ biến được biết đến hiện nay thuộc các chi Chlorobium, Rhodobacter, Thiodictyon, Rhodovulum, Rhodomicrobium (Ehrenreich và Widdel, 1994; Heising và Schink, 1998; Heising và cs, 1999; Straub và cs, 1999; Kappler và Newman, 2004; Miot và cs, 2009). Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng vi khuẩn quang hợp oxy hóa Fe(II) không có khả năng sử dụng Fe(II) ở dạng khoáng mà chỉ có thể oxy hóa Fe(II) ở dạng ion hòa tan (Kappler và Newman, 2004), do đó chúng chỉ đóng vai trò nhỏ trong quá trình oxy hóa - khử sắt và sự phong hóa sắt trong môi trường trên cạn. 1.1.5. Vi khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe(II) Gần đây, việc xác định được các vi khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe(II) đã lấp đầy chỗ trống trong bức tranh tổng thế về chu trình oxy hóa - khử sắt nhờ vi sinh vật (Widdel và cs, 1993; Straub và cs, 1996). Các bằng chứng gần đây cũng đã chỉ ra rằng vi khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe(II) có thể đóng vai trò quan trọng trong chu trình oxy hóa - khử sắt (Senn và Hemond, 2002; Straub và cs, 2004; Weber và cs, 2006 c), trong chu trình sinh địa hóa đất, trầm tích, khoáng hóa, và quá trình cố định các chất phóng xạ và kim loại nặng (Chaudhuri và cs, 2001; Weber và cs, 2001; Lack và cs, 2002; Weber và cs, 2006 c). Trong môi trường không có oxy, quá trình oxy hóa Fe(II) nhờ vi khuẩn đã được chứng minh là thường đi kèm với quá trình khử perchlorate, chlorate và đặc biệt là nitrate (Straub và cs, 1996; Bruce và cs, 1999; Weber và cs, 2006 c). Khử nitrate nhờ vi khuẩn NO 2 - NO 3 - NH 3 Nitrate hoá Khử Nitrate Pseudomonas , Alcaligenes Bacillus, Agrobacterium Cố đ ịnh Nitơ Azotobacter , Rhizobium NO 2 - N 2 NO N 2 O Nitrosomonas Nitrobacter Hình 2. Chu trình nitơ trong tự nhiên. Nguồn nitơ chủ yếu cho quá trình đồng hoá ở các sinh vật tự dưỡng và dị dưỡng là ammonium và nitrate (được khử thành ammonium trước khi sử dụng). Trong tế bào, nitơ tập trung ở thành phần của protein (các axit amin) và được chuyển hoá thành dạng vô cơ thông qua quá trình oxy hoá hoặc khử nhóm amin (-NH2) trong axit amin thành ammonium. Ngoài tự nhiên, ammonium tồn tại ở dạng NH3 tại pH kiềm và ở dạng NH4+ tại pH acid và trung tính. Cố định nitơ không khí chuyển thành ammonium là quá trình tiêu tốn nhiều năng lượng. Trong tự nhiên chỉ có một số loài vi khuẩn và tảo lam có khả năng thực hiện phản ứng này nhờ sản sinh ra enzyme nitrogenase. Các loài vi khuẩn cố định nitơ được chia vào hai nhóm (1) các loài sống cộng sinh trong nốt sần ở rễ của thực vật (Rhizobium) và (2) các loài sống tự do trong đất, tập trung quanh vùng rễ thực vật (Azotobacter) (Shapleigh, 2000). Nitrate hoá là quá trình chuyển hoá ammonium thành nitrate do hai nhóm vi khuẩn riêng biệt đảm nhiệm. Nhóm thứ nhất là các loài thuộc chi Nitrosomonas (và một số chi khác như Nitrospira, Nitrococcus, Nitrosolobus và Nitrosovibrio) oxy hoá ammonium thành nitrite: NH4+ + 1,5 O2 → NO2− + 2 H+ + H2O. Nhóm thứ hai đại diện là chi Nitrobacter tiếp tục oxy hoá nitrite thành nitrate: NO2− + 0,5 O2 → NO3−. Ngoài ra hai chi Nitrospira và Nitrococcus thuộc nhóm thứ nhất cũng có khả năng tham gia bước phản ứng oxy hoá nitrite thành nitrate (Shapleigh, 2000). Khử nitrate thành khí nitơ là quá trình diễn ra trong điều kiện không có oxy, trong đó nitrate được vi sinh vật sử dụng làm chất nhận điện tử cuối cùng khép kín chuỗi hô hấp trong tế bào. Khử nitrate diễn ra qua một số bước trung gian, mỗi bước do một loại enzyme làm chất xúc tác: NO3− → NO2− → NO → N2O → N2. Các nghiên cứu về đa dạng và sinh thái cho thấy phổ biến nhất trong các môi trường đất, nước và nước thải là các loài thuộc chi Pseudomonas (P. fluorescens, P. aeruginosa, P. denitrificans) và Acaligenes (Shapleigh, 2000). Trong tự nhiên, vi khuẩn có khả năng sinh trưởng bằng cách khử nitrate tương đối đa dạng, thuộc nhiều nhóm phân loại khác nhau (Shapleigh, 2000). Nguồn điện tử cho nhóm vi khuẩn này sử dụng để khử nitrate cũng rất phong phú, bao gồm các acid hữu cơ, cacbuahydro mạch thẳng hay mạch vòng, kể cả một số chất khó phân hủy (Shapleigh, 2000). Trong môi trường nước ngọt nitrate là chất nhận điện tử quan trọng thứ hai sau oxy, vì thế nhóm vi khuẩn khử nitrate ở đây cũng đa dạng hơn so với môi trường nước lợ và nước mặn, nơi có vi khuẩn khử sulfat chiếm ưu thế do ảnh hưởng của nồng độ sulfate (SO42-) cao từ nước biển. 1.3. Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate ở pH trung tính, oxy hóa Fe(II) hòa tan và Fe(II) ở dạng khoáng nhờ vi khuẩn kỵ khí không phụ thuộc ánh sáng xảy ra đồng thời với quá trình khử nitrate đã được chứng minh trong các môi trường nước mặn và nước ngọt khác nhau, bao gồm cả đất ruộng, ao, suối, mương, phá nước lợ, hồ, đầm lầy, lớp ngập nước, thủy nhiệt, trầm tích đáy biển (Straub và cs, 1996; Benz và cs, 1998; Chaudhuri và cs, 2001; Ratering và Schnell, 2001; Hauck và cs, 2001; Senn và Hemond, 2002; Edwards và cs, 2003). Những môi trường này chứa quần xã vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate khoảng 103 - 5ì108 tế bào/g trầm tích tham gia vào chu trình oxy hóa - khử sắt. ở pH 7, tất cả các cặp oxy hóa khử của quá trình khử nitrate có giá trị dương (NO3ˉ/NO2ˉ = +430 mV; NO2ˉ/NO = +350 mV; NO/N2O = +1180 mV; N2O/N2 = +1350 mV (Thauer và cs, 1977)) hơn so với cặp oxy hóa khử Fe(III)/Fe(II) do đó nitrate là chất nhận điện tử thích hợp cho quá trình oxy hóa Fe(II). Về mặt nhiệt động học, oxy hóa Fe(II) có thể xảy ra đồng thời với khử nitrate thành NH4+ (NO3ˉ/NH4+ = + 360 mV (Thauer và cs, 1977), nhưng thực tế chưa có bằng chứng nào chứng minh vi khuẩn oxy hóa Fe(II) tạo ra NH4+ từ việc khử nitrate (Straub và cs, 1996, 1998; Benz và cs, 1998). Trong tất cả các vi khuẩn được biết đến, oxy hóa Fe(II) luôn đi kèm với khử nitrate thành N2 (Straub và cs, 1996; Benz và cs, 1998). Gần đây, Weber và cộng sự (2006 c) mới phát hiện được chủng Geobacter sp. có cả hai khả năng khử Fe(III) và oxy hóa Fe(II) bằng nitrate tạo NH4+ là sản phẩm của quá trình khử. Vì quá trình oxy hóa Fe(II), khử nitrate không bị giới hạn bởi vùng tiếp xúc ánh sáng nên có thể có vai trò quan trọng hơn quá trình oxy hóa kỵ khí nhờ vi khuẩn quang hợp (Straub và cs, 2001). Đáng chú ý là hầu hết các thí nghiệm làm giàu hay nuôi cấy vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate đã tiến hành đều phụ thuộc vào nguồn carbon hữu cơ (như Na-acetate) (Straub và cs, 1996; Benz và cs, 1998), tức là điều điện sinh trưởng dị dưỡng vô cơ. Phương pháp MPN đã cho thấy FOM dị dưỡng chiếm 0,8% tổng số vi khuẩn khử nitrate và thường gặp hơn so với FOM tự dưỡng (Straub và cs, 1998). Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate tự dưỡng mới chỉ được biết đến với hai chủng Ferroglobus placidus, là một vi khuẩn cổ ưa nhiệt (Hafenbradl và cs, 1996) và chủng 2002, là vi khuẩn ưa ấm thuộc phân lớp β-Proteobacteria (Weber và cs, 2006 b). 1.4. Cơ chế phân tử của quá trình oxy hóa Fe(II) và các gen liên quan Cho đến nay chưa có bất cứ công bố nào về cơ chế phân tử của quá trình oxy hóa Fe(II) ở vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate. Tuy nhiên, quá trình oxy hóa Fe(II) ở vi khuẩn hiếu khí, ưa acid Acidithiobacillus ferrooxidans đã được nghiên cứu khá chi tiết. Hình 3. Cơ chế tạo năng lượng trong quá trình oxy hóa Fe(II) ở vi khuẩn A. ferrooxidans theo Ingledew và cộng sự (Ehrlich và Newman, 2008). Theo mô hình về quá trình oxy hóa Fe(II) ở A. ferrooxidans do Ingledew mô tả năm 1986 (hình 3) (Ehrlich và Newman, 2008), Fe(II) được oxy hóa ở bề mặt ngoài của màng ngoài tế bào bằng cách chuyển 1 điện tử cho lớp Fe(III) nằm trong màng ngoài của tế bào, lớp sắt này bị khử thành Fe(II). Điện tử sau đó được chuyển lần lượt cho enzyme X (chưa xác định), protein rusticyanin và cytochrome c nằm trong khoảng gian màng. Cytochrome c sau đó gắn lên bề mặt ngoài của màng sinh chất để thuận tiện cho việc chuyển điện tử qua màng tới cytochrome a1 định vị ở mặt trong của màng sinh chất. Cytochrome a1 sau đó chuyển điện tử cho O2 để tạo thành H2O (hình 3) (Ehrlich và Newman, 2008). Sau đó, Blake và cộng sự (1992) đã đưa ra một mô hình chuỗi dẫn truyền điện tử trong quá trình oxy hóa Fe(II) ở A. Ferrooxidans, theo đó điện tử được chuyển rất nhanh từ Fe(II) đến rusticyanin nhờ xúc tác bởi enzyme (iron rusticyanin oxidoreductase). Quá trình được chứng minh là phụ thuộc vào sự có mặt của ion sulfate. Tuy nhiên vào thời điểm đó các tác giả lại chưa xác định được vị trí của cytochrome c (chất khử rusticyanin) và cách chuyển điện tử từ Fe(II) đi vào khoảng gian bào (nơi rusticyanin khư trú). Hình 4. Mô hình mới nhất hiện nay về cơ chế dẫn truyền điện tử từ Fe(II) đến O2 trong quá trình oxy hóa Fe(II) ở A. ferrooxidans (Ehrlich và Newman, 2008). OM, màng ngoài; PP, khoảng gian màng; PM, màng sinh chất; Cyc1, cytochrome c1; Cyc2, cytochrome c2; rc, rusticyanin; bc1, phức hợp cytochrome bc1; aa3, cytochrome aa3; mũi tên chỉ hướng dòng điện tử. Cho đến năm 2002, Yarzábal và cs đã xác định được cytochrome c có khối lượng phân tử lớn (Cyc2) trên màng ngoài của A. ferrooxidans chủng 23270 và chủng 33020 bằng phương pháp sinh học phân tử (Yarzábal và cs, 2002a, b). Trước đó gen mã hóa cho Cyc2 cũng đã được chứng minh là gen thuộc operon rus (Appia-Ayme và cs, 1999). Operon này bao gồm các gen mã hóa cho tất cả các protein liên quan đến chuỗi dẫn truyền điện tử từ Fe(II) tới O2 và chúng được điều hòa rất nghiên ngặt (Yarzábal và cs, 2004). Những protein được mã hóa từ operon rus sẽ vận chuyển điện tử đến chất nhận điện tử cuối cùng là O2 lần lượt là cytochrome Cyc2, rusticyanin, cytochrome Cyc1, và cytochrome oxidase (aa3) (hình 4). Vị trí của cytochrome Cyc2 trên màng ngoài có liên quan trực tiếp đến quá trình vận chuyển một điện tử từ mỗi Fe(II) vào trong tế bào chứng minh rằng Fe(II) được sử dụng như một nguồn năng lượng của A. ferrooxidans nhưng không xâm nhập vào bên trong tế bào. Các gen liên quan đến quá trình oxy hóa Fe(II) mới chỉ được đề cập ở các FOM hiếu khí như A. ferrooxidans và FOM quang hợp kỵ khí như Rhodopseudomonas palustris, chủng TIE-1 (Jiao và cs, 2005; Jiao và Newman, 2007) hay Rhodobacter capsulatus SB1003 (Croal và cs, 2007). Những gen liên quan và cơ chế dẫn truyền điện tử trong quá trình oxy hóa Fe(II) kỵ khí đi kèm với quá trình khử nitrate trong môi trường pH trung tính vẫn chưa được làm rõ, và cho đến nay chưa có công bố nào đề cập đến vấn đề này. Khó khăn trong việc nghiên cứu có thể là do môi trường sống kỵ khí của những vi khuẩn quyết định hoặc là do trong môi trường pH trung tính, cơ chất và sản phẩm của quá trình oxy hóa Fe(II) ít hòa tan gây khó khăn trong quá trình nghiên cứu sinh lý cũng như di truyền hay cơ chế chuyển hóa diễn ra trong tế bào (Straub và cs, 2001). 1.5. ảnh hưởng của ô nhiễm nitrate và thừa sắt trong nguồn nước sinh hoạt Ô nhiễm nitrate và sắt trong nước sinh hoạt là một trong những vấn đề quan trọng đang được quan tâm ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Hàm lượng nitrate cho phép trong các nguồn nước sinh hoạt là 10 mg/L theo tiêu chuẩn quốc tế và 45 mg/L theo tiêu chuẩn Việt Nam. Một nghiên cứu của Kross và cộng sự (1993) cho thấy nước giếng ở Iowa, Mỹ có nồng độ nitrate vượt quá 10 mg/L so với lượng tiêu chuẩn cho phép. Hàm lượng nitrate trong vùng nước châu thổ sông Cửu Long, Việt Nam lên đến 80 mg/L (Mai Thanh Truyết, 1997), trong khi hàm lượng cho phép là 45 mg/L (TCVN 5944 - 1995). Nghiên cứu của Viện Vệ sinh dịch tễ Tây Nguyên cho biết tình trạng ô nhiễm các kim loại nặng như sắt và mangan rất đáng báo động, hàm lượng sắt lên tới 50 mg/L, trong khi hàm lượng tiêu chuẩn cho phép là 1 - 5 mg/L (TCVN 5944 - 1995). 1.5.1. ảnh hưởng của nitrate đến sức khỏe con người Hội chứng trẻ da xanh (methemoglobinaemia): Hội chứng methemoglobinemia được hình thành do nhiều nguyên nhân, trong đó bao gồm cả việc thiếu hụt các enzyme khử methemoglobin (mang tính di truyền), sự khác thường về mặt di truyền của hemoglobin (dễ bị oxy hóa), và ảnh hưởng của dược phẩm và hóa chất có tính oxy hóa bao gồm cả nitrate và nitrite (Avery, 1999). Nitrate hoặc nitrite oxy hóa Fe(II) trong hemoglobin thành Fe(III) là nguyên nhân khiến hemoglobin chuyển thành dạng methemoglobin, ở trạng thái này hồng cầu không thể liên kết và vận chuyển oxy (Avery, 1999; Lundberg và cs, 2004). Thông thường, khi methemoglobin hình thành được khoảng 15% lượng hemoglobin lưu thông thì bắt đầu hình thành hội chứng xanh tím (Avery, 1999). Hội chứng này phổ biến ở trẻ dưới 6 tháng tuổi bởi vì lượng enzyme khử methemoglobin (reductase NADH-cytochrome b5) của chúng chỉ bằng một nửa của người lớn (Lundgerg và cs, 2004). Tác hại của nitrate đối với sức khỏe con người không phải là do bản thân ion nitrate gây ra. Thực tế là nitrate có độc tính rất thấp nhưng khi nồng độ nitrate tăng lên thì nó sẽ chuyển thành nitrite nhờ xúc tác của enzyme vi khuẩn và chính nitrite là nguyên nhân gây độc (Lundberg và cs, 2004). Ung thu dạ dày: Quá trình chuyển hóa giữa nitrate và nitrite có thể hình thành N-nitrosamines là một chất gây ung thư phổ biến (Tricker và Preussmann, 1991). N-nitrosamines có thể được hình thành từ chế độ ăn, môi trường nghề nghiệp và thông qua sử dụng thuốc lá. Bình thường trong dạ dày có tính acid nên nitrite tạo thành acid nitrous và không gây hại cho dạ dày. Nhưng khi tính acid của dạ dày giảm (do sử dụng thuốc hoặc bị bệnh) các vi khuẩn định cư trong dạ dày có thể xúc tác cho việc hình thành N-nitrosamines từ nitrite, và đây có thể là một trong những nguyên nhân gây ung thư dạ dày. Tuy nhiên cơ chế chi tiết của hiện tượng này vẫn chưa được làm rõ (Lundberg và cs, 2004). Ung thư bàng quang. Hầu hết nitrate nội sinh và thu nạp từ chế độ ăn được thải ra ở dạng nước tiểu. Vì nước tiểu thường là vô trùng nên không có quá trình khử nitrate xảy ra. Tuy nhiên, trong trường hợp nhiễm khuẩn đường tiết niệu thì một số lượng đáng kể nitrite có thể được tạo thành bởi vi khuẩn. Nhiễm Schistosoma haematobium (sống ký sinh) là một tác nhân cực kỳ nguy hiểm đối với quá trình phát triển ung thư bàng quang, và N-nitrosamines được cho là đóng vai trò quan trọng trong việc phát sinh dạng ung thư này. Cơ chế giả thiết là do nhiễm kinh niên vi khuẩn khử nitrate, làm tăng nồng độ nitrite trong nước tiểu, do đó tăng cường sinh N-nitrosamines và có thể dẫn tới ung thư bàng quang (Lundberg và cs, 2004). 1.5.2. ảnh hưởng của thừa sắt đến sức khỏe con người Vai trò thiết yếu của sắt: Sắt là nguyên tố phổ biến trong tự nhiên, là một thành phần quan trọng trong tổng hợp hemoglobin (chất vận chuyển oxy cho các tế bào trong cơ thể) và myoglobin (chất dự trữ oxy cho cơ thể). Ngoài ra sắt còn tham gia vào thành phần một số enzyme oxy hoá khử như catalase, peroxydase và các cytochrome (những chất xúc tác sinh học quan trọng trong cơ thể). Nó đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất ra năng lượng oxy hoá, vận chuyển oxy, hô hấp của ty lạp thể và bất hoạt các gốc oxy có hại. Tuy nhiên quá tải sắt trong cơ thể cũng gây ứ đọng sắt tại các mô như tim, gan, tuyến nội tiết..., dẫn đến rối loạn trầm trọng chức năng các cơ quan này (Trần Thị Kiều My và Nguyễn Hà Thanh, 2006). Tác hại của thừa sắt trong cơ thể hiện nay vẫn còn đang gây nhiều tranh cãi. Người ta cho rằng bộ não là mục tiêu chính của sự thừa sắt, sự tích lũy sắt trong mô não hoặc gây ra hoặc đóng góp vào việc sinh ra bệnh về thần kinh như Parkinson và Alzheimer. Sắt còn được coi như là một chất gây ung thư rất mạnh. Và hiện nay người ta đã có các bằng chứng chứng minh thừa sắt gây ra bệnh ung thư gan. Sắt dư thừa lắng đọng trong tim và các động mạch có thể gây nên các bệnh về tim cũng như là phá vỡ động mạch. Sắt thừa lắng đọng trong lá lách sẽ phá vỡ sự bài tiết insuline và gây ra bệnh đái tháo đường nghiên trọng ở người lớn (người ta tìm thấy những lợp sắt lắng đọng trong các tế bào tụy ở người có bệnh đái đường tuýp 2) (Moon, 2008). Để có thể hấp thu được, sắt phải chuyển từ dạng ferric (Fe(III)) sang dạng ferrous (Fe(II)). Pepsin tách sắt khỏi các hợp chất hữu cơ và chuyển thành dạng gắn với các acid amin hoặc đường. Acid clohydric khử Fe(III) thành Fe(II) để hấp thu (Trần Thị Kiều My và Nguyễn Hà Thanh, 2006). Vì vậy nên lượng sắt dư thừa trong nước uống cho dù ở dạng Fe(II) hay Fe(III) đều gây nguy hiểm cho con người. 1.6. ý nghĩa của việc nghiên cứu tính đa dạng di truyền và tiềm năng ứng dụng của các vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate Với khả năng hô hấp kỵ khí bằng nitrate, vi khuẩn oxy hóa Fe(II) khử nitrate có thể tham gia vào quá trình loại bỏ nitơ trong các nguồn nước thải hay nước sinh hoạt có nồng độ nitơ cao. Quá trình này diễn ra khi có mặt các hợp chất hữu cơ làm nguồn điện tử thích hợp để khử nitrate, ví dụ như lactate, acetate hay methanol là những sản phẩm của quá trình phân giải chất hữu cơ cao phân tử. Bên cạnh đó, khả năng sinh trưởng vô cơ sử dụng Fe(II) làm nguồn điện tử để khử nitrate là một ưu thế của nhóm vi khuẩn này so với các loài khử nitrate thông thường. Do tác động của vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate, cùng một lúc ion Fe(II) và nitrate dư trong nguồn nước có thể được loại bỏ. Khả năng ứng dụng của nhóm vi khuẩn này có ý nghĩa đối với việc xử lý các nguồn nước ngầm dùng cho sinh hoạt bị nhiễm sắt và nitơ ngấm xuống từ tầng nước mặt. Từ thực trạng ô nhiễm sắt và nitrate cũng như ảnh hưởng của chúng đến sức khỏe con người cùng với vai trò của các vi khuẩn có khả năng làm giảm lượng sắt và nitrate trong môi trường, những nghiên cứu về tính đa dạng di truyền và tiềm năng ứng dụng của nhóm vi khuẩn này trong các biện pháp xử lý các vùng ô nhiễm sắt và nitrate là việc làm cần thiết. Nghiên cứu này không chỉ bổ sung kiến thức khoa học về một nhóm vi khuẩn có khả năng oxy hóa Fe(II), khử nitrate mà còn đưa ra những gợi ý về hướng xử lý các nguồn nước ô nhiễm kim loại nặng và chất hữu cơ. Cho đến nay, nhóm vi khuẩn này chỉ mới được tập trung nghiên cứu ở một số nước châu Âu với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác biệt với nước ta. Còn trong nước thì chưa có nghiên cứu nào đề cập đến nhóm vi khuẩn tiềm năng này. 1.7. Các phương pháp sinh học phân tử hiện đại được sử dụng trong các nghiên cứu về tính đa dạng và cấu trúc di truyền của quần xã vi khuẩn 1.7.1. DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) Một trong những kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại phổ biến được sử dụng để đánh giá tính đa dạng di truyền của quần xã vi sinh vật không qua nuôi cấy hiện nay là kỹ thuật PCR-DGGE (Giovannoni và cs, 1990; Ward và cs, 1990). PCR-DGGE tiến hành với DNA của ribosome được Muyzer và cs công bố trong nghiên cứu về sinh thái vi sinh vật năm 1993. Cho đến nay kỹ thuật này được biết đến phổ biến trong nghiên cứu đa dạng di truyền vi sinh vật trong nhiều phòng thí nghiệm. Ngày càng có nhiều công bố về ứng dụng PCR-DGGE trong nghiên cứu đa dạng di truyền vi sinh vật trong nhiều môi trường sinh thái khác nhau như trong đất (Norris và cs, 2002; Avrahami, 2002; Nicol và cs, 2003), biển (Bano and Hollibaugh, 2002), sông (Sekiguchi và cs, 2002) và nước hồ (Crump và cs, 2003). Ngoài ra sử dụng PCR-DGGE còn xác định được nhóm vi sinh vật ưu thế trong các mẫu môi trường nghiên cứu (Bano và Hollibaugh, 2000). Phương pháp DGGE dựa trên việc di chuyển của các phân đoạn 16S rDNA đã được khuếch đại trên gel polyacrylamide có chứa chất biến tính. Trong phương phày này, các phân đoạn DNA giống nhau về chiều dài nhưng khác nhau về trình tự các cặp bazơ có thể được phân tách (Fischer và Lerman, 1979). Trình tự giàu GC (còn gọi là kẹp GC) có thể được gắn vào một trong hai mồi trong phản ứng PCR để ổn định khả năng biến tính của các phân đoạn trên gel polyacrylamide để có thể xác định được 100% số trình tự có trong mẫu (Myers và cs, 1985; Sheffield và cs, 1989). DGGE cho phép xác định cả những vi sinh vật không thể phân lập và nuôi cấy được (Davies và cs, 2004). 1.7.2. FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) FISH là một trong số những phương pháp cho phép xác định nhóm phân loại của vi khuẩn trong mẫu mà không qua nuôi cấy bằng cách lai với các đầu dò gắn huỳnh quang đặc hiệu cho rRNA và pháp hiện trên kính hiển vi huỳnh quang. FISH ứng dụng cho vi khuẩn lần đầu tiên được mô tả hai mươi năm về trước (Giovannoni và cs, 1988; Delong và cs, 1989; Amann và cs, 1990), và được được đánh dấu như một bước tiến vượt bậc trong lĩnh vực sinh thái vi sinh vật. Phương pháp này chủ yếu dựa trên trình tự của hệ tiểu đơn vị 16S rRNA, là trình tự đã được rất quan tâm trong nghiên cứu hệ thống phân loại của vi sinh vật (Woese và cs, 1990; Ludwig và Schleifer, 1994). Đây là phương pháp duy nhất cho phép quan sát tính đa dạng di truyền trực tiếp trong môi trường qua các tế bào bắt cặp với đầu dò đặc hiệu khác nhau (Amann và cs, 1995). 1.7.3. ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) ARDRA là phương pháp phân tích các đoạn cắt giới hạn của 16S DNA sau khi được khuếch đại bằng phản ứng PCR. ARDRA được sử dụng để phân tích quần xã vi khuẩn trong các môi trường khác nhau (Moyer và cs, 1994; Martínez-Murcia và cs, 1995; Lagacé và cs, 2004). Phương pháp này còn được sử dụng để đánh giá nhanh sự biến đổi về mặt di truyền trong quần xã qua thời gian hoặc là so sánh các quần xã trong các điều kiện môi trường khác nhau (Frederic và cs, 2000; Lagacé và cs, 2004) hay nghiên cứu đa dạng di truyền các chủng đơn trong quần xã vi sinh vật (Moyer và cs, 1994). 1.7.4. Giải trình tự tự động Các máy đọc trình tự tự động hiện nay hoạt động dựa trên phương pháp xác định trình tự DNA (phương pháp Dideoxy - hay còn gọi là phương pháp gián đoạn chuỗi (chain-determination method)) được Sanger phát triển năm 1977. Nguyên tắc của phương pháp là sử dụng 1% ddNTP (dideoxynucleotide, không có nhóm 3'-OH) để làm ngừng phản ứng tổng hợp DNA một cách ngẫu nhiên. Các đoạn nucleotide có kích thước dài ngắn khác nhau sẽ được tổng hợp. A, T, G, C được đánh dấu huỳnh quang khác nhau sẽ được pháp hiện bằng detector tín hiệu huỳnh quang khi điện di mao quản 8 đến 16 kênh. Chương 2 - Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Nguyên vật liệu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Mẫu bùn và trầm tích được thu thập ở ba môi trường sinh thái đại diện khác nhau: mẫu bùn đáy ao nước ngọt và chân ruộng ngập nước được thu ở ngoại thành Hà Nội, mẫu trầm tích nước lợ được thu ở ven biển Vân Đồn - Quảng Ninh. Mẫu chân ruộng và trầm tích ven biển được thu thập trong các ống nhựa mica có nút cao su ở hai đầu cho phép khoan sâu tới 60 cm dưới bề mặt trầm tích (hình 5). Mẫu đáy ao được thu thập trong bình thuỷ tinh, sau đó bổ sung nước vào toàn bộ thể tích để giảm thiểu sự ảnh hưởng của oxy không khí. Mẫu được bảo quản ở nhiệt độ 4°C cho đến khi tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Hình 5. Mẫu bùn và trầm tích thu thập ngoài môi trường tự nhiên, được đảm bảo kỵ khí nghiêm ngặt. 2.1.2. Hóa chất Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu vi sinh vật đều là những hóa chất có tiêu chuẩn chất lượng cao của các hãng cung cấp lớn như Merck, Sigma. Hoá chất và một số kit dùng cho phân tích sinh học phân tử do các hãng Bioneer-Hàn Quốc, Fermentas-Đức, Qiagen-Mỹ, ABI-Mỹ, BioRad-Mỹ cung cấp. - Hóa chất sử dụng nuôi cấy vi khuẩn: Các chất khoáng (bảng 1), vi lượng (bảng 2), vitamine (bảng 2), chất cho điện tử (FeSO4 và MnSO4), chất nhận điện tử (NaNO3), khí N2 và CO2. - Hóa chất sử dụng trong phương pháp quang phổ xác định hàm lượng sắt II, mangan II và nitrate: hydroxylamine hydrochloride, formaldehyde, ammonia, phenanthroline, ammonium acetate, disulfofemic... - Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm sinh học phân tử: Hóa chất cần thiết để tách DNA, PCR, tinh sạch sản phẩm PCR, điện di biến tính, giải trình tự. 2.1.3. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học - ĐHQGHN, sử dụng các thiết bị chuyên môn dùng trong vi sinh vật học, sinh học phân tử và hoá phân tích đạt tiêu chuẩn quốc tế. - Bể ổn nhiệt Jeio Tech, Hàn Quốc - Máy đo pH Horiba, Nhật Bản - Máy ly tâm Eppendorf, Đức - Máy PCR Eppendorf, Đức - Máy điện di ngang Nyx Technik, Mỹ - Máy DGGE DcodeTM universal Mutation Detection System BioRad, Mỹ - Máy GelDoc BioRad, Mỹ - Máy đo quang phổ UV-Vis (GBC instrument, úc) - Kính hiển vi quang học Olympus, Nhật Bản - Kính hiển vi huỳnh quang Zeiss, Đức Và một số thiết bị cần thiết khác được sử dụng trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí như bình N2, CO2, ống nghiệm nút xoáy, bình serum và nút cao su. 2.2. Phương pháp nghiên cứu Các phương pháp, nội dung nghiên cứu được sử dụng trong đề tài được tóm tắt bằng sơ đồ thí nghiệm thể hiện ở hình 6. Hình 6. Sơ đồ thí nghiệm được tiến hành trong nghiên cứu. 2.2.1. Xác định số lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate Bảng 1. Môi trường khoáng kỵ khí nước ngọt và nước lợ cho vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate (Ratering, 1999). Thành phần Nước ngọt Nước lợ Nước cất 1 lít 1 lít NaCl 1 g 13,7 g MgCl2.6H2O 0,4 g 5,9 g CaCl2.2H2O 0,15 g 0,81 g KCl 0,5 g 0,58 g KBr - 0,05 g MgSO4.7H2O 0,25 g 0,25 g NH4Cl 0,25 g Hỗn hợp NH4Cl và KH2PO4 được chuẩn bị trong 50 ml nước cất, khử trùng riêng KH2PO4 0,2 g Khử trùng ở 121oC trong 25 phút, lấy ra ở 80oC, sục khí N2 trong 5 phút, làm nguội Thêm các dung dịch sau (đã khử trùng riêng): Hỗn hợp Vitamine (bảng 2) 1 ml 1 ml Hỗn hợp vi lượng (bảng 2) 1 ml 1 ml Vitamin B1 (Thiamin) 1 ml 1 ml Vitamin B12 0,1 ml 0,1 ml Vitamin B2 1 ml 1 ml Na- Acetate 1 M 1 ml 1 ml NaNO3 1 M (chất nhận điện tử) 5 ml (5 mM) 5 ml (5 mM) FeSO4 1 M (chất cho điện tử) 10 ml (10 mM) 10 ml (10 mM) NaHCO3 1 M 30 ml 30 ml Chuẩn pH ở 7 - 7,2, sau đó chia môi trường sang các bình serum và ống nghiệm rồi sục khí N2, đậy bình và ống nghiệm bằng nút cao su có kẹp nhôm hay nút vặn có lỗ hở Bảng 2. Thành phần hỗn hợp vi lượng và vitamine. Hỗn hợp Vi lượng Hỗn hợp Vitamine Thành phần mg/L nước cất Thành phần mg/100 ml đệm phosphate Na2EDTA 5200 Na2HPO4/NaH2PO4 25 mM pH 7,1: 100 ml FeSO4.7H2O 2100 4-Aminobenzoic acid 4 H3BO3 30 D(+)- Biotin (Vitamine H) 1 MnCl2.4H2O 100 Nicotinic acid (Niacin) 10 CoCl2.6H2O 190 Calcium-D(+)- Pantothenat 5 NiCl2.6H2O 24 Pyridoxin 2 HCl 15 CuCl2.2H2O 2 Lopoic acid 1,5 ZnSO4.7H2O 144 Folic acid 4 Na2MoO4.2H2O 36 Na-2- Mercaptoethan sulfonat 25 Chuẩn pH = 6,5 bằng NaOH Số lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate được xác định thông qua phương pháp MPN (American Public Health Association, 1969). Phương pháp này được xây dựng dựa trên phép pha loãng mẫu và số lượng ống dương tính (sinh trưởng) và âm tính (không sinh trưởng) trong các dãy pha loãng. Biểu hiện dương tính có thể là sự có mặt của khí trong các ống lên men, độ đục của môi trường, sự biến đổi màu của môi trường hay sự thay đổi pH tùy thuộc vào các trường hợp khác nhau (USDA, 2008; Downes và Ito, 2001). Môi trường dịch thể kỵ khí hoàn toàn có thành phần khoáng tương ứng với nước ngọt (dùng cho mẫu bùn từ đáy ao và chân ruộng ngập nước) hoặc nước lợ (dùng cho mẫu trầm tích ven biển Vân Đồn - Quảng Ninh) (bảng 1). Thí nghiệm MPN được tiến hành với dãy pha loãng đến 10- 8 với thể tích 10% bùn đáy hoặc trầm tích trong môi trường khoáng nước ngọt hay nước lợ, thí nghiệm được tiến hành với 3 dãy pha loãng, mẫu được đảm bảo kỵ khí hoàn toàn và ủ trong tủ ấm tại 28oC trong 8 tuần. Sự phát triển của vi khuẩn trong ống MPN được ghi nhận thông qua sự thay đổi màu môi trường từ trắng đục (màu của Fe(II)) sang vàng nâu (màu của Fe(III)). 2.2.2. Phân lập vi khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe(II), khử nitrate ống MPN ở nồng độ pha loãng cao nhất có vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate phát triển được sử dụng để làm nguồn phân lập các khuẩn lạc đơn. Việc phân lập được tiến hành theo phương pháp pha loãng trên dãy ống thạch bán lỏng (1%) với môi trường có thành phần tương tự như môi trường dùng trong phương pháp MPN (Widdel và Bak, 1992). ống thạch bán lỏng sau khi bổ sung nguồn vi sinh vật (10%) từ ống MPN (nguồn phân lập) được sục khí N2 và ủ ở tư thế đảo ngược đầu tại 28oC trong bóng tối. Khuẩn lạc đơn phát triển trong các ống pha loãng được tách bằng pipet Pasteur và chuyển sang môi trường dịch thể thích hợp (nước ngọt hay nước lợ). 2.2.3. Tách DNA tổng số từ mẫu bùn và trầm tích và chủng đơn DNA tổng số của mẫu bùn và trầm tích từ các ống MPN được tách chiết theo phương pháp do Zhou và cs, 1996 mô tả với cải biến về nồng độ đệm phosphate (tăng từ 100 mM lên 120 mM) trong đệm tách (gồm:100 mM Tris (pH 8);100 mM EDTA (pH 8); 120 mM Đệm phosphate (Na2HPO4/NaH2PO4); 1,5 M NaCl; 1% CTAB). Trộn 2 ml mẫu làm giàu từ ống MPN với 5,4 ml đệm tách DNA trong ống falcol (chịu dung môi). Phá tế bào bằng phương pháp sốc nhiệt trong nitơ lỏng và bể ổn nhiệt ở 37oC, lặp lại 5 lần. Bổ sung 40 μl proteinase K (10 mg/ml), lắc ngang với tốc độ 225 vòng/phút trong 30 phút ở 37oC. Thêm 600 μl SDS (20%), ủ ở 65oC trong 2 giờ, 25 phút đảo lộn đầu một lần. Trộn đều kỹ với lượng tương đương PCI về thể tích. Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Thu lấy phần dịch phía trên sang ống mới, trộn đều kỹ với lượng tương đương CI về thể tích. Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Thu lấy phần dịch phía trên sang ống mới, bổ sung 0,6 lần thể tích isopropanol, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Ly tâm thu kết tủa DNA ở 12000 vòng/ phút trong 25 phút ở nhiệt độ phòng. Đổ phần dịch ở trên, rửa kết tủa với 10 ml ethanol 80%, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. Đổ ethanol, để khô ở nhiệt độ phòng. Hòa tan DNA trong 50 μl nước MQ đã khử trùng, chuyển DNA sang ống eppendorf 1,5 ml và giữ ở -20oC. DNA genome của chủng đơn được tách theo phương pháp của Marmur (1961). 1 ml dịch tế bào được ly tâm 5000 - 10000 vòng/ phút trong 5 phút, sau đó rửa với 1 ml đệm TE (pH 8) rồi hòa tế bào trong 0,5 ml 5 mM EDTA (pH 8). Thêm 50 μl lysozym (40 mg/ml), trộn đều, ủ trong bể ổn nhiệt ở 37oC trong 1 giờ. Thêm 50 μl SDS (20%) và 50 μl proteinase K (4 mg/ml), trộn đều và ủ trong bể ổn nhiệt ở 55oC trong 1 giờ. Thêm 400 μl PCI, trộn đều trong 1- 3 phút, ly tâm 15000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút. Chuyển lớp dịch trong ở trên sang ống eppendorf mới. Thêm 400 μl CI, trộn đều, ly tâm 15000 vòng/phút tại 4oC trong 15 phút. Chuyển lớp dịch trong ở trên sang ống eppendorf mới. Thêm 1/10 thể tích dung dịch 3M Na-acetate (pH 5,2) và 2 lần thể tích dung dịch 2-propanol (đã để lạnh -20oC), trộn đều và giữ ở -20oC trong vòng 15 phút đến 1 giờ. Ly tâm 15000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút, chắt phần dịch phía trên để thu kết tủa DNA. Rửa DNA trong ethanol 70% (đã để lạnh -20oC) trong 1 phút, ly tâm 15000 vòng/ phút, đổ cồn, làm khô DNA ở nhiệt độ phòng. Hòa tan DNA trong 50 μl MQ vô trùng (hoặc đệm TE) và bảo quản tại -20°C cho các thí nghiệm tiếp theo. Sản phẩm DNA được kiểm tra trên gel agarose 1% trong đệm TAE tại 100V trong thời gian 15 phút. Sau khi điện di, gel agarose được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide (5 mg/ml) trong 15 phút, sau đó rửa nước và chụp ảnh dưới tia UV trên máy GelDoc (BioRad). 2.2.4. Phân tích đa dạng di truyền các chủng đơn bằng phương pháp ARDRA ARDRA được sử dụng để nghiên cứu mức độ đa dạng về di truyền của vi sinh vật dựa trên phân tích kết quả xử lý gen 16S rDNA bằng enzyme giới hạn (Ravenschlag và cs, 1999). Gen 16S rDNA (xấp xỉ 1500 bp) của các chủng đơn được khuếch đại trong phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27F (AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG) và 1492R (GGT TAC CTT GTT ACG ACT T) với thành phần và chu trình phản ứng ở bảng 3. Bảng 3. Phản ứng PCR gen 16S rDNA. Thành phần phản ứng Thể tích (μl) Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ H2O MQ 13,5 94 3 phút 10x buffer 2,5 94 30 giây 35 BSA (3 mg/ml) 2,5 55 45 giây MgCl2 (20 mM) 2 72 1,5 phut dNTP (2,5 mM) 2 72 7 phút Mồi 27F (50 pmol/μl) 0,5 Mồi 1492R (50 pmol/μl) 0,5 Taq polymerase (5u/μl) 0,5 DNA Khuôn 1 Tổng thể tích phản ứng 25 Gen 16S rDNA sau khi khuếch đại được xử lý bằng hai enzyme giới hạn MspI và HaeIII (Fermentas) (bảng 4). Sản phẩm DNA sau khi đã xử lý enzyme được phân tách bằng điện di trên gel agarose 2% tại 100 V trong thời gian 30 phút. Các chủng vi khuẩn sẽ được xếp nhóm dựa trên sự tương đồng về phổ các băng điện di. Bảng 4. Phản ứng cắt gen 16S rDNA bằng các enzym giới hạn MspI và HaeIII. Nước cất vô trùng 18 μl 10x đệm R (hoặc đệm Tango) 2 μl Sản phẩm PCR 10 μl (0,1 - 0,5 μg DNA) Enzym HaeIII (hoặc MspI) (Fermentas) 1 μl (10 u/μl) Trộn đều và ly tâm nhanh, sau đó ủ hỗn hợp phản ứng tại 37oC trong 3 giờ 2.2.5. Phương pháp điện di biến tính DGGE Hình 7. Vị trí các mồi trên gen 16S rDNA ở Lactobacillus plantarum. Khuếch đại đoạn gen 16S rDNA (550 bp): Vùng V3 - V5 của gen 16S rDNA với độ dài 550 bp (hình 7) được khuếch đại trong phản ứng PCR sử dụng cặp mồi GM5F (CCT ACG GGA GGC AGC AG) và 907R (CCG TCA ATT CCT TTR AGT TT) (Muyzer và cs, 1993). “Touch-down” PCR (bảng 5) được sử dụng để tăng độ đặc hiệu và giảm sự hình thành các sản phẩm phụ. Để tạo tính ổn định cho việc phân tách các trình tự DNA trên gel điện di biến tính, kẹp GC gồm 40 bp (CGC CCG CCG CGC GCG GCG GCC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G) được gắn vào đầu 5’ của mồi GM5F. Bảng 5. Thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt của PCR cho DGGE. Thành phần phản ứng Thể tích (μl) Chu kỳ nhiệt của “touch-down” PCR H2O MQ 27 Taq polymerase được đưa vào phản ứng sau bước biến tính đầu tiên ở 94○C trong 1 phút khi nhiệt độ đạt 80○C. Nhiệt độ gắn mồi được đặt cao hơn 10○C so với nhiệt độ lý thuyết (tức là 65○C). Sau mỗi chu kỳ, nhiệt độ gắn mồi giảm đi 0,5○C cho tới khi đạt tới 55○C, ở nhiệt độ này phản ứng tiến hành thêm 15 chu kỳ. Thời gian kéo dài chuỗi của mồi là 3 phút. 10x Taq buffer 5 BSA (3 mg/ml) 5 MgCl2 (20 mM) 4 dNTP (2,5 mM mỗi loại) 4 Mồi GM5F-GC (50 pmol/μl) 1 Mồi 907R (50 pmol/μl) 1 DNA khuôn 2 Taq polymerase (5 u/μl) 1 Tổng thể tích phản ứng 50 DGGE: Điện di được tiến hành trên gel polyacrylamide 6% với dải biến tính urea/formamid từ 30% đến 60%. Quá trình điện di được thực hiện bằng bộ điện di DcodeTM System (BioRad) trong đệm TAE, ở nhiệt độ 60°C, tại 200 V, trong 3,5 giờ. Sau khi điện di, gel polyacrylamide được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide (5 mg/ml) trong 30 phút, sau đó rửa nước và chụp ảnh dưới tia UV trên máy GelDoc (BioRad). Thôi gel: Băng điện di được cắt, rửa và thôi trong nước qua đêm tại 4°C. Dịch thôi DNA được dùng làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR như chu trình nhiệt của phản ứng PCR cho DGGE (bảng 5) với cặp mồi GM5F (không có kẹp GC) và 907R. Sản phẩm PCR tiếp theo được tinh sạch bằng kít và giải trình tự. 2.2.6. Giải trình tự gen 16S rDNA và dựng cây phân loại Gen 16S rDNA của các chủng đơn (1500 bp) và sản phẩm PCR từ các băng điện di biến tính (550 bp) sau khi tinh sạch bằng kít tinh sạch sản phẩm PCR (Bioneer - Hàn Quốc) được tiến hành phản ứng đọc trình tự với ABI Prism BigDye Terminator cycle sequencing kit và đọc trình tự trên máy tự động 3110 Avant Appied Biosystems. Trình tự gen sau đó được phân tích, so sánh với trình tự 16S rDNA của các loài có liên quan hiện đã công bố trên Database DDBJ/EMBL/GenBank sử dụng phần mềm BLAST Search. Cây phân loại được dựng theo phương pháp neighbour-joining (Saitou và Nei, 1987), trong đó định dạng cây được tiến hành dựa trên 1000 phép so sánh đa chiều (Felsenstein, 1985). 2.2.7. Phương pháp FISH FISH (Fluorescence in situ hybridization) là phương pháp lai sử dụng các đầu dò thích hợp bắt cặp với rRNA nhằm xác định phả hệ của vi sinh vật trong quần xã một cách trực tiếp, không qua bước phân lập và nuôi cấy (Amann và cs, 1992). Chuẩn bị hóa chất: Formaldehyde 37% PBS 10´ 5 M NaCl 1 M Tris-HCl 0,5 M EDTA SDS 10% Formamide DAPI (0,02 mg/ml) Đầu dò: là các đoạn oligonucleotide dài 18 - 20 nucleotide gắn chất huỳnh quang sulphoindocyonide (CY3, hấp phụ bước sóng 552 nm). Các đầu dò đã sử dụng trong nghiên cứu này được liệt kê trong bảng 6 (nồng độ 2 ng/μl). Bảng 6. Các đầu dò sử dụng trong nghiên cứu. Tên đầu dò Đối tượng bắt cặp Trình tự (5’đ 3’) Formamide (%) NaCl (mM) ALF968 a-Proteobacteria GGTAAGGTTCTGCGCGTT 20 225 BET42a b-Proteobacteria GCCTTCCCACTTCGTTT 35 80 GAM42a g-Proteobacteria AAACGATGTGGGAAGGC 35 80 Các bước tiến hành: Cố định mẫu: - Hoà 0,5 g mẫu đất hoặc bùn trong 1,5 ml PBS 1´. - Bổ sung formaldehyde vào mẫu tới nồng độ 2 - 4% và cố định ở 4°C trong thời gian ít nhất là 30 phút nhưng không quá 24 giờ. - Ly tâm, loại phần dịch và rửa lại cặn tế bào bằng PBS 1´. - Ly tâm, loại PBS 1´ và bổ sung 1,5 ml hỗn hợp dung dịch etanol/PBS (1:1). - Bảo quản tế bào đã cố định tại -20°C. Bảng 7. Chuẩn bị đệm lai và đệm rửa. Dung dịch gốc Thể tích Nồng độ cuối 2 ml đệm lai 50 ml đệm rửa 5 M NaCl 360 μl (900 mM) Phụ thuộc vào từng đầu dò 1 M Tris/HCl 40 μl 1 ml 20 mM Formamide % phụ thuộc vào từng đầu dò (bảng 6) 0,5 M EDTA 0,5 ml 5 mM Nước cất vô trùng dẫn tới 2 ml dẫn tới 50 ml SDS 10% (bổ sung cuối cùng để tránh kết tủa) 2 μl 50 ml 0,01% Lai với đầu dò: - Lấy 15 - 20 ml mẫu hoà với 2 ml nước cất vô trùng và đưa tế bào trên màng polycarbonate (0,2 μm). - Để khô mẫu trong không khí và bảo quản trong hộp kín tại -20°C cho đến khi sử dụng. - Chia màng thành các phần nhỏ để tiến hành lai (một màng có đường kính 25 mm có thể chia làm 6 - 10 phần sử dụng cho các đầu dò khác nhau). Dùng bút chì đánh dấu mẫu (bằng số). - Chuẩn bị 2 ml đệm lai trong ống eppendorf (bảng 7). - Chuẩn bị dung dịch đầu dò: trộn 2 ml đầu dò với 18 ml đệm lai trong ống eppendorf 0,5 ml, giữ trong đá, tránh ánh sáng. - Đặt một miếng giấy thấm vào ống falcone 50 ml, đổ phần đệm lai còn lại vào ống. - Đặt mảnh màng polycarbonate lên lam kính, mặt có mẫu lên trên. Các mẫu lai với cùng một đầu dò có thể đặt cùng trên một lam kính. - Nhỏ hỗn hợp đầu dò lên các mẫu và đặt toàn bộ lam kính vào ống falcon có miếng giấy lọc thấm đệm lai đã chuẩn bị trước (ở tư thế nằm ngang) và lai ở 46°C trong thời gian ít nhất là 90 phút (nhưng không quá 3 giờ). - Chuẩn bị 50 ml đệm rửa trong ống falcon 50 ml (bảng 7). - Chuyển nhanh mẫu sau khi lai vào đệm rửa đã được làm nóng trong bể ổn nhiệt tại 48°C trong 15 phút. Gạn bớt đệm và đổ mẫu ra đĩa petri. Dùng kẹp gắp mẫu, nhúng qua nước cất vô trùng trong vài giây và đặt lên giấy thấm cho khô (mặt có mẫu ở trên). Nhuộm đối chứng và quan sát: - Để nhuộm đối chứng, nhỏ 50 ml dung dịch DAPI lên mỗi mẫu, giữ 3 phút trong tối, sau đó rửa nhanh trong nước cất và rửa trong cồn 80% trong vài giây rồi để khô trong không khí (đặt trong hộp tối). Mẫu có thể được bảo quản trong -20°C trong vài ngày mà tín hiệu huỳnh quang không bị thay đổi. - Phủ một lớp Citifluor/Vecta shield (4:1 v/v) và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. 2.2.8. Định lượng Fe(II), Mn(II) và nitrate Mẫu vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate được nuôi cấy trong môi trường kỵ khí dạng dịch thể chứa Fe(II) (10 mM) và nitrate (5 mM) trong bình serum đậy kín bằng nút cao su. Mẫu dịch nuôi cấy (1 ml) được thu sau mỗi 24 giờ để xác định nồng độ Fe(II) và nitrate. Trong thí nghiệm xác định khả năng oxy hóa Mn(II) của vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate, Mn(II) được sử dụng để thay thế Fe(II) làm chất cho điện tử trong môi trường nuôi cấy. a) Định lượng Fe(II) bằng thuốc thử phenanthrolin (DIN 38406 E1-1, 1983) Nguyên lý: O- phenanthrolin phản ứng với Fe(II) tạo phức có màu tím đỏ trong khoảng pH 3 - 9, đo được ở bước sóng 510 nm. Nồng độ Fe(II) cho phép đo là 0,01 - 5 mg/L. Kết quả của phép đo có thể bị ảnh hưởng bởi ion Mn và Cu. Chuẩn bị: Dung dịch HCl 25% (rửa dụng cụ): Dụng cụ được rửa bằng HCl 25% và tráng bằng nước cất trước khi sử dụng Dung dịch H2SO4 loãng (hạ pH): H2SO4 đặc : nước = 1 : 4 Dung dịch ammonium acetate 5,2 M (đệm): CH3COONH4 40 g CH3COOH 50 ml Nước cất đủ100 ml Dung dịch phenanthrolin 21 mM (Tạo phức): C12H9ClN2.H2O 0,5 g Nước cất đủ 100 ml (Bảo quản trong lọ tối, hạn sử dụng trong 1 tuần) Dung dịch chuẩn: FeSO4.7H2O 2,78 mg HCl 25% 6,25 ml Nước cất đủ 100 ml Tiến hành: - Sau khi thu mẫu, ngay lập tức hạ pH tới 1 bằng dung dịch H2SO4 loãng (1% thể tích). - Thêm vào 50 ml mẫu 5 ml dung dịch ammonium acetate, trộn đều bằng vortex, hỗn hợp phải có pH nằm trong khoảng 3,4 - 5,5 (tối ưu là 4,5). - Thêm 2 ml dung dịch phenanthrolin, trộn đều. - Thêm nước cho tới 100 ml, trộn đều. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. - Đo OD tại bước sóng 510 nm. - Đường chuẩn được tiến hành với nồng độ Fe(II) từ 5 - 50 μM. b) Phương pháp trắc quang với thuốc thử acid disulfofemic, định lượng nitrate (Lê Đức, 2004) Nguyên lý: Ion NO3− tác dụng với acid disulfofemic tạo thành nitrodisulfofemic, chất này phản ứng với ammonia (NH3) đặc tạo thành phức có màu vàng, xác định được ở bước sóng 410 nm. Nồng độ nitrate cho phép đo là 0,5 - 5 mg/L. Chuẩn bị: Dung dịch acid disulfofemic: Phenol tinh khiết không màu 25 g H2SO4 đặc (tinh khiết) 150 ml H2SO4 bốc khói (oleum) 75 ml Trộn đều, đun sôi cách thủy trong bình cầu gắn ống sinh hàn hồi lưu trong 2 giờ Dung dịch chuẩn: KNO3 (đã sấy khô ở 105oC) 0,1631 g Nước cất 500 ml CHCl3 1 ml Nước cất đủ 1000 ml Tiến hành: - Mẫu nước (chứa không quá 5 mg/L nitrate) lấy vào ống nghiệm, trung hòa đến pH 7. - Chuyển mẫu sang chén sứ, cô cạn bằng đun cách thủy. - Thêm 2 ml dung dịch acid disulfofemic, hòa tan phần cặn bằng đũa thủy tinh. - Thêm 20 ml nước cất, 6 ml NH3 đặc hoặc 6 ml KOH 12N. - Thêm nước cất cho đủ 50 ml (trong bình định mức). - Đo OD tại bước sóng 410 nm. - Đường chuẩn được xây dựng trên các nồng độ dung dịch chuẩn từ 0 - 10 mM c) Phương pháp formaldoxime, định lượng Mn(II) (Brewer và Spencer, 1971) Nguyên lý: Ion mangan phản ứng màu với formaldoxime (formaldehyde oxime) trong môi trường kiềm tạo thành phức có màu cam đỏ đậm, xác định ở bước sóng 450 nm. Để không hình thành các kết tủa hydroxit, pH tối ưu của phương pháp này là 8,8 - 8,9. Chuẩn bị: Formaldoxime: 20 g Hydroxylamine hydrochloride hòa tan trong 450 ml nước cất, thêm 10 ml dung dịch Formaldehyde 37% và thêm nước đến 500 ml. Ammonia (NH3) Hỗn hợp Formaldoxime:Ammonia với tỉ lệ 5:2 Dung dịch chuẩn (100 μg Mn(II)/ml): Hòa tan 0,2876 g permanganate kali (KMnO4) trong 100 ml nước cất, thêm 3 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc, dẫn acid sunfurous (SO2 trong nước) cho đến khi dung dịch mất màu. Đun sôi dung dịch để loại bỏ SO2 thừa, sau đó làm lạnh dung dịch. Bổ sung nước cho đủ 1 lít. Tiến hành: - Đưa 35 ml mẫu về pH = 8,8 - 8,9. - Thêm 3 ml hỗn hợp formaldoxime/ammonia vào lắc xoay tròn, đều. - Sau 2 - 30 phút đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 450 nm. - Đường chuẩn được xây dựng trên các nồng độ dung dịch chuẩn từ 0 - 10 mM. Chương 3 - Kết quả và thảo luận 3.1. Xác định số lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate tại các môi trường sinh thái khác nhau (B) (A) Số lượng tế bào (ì103 ã g -1) Hình 8. Xác định số lượng vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate trong các môi trường sinh thái khác nhau. (A) - Nhận biết sự có mặt của vi khuẩn trong các ống MPN thông qua biến đổi màu sắc của môi trường từ trắng xanh (Fe(II)) sang vàng nâu (Fe(III)). (B) - Số lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate xác định thông qua phương pháp MPN. Ba môi trường đại diện được lựa chọn để tiến hành nghiên cứu gồm có bùn đáy ao nước ngọt, chân ruộng lúa ngập nước và trầm tích nước lợ ven biển. Đây là những môi trường có sự tham gia hoạt động tích cực của vi khuẩn trong chu trình chuyển hoá sắt và nitơ (Ratering và Schnell, 2001). Số lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate trong các mẫu bùn đáy và trầm tích thu thập tại ba môi trường sinh thái khác nhau được xác định thông qua phương pháp MPN (Most Probable Number) sử dụng môi trường dịch thể chứa FeSO4 làm chất cho điện tử và NaNO3 làm chất nhận điện tử cuối cùng. Thành phần khoáng trong môi trường tương ứng với điều kiện nước ngọt (đối với mẫu bùn đáy ao và bùn chân ruộng ngập nước) hoặc nước lợ (đối với trầm tích ven biển). Sự phát triển của vi khuẩn sinh trưởng nhờ oxy hoá Fe(II) đồng thời với khử nitrate trong các ống MPN được nhận biết thông qua sự biến đổi màu sắc của môi trường từ trắng xanh (màu của Fe(II)) sang màu vàng nâu (màu của Fe(III)) (hình 8A). Kết quả thí nghiệm MPN (hình 8B) cho thấy số lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate cao nhất trong mẫu bùn chân ruộng ngập nước (9,3 x 103 tế bào/g bùn), cao hơn hẳn so với mẫu trầm tích nước lợ ven biển (4,3 x 103 tế bào/g trầm tích) và mẫu bùn đáy ao nước ngọt (1,5 x 103 tế bào/g bùn). Mật độ và mối tương quan giữa số lượng vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate với các điều kiện môi trường tại mỗi vùng sinh thái như trên cũng đã được tìm thấy trong một số nghiên cứu trước đây. Khi nghiên cứu chu trình chuyển hoá sắt trong đất trồng lúa tại ý, Ratering đã phát hiện thấy nồng độ các ion sắt trong môi trường này rất cao và các loài tham gia chu trình chuyển hoá sắt đóng vai trò quan trọng trong chu trình chuyển hoá vật chất tại đây (Ratering, 1999). Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu khác cũng cho thấy số lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate tại nhiều vùng sinh thái khác nhau trên thế giới dao động trong khoảng từ 1 ì 103 đến 5 ì 108 tế bào/g mẫu khô (Straub và cs, 1996; Hauck và cs, 2001; Ratering và Schnell, 2001; Weber và cs, 2006 b, c). 3.2. Phân tích cấu trúc quần xã vi khuẩn bằng điện di biến tính (DGGE) Phương pháp điện di biến tính - DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) được ứng dụng phổ biến trong nghiên cứu đa dạng, phân tích cấu trúc di truyền của quần xã vi khuẩn cũng như xác định các nhóm vi khuẩn chiếm ưu thế trong các môi trường sinh thái khác nhau (Norris và cs, 2002; Sekiguchi và cs, 2002; Bano và Hollibaugh, 2002; Avrahami, 2002; Nicol và cs, 2003; Crump và cs, 2003). Với mục đích xác định nhóm vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate chiếm ưu thế tại các môi trường nghiên cứu, chúng tôi tiến hành phân tích cấu trúc quần xã vi khuẩn trong các ống MPN ở độ pha loãng 10-3 (là nồng độ gần tới hạn của dãy MPN đối với cả 3 mẫu) bằng phương pháp PCR-DGGE đoạn gen 16S rDNA (hình 9). Các băng điện di được cắt từ gel và sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR sau đó để xác định trình tự và so sánh với các trình tự 16S rDNA đã công bố trong ngân hàng dữ liệu GeneBank. Anaeromyxobacter sp. Pseudomonas sp. A R B Paracoccus sp. Hình 9. Phổ điện di biến tính (DGGE) phân tích đoạn 16S rDNA của quần xã vi khuẩn trong các ống MPN của các mẫu nghiên cứu. A - Bùn đáy ao nước ngọt; R - Bùn chân ruộng ngập nước; B - Trầm tích ven biển. Có thể thấy rằng nhóm vi khuẩn thuộc chi Anaeromyxobacter có mặt trong cả 3 dạng môi trường nghiên cứu. Đây là nhóm vi khuẩn nằm trong phân lớp d-Proteobacteria, hiện mới chỉ có một loài duy nhất được công bố là A. dehalogenans cùng với một số đại diện chưa định danh đến loài. Các chủng Anaeromyxobacter đã công bố đều sinh trưởng kỵ khí khử Fe(III), chưa có chủng nào được nghiên cứu về khả năng sinh trưởng khử nitrate, sử dụng Fe(II) làm chất cho điện tử (Treude và cs, 2003; Straub và cs, 1996, 1998). Trong môi trường nuôi cấy sử dụng ở đây (cũng như trong điều kiện tự nhiên), Fe(III) đồng thời tồn tại với Fe(II) do kết quả chuyển hoá Fe(II) bằng con đường hoá học (phản ứng với lượng nhỏ oxy trong môi trường) và con đường sinh học (do các vi sinh vật oxy hoá Fe(II), khử nitrate). Do vậy, sự có mặt của các loài sinh trưởng kỵ khí khử Fe(III) như Anaeromyxobacter trong điều kiện môi trường nghiên cứu ở đây (cũng như trong tự nhiên) là mắt xích khép kín chu trình chuyển hoá sắt tại đây. Hai nhóm vi khuẩn Paracoccus và Pseudomonas tương ứng chiếm ưu thế trong mẫu bùn ao nước ngọt và chân ruộng ngập nước. Đây là hai chi vi khuẩn thuộc lớp Proteobacteria, có nhiều đại diện sinh trưởng kỵ khí khử nitrate, bao gồm cả các loài có khả năng sử dụng Fe(II) làm chất cho điện tử (Weber và cs, 2006b; Ratering và Schnell, 2001; Schafleigh, 2000). Như vậy có thể kết luận rằng trong môi trường nước ngọt tại Việt Nam (đại diện là ao nước ngọt và ruộng ngập nước), Paracoccus và Pseudomonas là các nhóm vi khuẩn đóng vai trò chính trong việc oxy hoá Fe(II) bằng nitrate. Tuy nhiên, trong môi trường nước lợ bằng phương pháp này hiện chưa xác định được nhóm vi khuẩn chiếm ưu thế. Nguyên nhân có thể do sự kém cạnh tranh của vi khuẩn khử nitrate nói chung so với các nhóm kỵ khí khác, đặc biệt là nhóm vi khuẩn khử sulfate trong môi trường này (Schafleigh, 2000). Đánh giá đa dạng di truyền vi khuẩn trong các môi trường nghiên cứu bằng phương pháp FISH FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) là phương pháp xác định trực tiếp (không qua bước phân lập và nuôi cấy) mối liên quan phả hệ của vi khuẩn trong môi trường sống của chúng thông qua các đầu dò đánh dấu huỳnh quang có thể bắt cặp với rRNA (Amann và cs, 1995). BET42a GAM42a ALF968 Hình 10. Hình ảnh hiển vi của tế bào vi khuẩn trong các mẫu nghiên cứu bắt cặp với đầu dò huỳnh quang . Theo kết quả nghiên cứu của một số công trình đã công bố, nhóm vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate thường thuộc vào phân lớp a-, b- và g-Proteobacteria (Chaudhuri và cs, 2001; Edwards và cs, 2003) vì vậy, trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng ba đầu dò ALF968, BET42a và GAM42a tương ứng bắt cặp đặc hiệu với rRNA của các vi khuẩn thuộc ba phân lớp trên. Tỷ lệ vi khuẩn mỗi nhóm được tính theo tỷ lệ số tế bào bắt cặp với đầu dò (hình 10) tương ứng trên tổng số tế bào được nhuộm DAPI. Phần không bắt cặp với một trong ba đầu dò được sử dụng ở đây được gọi là phần không xác định (KXĐ) (hình 11). Thí nghiệm lai với các đầu dò chỉ cho kết quả đối với mẫu từ hai môi trường nước ngọt là bùn chân ruộng ngập nước và bùn đáy ao nước ngọt. Riêng đối với mẫu trầm tích ven biển, không cho kết quả dương tính đối với cả 3 đầu dò. ở hai mẫu dương tính đều cho kết quả với đầu dò ALF968, riêng đầu dò GAM42a và BET42a chỉ cho kết quả dương tính tương ứng ở mẫu bùn chân ruộng ngập nước và mẫu bùn đáy ao nước ngọt (hình 11). Như vậy, bằng phương pháp này chúng tôi không xác định được mức độ đa dạng di truyền của mẫu trầm tích ven biển với 3 đầu dò sử dụng. KXĐ 60% ALF968 20% GAM42a 20% KXĐ 50% ALF968 30% BET42a 20% Bùn chân ruộng ngập nước Bùn đáy ao nước ngọt Hình 11. Kết quả phân tích đa dạng di truyền vi khuẩn trong các mẫu nghiên cứu bằng phương pháp FISH. 3.4. Mức độ oxy hóa Fe(II) và khử nitrate của vi khuẩn trong các mẫu nghiên cứu Nồng độ Fe(II) và nitrate trong môi trường nuôi cấy được xác định theo thời gian để đánh giá khả năng sinh trưởng bằng oxy hóa Fe(II) và khử nitrate của vi khuẩn trong các mẫu làm giàu (hình 12). Kết quả cho thấy quần xã vi khuẩn được làm giàu qua dãy MPN thể hiện khả năng sinh trưởng với Fe(II) và nitrate khá cao. ở cả 3 mẫu, lượng nitrate trong môi trường bị khử đáng kể sau 4 ngày (hình 12B), tuy nhiên lượng Fe(II) không giảm tương ứng (hình 12A). Hiện tượng này có thể lý giải bằng sự có mặt của nhóm vi khuẩn Anaeromyxobacter trong cả 3 mẫu phân tích (kết quả thí nghiệm điện di biến tính, mục 3.2) cùng với các nhóm vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate làm chuyển hoá liên tục giữa Fe(III) và Fe(II) trong môi trường. (B) (A) Hình 12. Hoạt tính oxy hoá Fe(II) (A) và khử nitrate (B) của quần xã vi khuẩn tại ba môi trường nghiên cứu sau khi đã làm giàu thông qua phương pháp MPN. Ký hiệu: O đối chứng không có VSV; Ă mẫu bùn đáy ao nước ngọt; —mẫu bùn chân ruộng ngập nước;  mẫu trầm tích nước lợ ven biển. 3.5. Phân lập vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate từ các mẫu nghiên cứu Song song với các phương pháp phân tích đa dạng và cấu trúc di truyền quần xã vi khuẩn không qua bước phân lập và nuôi cấy như phương pháp PCR-DGGE và FISH đã tiến hành ở phần trên, chúng tôi tiếp tục tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate đại diện với mục đích (i) đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần xã vi sinh vật thông qua phân lập và nuôi cấy; (ii) nghiên cứu chi tiết các đặc điểm sinh lý, sinh hóa và tìm hiểu khả năng ứng dụng của các chủng đại diện và (iii) xác định vị trí phân loại và định danh khoa học cho các chủng đại diện đó. (A) (B) Hình 13. Phân lập vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate đại diện tại các môi trường nghiên cứu. (A) - Phân lập chủng đơn thông qua phương pháp ống thạch kỵ khí bán lỏng; (B) - Nuôi cấy chủng đơn vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate trong môi trường dịch thể ở điều kiện kỵ khí hoàn toàn. Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate được phân lập theo phương pháp pha loãng trên dãy ống thạch bán lỏng (1%) đến độ pha loãng 10-8 (Widdel và Bak, 1992) (hình 13A). Các khuẩn lạc đơn được phân lập dựa trên sự khác nhau về hình dạng, kích thước khuẩn lạc. Mỗi khuẩn lạc được tách ra và nuôi cấy kỵ khí trong môi trường dịch thể chứa Fe(II) (10 mM) và nitrate (5 mM) trong bình serum có nút cao su (hình 13B). 12 khuẩn lạc đơn được chọn lọc và phân lập từ các ống MPN ở độ pha loãng cao nhất có vi khuẩn phát triển (bảng 8) là đại diện cho vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate chiếm đa số tại ba môi trường nghiên cứu. Nguồn gốc phân lập, ký hiệu tên chủng và đặc điểm hình thái khuẩn lạc của 12 chủng đơn được trình bày chi tiết ở bảng 8 dưới đây. Bảng 8. Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate phân lập được từ các môi trường nghiên cứu. IN1 - IN12: 12 chủng đơn phân lập được từ các mẫu nghiên cứu. Nguồn phân lập Tên chủng Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Bùn chân ruộng lúa ngập nước ở Cổ Nhuế, Hà nội IN1 Hình tròn, bề mặt nhẵn, kích thước 1-2 mm IN2 Hình tròn, bề mặt không nhẵn, kích thước 0,25-0,5 mm IN3 Hình tròn, bề mặt xù xì, kích thước 0,25-0,5 mm IN4 Hình tròn, bề mặt xù xì, kích thước 1-2 mm Trầm tích nước lợ tại biển Vân Đồn, Quảng Ninh IN5 Hình tròn, bề mặt nhẵn, kích thước 0,25 mm IN6 Hình bầu dục, bề mặt nhẵn, kích thước 0,25-0,5 mm IN7 Hình tròn, bề mặt xù xì, kích thước 0,8 mm IN8 Hình tròn tia, mật độ tế bào ở ngoài ít hơn phía trong, kích thước 1-1,5 mm Bùn đáy ao nước ngọt ở Cổ Nhuế, Hà nội IN9 Hình tròn, bề mặt xù xì, kích thước 0,5-1 mm IN10 Hình tròn không đều, kích thước 0,5-1 mm IN11 Hình tròn, bề mặt nhẵn, kích thước 0,2-0,3 mm IN12 Hình đĩa lồi hai mặt, kích thước 2-2,5 mm 3.6. Đánh giá tính đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate bằng phương pháp ARDRA Tính đa dạng di truyền của 12 chủng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate đã phân lập ở trên được phân tích bằng phương pháp ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) sử dụng hai enzyme giới hạn HaeIII và MspI (hình 14). Kết quả thu được cho thấy 12 chủng vi khuẩn này có thể xếp vào 5 nhóm di truyền khác nhau (bảng 9). IN1 IN2 IN3 IN4 IN5 IN6 IN7 IN8 IN9 IN10 IN11 IN12 M IN1 IN2 IN3 IN4 IN5 IN6 IN7 IN8 IN9 IN10 IN11 IN12 HaeIII MspI Hình 14. Phổ điện di gen 16S rDNA của 12 chủng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate sau khi xử lý bằng các enzyme giới hạn HaeIII và MspI. IN1 - IN12: 12 chủng đơn phân lập được từ các mẫu nghiên cứu; M: Marker 1000 bp (Bioneer). Bảng 9. Tính đa dạng di truyền về di truyền của 12 chủng vi khuẩn oxy hóa Fe(II) khử nitrate đã phân lập (IN1 - IN12) dựa trên phân tích ARDRA. Nhóm ARDRA Chủng vi khuẩn Các đoạn DNA tạo ra sau khi xử lý gen 16S rDNA bằng các enzyme giới hạn (bp) HaeIII MspI 1 IN1, IN2, IN4, IN11 200, 300 300, 500 2 IN3, IN8 200, 300 500 3 IN5, IN9 200, 300 500, 800 4 IN6, IN10, IN12 200, 300, 500 300, 500 5 IN7 200, 900 500 Từ kết quả phân nhóm ở bảng 9 kết hợp với nguồn gốc phân lập 12 chủng vi khuẩn này (bảng 8), có thể nhận thấy tính đa dạng di truyền của 12 chủng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate phụ thuộc vào địa điểm thu mẫu ban đầu. Mẫu trầm tích nước lợ ven biển thể hiện mức độ đa dạng di truyền cao nhất với 4 chủng phân lập từ mẫu này (IN5, IN6, IN7, IN8) thuộc vào 4 nhóm khác nhau (nhóm ARDRA-2, nhóm ARDRA-3, nhóm ARDRA-4 và nhóm ARDRA-5). Tiếp đến là mẫu bùn đáy ao nước ngọt với 4 chủng (IN9, IN10, IN11, IN12) thuộc vào 3 nhóm khác nhau (nhóm ARDRA-1, nhóm ARDRA-2 và nhóm ARDRA-4). Thể hiện tính đa dạng di truyền thấp nhất là mẫu bùn chân ruộng ngập nước với 4 chủng (IN1, IN2, IN3, IN4) thuộc vào 2 nhóm khác nhau (nhóm ARDRA-1 và nhóm ARDRA-2). Ba chủng IN2, IN7 và IN12 đại diện cho 3 nguồn phân lập và đại diện cho các nhóm ARDRA chính (bảng 9, tên chủng được in đậm) được lựa chọn để tiến hành phân tích trình tự gen 16S rDNA và định danh khoa học. Chủng IN2 đại diện cho nhóm ARDRA-1 gồm 4 chủng từ hai dạng môi trường nước ngọt, chiếm trên 30% trong tổng số các chủng phân lập được. Tương tự, chủng IN12 đại diện cho nhóm ARDRA-4 gồm 3 chủng từ môi trường nước lợ và ao nước ngọt, chiếm 25% trong tổng số các chủng phân lập được. Chủng IN7 làm thành một nhóm riêng biệt (ARDRA-5), chỉ tìm thấy ở môi trường nước lợ ven biển. Hình 15. Cây phân loại thể hiện mối liên quan giữa các chủng IN2, IN7, IN12 và các loài gần gũi dựa trên trình tự gen 16S rDNA. Cây được dựng theo phương pháp neighbor-joining, đơn vị = 0,02 Knuc trong trình tự nucleotide. Các số hiển thị ở các vị trí phân nhánh là kết quả phân tích bootstrap đối với 1000 phép so sánh (chỉ có các giá trị trên 50% được trình bày trên hình). B. subtilis là loài vi khuẩn được chọn làm outgroup. Kết quả so sánh trình tự gen 16S rDNA của các chủng này với ngân hàng dữ liệu GenBank cho thấy chủng IN2 có độ tương đồng cao nhất với Anaeromyxobacter dehalogenans (99%), chủng IN7 có độ tương đồng cao nhất với Pseudomonas stutzeri (98%) và chủng IN12 có độ tương đồng cao nhất với Paracoccus ferooxydant (97%) (hình 15). Như vậy nhóm ARDRA-4 với chủng IN12 làm đại diện là các chủng thuộc chi Paracoccus và được tìm thấy trong hai dạng môi trường nước lợ ven biển và ao nước ngọt. Paracoccus là chi vi khuẩn nằm trong phân lớp a-Proteobacteria, gồm các loài sinh trưởng kỵ khí tuỳ tiện, hô hấp bằng nitrate hoặc oxy (Schapleigh, 2000). Kết hợp với kết quả phân tích PCR-DGGE ở trên có thể thấy rằng Paracoccus và Pseudomonas là hai nhóm chính oxy hoá Fe(II) khử nitrate chiếm ưu thế trong ba dạng môi trường được nghiên cứu, trong đó Paracoccus có vai trò quan trọng hơn ở ao nước ngọt và Pseudomonas ở ruộng ngập nước. Đại diện của cả hai nhóm này được tìm thấy ở môi trường nước lợ ven biển, có thể là do ảnh hưởng của nguồn nước ngọt từ đất liền. Dựa trên kết quả so sánh trình tự gen 16S rDNA ở trên, các chủng IN2, IN7 và IN12 được định danh lần lượt là Anaeromyxobacter sp. IN2, Pseudomonas sp. IN7 và Paracoccus sp. IN12. Trong ba chủng được nghiên cứu chi tiết ở trên chỉ có chủng IN7 là đại diện được phân lập từ môi trường nước lợ ven biển. Bằng phương pháp PCR-DGGE trình bày ở trên, nhóm vi khuẩn chiếm ưu thế trong môi trường nước lợ chưa xác định được. Tuy nhiên việc phân tích các chủng đại diện phân lập được từ cả ba môi trường nghiên cứu cho phép kết luận Pseudomonas cũng là một nhóm chiếm ưu thế trong dạng môi trường này. 3.7. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, phân loại và hoạt tính sinh học của các chủng vi khuẩn đại diện Hai chủng vi khuẩn IN2 và IN12 đại diện cho hai nhóm vi khuẩn chiếm ưu thế trong các môi trường nghiên cứu là Anaeromyxobacter và Paracoccus (phần 3.6). Hơn thế, trong quá trình thí nghiệm chúng tôi nhận thấy rằng đây là hai chủng thể hiện khả năng sinh trưởng cao nhất trong số các chủng đã phân lập được. Để tìm hiểu khả năng ứng dụng của nhóm vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các đặc điểm sinh lý của hai chủng này. Kết quả nghiên cứu cho thấy hai chủng IN2, IN12 rất khác nhau về đặc điểm sinh lý (bảng 10). Trong khi chủng IN2 là vi khuẩn kỵ khí bắt buộc thì chủng IN12 là vi khuẩn kỵ khí tùy tiện, có khả năng hô hấp bằng oxy (sinh trưởng hiếu khí). Ngoài nitrate được sử dụng làm chất nhận điện tử cuối cùng, chủng IN2 còn có khả năng sử dụng Fe(III) làm chất nhận điện tử còn chủng IN12 không có khả năng này. Cả hai chủng đều không sinh trưởng bằng khử sulfate (SO42-). Bảng 10. Đặc điểm sinh lý của hai chủng vi khuẩn IN2 và IN12. Ký hiệu: (-): không sinh trưởng; (+ đến +++): các mức độ sinh trưởng tăng dần. Đặc điểm sinh lý IN2 IN12 Hô hấp bằng oxy (sinh trưởng hiếu khí) - + + Sinh trưởng phụ thuộc độ mặn của môi trường (% NaCl) 0% - + + + 1% + + + + + + 2% + + + + + + 3% + + + + + + 4% + + + + + 5% + + + + Chất cho điện tử (để khử nitrate) Lactate + + + + + + Acetate + + + + + + Ethanol + + + + + + Benzoate + + + + Chất nhận điện tử (oxy hoá lactate) Nitrate + + + + + + Fe(III) + + + - Sulfate - - Đối với các nguồn điện tử khác nhau phục vụ cho quá trình khử nitrate, ngoài Fe(II) đã được sử dụng để phân lập và nuôi cấy từ ban đầu, lactate, acetate, benzoate và ethanol đều được oxy hoá bởi hai chủng IN2 và IN12. Trong trường hợp benzoate, một acid hữu cơ chứa vòng thơm và thường khó bị oxy hoá hơn các hợp chất còn lại, chủng IN12 thể hiện khả năng oxy hoá kém hơn hẳn so với chủng IN2. Độ mặn là một trong các yếu tố môi trường quan trọng ảnh hưởng đến sinh lý của vi khuẩn trong tự nhiên, do vậy ở đây chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ muối trong môi trường đối với khả năng sinh trưởng của hai chủng vi khuẩn quan tâm. Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng IN2 có nhu cầu về muối để sinh trưởng còn chủng IN12 thì không. Trong khi chủng IN12 có thể sinh trưởng trong môi trường không cần bổ sung NaCl thì chủng IN2 chỉ phát triển khi NaCl có mặt ở nồng độ 1% trở lên. Tuy nhiên, chủng IN2 lại có khả năng chịu muối cao hơn IN12, chủng này vẫn phát triển tốt ở nồng độ muối 5% trong khi đó tốc độ sinh trưởng của IN12 bị ảnh hưởng đáng kể ở các nồng độ muối cao hơn 3%. Điều này cũng phù hợp với đặc điểm phân bố của hai chủng vi khuẩn trong tự nhiên, cụ thể là chủng IN2 đại diện cho nhóm vi khuẩn được tìm thấy ở nhiều dạng môi trường khác nhau, bao gồm cả nước ngọt và nước lợ, trong khi đó chủng IN12 đại diện cho nhóm chỉ tìm thấy ở bùn đáy thuỷ vực nước ngọt. Chủng IN2 gồm những tế bào dạng trực khuẩn, kích thước 1 ´ 4 - 5 μm, chuyển động tích cực (hình 16). So sánh trình tự gần đủ gen mã hóa cho gen 16S rDNA với ngân hàng dữ liệu GenBank cho phép xếp chủng IN2 vào chi Anaeromyxobacter (loài gần gũi nhất là A. dehalogenans, 99% tương đồng). Như vậy chủng IN2 được bổ sung vào danh sách chi Anaeromyxobacter với tên khoa học là Anaeromyxobacter sp. IN2 và mã trình tự gen 16S rDNA trong GenBank là FJ939131 (hình 16). Anaeromyxobacter là một chi được biết đến với các đại diện sinh trưởng kỵ khí bắt buộc bằng oxy hoá các hợp chất hữu cơ để khử Fe(III) (Treude và cs, 2003). Trong nghiên cứu này, lần đầu tiên vi khuẩn Anaeromyxobacter mà đại diện là chủng IN2 thể hiện khả năng sinh trưởng bằng oxy hoá Fe(II), khử nitrate, tuy nhiên hình thức sinh trưởng này không vượt trội so với sinh trưởng kỵ khí khử Fe(III). Hình thức sinh trưởng tương tự cũng xảy ra với các chủng thuộc chi Geobacter (Weber và cs, 2006 c). Nghiên cứu này chỉ ra rằng trầm tích có chứa các chủng vi khuẩn Geobacter sp. có khả năng oxy hóa Fe(II) và khử Fe(III) cùng với khử nitrate thành NH4+. Anaeromyxobacter sp. IN2 Paracoccus sp. IN12 0,5 μm Hình 16. Hình thái tế bào và vị trí phân loại của hai chủng IN2 và IN12. Hình thái tế bào được quan sát trên kính hiển vi quang học, độ phóng đại 1000 lần (đơn vị = 5 mm). Cây phân loại được dựng theo phương pháp neighbor-joining, đơn vị = 0,02 Knuc trong trình tự nucleotide. Các số hiển thị ở các vị trí phân nhánh là kết quả phân tích bootstrap đối với 1000 phép so sánh (chỉ có các giá trị trên 500 được trình bày trên hình). B. subtilis là loài vi khuẩn được chọn làm outgroup. Chủng IN12 gồm những tế bào hình oval có kích thước 1,5 ´ 1.5 - 2 μm, chuyển động chậm. So sánh trình tự gần đủ của gen 16S rDNA với ngân hàng dữ liệu GenBank cho phép xếp chủng IN12 vào chi Paracoccus (loài gần gũi nhất là P. aminovorans, 98% tương đồng). Paracoccus là chi vi khuẩn nằm trong phân lớp α-Proteobacteria, gồm nhiều loài có khả năng hô hấp bằng oxy (sinh trưởng hiếu khí), đồng thời hô hấp bằng khử nitrate (Shapleigh, 2000). Nhiều đại diện của chi Paracccus được tìm thấy trong các điều kiện tối ưu cho khử nitrate, như đáy các thuỷ vực (Shapleigh, 2000) hay trong các hệ thống xử lý nước thải loại bỏ nitơ, ví dụ như P. denitrificans, P. ferooxydans (Bitton, 1999). Chủng IN12 được định danh khoa học là Paracoccus sp. IN12 và có mã trình tự gen 16S rDNA trong GenBank là GU084390 (hình 16). Mặc dù cùng được phân lập thông qua bước làm giàu bằng dãy MPN với chất cho và nhận điện tử tương ứng là Fe(II) và nitrate, hai hủng IN2 và IN12 lại đại diện cho hai nhóm vi khuẩn khác nhau tham gia chu trình sắt ở môi trường trung tính, cụ thể là oxy hoá Fe(II) thành Fe(III) bằng nitrate và khử Fe(III) thành Fe(II) bằng các hợp chất hữu cơ. Tuy cũng có khả năng sinh trưởng cao trong môi trường có Fe(II) và nitrate nhưng chủng IN2 sẽ khó có khả năng ứng dụng vào mục đích loại bỏ Fe(II) và nitrate trong các nguồn nước ô nhiễm vì bị ảnh hưởng bởi khả năng sử dụng Fe(III) làm chất nhận điện tử cuối cùng để tạo năng lượng. Khác với IN2, chủng IN12 là một vi khuẩn oxy hoá Fe(II) khử nitrate điển hình. Hơn thế nữa, chủng vi khuẩn này có khả năng sinh trưởng trong nhiều đều kiện môi trường khác nhau như có mặt hay không có mặt oxy, thích nghi với nhiều loại nguồn điện tử khác nhau (như Fe(II), các acid hữu cơ, rượu) và sinh trưởng tốt trong môi trường có độ mặn dao động trong dải 0 - 3% (đặc trưng cho cả môi trường nước ngọt và nước lợ). Với những ưu điểm kể trên, chủng IN12 hứa hẹn có tiềm năng ứng dụng vào việc loại bỏ nitơ và Fe(II) trong các nguồn nước ô nhiễm. Hoạt tính oxy hóa Fe(II) và khử nitrate của chủng IN12 được xác định ở điều kiện kỵ khí với Fe(II) là chất cho điện tử và nitrate làm chất nhận điện tử cuối cùng. Kết quả xác định nồng độ các chất cho và nhận điện tử trong môi trường biến đổi theo thời gian cho thấy sự giảm nồng độ Fe(II) và nitrate diễn ra song song với tốc độ đáng kể (hình 17). Bên cạnh đó khả năng sử dụng Mn(II) làm chất cho điện tử để khử nitrate cũng được kiểm tra, tuy nhiên chủng IN12 không thể hiện sinh trưởng rõ rệt trong điều kiện nuôi cấy này. Theo một số nghiên cứu đã công bố, hoạt tính oxy hoá Mn(II), khử nitrate bằng con đường sinh học được xác định trong một số quần xã vi khuẩn ở đáy các thuỷ vực, nhưng cho đến nay chưa có chủng vi khuẩn nào được phân lập trong phòng thí nghiệm với hoạt tính kể trên (Vandenebeele và cs, 1995; Gounot, 1994). Hình 17. Loại bỏ Fe(II) (ã) và nitrate (Ă) trong môi trường do tác động của chủng vi khuẩn IN12. Kết luận Số lượng vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate trong các mẫu bùn thu thập ở thủy vực nước ngọt, chân ruộng ngập nước và vùng nước lợ ven biển nằm trong khoảng 103 - 104 tế bào/g, trong đó mẫu bùn ở chân ruộng ngập nước có số lượng tế bào vi khuẩn này cao hơn cả (9,3 ´ 103 tế bào/g). Kết quả phân tích DGGE cho thấy nhóm vi khuẩn thuộc chi Anaeromyxobacter chiếm ưu thế ở cả ba dạng môi trường sinh thái nghiên cứu và đóng vai trò khép kín chu trình chuyển hoá sắt trong các môi trường nghiên cứu thông qua khả năng sinh trưởng kỵ khí khử Fe(III). Paracoccus và Pseudomonas là hai nhóm vi khuẩn chính thực hiện quá trình oxy hoá Fe(II), khử nitrate tương ứng ở mẫu bùn đáy ao và chân ruộng ngập nước. Đại diện thuộc chi Pseudomonas (chủng IN7) cũng được tìm thấy trong môi trường nước lợ ven biển, và có thể đóng vai trò quan trọng trong môi trường này. Vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate tại các môi trường nghiên cứu có tính đa dạng khá cao. 12 chủng đơn phân lập từ các mẫu MPN được xếp vào 5 nhóm khác nhau trong phân tích ARDRA sử dụng hai enzyme giới hạn HaeIII và MspI, trong đó mẫu trầm tích ven biển thể hiện tính đa dạng di truyền cao hơn cả với 4 chủng thuộc vào 4 nhóm ARDRA khác nhau. IN2 và IN12 đại diện cho hai nhóm vi khuẩn tham gia chu trình chuyển hoá sắt tại các môi trường nghiên cứu, trong đó chủng IN2 tham gia khử Fe(III) thành Fe(II) bằng các hợp chất hữu cơ và chủng IN12 tham gia oxy hoá Fe(II) thành Fe(III) bằng nitrate. Hai chủng này có khả năng sinh trưởng với nhiều chất cho điện tử (lactate, acetate, ethanol, benzoate) và nhận điện tử (nitrate, Fe(III)) tại các nồng độ muối khác nhau trong môi trường. So sánh trình tự gần đủ của gen 16S rDNA với các loài đã công bố trên GenBank cho phép định danh hai chủng vi khuẩn IN2 và IN12 lần lượt là Anaeromyxobacter sp. IN2 (mã trình tự đăng ký trên GenBank là FJ939131) và Paracoccus sp. IN12 (mã trình tự đăng ký trên GenBank là GU084390). hướng nghiên cứu tiếp theo Với hoạt tính cao trong việc oxy hoá Fe(II) và khử nitrate, chủng IN12 có tiềm năng ứng dụng thực tế trong việc xử lý các nguồn nước nhiễm nitơ và ion kim loại Fe(II). Nghiên cứu tìm giá thể phù hợp để tạo chế phẩm chứa vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate. Nghiên cứu thử nghiệm áp dụng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate để xử lý nước ngầm nhiễm sắt và nitơ. Tài liệu tham khảo Tài liệu Tiếng việt 1. Lê Đức (2004), Một số phương pháp phân tích môi trường, NXB ĐHQGHN. 2. Mai Thanh Truyết (1997), “Ô nhiễm nitrate trong nước vùng châu thổ sông Cửu long”, 3. TCVN 5944 (1995), “Chất lượng nước - Tiêu chuẩn chất lượng nước ngầm”, 4. Trần Thị Kiều My, Nguyễn Hà Thanh (2006), “Chuyển hóa sắt trong cơ thể và quá tải sắt ở một số bệnh máu” Hội nghị Khoa học ngành Huyết học – Truyền máu Quốc gia. 5. Viện Vệ sinh Dịch tễ Tây nguyên (2009) “Đánh giá ô nhiễm kim loại nặng tại nguồn nước ở Tây nguyên” Thông Tấn Xã Việt Nam. Tài liệu Tiếng Anh 6. Amann RI, Krumholz L, Stahl DA (1990), “Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic, and environmental studies in microbiology” J Bacteriol, 172 (2), pp. 762-770. 7. Amann RI, Stromley J, Devereux R. Key R, Stahl DA (1992), “Molecular and microscopic identification of sulfate-reducing bacteria in multispecies biofilms”, Appl Environ Microbiol, 58 (2), pp. 614-623. 8. Amann RI, Ludwig W, Schleifer KH (1995), “Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation”, Microbiol Rev, 59 (1), pp. 143-169. 9. American public health association (1996), Standard methods for the examination of water and waste water including bottom sediments and sludge, 604-609. 10. Appia-Ayme C, Guiliani N, Ratouchniak J, Bonnefoy V (1999), “Characterization of an operon encoding two c-type cytochromes, an aa3-type cytochrome oxidase, and rusticyanin in Thiobacillus ferrooxidans ATCC 33020”, Appl Environ Microbiol, 65 (11), pp. 4781-4787. 11. Avery AA (1999), “Infantile methemoglobinemia: Reexamining the role of drinking water nitrates”, Environ Health Perspect, 107 pp. 583-586. 12. Avrahami S (2002), Doctor thesis: Effects of temperature, soil ammonium concentration and fertilizer on activity and community structure of soil ammonia oxidizers, The faculty of Biology of the Philipps University of Marburg, Germany. 13. Bano N, Hollibaugh JT (2000), “Diversity and distribution of DNA sequences with affinity to ammonia-oxidizing bacteria of the β Subdivision of the class Proteobacteria in the Arctic Ocean”, Appl Environ Microbiol, 66 (5), pp. 1960-1969. 14. Bano N, Hollibaugh JT (2002), “Phylogenetic composition of bacterioplankton assemblages from the Arctic Ocean”, Appl Environ Microbiol, 68 (2), pp. 505-518. 15. Benz M, Brune A, Schink B (1998), “Anaerobic and aerobic oxidation of ferrous iron at neutral pH by chemoheterotrophic nitrate-reducing bacteria”, Arch Microbiol, 169 pp. 159-165. 16. Bitton G (1999), Wastewater Microbiology, Wiley-Liss, Inc. Toronto, Canada. 17. Blake RC, Waskowsky J, Harrison AP (1992) “Respiratory components in acidophilic bacteria that respire on iron”, Geomicrobiol J, 10 pp. 173-192. 18. Brewer PG, Spencer DW (1971), “Colorimetric determination of manganese in anoxic waters”, Limnol Oceanogr, 16 (1), pp. 107-110. 19. Bruce RA, Achenbach LA, Coates JD (1999), “Reduction of (per)chlorate by a novel organism isolated from paper mill waste”, Environ Microbiol, 1 (4), pp. 319-329. 20. Chaudhuri SK, Lack JG, Coastes JD (2001), “Biogenic magnetite formation through anaerobic biooxidation of Fe(II)”, Appl Environ Microbiol, 67 (6), pp. 2844-2848. 21. Croal LR, Jiao Y, Newman DK (2007), “The fox operon from Rhodobacter strain SW2 promotes phototrophic Fe(II) oxidation in Rhodobacter capsulatus SB1003”, J Bacteriol, 189 (5), pp. 1774-1782. 22. Crump BC, Kling GW, Bahr M, Hobbie JE (2003), “Bacterioplankton community shifts in an Arctic lake correlate with seasonal changes in organic matter source”, Appl Environ Microbiol, 69 (4), pp. 2253-3368. 23. Davies CE, Hill KE, Wilson MJ, Stephens P, Hill CM, Harding KG, Thomas DW (2004), “Use of 16S ribosomal DNA PCR and denaturing gradient gel electrophoresis for analysis of the microfloras of healing and nonhealing chronic venous leg ulcers”, J Clin Microbiol, 42 (8), pp. 3549-3557. 24. Delong EF, Wickham GS, Pace NR (1989), “Phylogenetic stain: ribosomal RNA-based probes for the identification of single cells”, Science, 243 (4896), pp. 1360-1363. 25. Dhillon A, Edwards K, Webb E, Roger D, Sogin M (2005), “Marinobacter aquaeolei gene expression studies for clues to neutrophilic iron oxidation”, NAI 2005 Biennial Meeting of the NASA Astrobiololy Institute. 26. DIN 38406-E1-1 (1983), German standard methods for the examination of water, waste water and sludge, cation (group E), determination of iron (E1). 27. Downes FP, Ito K (2001), Compendium of methods for the microbiological examination of foods, American Public Health Association, Washington, D.C. 28. Edwards KJ, Rogers DR, Wirsen CO, McCollom TM (2003), “Isolation and characterization of novel psychrophilic, neutrophilic, Fe-oxidizing, chemolithoautotrophic α- and γ-Proteobacteria from the deep sea”, Appl Environ Microbiol, 69 (5), pp. 2906-2913. 29. Ehrenberg (1919), “Gallionella ferruginea”, In Ellis D, Iron bacteria, Methuen & Co. Ltd. 30. Ehrenreich A, Widdel F (1994), “Anaerobic oxidation of ferrous iron purple bacteria, a new type of phototrophic metabolism”, Appl Environ Microbiol, 60 (12), pp. 4517-4526. 31. Ehrlich HL, Newman DK (2008), Geomicrobiology, fifth edtion, CRC Press. 32. Emerson D, Moyer C (1997), “Isolation and characterization of novel iron-oxidizing bacteria that grow at circumneutral pH”, Appl Environ Microbiol, 63 (12), pp. 4784-4792. 33. Emerson D (2000), “Microbial oxidation of Fe(II) and Mn(II) at circumneutral pH”, In Lovley DR, Environmental microbe-metal interaction, ASM Press. 34. Emerson D, Weiss JV (2004), “Bacterial iron oxidation in circumneutral freshwater habitals: findings from the field and the laboratory”, Geomicrobiol J, 21 pp. 405-414. 35. Felsenstein J (1985), “Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap”, Evolution, 39 pp. 783-791. 36. Fischer SG, Lerman LS (1979), “Length-independent separation of DNA restriction fragments in two-dimensional gel electrophoresis”, Cell, 16 (1), pp. 191-200. 37. Ghiorse WC (1984), “Biology of iron- and manganese- depositing bacteria”, Annu Rev Microbiol, 38 pp. 515-550. 38. Giovannoni SJ, Delong EF, Olsen GJ, Pace NR (1988), “Phylogenetic group-specific oligodeoxynucleotide probes for identificatio of single microbial cells” J Bacteriol, 170 (2), pp. 720-726. 39. Giovannoni SJ, Britschgi TB, Moyer CL, Field KG (1990), “Genetic diversity in Sargasso Sea bacterioplankton”, Nature, 345 pp. 60-63. 40. Gounot AM (1994), “Microbial oxidation and reduction of manganese: Consequences in groundwater and applications”, FEMS Microbiol Rev, 14 (4), pp. 339-349. 41. Hafenbradl D, Keller M, Dirmeier R, Rachel R, Rossagel P, Burggraf S, Huber H, Stetter KO (1996), “Ferroglobus placidus gen. nov., sp. nov., A novel hyperthermophilic archaeum that oxidizes Fe2+ at neutral pH under anoxic conditions”, Arch Microbiol, 166 (5), pp. 308-314. 42. Harder EC (1919), Iron-depositing bacteria and their geologic relations, U. S. Geologycal Survey, Professional Paper 113. 43. Hauck S, Benz M, Brune A, Schink B (2001), “Ferrous iron oxidation by denitrifying bacteria in profundal sediments of a deep lake (Lake Constance)”, FEMS Microbiol Ecol, 37 pp. 127-134. 44. Heising S, Schink B (1998), “Phototrophic oxidation of ferrous iron by a Rhodomicrobium vannielii strain”, Microbiology, 144 pp. 2263-2269. 45. Heising S, Richter L, Ludwig W, Schink B (1999), “Chlorobium ferrooxidans sp. nov., a phototrophic green sulfur bacterium that oxidizes ferrous iron in coculture with a “Geospirillum” sp. strain”, Arch Microbiol, 172 pp. 116-124. 46. Jiao Y, Kappler A, Croal LR, Newman DK (2005), “Isolation and characterization of a genetically tractable photoautotrophic Fe(II)-oxidizing bacterium, Rhodopseudomonas palustris strain TIE-1”, Appl Environ Microbiol, 71 (8), pp. 4487-4496. 47. Jiao Y, Newman DK (2007), “The pio operon is essential for phototrophic Fe(II) oxidation in Rhodopseudomonas palustric TIE-1” J Bacteriol, 189 (5), pp. 1765-1773. 48. Kappler A, Newman DK (2004), “Formation of Fe(III)-minerals by Fe(II)-oxidizing photoautotrophic bacteria”, Geochim Cosmochim Acta, 68 pp. 1217-1226. 49. Kỹtzing (1919), “Leptothrix ochracea”, In Ellis D, Iron bacteria, Methuen & Co. Ltd. 50. Kross BC, Hallberg GR, Bruner DR, Cherryholmes K, Johnson K (1993), “The nitrate contamination of private well water in Iowa”, Am J Public Health, 83 (2), pp. 270-272. 51. Lack JG, Chaudhuri SK, Kelly SD, Kemner KM, O’Connor SM, Coates JD (2002), “Immobilization of radionuclides and heavy metals through anaerobic bio-oxidation of Fe(II)”, Appl Environ Microbiol, 68 (6), pp. 2704-2710. 52. Lagacé L, Pitre M, Jacques M, Roy D (2004), “Identifiacation of the bacterial community of maple sap by using amplified ribosomal DNA (rDNA) restriction analysis and rDNA sequencing”, Appl Environ Microbiol, 70 (4), pp. 2052-2060. 53. Ludwig W, Schleifer KH (1994), “Bacterial phylogeny based on 16S and 23S rRNA sequence analysis”, FEMS Microbiol Rev, 15 (2-3), pp. 155-173. 54. Lundberg JO, Weitzberg E, Cole JA, Benjamin N (2004), “Nitrate, bacteria and human health”, Nature, 2 pp. 593-602. 55. Marmur J (1961), “A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms”, J Mol Biol, 3 pp. 208-218. 56. Martínez-Murcia AJ, Acinas SG, Rodriguez-Valera F (1995), “Evaluation of prokaryotic diversity by restrictase digestion of 16S rDNA directly amplified from hypersaline environments”, FEMS Microbiol Ecol, 17 (4), pp. 247-255. 57. Miot J, Benzerara K, Obst M, Kappler A, Hegler F, Schọedler S, Bouchez C, Guyot F, Morin G (2009), “Extracellular iron biomineralization by photoautotrophic iron-oxidizing bacteria”, Appl Environ Microbiol, 75 (17), pp. 5586-5591. 58. Moyer CL, Dobbs FC, Karl DM (1994), “Estimation of diversity and community structure through restriction fragment length polymorphism distribution analysis of bacterial 16S rRNA gens from a microbial mat at an active, hydrothermal vent system, Loihi Seamount, Hawaii”, Appl Environ Microbiol, 60 (3), pp. 871-879. 59. Moon J (2008), Iron - The most deadly metal, George Ohsawa Macrobiotic Foundation Chico, California. 60. Muyzer G, De Waal EC, Utterlinden AG (1993), “Profiling of complex microbial population by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction amplified genes coding for 16S rRNA”, Appl Environ Microbiol, 59 pp. 695-700. 61. Myers RM, Fischer SG, Lerman LS, Maniatis T (1985), “Nearly all single base substitutions in DNA fragments joined to a GC-clamp can be detected by denaturing gradietnt gel electrophoresis”, Nucl Acids Res, 13 (9), pp. 3131-3145. 62. Nicol GW, Glover LA, Prosser JI (2003), “The impact of grassland management on archaeal community structure in upland pasture rhizosphere soil”, Environ Microbiol, 5 (3), pp. 152-162. 63. Norris TB, Wraith JM, Castenholz RW, McDermott TR (2002), “Soil microbial community structure across a thermal gradient following a geothermal heating event”, Appl Environ Microbiol, 68 (12), pp. 6300-6309. 64. Ratering S (1999), Iron cycle in italian rice field soil: localization of the redox processes and charactarization of the involved microorganisms, PhD Dissertation, University Marburg (Germany). 65. Ratering S, Schnell S (2001), “Nitrate-dependent iron(II) oxidation in paddy soil”, Environ Microbiol, 3 pp. 100-109. 66. Ravenschlag K, Sahm K, Pernthaler J, Amann R (1999), “High bacterial diversity in permanently cold marine sediments”, Appl Environ Microbiol, 65 pp. 3982 - 3989. 67. Rentz JA, Kraiya C, Luther GW, Emerson D (2007), “Control of ferrous iron oxidation within circumneutral microbial iron mats by cellular activity and autocatalysis”, Environ Sci Technol, 41 (17), pp. 6084-6089. 68. Saitou N, Nei M (1987), “The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees”, Mol Biol Evol, 4 pp. 406-425. 69. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR (1977), “DNA sequencing with chain-terminating inhibitors”, Proc Natl Acad Sct USA, 74 (12), pp. 5463-5467. 70. Sekiguchi H, Watanabe M, Nakahara T, Xu B, Uchiyama H (2002), “Succession of bacterial community structure along the Changjiang river determined by denaturing gradient gel electrophoresis and clone library analysis”, Appl Environ Microbiol, 68 (10), pp. 5142-5150. 71. Senko JM, Dewers TA, Krumholz LR (2005), “Effect of oxidation rate and Fe(II) state on microbial nitrate-dependent Fe(III) mineral formation”, Appl Environ Microbiol, 71 (11), pp. 7172-7177. 72. Senn DB, Hemond HF (2002), “Nitrate controls on iron and arsenic in an urban lake”, Science, 296 pp. 2373-2376. 73. Shapleigh JP (2000), The Denitrifying Prokaryotes. In M. Dworkin, S. Falkow, E. Rosenberg, K.H. Schleifer, E. Stackerbrandt, eds. The prokaryotes: an evolving electronic resource for the microbiological community, Springer-Verlag, New York. 74. Sheffield VC, Cox DR, Lerman LS, Myers RM (1989), “Attachment of a 40-base-pair G+C-rich sequence (GC-clamp) to genomic DNA fragments by the polymerase chain reaction results in improved detection of single-base changes”, Proc Natl Acad Sci, 86 pp. 232-236. 75. Sobolev D, Roden EE (2001), “Suboxic deposition of ferric iron by bacteria in opposing gradients of Fe(II) and oxygen at circumneutral pH”, Appl Environ Microbiol, 67 (3), pp. 1328-1334. 76. Straub KL, Benz M, Schink B, Widdel F (1996), “Anaerobic, nitrate-dependent microbial oxidation of ferrous iron”, Appl Environ Microbiol, 62 (4), pp. 1458-1460. 77. Straub KL, Buchholz-Cleven BEE (1998), “Enumeration and detection of anaerobic ferrous iron-oxidizing, nitrate-reducing bacteria from diverse European sediments”, Appl Environ Microbiol, 64 (12), pp. 4846-4856. 78. Straub KL, Rainey FA, Widdel F (1999), “Rhodovulum iodosum sp. nov. and Rhodovulum robiginosum sp. nov., two new marine phototrophic ferrous-iron-oxidizing purple bacteria”, Int J Syst Bacteriol (IJSB), 49 pp. 729-735. 79. Straub KL, Benz M, Schink B (2001), “Iron metabolism in anoxic environments at near neutral pH”, FEMS Microbiol Ecol, 34 pp. 181-186. 80. Straub KL, Schber W, Buchholz-Cleven B, Schink B (2004), “Diversity of ferrous iron-oxidizing, nitrate-reducing bacteria and their involvement in oxygen-independent iron cycling”, Geomicrobiol J, 21 (6), pp. 371-378. 81. Temple KL, Colmer AR (1951), “The autotrophic oxidation of iron by a new bacterium: Thiobacillus ferrooxidans”, J Bacteriol, 62 (5), 605-611. 82. Thauer RK, Jungermann K, Decker K (1977), “Energy conservation in chemotrophic anaerobic bacteria”, Bacteriol Rev, 41 (1), pp. 100-180. 83. Treude N, Rosencrantz D, Liesack W, Schnell S (2003), “Strain FAc12, a dissimilatory iron-reducing member of the Anaeromyxobacter subgroup of Myxococcales”, FEMS Microbiol Ecol, 44 pp. 261-269. 84. Tricker AR, Preussmann R (1991), “Carcinogenic N-nitrosamines in the diet: occurrence, formation, mechanisms and carcinogenic potential”, Mutat Res, 259 (3 - 4), pp. 277-289. 85. USDA (United States Department of Agriculture) (2008), Laboratory Guidebook: Most probable number procedure and tables. 86. Vandenebeele J, De Beer J, Germonpre R, Van De Sande R, Verstraete W (1995), “Influence of nitrate on manganese removing microbial consortia from sand filters”, Wat Res Vol, 29 (2), pp. 579-587. 87. Ward DM, Weller R, Bateson MM (1990), “16S rRNA sequences reveal numerous uncultuted microorganisms in a natural community”, Nature, 345 pp. 63-65. 88. Weber KA, Picardal FW, Roden EE (2001), “Microbially catalyzed nitrate-dependent oxidation of biogenic solid-phase Fe(II) compounds”, Environ Sci Technol, 35 (8), pp. 1644-1650. 89. Weber KA, Achenbach LA, Coates JD (2006 a) “Microorganisms pumping iron: anaerobic microbial iron oxidation and reduction”, Nature, 4 pp. 752-764. 90. Weber KA, Pollock J, Cole KA, O’Connor SM, Achenbach LA, Coates JD (2006 b), “Anaerobic nitrate-dependent iron(II) bio-oxidation by a novel Lithoautotrophic Betaproteobacterium, Strain 2002”, Appl Environ Microbiol, 72 (1), pp. 686-694. 91. Weber KA, Urrutia MM, Churchill PF, Kukkadapu RK, Roden EE (2006 c), “Anaerobic redox cycling of iron by freshwater sediment microorganisms”, Environ Microbiol, 8 (1), pp. 100-113. 92. Widdel F, Bak F (1992), “Gram-negative mesophilic sulfate-reducing bacteria”, In The Prokaryotes, 2nd ed. Springer, Berlin Heidelberg New York, pp. 3352-3378. 93. Widdel F, Schnell S, Heising S, Ehrenreich A, Assmus B, Schink B (1993), “Ferrous iron oxidation by anoxygenic photophic bacteria”, Nature, 362 pp. 834-836. 94. Woese CR, Kandler O, Wheelis ML (1990), “Towards a natural system of organisms: Proposal for the domains Archaea, Bacteria, and Eucarya”, Proc Natl Acad Sci USA, 87 pp. 4576-4579. 95. Yamanaka T, Fukumori Y (1995), “Molecular aspects of the electron transfer system which participates in the oxidation of ferrous ion by Thiobacillus ferrooxidans”, FEMS Microbiol Rev, 17 (4), pp. 401-413. 96. Yarzábal A, Brasseur G, Ratouchniak F, Lund K, Lemesle-Meunier D, DeMoss JA, Bonnefoy V (2002 a), “The high-molecular-weight cytochrome c Cyc2 of Acidithiobacillus ferrooxidans is an outer membrane protein”, J Bacteriol, 184 (1), pp. 313-317. 97. Yarzábal A, Brasseur G, Bonnefoy V (2002 b), “Cytochromes c of Acidithiobacillus ferrooxidans”, FEMS Microbiol Let, 209 pp. 189-195. 98. Yarzábal A, Appia-Ayme C, Ratouchniak F, Bonnefoy V (2004), “Regulation of the expression of Acidithiobacillus ferrooxidans rus operon encoding two cytochromes c, a cytochrome oxidase and rusticyanin”, Microbiology, 150 pp. 2113-2123. 99. Zhou J, Bruns MA, Tiedje JM (1996), “DNA recovery from soils of diverse composition”, Appl Environ Microbiol, 62 pp. 316-322. Phụ lục Các trình tự gen IN2 16S rDNA (1429 bp), Anaeromyxobacter sp. tacacatgcagtcgagcgagaaagcccgcaagggtgagtaaagcggcgcacgggtgcgtaacacgtgggtaatctgccctagagtccggaataactcgccgaaaggcgtgctaatgccggatgagaccacgggagcctcggctcctgcgggaaaaggtggcctctgtacacaagctatcgctctaggatgagcccgcggcccatcagctcgttggcggggtaatggcccaccaaggcaacgacgggtagctggtctgagaggacgatcagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatcttgcgcaatgggcgaaagcctgacgcagcaacgccgcgtgtgtgatgaaggtcttcggatcgtaaagcactgtcgcgagggacgaataagggacgggcgaacagtccgtttcgatgacggtacctcgagaggaagcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagagggtgcaagcgttgttcggaattattgggcgtaaagcgcgtgtaggcggcctagcaagtcggatgtgaaagccctcggcttaaccgaggaagtgcgttcgaaactactgggcttgagtaccggagagggtggcggaattcccggtgtagaggtgaaattcgtagatatcgggaggaacaccagtggcgaaggcggccacctggacggatactgacgctgagacgcgaaagcgtgggtagcaaacaggattagataccctggtagtccacgctgtaaacgatgagcgctaggtgttgcgggtgttgacccctgcagtgccgcagctaacgcattaagcgctccgcctgggaagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgacgcaacgcgcagaaccttacctggtcttgacatcctcggaatccctcagagatgagggggtgcccgcaagggaaccgagagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccctgccgttagttgccatcattcagttgggcactctaacgggactgccggcgtcaagccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcctcatggcctttatgaccagggctacacacgtgctacaatggccggtacagagggtcgccaagtcgcgagacggagctaatcccagaaaaccggtctcagttcggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacac