Luận văn Ứng dụng phương pháp pcr (polymerase chain reaction) và phương pháp nuôi cấy để khảo sát sự nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm đường phố

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH PHẠM THỊ HỮU KIỀU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) VÀ PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY ĐỂ KHẢO SÁT SỰ NHIỄM VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM ĐƯỜNG PHỐ Chuyên ngành : Vi sinh vật học Mã số : 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. TRẦN LINH THƯỚC Thành Phố Hồ Chí Minh - 2007 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và chân thành, em xin cảm ơn: Quý Thầy, Cô Khoa Sinh Trường Đại Học Sư Phạm TP. HCM đã cung cấp cho em những kiến thức quý báu trong cả khóa học, dặc biệt là TS. Trần Thanh Thủy và TS. Trần Thị Thanh đã tận tình giúp đỡ, chỉ dẫn, động viên em trong suốt quá trình học tập. Em xin chân thành cảm ơn Thầy PGS.TS. Trần Linh Thước đã luôn tận tâm hướng dẫn và tạo mọi điều kiện để em hoàn thành tốt luận văn này. Xin cảm ơn các bạn Nhân, Linh, Vân, Dung, Na, Ánh và tất cả các thành viên của Lab A, đặc biệt là Ths. Nguyễn Thị Bạch Huệ, đang công tác tại Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh học Phân tử, Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh họcTrường ĐHKHTN, ĐHQG TP. HCM, đã hết lòng giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực nghiệm. Xin cảm ơn các bạn lớp cao học K.15 - VSV và các thành viên Cao học khóa 15 đã cùng gắn bó với tôi. Cảm ơn Anh! Người đã luôn sát cánh và ở cạnh tôi. Lời cảm ơn cuối cùng, con xin gởi đến tất cả “Ba Mẹ” và đại gia đình thân yêu của con đã luôn yêu thương, đùm bọc con, là điểm tựa vững chắc và niềm tin của con trong suốt cuộc đời. TP. HCM, nam 2007 Phạm Thị Hữu Kiều DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AC : Relative Accuracy (Độ chính xác tương đối) AOAC : Association of Official Analytical Chemists ATP : Adenosine triphosphat bp : base pair (cặp base) BPW : Buffer Pepton Water (đệm pepton) cAMP : cyclic Adenosine Monophosphate cGMP : cyclic Guanosine Monophosphate DNA : Deoxyribose nucleic acid dNTP : deoxynucleotide triphosphate EDTA : Ethylene Diamine Tetra Acetic acid ELISA : Enzyme - Linked Immuno Sorbent Assay (Phương pháp hấp thụ miễn dịch gắn enzyme) FN : False Negative (âm tính giả) NC : nuôi cấy FP : False Positive (dương tính giả) HUS : Haemolytic-Uraemic Syndrome (hội chứng tan huyết) LDC : Lysine Decarboxylase MMC : Microbiological Methods Committee MR : Methyl Red MYP : Mannitol - Egg York - Polymycin NordVal : Nordic System for Validation of Alternative PCR : Polymerase Chain Reaction SE : Relative Sensitivity (Độ nhạy tương đối) SP : Relative Specificity (Độ đặc hiệu tương đối) TAE : Tris-Acetate-EDTA TE : Tris-Acetate-EDTA TSB : Tryptone Soya Broth TSI : Triple Sugar Iron Agar VP : Voges - Proskauer WHO : World Health Organization XLD : Xylose Lysine Desoxycholate ISO : International Standards Organization EDTA : Ethylene Diamine Tetraacetic Acid DANH MUÏC CAÙC BAÛNG Bảng 1.1. Triệu chứng của ngộ độc thực phẩm do một số vi khuẩn ...........8 Bảng 1.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam năm 2005 và năm 2006 ........................................................................................................9 Bảng 1.3. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam năm 2005 và năm 2006 .....................................................................................10 Bảng 1.4. Thống kê tình hình ngộ độc thực phẩm tại TP. HCM từ năm 2001 đến 2006.......................................................................11 Bảng 1.5. Tiêu chuẩn của Bộ Y tế đối với các loại nước giải khát ..............14 Bảng 1.6. Tiêu chuẩn của Bộ Y tế đối với nhóm thực phẩm chế biến từ sữa ......................................................................................................14 Bảng 1.7. Tiêu chuẩn của Bộ Y tế đối với nhóm sữa chua..........................15 Bảng 1.8. Tiêu của Bộ Y tế đối với nhóm kem, nước đá.............................15 Bảng 1.9. Bảng phân loại độc tố của C. perfringens ....................................22 Bảng 2.1. Chỉ tiêu phân tích vi sinh của Bộ Y tế đối với nhóm sữa.............44 Bảng 2.2. Chỉ tiêu phân tích vi sinh của Bộ Y tế đối với các loại nước giải khát ..............................................................................44 Bảng 2.3. Chỉ tiêu phân tích vi sinh của Bộ Y tế đối với nhóm kem ...........44 Bảng 2.4. Kích thước vạch khuếch đại của các vi khuẩn nghiên cứu ..........49 Bảng 2.5. Trình tự các mồi được sử dụng trong phản ứng PCR...................50 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát tình hình nhiễm vi sinh vật trên nhóm sữa tại TP. HCM theo phương pháp PCR và nuôi cấy ..................................63 Bảng 3.2. Thống kê kết quả kiểm tra trên mẫu sữa tại TP. HCM bằng phương pháp PCR và nuôi cấy ................................................................66 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát tình hình nhiễm vi sinh vật trên nước giải khát tại TP. HCM theo phương pháp PCR và nuôi cấy ...........................68 Bảng 3.4. Thống kê kết quả kiểm tra trên nhóm nước giải khát tại TP. HCM theo phương pháp PCR và nuôi cấy ...........................70 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát tình hình nhiễm vi sinh vật trên nhóm kem tại TP. HCM theo phương pháp PCR và nuôi cấy .....................72 Bảng 3.6. Thống kê kết quả kiểm tra trên nhóm kem tại TP. HCM theo phương pháp PCR và nuôi cấy ............................................73 Bảng 3.7. Tính tương đồng của phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy đối với chỉ tiêu Salmonella, E. coli và S. aureus ...........77 Bảng 3.8. Tính tương đồng của phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy đối với chỉ tiêu B. cereus và C. perfringens77 DANH MUÏC CAÙC HÌNH Trang Hình 2.1. Thang DNA 100bp ...........................................................37 Hình 2.2. Các bước của phản ứng PCR ..................................................... 38 Hình 2.3. Số bản sao DNA tăng theo từng chu kỳ trong phản ứng PCR .. .39 Hình 2.4. Đưa mẫu vào máy PCR ............................................................. 48 Hình 3.1. Thử nghiệm sinh hóa khẳng định Salmonella ............................ 58 Hình 3.2. Thử nghiệm sinh hóa khẳng định E. coli.................................... 58 Hình 3.3. Thử nghiệm sinh hóa khẳng định S. aureus ............................... 59 Hình 3.4. Thử nghiệm sinh hóa khẳng định B. cereus ............................... 59 Hình 3.5. Thử nghiệm sinh hóa khẳng định C. perfringens ....................... 59 Hình 3.6. Kết quả phát hiện E. coli, Salmonella, B. cereus, S. aureus và C. perfringens bằng kỹ thuật PCR......................................... 59 Hình 3.7. Khuẩn lạc B. cereus ................................................................... 60 Hình 3.8. Thử nghiệm sinh hóa khẳng định B. cereus ............................... 60 Hình 3.9. Thử nghiệm sinh hóa khẳng định C. perfringens ...................... 60 Hình 3.10. Khuẩn lạc C. perfringens ........................................................... 61 Hình 3.11. Kết quả phát hiện E. coli, Salmonella, B. cereus, S. aureus và C. perfringens bằng kỹ thuật PCR .................................................. 62 DANH MUÏC CAÙC BIEÅU ÑOÀ Trang Biểu đồ 3.1. Tình hình nhiễm vi sinh vật trong mẫu sữa trên địa bàn TP. HCM ..................................................................................63 Biểu đồ 3.2. Tình hình nhiễm vi sinh vật trên nước giải khát tại địa bàn TP. HCM .................................................................................66 Biểu đồ 3.3. Tình hình nhiễm vi sinh vật trên nhóm kem tại địa bàn TP. HCM ...................................................................................................68 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Theo báo cáo của tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2001), hàng năm có tới 30% dân số ở các nước phát triển bị bệnh do thực phẩm, chủ yếu là ngộ độc thực phẩm (NĐTP), ở các nước đang phát triển các trường hợp ngộ độc thực phẩm lại cao hơn nhiều [25]. Ngộ độc thực phẩm trong những năm gần đây được ghi nhận khá thường xuyên và đã trở thành mối quan tâm của toàn xã hội. Ở các nước phát triển, tình hình ngộ độc thực phẩm luôn là vấn đề được quan tâm vì những tổn thất lớn về kinh tế và con người do ngộ độc thực phẩm gây ra. Tại Mỹ, theo thống kê của trung tâm Kiểm soát và Phòng chống bệnh (CDC), hàng năm có khoảng 76 triệu ca ngộ độc thực phẩm và 5.000 trường hợp tử vong. Thiệt hại do các trường hợp ngộ độc thực phẩm ước tính khoảng từ 5 đến 17 tỉ USD [34]. Cũng như nhiều quốc gia khác, tại Việt Nam vấn đề ngộ độc thực phẩm ngày càng gia tăng, đặc biệt trong hai năm gần đây hiện tượng này càng phổ biến hơn. Mỗi năm, nước ta có 250 - 500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000 - 10.000 nạn nhân và 100 - 200 ca tử vong. Nhà nước cũng phải chi trên 3 tỉ đồng cho việc điều trị, xét nghiệm và truy tìm nguyên nhân [50]. Theo thống kê chưa đầy đủ của cục Vệ sinh an toàn thực phẩm từ năm 2000 đến năm 2006, cả nước đã xảy ra 988 vụ ngộ độc thực phẩm với 23.190 người bị ngộ độc và 263 người chết [44]. Trong đó, có 155 vụ ngộ độc tại bếp ăn tập thể với 14.653 người bị ngộ độc bao gồm: 97 vụ NĐTP tại các khu công nghiệp, khu chế xuất với 9.989 người bị ngộ độc; 58 vụ NĐTP trong các trường học với 3.790 cháu bị ngộ độc và 2 cháu tử vong. Riêng tại TP. HCM có 113 vụ NĐTP với 7.688 người bị ngộ độc và 7 người tử vong. Tại Hà Nội xảy ra 37 vụ NĐTP với 370 người ngộ độc và 2 người tử vong [49]. Trong tổng số 988 vụ ngộ độc thực phẩm của cả nước (từ năm 2000 đến năm 2006), có 161 vụ NĐTP do thức ăn đường phố (thực phẩm chế biến sẵn bán trên vỉa hè trước các chợ, công viên, trường học) với 3.759 người bị ngộ độc và 7 người tử vong. Thực trạng vấn đề ngộ độc do thức ăn đường phố hiện nay ở nước ta ngày càng gia tăng, hiện tượng vi phạm quy định về vệ sinh an toàn thực phẩm đối với nhóm thực phẩm đường phố phổ biến. Trong khi đó, tình hình kiểm tra, giám sát của cơ quan chức năng đối với nhóm thực phẩm này gặp nhiều khó khăn và chưa đạt hiệu quả [48]. Có nhiều nguyên nhân khác nhau có thể gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm như nhiễm vi sinh, nhiễm các hóa chất độc hại hoặc dư lượng thuốc trừ sâu và thuốc bảo vệ thực vật trong thực phẩm quá mức cho phép, nhưng phần lớn các trường hợp có nguồn từ vi sinh vật, do sự hiện diện của vi sinh vật gây bệnh hay sự hiện diện của độc tố tiết ra bởi các vi sinh vật gây bệnh [46]. Ngày nay, yêu cầu an toàn vệ sinh thực phẩm nhất là về phương diện vi sinh trở thành một trong những tiêu chuẩn không thể thiếu đối với chất lượng thực phẩm. Việc phân tích, phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm và thực hiện các biện pháp đảm bảo đạt tiêu chuẩn về an toàn vi sinh trong sản xuất chế biến thực phẩm, đặc biệt là nhóm thực phẩm đường phố ngày càng được quan tâm [43]. Chính vì những lí do trên, chúng tôi chọn đề tài “Ứng dụng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) và phương pháp nuôi cấy để khảo sát sự nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm đường phố” 2. Sơ lược vấn đề nghiên cứu Tại Việt Nam, việc phát hiện các vi sinh vật gây bệnh chủ yếu dựa vào phương pháp nuôi cấy truyền thống, tốn nhiều thời gian, thao tác phức tạp và độ nhạy chưa cao. Trong khi đó, nhiều phương pháp mới như: phương pháp ELISA, phương pháp PCR, phương pháp sử dụng mẫu dò, phương pháp phát hiện vi sinh vật dựa trên kỹ thuật phát quang sinh học,… có nhiều ưu điểm về thời gian, độ nhạy và độ chính xác cao đang được phát triển rộng rãi trên thế giới và đang dần thay thế cho phương pháp truyền thống. Cũng như các nước, nhu cầu thực tế tại Việt Nam hiện nay là cần ứng dụng những kỹ thuật mới này vào việc kiểm tra, giám sát tình hình nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm để nhanh chóng phát hiện các nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm và ngăn ngừa một cách có hiệu quả các tác hại từ ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật gây ra. Với nhu cầu thực tiễn như trên, Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học phân tử Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG TP. HCM đã tiến hành xây dựng các quy trình và bộ kit PCR phát hiện nhanh các vi sinh vật gây ngộ độc trên thực phẩm như: Escherichia coli, Salmonella, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus và Clostridium perfringens. Để được công nhận như một phương pháp chuẩn và được phép lưu hành rộng rãi tại các phòng thí nghiệm phân tích vi sinh trong cả nước, các quy trình này đã được tiến hành đánh giá hiệu lực bằng việc phân tích và so sánh kết quả thu nhận được giữa phương pháp nuôi cấy và phương pháp PCR tại các phòng thí nghiệm trọng điểm phía Nam. Đồng thời, để có thể sử dụng vào thực tế, các quy trình này đã được ứng dụng để khảo sát tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm trên các mẫu thực tế và so sánh với kết quả theo phương pháp nuôi cấy truyền thống. Tuy nhiên, trong thực phẩm đường phố chưa được nghiên cứu và khảo sát để đưa ra kết luận cụ thể về mức độ nhiễm vi sinh ở nhóm thực phẩm này. Vì thế, đề tài luận văn này phần nào đáp ứng được nhu cầu thực tế về kiểm tra vệ sinh an toàn thực phẩm đường phố hiện nay ở nước ta. 3. Mục đích nghiên cứu Mục đích nghiên cứu của đề tài luận văn này là ứng dụng các quy trình và bộ kit PCR nói trên để phát hiện E. coli, S. aureus, Salmonella, B. cereus và C. perfringens trong thực phẩm đường phố tại TP. HCM, đồng thời so sánh với kết quả theo phương pháp nuôi cấy. Từ đó, khảo sát được tình hình nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm đường phố trên địa bàn TP. HCM so với chỉ tiêu cho phép của nhà nước. Nội dung của luận văn này là một phần thuộc đề tài khoa học và công nghệ trọng điểm cấp Nhà nước của Bộ Khoa học và Công nghệ “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào việc kiểm tra, giám sát an toàn vệ sinh thực phẩm” mã số KC. 04. 30 do Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG, TP. HCM chủ trì và PGS. TS. Trần Linh Thước chủ nhiệm đề tài. 4. Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu sự hiện diện của E. coli, Salmonella, S. aureus, B. cereus và C. perfringens trong nhóm thực phẩm đường phố (thực phẩm được chế biến sẵn bán trên vỉa hè trước các chợ, trường học, công viên,…), bao gồm: nhóm sữa như sữa tươi, sữa đậu nành, sữa đậu xanh và sữa chua; nước sâm, nước mía và nước rau má thuộc nhóm nước giải khát và các loại kem: kem tươi, kem ký, kem ly, kem cây, kem chiên và kem marino. 5. Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu trên thực phẩm đường phố thuộc nhóm sữa, nước giải khát và kem tại các Quận: 3, 5, 8, 10 và quận Tân Bình thuộc địa bàn TP. HCM. 6. Nhiệm vụ nghiên cứu - Phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong các mẫu thực phẩm đường phố bằng phương pháp PCR và phương pháp nuôi cấy truyền thống. - Đánh giá tình hình nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong nhóm thực phẩm đường phố trên so với chỉ tiêu cho phép của Bộ Y tế. - So sánh, đánh giá kết quả phân tích của phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy truyền thống. - Rút ra kết luận của đề tài - Đề nghị và hướng phát triển của đề tài 7. Phương pháp nghiên cứu - Các phương pháp phân tích chỉ tiêu vi sinh: phương pháp PCR, phương pháp nuôi cấy, phân lập, các phương pháp thử nghiệm hóa sinh - Xử lí kết quả bằng phương pháp thống kê toán học đơn giản 8. Dự kiến cấu trúc luận văn Luận văn gồm các phần: Mở đầu Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả và biện luận Kết luận và đề nghị Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Thực trạng vấn đề ngộ độc thực 1.1.1. Khái niệm ngộ độc thực phẩm Ngộ độc thực phẩm là khái niệm chung để chỉ các triệu chứng gây ra do sử dụng thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật gây bệnh, các chất độc từ môi trường hoặc chất độc tự nhiên có trong bản thân thực phẩm [27]. Theo Bộ Y tế, ngộ độc thực phẩm là hội chứng cấp tính xảy ra do ăn, uống phải thức ăn có chứa chất độc, biểu hiện bằng những triệu chứng dạ dày - ruột, thần kinh hoặc những triệu chứng khác tuỳ theo tác nhân gây ngộ độc [73]. 1.1.2. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi hai nguyên nhân chính 1.1.2.1. Ngộ độc do hóa chất Là những trường hợp ăn phải thức ăn có chứa hóa chất độc như: chất phụ gia, kim loại nặng hoặc dư lượng thuốc trừ sâu, phân bón hóa học còn sót lại trên thực phẩm [45]. Ước tính có khoảng 11 - 27% vụ ngộ độc thực phẩm (so với tổng số các vụ NĐTP) có nguyên nhân là do thực phẩm bị nhiễm các loại hóa chất chẳng hạn: CN, As, Hg, Pb, hóa chất bảo quản thực phẩm, hóa chất bảo vệ thực vật [50]. 1.1.2.2. Ngộ độc do vi sinh vật Là ngộ độc do ăn phải thức ăn có chứa vi sinh vật gây bệnh hoặc độc tố của chúng [45], bao gồm các trường hợp sau: - Ngộ độc thực phẩm do thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật (chiếm 33 - 49% so với tổng số các vụ NĐTP), chủ yếu do các chủng Salmonella, E. coli, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes [50]. Ngộ độc do ăn phải thức ăn có chứa vi sinh vật thường xảy ra khoảng 16 - 30 giờ sau khi ăn thức ăn nhiễm khuẩn. Các vi khuẩn được nhân lên trong cơ thể và gây bệnh thông qua quá trình xâm nhiễm hoặc do nội độc tố được tạo ra trong tế bào vi khuẩn và được phóng thích ra ngoài môi trường khi tế bào vi sinh vật bị phân hủy. - NĐTP do thực phẩm bị nhiễm độc tố của vi khuẩn (chiếm 20 - 30% tổng số các vụ NĐTP) là nguyên nhân của các vụ ngộ độc thực phẩm tập thể. Trong số này, vi khuẩn Staphylococcus aureus hiện diện trong các món ăn làm bằng tay (bánh ngọt), Clostridium perfringens hay phát sinh trong các món được nấu nướng và hâm nóng [20]. Ngộ độc do ăn phải thức ăn chứa độc tố là do một số vi khuẩn có khả năng tạo độc tố và tiết ra ngoài môi trường gọi là ngoại độc tố. Ngoại độc tố rất độc và gây ra những rối loạn điển hình, ngộ độc thực phẩm do độc tố thường xảy ra sau 1 - 6 giờ tùy thuộc vào lượng độc tố có trong cơ thể. Các vi sinh vật sinh độc tố điển hình là: C. botulinum, C. perfringens và S. aureus [50]. Ngoài ra, các vụ ngộ độc còn do thực phẩm vốn hàm chứa các chất độc tự nhiên (6 - 17,5% so với tổng số các vụ NĐTP) [45]. 1.1.3. Triệu chứng của ngộ độc thực phẩm Ngộ độc thực phẩm thường xảy ra ở nhiều người, có những triệu chứng giống nhau sau khi tiêu thụ thực phẩm. Tuy nhiên, mức độ tác động sẽ khác nhau tùy thuộc vào khả năng đáp ứng với độc tố và thể trạng của từng người. Các triệu chứng thường gặp của ngộ độc thực phẩm là: tiêu chảy, chóng mặt, nôn mửa, đau nhức người, sốt và đau đầu. Những triệu chứng này có thể thay đổi tùy thuộc vào tác nhân gây ngộ độc là tế bào hay độc tố của vi khuẩn [28]. Triệu chứng ngộ độc thực phẩm do một số vi khuẩn cũng như các loại thực phẩm thường chứa các vi khuẩn này được trình bày tóm tắt ở Bảng 1.1. Bảng 1.1. Triệu chứng của ngộ độc thực phẩm do một số vi khuẩn Tác nhân Nguồn gây bệnh Triệu chứng Salmonella Trứng, thịt gia cầm nấu chưa chín Sốt,tiêu chảy, đau bụng, nôn V. cholerae (phẩy khuẩn tả) Dùng nước ô nhiễm làm kem, đá, tưới rửa rau quả, ăn sống cá, nhuyễn thể Tiêu chảy, nôn, đau bụng Clostridium perfringens Thực phẩm đóng hộp bị ô nhiễm trong quá trình chế biến: cá, thịt, các loại rau Giảm trương lực cơ (mắt mờ, khó thở) Escherichia Coli Thịt, cá, rau, sữa tươi, nước bị ô nhiễm phân người Tiêu chảy (lỵ) phân có máu Staphylococcus aureus (tụ cầu) Sản phẩm từ sữa, thịt gia cầm nấu chưa chín. Nhiễm trùng từ mũi, tay và da lây Buồn nôn, tiêu chảy, đau bụng, sang thức ăn chín mất nước nặng Shigella (lỵ) Sữa và thực phẩm bị ẩm ướt, nhiễm phân Tiêu chảy, phân có máu, sốt Bacillus cereus Ngũ cốc, rau, sữa, thịt quay hoặc rán Đau bụng, tiêu chảy, buồn nôn Nguồn [69] 1.1.4. Thực trạng vấn đề ngộ độc thực phẩm 1.1.4.1. Thực trạng vấn đề ngộ độc thực phẩm trên thế giới Các cuộc khảo sát gần đây cho thấy, các bệnh do ngộ độc thực phẩm xảy ra có thể nhiều hơn 300 đến 350 lần số trường hợp được báo cáo. Ước tính hàng năm có khoảng 1,5 tỉ lượt trẻ em dưới 5 tuổi mắc bệnh tiêu chảy do thực phẩm và hơn 3 triệu trẻ em chết vì bệnh này, hầu hết các trường hợp trên là ở các nước đang phát triển [33]. Theo thống kê của FOODHACCP, năm 2005, trên thế giới có 940 vụ ngộ độc thực phẩm lớn, trong đó có 381 vụ ngộ độc do vi sinh vật, đứng đầu vẫn là do: E. coli, S. aureus, Salmonella và L. monocytogenes [35]. Vi khuẩn Salmonella là nguyên nhân của 70% vụ ngộ độc, vi khuẩn này có trong nhiều loại thực phẩm (đồ nguội, thịt nguội, nghêu, sò, gà, chế phẩm từ sữa sống, nhất là các món ăn chế biến từ trứng tươi hoặc còn hơi tươi sống) [45]. Chỉ riêng những tháng đầu năm 2006, đã có hai trận dịch lớn xảy ra tại Angola và Nam Sudan làm 49.627 người mắc bệnh và 1.814 người tử vong. Nguyên nhân được xác định là do nguồn nước nhiễm V. cholerae [26]. Tại Thái Lan, ngày 17/03/2006 cũng đã xảy ra một vụ ngộ độc thực phẩm làm 152 người bị ngộ độc với các triệu chứng: khó nuốt, khó cử động, đau bụng và nhũn cơ. Trong số 100 người nhập viện, có 40 người nhập viện với tình trạng khó thở, suy hô hấp nặng. Nguyên nhân được xác định là do Clostridium botulinum trong măng tây đóng hộp [32]. 1.1.4.2. Thực trạng vấn đề ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam a. Tình hình ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam Thống kê từ trung tâm chống độc Bệnh viện Bạch Mai, tại khu vực phía Bắc, số người bị ngộ độc thực phẩm năm 2005 là gần 4.000 người, trong đó có 50 trường hợp tử vong. So với năm 2004, tỉ lệ tử vong ở các trường hợp bị ngộ độc thực phẩm tăng gần 90% [52]. Theo thống kê của cục An toàn vệ sinh thực phẩm, tình hình ngộ độc thực phẩm trong hai năm 2005 và 2006 như sau: Bảng 1.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam năm 2005 và 2006 Thống kê 2005 2006 Số vụ ngộ độc 127 139 Số người bị ngộ độc 3.410 5.564 Số người tử vong 21 49 Nguồn: [30] Năm 2005 được xem là đỉnh điểm của những vụ ngộ độc thực phẩm so với những năm trước đó, nhưng qua bảng thống kê trên cho thấy năm 2006 tình trạng NĐTP còn cao hơn cả về số vụ, số người mắc và tử vong. Trong “Tháng hành động vì vệ sinh an toàn thực phẩm” năm 2007 (từ ngày 15/04 - 15/05/2007), cả nước đã xảy ra 19 vụ ngộ độc thực phẩm, với 534 người mắc, 8 người tử vong, số vụ ngộ độc thực phẩm quy mô trên 50 người là 3 vụ với tổng số 269 người mắc; trong “Tháng hành động vì vệ sinh an toàn thực phẩm”, năm 2006 (từ ngày 15/04 - 15/05/2006) xảy ra 17 vụ NĐTP, có 278 người mắc, 4 người tử vong [53]. So với năm 2006, tình hình ngộ độc thực phẩm xảy ra trong “Tháng hành động vì vệ sinh an toàn thực phẩm” năm 2007 tăng cao hơn nhiều cả về số vụ lẫn số người bị ngộ độc, đáng chú ý là số người tử vong tăng gấp đôi so với cùng kỳ năm 2006 (năm 2006 có 4 người tử vong, năm 2007 là 8 người) [52]. Trong các nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm năm 2005 và 2006, nguyên nhân do nhiễm vi sinh vật chiếm tỉ lệ cao nhất (năm 2005 là 50,4%, năm 2006 là 31,8%); sau đó là do thực phẩm chứa chất độc tự nhiên (28,3% năm 2005, năm 2006 là 23,7%) còn lại là do hóa chất và không xác định được rõ nguyên nhân [48]. Nguyên nhân gây NĐTP trong năm 2005 và 2006 được thống kê ở Bảng 1.3. Bảng 1.3. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam năm 2005 và 2006 Nguyên nhân 2005 2006 Do vi sinh vật 64 vụ (50,4%) 53 vụ (38,1%) Thực phẩm độc 36 vụ (28,3%) 33 vụ (23,7%) Do hóa chất 10 vụ (7,9%) 16 vụ (11,5%) Không xác định 17 vụ (13,4%) 37 vụ (26,7%) Nguồn: [48] b. Tình hình ngộ độc thực phẩm trên địa bàn TP. HCM Trong nhiều năm qua, TP. HCM được xem là một trong những địa phương có số vụ NĐTP cao nhất cả nước, vì đây là nơi tập trung đông dân cư, số dân nhập cư, hộ nghèo còn nhiều, do vậy mà việc quản lý vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm gặp nhiều khó khăn và chưa thật hiệu quả. Ở TP. HCM, theo trung tâm y tế dự phòng ghi nhận, tình hình ngộ độc thực phẩm từ năm 2001 đến 2006 được thống kê như sau: Bảng 1.4. Thống kê tình hình ngộ độc thực phẩm tại TP. HCM từ năm 2001 đến 2006 Thống kê Tình hình ngộ độc thực phẩm tại TP. HCM Năm thống kê 2001 2002 2003 2004 2005 2006 Số vụ ngộ độc thực phẩm 9 29 22 26 27 39 Số người ngộ độc 796 930 1158 964 1536 1564 Ngộ độc do vi sinh (%) 83,9 75,7 67,7 64,1 39,1 38,1 Số người tử vong 0 2 0 0 3 5 Nguồn: [47] Trong vài năm gần đây, số vụ ngộ độc thực phẩm tại TP. HCM từ năm 2001 đến 2006 được ghi nhận ngày càng gia tăng cả về số vụ lẫn số người mắc. Cao điểm là năm 2006 tại TP. HCM có 39 vụ ngộ độc với 1.564 người bị ngộ độc, chiếm một tỉ lệ cao về NĐTP của cả nước (chiếm 35,64% so với cả nước), so với năm 2001, năm 2006 số vụ NĐTP tăng hơn 4 lần, số người ngộ độc tăng gấp đôi, đặc biệt số người tử vong tăng 5 lần, nguyên nhân ngộ độc do vi sinh vật vẫn chiếm một tỉ lệ đáng kể (năm 2001 là 83,9%, năm 2006 là 38,1%) [58]. Nguyên nhân của sự gia tăng số vụ NĐTP này là do tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm nói chung không được bảo đảm chẳng hạn: tình hình kinh doanh những mặt hàng nguyên liệu thực phẩm kém chất lượng, không đảm bảo vệ sinh hoặc sử dụng những phụ gia độc hại; tình trạng chế biến bảo quản thực phẩm không an toàn; cơ sở vật chất, dụng cụ không đạt yêu cầu; vệ sinh cá nhân và ý thức nhân viên chế biến chưa tốt [52]. 1.1.4.3. Tình hình ngộ độc do thức ăn đường phố Đến nay, các cơ quan chức năng vẫn phải thừa nhận việc đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm đường phố đang là vấn đề cần được quan tâm [42]. Hiện tượng vi phạm quy định vệ sinh an toàn thực phẩm ở các dịch vụ thức ăn đường phố ngày càng cao, kết quả trong tháng 8 năm 2005 có 11 ca ngộ độc do thức ăn đường phố với hơn 600 người mắc, trong đó có 3 người tử vong [45]. Cuộc khảo sát của Bộ Y tế, năm 2005 kết luận: ở Hà Nội và Thành Phố Hồ Chí Minh có 88% số cơ sở thức ăn đường phố kém chất lượng. Theo đánh giá của đoàn thanh tra Bộ Y tế sau một tuần hành động thanh tra, kiểm tra thức ăn đường phố tại Thành Phố Hồ Chí Minh (từ ngày 23 - 27/08/05) đã kết luận: “nhiều cơ sở chế biến thực phẩm đường phố còn sử dụng phẩm màu trong chế biến thức ăn, nguồn nước sử dụng chưa đảm bảo vệ sinh, đáng chú trọng hơn là hàm lượng vi sinh cao hơn tiêu chuẩn cho phép trong thực phẩm theo quy định của Bộ Y tế (4/1998)” [55]. Đặc biệt là tình trạng thực phẩm đã chế biến sẵn bán tại các công viên, chợ, trường học rất phổ biến; trong khi đó, điều kiện vệ sinh cơ sở, vệ sinh dụng cụ chế biến và vệ sinh cá nhân người trực tiếp chế biến các loại thực phẩm này vẫn chưa bảo đảm, tình trạng sử dụng phụ gia thực phẩm ngoài danh mục cho phép vẫn còn [29]. Loạt bài: “Thực phẩm đường phố, 1.001 kiểu... mất vệ sinh” của Báo Thanh Niên [33] và cuộc hội thảo về vấn đề này tại TP. HCM vào cuối tuần tháng 8 năm 2006 [41], đã cho thấy thực trạng thức ăn đường phố ở nước ta vượt quá ngưỡng báo động, ngoài tầm kiểm soát của cơ quan chức năng. Hiện tượng thực phẩm đường phố không đảm bảo vệ sinh trong khi chế biến, nguồn nước còn nhiễm bẩn, việc vệ sinh các dụng cụ đựng thức ăn chưa đạt yêu cầu,…vẫn đang diễn ra ở hầu hết các cơ sở bán thức ăn đường phố trong cả nước [54]. Phần lớn ý kiến của các nhà chuyên môn, các nhà quản lý đều cho rằng hiện các văn bản pháp quy về vệ sinh an toàn thực phẩm đường phố còn thiếu, hình thức xử phạt chưa đủ mạnh để răn đe. Đặc biệt, để đáp ứng nhu cầu ăn uống ngày càng gia tăng nên số lượng cơ sở chế biến kinh doanh thực phẩm quy mô nhỏ, không đảm bảo vệ sinh ngày một nhiều, là nguyên nhân dẫn đến tình trạng ngộ độc thực phẩm đường phố, hơn nữa, việc quản lý những người bán thức ăn đường phố là rất khó, do số đông họ là những người nhập cư, là thành phần nghèo, khó khăn, điểm bán thường lưu động, khó xử lý, vì vậy mà việc giám sát vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm đường phố hiện đang gặp rất nhiều khó khăn và cần sự phối hợp đồng bộ của toàn xã hội để giám sát tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm đường phố hiện nay ở nước ta [48]. Chính vì những lí do trên mà hiện nay, việc khảo sát để đưa ra kết luận về tình hình nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm đường phố so với tiêu chuẩn cho phép của nhà nước là điều cần thiết và đang được quan tâm. 1.1.5. Các quy định hiện hành và tiêu chuẩn nhà nước về việc đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm 1.1.5.1. Tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm đối với các loại nước giải khát Tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm của Bộ Y tế đối với các loại nước giải khát hiện nay ở nước ta rất đa dạng.Trong phần này, chúng tôi chỉ chọn một số quy định về chỉ tiêu vi sinh đối với một vài nhóm nước giải khát thuộc phạm vi nghiên cứu của đề tài. Các tiêu chuẩn này được trình bày ở Bảng 1.5. Bảng 1.5. Tiêu chuẩn của Bộ Y tế đối với các loại nước giải khát Chỉ tiêu thử nghiệm Nước khoáng đóng chai Nước không có cồn Nước có cồn Tổng vi khuẩn hiếu khí/g GMP/250ml 102 5.104 Coliforms/g 0/250ml 10 102 E. coli/g KQĐ 0 0 S. aureus/g KQĐ 0 10 Clostridium perfringens/g 0/250ml 0 10 Salmonella/25g KQĐ KQĐ 0 Nấm men, mốc/g KQĐ 10 KQĐ Nguồn: [2] 1.1.5.2. Tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm đối với nhóm sữa Có rất nhiều loại sữa khác nhau hiện đang bán trên thị trường, tuy nhiên, chúng tôi chỉ đề cập đến chỉ tiêu vi sinh của Bộ Y tế đối với các sản phẩm được chế biến từ sữa và nhóm sữa chua. Các chỉ tiêu này được trình bày ở Bảng 1.6 và Bảng 1.7. Bảng 1.6. Tiêu chuẩn của Bộ Y tế đối với nhóm các sản phẩm chế biến từ sữa Chỉ tiêu thử nghiệm Bơ, phomát Sữa tươi tuyệt trùng Sữa hoàn nguyên tuyệt trùng Vi khuẩn hiếu khí/g 104 5.104 10 Coliforms/g 10 10 0 E. coli/g 0 3 0 S. aureus/g 0 KQĐ 0 Salmonella/25g 0 0 0 C. perfringens/g KQĐ KQĐ 0 Nguồn: [2] Bảng 1.7. Tiêu chuẩn của Bộ Y tế đối với nhóm sữa chua Chỉ tiêu thử nghiệm Sữa chua (Yoghurt) không xử lí nhiệt Sữa chua (Yoghurt) có xử lí nhiệt Vi khuẩn hiếu khí/g 104 10 Coliforms/g 10 0 E. coli/g 0 0 S. aureus/g 0 0 Salmonella/25g 0 0 Nấm men, mốc/g 10 10 Nguồn: [2] 1.1.5.3. Tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm đối với kem, nước đá Các chỉ tiêu vi sinh hiện diện ở nhóm kem, nước đá theo quy định của Bộ Y tế được trình bày ở Bảng 1.8. Bảng 1.8. Tiêu của Bộ Y tế đối với nhóm kem, nước đá Chỉ tiêu thử nghiệm Kem, nước đá Tổng vi khuẩn hiếu khí/g 5.104 Coliforms/g 102 E. coli/g 0 S. aureus/g 10 Clostridium perfringens/g 10 Salmonella/25g 0 Nguồn: [2] 1.2. Các vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm thường gặp 1.2.1. Escherichia coli E. coli là trực khuẩn Gram âm, ngắn, di động, tạo vỏ capsule polysac- charide. Loài E. coli gồm nhiều chủng khác nhau. Một số hoàn toàn là sinh vật hội sinh. Một số có thể kết hợp với yếu tố gây độc làm cho chúng có khả năng hoạt động như những vi khuẩn gây bệnh đặc hiệu ở đường ruột, ngoài đường tiêu hoá và đặc biệt là đường tiết niệu [31]. E. coli có thể gây viêm đường ruột cấp ở người, đặc biệt là ở trẻ sơ sinh với tỷ lệ tử vong cao. Một số chủng có thể gây bệnh kiết lỵ và xuất huyết kết tràng. Các chủng E. coli gây bệnh được chia thành 5 nhóm với cơ chế gây bệnh khác nhau như sau [18]: + Enterotoxigenic E. coli (ETEC): Gây bệnh bằng cách bám vào bề mặt niêm mạc màng nhầy của tế bào biểu mô ở ruột non và tạo các độc tố gắn kết với tế bào biểu mô và gây tiêu chảy [18]. Độc tố ETEC tạo ra bao gồm độc tố đường ruột không bền nhiệt (LT) và độc tố đường ruột bền nhiệt (ST). Bệnh tiêu chảy do ETEC gây ra không có triệu chứng viêm và không gây sốt [37]. + Enteropathogenic E. coli (EPEC): gây viêm ruột ở trẻ sơ sinh, đặc biệt là ở những nước nhiệt đới và có thể gây tỷ lệ tử vong cao. EPEC cũng gây tiêu chảy tương tự như ETEC nhưng cơ chế hoàn toàn khác. Hầu hết các chủng EPEC không tạo độc tố LT, ST hay VT (vero cytotoxin) nhưng một số chủng có khả năng tạo độc tố Shiga, một loại độc tố mạnh ảnh hưởng đến thần kinh. EPEC gây bệnh bằng cách tạo ra một protein bám dính ở ngoài màng – intimin – tham gia vào quá trình bám dính vào thành ruột và tác động vào việc truyền tín hiệu trong tế bào. Nhiều chủng có khả năng kết bám mạnh vào tế bào biểu mô ruột, thường là ruột kết, dẫn đến sự phá hủy lớp nhung mao gây tiêu chảy. Bệnh gây ra do EPEC thường đi kèm với phản ứng viêm và một số triệu chứng khác do sự xâm nhiễm của vi khuẩn này vào tế bào chủ. Đại diện của nhóm này là Enteroadherent E. coli, đây là một tác nhân thường xuyên gây tiêu chảy tại Mexico và Nam Mỹ [18]. + Enteroinvasive E. coli (EIEC): các chủng EIEC gây ra khoảng 5% các ca tiêu chảy ở những vùng có điều kiện vệ sinh kém. Các yếu tố gây độc ở EIEC giống với Shigella, được kiểm soát bởi các gen nằm trên plasmide và trên nhiễm sắc thể, mã hóa cho các protein màng ngoài cần thiết cho sự xâm nhiễm. Trong quá trình xâm nhiễm, EIEC xâm nhập qua lớp niêm mạc, gắn lên bề mặt tế bào và cảm ứng quá trình thực bào. Các gen trên plasmide giúp cho vi khuẩn thoát khỏi thực bào và lan nhiễm sang các tế bào kế cận dẫn đến việc các mô bị phân hủy và gây hiện tượng viêm. Đây là nguyên nhân cơ bản các triệu chứng của bệnh kiết lỵ do EIEC gây ra [45]. + Enteroaggregative E. coli (EAEC): là tác nhân gây tiêu chảy kéo dài và liên tục ở trẻ em. Đặc điểm nổi bật của EAEC là khả năng tấn công tế bào biểu mô do sự kết bám của chúng với màng nhầy ruột và gây tiêu chảy. EAEC có khả năng tạo hemolysin và một độc tố kém bền với nhiệt có tên là EAST (Entero Aggregative ST). EAEC thường gây tiêu chảy liên tục ở trẻ em, không gây viêm và sốt [38]. + Enterohemorrhagic E. coli (EHEC): còn gọi là Verocytotoxigenic E. coli (VTEC): gây xuất huyết hàng loạt nhưng không gây sốt. Độc tố do EHEC tiết ra ảnh hưởng đến thận, gây xuất huyết kết tràng và hội chứng HUS (haemolyticuraemic syndrome). EHEC có khả năng tạo độc tố đường ruột verotoxin (VT), rất giống với độc tố Shiga do S. dysenteriae nhóm 1 tạo ra gây ảnh hưởng mạnh đến hệ thần kinh [42]. Chúng có khả năng xâm nhiễm vào tế bào chủ gây tiêu chảy, viêm ruột và có thể dẫn đến hiện tượng xuất huyết gây tử vong. Tỷ lệ tử vong ở trẻ em do nhiễm EHEC rất cao vì thường dẫn đến hội chứng HUS và gây tử vong. Trong đó, đại diện của nhóm này là E. coli O157:H7, đây là tác nhân gây nhiều trận dịch lớn trên thế giới [36]. 1.2.2. Staphylococcus aureus S.aureus là vi khuẩn Gram dương, thuộc họ vi khuẩn Staphylococc- aceae, giống Staphylococcus và loài là aureus, có khả năng phát triển trong điều kiện thiếu oxi, nhưng phát triển tốt nhất trong điều kiện hiếu khí. S. aureus không di động, không tạo bào tử, phát triển được trong môi trường có nồng độ muối lên tới hơn 15% [36]. Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là từ 10 - 45oC, nhưng nhiệt độ tối ưu là ở 30 - 37oC, pH thích hợp là 4,2 - 9,3, tối ưu trong khoảng 7- 7,5. Tất cả các dòng S. aureus đều mẫn cảm với novobiocine và dễ bị ức chế bởi các chất sát khuẩn như: hexachlorophere 3%, tím gelatian [39], [61] S. aureus có thể tạo nhiều loại độc tố bao gồm độc tố phá màng, độc tố đường ruột, độc tố tróc vảy, độc tố gây sốc [38]. - Độc tố gây sốc (TSST-1): có hoạt tính superantigen và gây ra hội chứng sốc độc tố. Chúng có thể gây sốc ở gan, thận, tim và trong một số trường hợp có thể dẫn đến tử vong - Độc tố tróc vảy (exfoliative toxin-ET): gồm hai loại là ETA và ETB gây ra triệu chứng da kết vảy hoặc nứt nẻ ở da -Độc tố phá màng: bao gồm α-toxin, β-toxin, δ-toxin, γ-toxin và leucocidin. Chúng có khả năng phá hủy màng và đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhập vào cơ thể - Độc tố đường ruột (Staphylococal enterotoxins-SE): là nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm, các độc tố này được phân loại dựa vào các kiểu kháng nguyên và được chia thành các kiểu độc tố đường ruột như: SE-A, SE-B, SE-C, SE- D, SE-E, SE-G, SE-H, SE-J,…Các độc tố này có hoạt tính siêu kháng nguyên (superantigen), khi được phóng thích vào máu thì gây ra các triệu chứng sốt, tiêu chảy, nôn mửa. Đây cũng là triệu chứng chính của các vụ ngộ độc do S. aureus [63]. S. aureus cũng là nguyên nhân của nhiều bệnh, phổ biến nhất là bệnh về da. Đặc điểm chung của ngộ độc do S. aureus là buồn nôn, ói mửa, đau dầu, đau dạ dày, đôi khi bị tiêu chảy. Bệnh nhân nhiễm S. aureus thường có triệu chứng sốc, sốt cao, phát ban. Nguy hiểm hơn, S. aureus còn gây nhiễm trùng, viêm tủy xương, viêm phổi, viêm nội mạc tim và gây tử vong. Tuy nhiên, bệnh do S. aureus thường nhẹ và sẽ tự khỏi trong 1 - 2 ngày 1.2.3. Salmonella Salmonella là vi khuẩn Gram âm, hình que, đa số đều có khả năng di động nhờ lông mao (trừ S. gallinarum, S. pullorum), không sinh bào tử, là sinh vật kỵ khí tùy ý, nhưng chúng phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí. Salmonella phát triển tốt trong khoảng nhiệt độ từ 5 - 47oC và pH là 4,5 - 9. Phát triển tốt nhất ở 37oC và pH khoảng 6,5 - 7,5 Giống Salmonella được chia thành hai loài: S. enterica và S. bongori, và được chia thành các loài phụ: + Loài S. enterica gồm 5 loài phụ: S. enterica I (S. enterica subspecies enterica), S. enterica II (S. enterica subspecies salamae), S. enterica IIIa (S. enterica subspecies arizonae), S. enterica IIIb (S. enterica subspecies diarizonae), S. enterica IV (S. enterica subspecies houtenae), S. enterica VI (S. enterica subspecies indica). + Loài S. bongori hay còn gọi là Salmonella subspecies V. Salmonella enterica I đa số được tìm thấy ở người và động vật máu nóng. Các nhóm S. enterica II đến VI và S. bongori hầu như chỉ tìm thấy ở các động vật máu lạnh và trong tự nhiên. Salmonella tạo ra hai loại độc tố chính là: - Độc tố đường ruột (enterotoxin): có tác động lên dạ dày, ruột, gây viêm loét, độc tố này thấm vào máu gây nhiễm độc huyết. Có hai loại độc tố đường ruột [1], [4]: * Độc tố LT (Labile temperature): không bền với nhiệt, có tác dụng hoạt hóa men adenyl cylase kích thích tiết Cl- và bicarbonate ra khỏi tế bào, ức chế Na+ đi vào trong tế bào gây tiêu chảy, mất nước. * Độc tố ST (Stabile temperature): bền với nhiệt, cơ chế tác động tương tự LT, có tác dụng hoạt hóa men guanyl cylase làm tăng c-GMP trong tế bào dẫn đến hiện tượng tiêu chảy. Salmonella gây ra ba loại bệnh chính là: thương hàn (S. typhi và S. paratyphi); viêm dạ dày, viêm ruột (S. typhimurium) và nhiễm trùng máu (S. cholerasuis, S. typhimurium). Khả năng gây độc của Salmonella phụ thuộc vào độc lực của từng dòng Salmonella xâm nhiễm và phụ thuộc vào trạng thái sức khỏe của mỗi người. Thông thường, một số Salmonella vẫn tồn tại trong ruột người, động vật nhưng không gây bệnh. Khi cơ thể bị suy nhược hay bị stress liên tục làm giảm sức đề kháng thì vi khuẩn này sẽ phát triển, xâm nhập vào hạch bạch huyết và các tổ chức khác của cơ thể gây sốt thương hàn hoặc phát tán theo hệ thống tuần hoàn đến khắp cơ thể gây nhiễm trùng máu. Phần lớn các bệnh nhân nhiễm Salmonella có thể tự hồi phục nhưng vi khuẩn thương hàn còn tồn tại lâu trong cơ thể. Bệnh nhân có thể trở thành người lành mang bệnh, từng đợt vi khuẩn theo phân ra ngoài và có thể trở thành nguồn lây bệnh nguy hiểm cho cộng đồng [9], [10]. 1.2.4. Bacillus cereus B. cereus là vi khuẩn Gram dương, hình que, hiếu - kỵ khí tùy ý, di động, tạo nội bào tử và phân bố rộng rãi trong môi trường. Ngưỡng nhiệt phát triển của B. cereus là 5 - 50oC, tối ưu ở 28 - 40oC. Bào tử của B. cereus chịu được nhiệt độ cao trên 100oC. Khả năng chịu nhiệt được gia tăng trong các thực phẩm có dầu và hàm lượng chất béo cao [8], [9]. B. cereus có 13 kiểu kháng nguyên màng, 42 kiểu kháng nguyên lông (kháng nguyên H) [56]. B. cereus có khả năng tạo nhiều loại độc tố, nguy hiểm nhất là độc tố gây nôn mửa vì gây ra các bệnh về gan. Đây là nội độc tố duy nhất kháng được trypsin, pepsin, chịu được pH cực đoan (pH: 2 - 11) và nhiệt độ cao (121oC trong 90 phút). Độc tố này có thể gắn vào dây thần kinh phế vị gây nôn mửa hoặc gây cản trở các hoạt động biến dưỡng xảy ra trong cơ thể [16], [52]. B. cereus là vi khuẩn gây bệnh cơ hội, gây tiêu chảy, nôn mửa và một số bệnh hoại thư. Độc tố gây tiêu chảy được tạo thành bởi phức hợp các nội độc tố tạo ra trong quá trình tăng trưởng của các tế bào sinh dưỡng sống trong ruột non. Thời gian ủ bệnh thường từ 10 - 13 giờ sau khi ăn phải thức ăn bị nhiễm. Bệnh thường nhẹ, kèm theo đau bụng, tiêu chảy nhiều, co thắt trực tràng và có cảm giác buồn nôn nhưng không nôn mửa. Các triệu chứng trên kéo dài trong 24 giờ. Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi B. cereus thường nhẹ và sẽ tự khỏi [6], [22]. [56]. 1.2.5. Clostridium perfringens C. perfringens là trực khuẩn Gram dương, sinh bào tử và không di động. C. perfringens phát triển tối ưu ở nhiệt độ 37 - 45oC. Ở 45oC, vi khuẩn có thể phát triển rất nhanh, từ 7 đến 9 phút cho một thế hệ. Vì vậy, C. perfringens được xem là vi khuẩn có tốc độ sinh trưởng cao nhất trong các loài vi sinh vật. C. perfringens không đòi hỏi điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt như các loài Clostridium khác. Do đó, một số chủng C. perfringens vẫn có khả năng phát triển trong môi trường có một ít oxi [21]. Tuy nhiên, C. perfringens thường không thể phát triển trong môi trường có nồng độ muối từ 6 - 8% hoặc nhiệt độ nuôi cấy nhỏ hơn 12oC, pH thích hợp đối với chủng này thường ở khoảng 6,0 - 7,5 [60]. C. perfringens có khả năng tiết khoảng 20 độc tố, trong đó có bốn độc tố chính là alpha, beta, epsilon và iota. Dựa vào các loại độc tố chính được tạo ra, người ta xếp C. perfringens thành 5 nhóm là: A, B, C, D, và E. Trong đó, tất cả các nhóm này đều tạo ra độc tố alpha. Độc tố của C. perfringens được trình bày tóm tắc ở Bảng 1.9. Bảng 1.9. Bảng phân loại độc tố của C. perfringens Độc tố chính Nhóm Alpha Beta Epsilon Iota A + - - - B + + + - C + + - - D + - + - E + - - + Nguồn: [47] Các trường hợp ngộ độc do C. perfringens ở người đều do 2 chủng C. perfringens nhóm A và C gây ra. Ngộ độc thực phẩm nhóm A xảy ra phổ biến với tác nhân chính là độc tố đường ruột, tác động lên các tế bào ở màng ruột, làm tăng tính thấm của màng gây tiêu chảy. Các triệu chứng do C. perfringens nhóm A gây ra thường là tiêu chảy, đau thắt ở bụng trong vòng 8 đến 24 giờ sau khi ăn phải thực phẩm bị nhiễm khuẩn. Ít có trường hợp bị sốt, buồn nôn hay ói mửa. Bệnh thường chấm dứt sau 2 - 3 ngày và không gây tử vong [5]. Tác nhân gây độc do C. perfringens nhóm C hiếm xảy ra nhưng thường gây tử vong. Tác nhân gây độc trong trường hợp này là độc tố beta có khả năng phá hủy các mô nhầy ở thành ruột và gây viêm nhiễm ruột non. Các triệu chứng của bệnh bao gồm: nôn mửa, đau bụng và tiêu chảy ra máu. Bệnh thường dẫn tới tử vong do viêm ruột và nhiễm trùng máu [6], [20]. 1.2.6. Shigella Shigella thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobateriaceae, là vi khuẩn Gram âm, hình bầu dục, không có lông, không di động, không sinh bào tử. Shigella có ngưỡng nhiệt phát triển là từ 7 - 46oC, pH: 5,5 - 9, tối ưu ở 37oC và pH 7,8. Riêng S. sonnei có thể sinh trưởng ở 0oC, do đó có thể tồn tại qua bảo quản lạnh. Chúng là nguyên nhân gây ra nhiều vụ ngộ độc thực phẩm trên toàn thế giới [30]. Shigella có hai loại độc tố: - Độc tố đường ruột: bao gồm hai loại độc tố là ShET1 và ShET2, bền vững ở 1000C, tác động lên đường ruột gây tiêu chảy và thường dẫn đến lỵ. - Độc tố thần kinh: được gọi là Shigatoxin, là một độc tố rất mạnh chỉ thấy ở S. dysenteriae 1, tương tự như verotoxin của E. coli O157:H7, tác động đặc hiệu vào hệ thần kinh. Ngoài ra, Shigatoxin còn được coi là tác nhân gây thương tổn ở niêm mạc sau khi xâm nhiễm vào tế bào ruột, kích thích sự phá hủy tế bào màng nhầy ruột [59]. Shigella có khả năng gây bệnh với sự có mặt một lượng nhỏ từ 10 đến 200 tế bào. Sự lan truyền từ người qua người có thể dễ dàng xảy ra qua đường phân hoặc lan truyền qua đường nước và thức ăn. Đặc tính nổi bật của Shigella là khả năng xâm nhiễm vào tế bào chủ và phá hủy các mô tế bào. Bệnh do Shigella khởi phát đột ngột với triệu chứng tiêu chảy liên tục trong ngày kèm theo đau quặn bụng, sốt, nôn mửa, các biểu hiện của lỵ và nhiễm trùng cấp tính như sốt cao li bì và có thể dẫn đến hôn mê. Một số biến chứng của bệnh do Shigella như nhiễm trùng máu, các biến chứng thần kinh và hội chứng tan huyết, có thể dẫn đến tử vong [15]. 1.2.7. Vibrio cholerae V. cholerae là vi khuẩn Gram âm, hình que, hai đầu không bằng nhau tạo thành hình dấu phảy nên còn được gọi là phảy khuẩn, di động rất nhanh trong môi trường nước, sống kỵ khí tùy nghi, có tiêm mao ở một cực. Vi khuẩn này phát triển tốt ở 30 - 40oC, chịu được pH kiềm, phát triển tốt ở pH: 8,5 - 9,5, có khả năng chịu mặn. Do đó, môi trường tăng sinh ban đầu thường được dùng là nước peptone kiềm và thạch kiềm [8]. V. cholerae có thể gây bệnh do độc tố tả CT (cholerae toxin). Ngoài ra, còn có LT1 và Stn là những độc tố gây bệnh có nhiều đặc điểm tương tự CT nhưng độc tính yếu hơn. Độc tố CT là một protein nhạy cảm với nhiệt độ, có trọng lượng phân tử là 8,4 kDa. Sự có mặt của độc tố CT trong cơ thể sẽ gây nên một chuỗi các rối loạn chuyển hóa bên trong tế bào, đáng kể nhất là hoạt hoá adenylate cyclase, làm tăng cAMP, gây bài tiết nước, Cl- và ức chế sự hấp thu Na+. Nếu khối lượng nước bị tiết ra quá lớn, vượt xa khả năng tái hấp thu của ruột sẽ gây tiêu chảy ồ ạt, nhanh chóng mất nước và điện giải (có thể lên đến 200 lít/ngày) và dẫn đến tử vong [5]. Sự lan truyền bệnh tả chủ yếu do nguồn nước bị nhiễm khuẩn từ phân người bệnh. Ngoài ra, thức ăn cũng là một nguyên nhân truyền bệnh quan trọng. Nguồn lây bệnh qua thực phẩm chủ yếu là từ hải sản. Thời kỳ ủ bệnh do nhiễm V. cholerae kéo dài từ 24 - 48 giờ. Các triệu chứng lâm sàng ban đầu là đầy hơi, chướng bụng sau đó chuyển dần sang các biểu hiện điển hình của bệnh tả là khởi phát đột ngột với các dấu hiệu là tiêu chảy xối xả phân lỏng, mất nước và chất điện giải nhanh chóng. Kế đến là ói mửa dẫn đến tình trạng trụy tim mạch và gây tử vong. Phần lớn bệnh nhân không bị sốt. Tỷ lệ tử vong của bệnh tả này là hơn 60% nếu không được cấp cứu kịp thời [3], [64], [65]. 1.2.8. Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes là trực khuẩn Gram dương, kích thước nhỏ, đôi lúc xếp thành chuỗi ngắn, không tạo bào tử, chuyển động xoay tròn trong tiêu bản giọt treo khi nuôi cấy ở 20 - 25oC. L. monocytogenes có ngưỡng nhiệt phát triển từ: - 4oC - 37oC. Do đó, chúng thường là tác nhân gây ngộ độc thực phẩm trong các loại thức ăn được bảo quản lạnh [1], [8]. L. monocytogenes có khả năng xâm nhiễm cao và sinh sản nhanh chóng không chỉ ngoại bào mà ngay cả nội bào thậm chí trong các đại thực bào. Bệnh do L. monocytogenes gây ra ở người thường là viêm màng não, nhiễm khuẩn máu và đôi khi có thể gây áp xe não. Tỷ lệ tử vong do L. monocytogenes khá cao từ 20 - 25%. Một khi đã chuyển sang các biến chứng như viêm màng não hoặc nhiễm trùng máu thì tỉ lệ tử vong lên đến 50 - 70%. Ở phụ nữ mang thai, đặc biệt là phụ nữ mang thai đến tháng thứ ba, L. monocytogenes có thể vào bào thai gây ra hậu quả nghiêm trọng có thể dẫn tới xảy thai hoặc chết non [40], [57]. 1.2.9. Vibrio parahaemolyticus V. parahaemolyticus là vi khuẩn Gram âm, không sinh bào tử, hình que, di động, là loại vi khuẩn hiếu khí tùy ý. Đây là loại vi khuẩn ưa mặn, có thể sinh trưởng ở nồng độ NaCl từ 0,5 - 10%, tối ưu ở nồng độ NaCl 3%, thích hợp với nhiệt độ từ 5 - 43oC, tối ưu là 37oC, chịu được pH từ 4,8 - 11 và tối ưu ở pH từ 7,8 - 8,6. V. parahaemolyticus sinh sản nhanh, ở điều kiện thuận lợi, thời gian cho một thế hệ của chúng là 9 - 10 phút. Chúng hiện diện phổ biến trong nước biển và có thể tồn tại trong thủy hải sản, chúng cũng có thể sống sót trong điều kiện đông lạnh. Do vậy cần lưu ý khi bảo quản thực phẩm, nhất là thực phẩm đông lạnh [19], [66]. Các chủng V. parahaemolyticus có phản ứng Kanagawa dương tính, thường tiết ra độc tố TDH. Các độc tố này có cấu tạo và cơ chế gây bệnh tương tự như độc tố tả cholerae ở V. cholerae, có vai trò hoạt hóa adenyl cyclase làm tăng quá trình tổng hợp cAMP dẫn đến việc tiết ion Cl- quá mức vào ruột. Hậu quả là NaCl được tích lũy cao ở bên trong lòng ruột nên nước bị kéo vào trong lòng ruột một cách thụ động, gây nên tiêu chảy. Tiêu chảy làm mất đi một lượng lớn nước cùng với ion K+ và bicarbonate. Bệnh tiêu chảy do V. parahaemolyticus gây ra có các triệu chứng như ớn lạnh, buồn nôn, đau thắt vùng bụng và sốt. Thường những triệu chứng này xuất hiện trong vòng 24 giờ sau khi nhiễm khuẩn. Bệnh thường kéo dài từ 1 đến 7 ngày, đôi khi dài hơn, trung bình khoảng 2,5 ngày [21]. 1.2.10. Clostridium botulinum C. botulinum thuộc vi khuẩn Gram dương, hình que, kỵ khí bắt buộc, có khả năng tạo bào tử . Bào tử của C. botulinum có thể chịu được nhiệt độ 105oC trong 1 - 2 giờ và bị tiêu diệt ở 120oC sau 20 - 30 phút. Một vài chủng bào tử có thể chịu đựng được nhiệt độ cao: 120oC trong vài giờ. C. botulinum chỉ tăng trưởng được ở nhiệt độ thích hợp là 34 - 35oC, với pH nằm trong khoảng 7,4 - 7,6. C. botulinum gây bệnh chủ yếu là do độc tố thần kinh botulin, độc tố này được xem là độc tố có độc tính mạnh nhất trong tự nhiên, độc tính của nó có thể gấp 100.000 lần so với độc tố của rắn chuông. Chỉ cần 0,1μg độc tố này cũng có thể gây chết người. Đây là một ngoại độc tố có bản chất protein, kém bền với nhiệt, bao gồm 7 loại độc tố được ký hiệu lần lượt là: A, B, C, D, E. F và G [20], [14]. Trong các nhóm độc tố của C. botulinum được phân loại như trên, chỉ có nhóm A, B, E và F có khả năng gây độc cho người. Các triệu chứng gây độc thường xuất hiện sau 18 - 36 giờ kể từ khi bệnh nhân ăn phải thực phẩm bị nhiễm độc tố. Triệu chứng ban đầu thường là buồn nôn, ói mửa và đau bụng. Bệnh nhân có thể bị tiêu chảy hoặc táo bón nhưng không sốt. Sau đó là các triệu chứng có liên quan đến thần kinh như khó nuốt, khó phát âm, sa mí mắt, các cơ bị mỏi hay yếu đi. Bệnh nhân không thể nhận thức minh bạch, nhức đầu, choáng váng. Trong giai đoạn cuối, nếu không được điều trị kịp thời, bệnh nhân khó thở, thở nhanh và gấp, cuối cùng chết do nghẹt thở [33]. Danh mục các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm đường phố được chúng tôi chọn để làm chỉ tiêu phân tích trong luận văn này bao gồm: Escherichia coli, Salmonella spp, Clostridium perfringens, Bacillus cereus và Staphylococus aureus. 1.3. Các phương pháp phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm 1.3.1. Phương pháp truyền thống Phương pháp nuôi cấy có lịch sử phát triển và ứng dụng lâu dài từ những năm 80 của thế kỷ XIX, nên đã được các cơ quan có thẩm quyền công nhận ở mức quốc gia cũng như quốc tế. Hiện nay, các phương pháp nuôi cấy đang được sử dụng rộng rãi và được công nhận là phương pháp chuẩn trong xét nghiệm vi sinh vật gây bệnh [7], [8], [9]. Quy trình phát hiện vi sinh vật theo phương pháp truyền thống gồm các bước cơ bản sau: - Tăng sinh: là quá trình làm tăng số lượng vi sinh vật mục tiêu trên môi trường nuôi cấy, đồng thời hạn chế quá trình phát triển của các vi sinh vật khác. Quá trình tăng sinh có thể gồm hai giai đoạn: Giai đoạn tăng sinh và giai đoạn tăng sinh chọn lọc trên môi trường đặc trưng. - Phân lập: là quá trình tách vi sinh vật mục tiêu ra khỏi quần thể vi sinh vật ban đầu dựa trên một số tính đặc trưng của vi sinh vật đích. - Khẳng định sinh hóa: là dùng các thử nghiệm sinh hóa, thử nghiệm miễn dịch để định danh vi sinh vật [8]. Nhược điểm của đa số các phương pháp truyền thống là tốn nhiều thời gian, chậm thu kết quả, mất nhiều công sức, tốn kém. Để khắc phục những nhược điểm này, nhiều phương pháp nhanh và tự động đã được phát triển và thương mại hóa. Các phương pháp này có thể được gọi chung là các phương pháp không truyền thống, các phương pháp không hiện đại có đặc điểm chung là cho kết quả nhanh hơn các phương pháp truyền thống. 1.3.2. Các phương pháp hiện đại 1.3.2.1. Phương pháp phát quang sinh học ATP Đây là phương pháp định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí dựa trên nguyên tắc định lượng ATP. Phân tử adenosine triphosphate (ATP) được tìm thấy trong tất cả các tế bào sống, nên sự phát hiện ATP là dấu hiệu để nhận biết vật thể sống đang tồn tại. ATP được phát hiện một cách nhanh chóng bởi lượng ánh sáng phát ra thông qua sự kết hợp với enzyme luciferase nhờ một máy đo ánh sáng. Kỹ thuật này có độ nhạy cao, có thể phát hiện 1pg ATP tương ứng với 103 tế bào vi khuẩn. Tuy nhiên, phương pháp phát quang dựa trên ATP không thể phát hiện các vi sinh vật chuyên biệt [8]. Ngày nay, sự phát quang sinh học đã được sử dụng khá rộng rãi để đánh giá chất lượng vệ sinh bề mặt thiết bị trong quá trình sản xuất, chế biến, đánh giá chất lượng thực phẩm, mỹ phẩm. Quy trình thực hiện rất đơn giản, cho kết quả nhanh chóng trong vài phút và có thể dễ dàng tự động hóa. Nguyên tắc chung của quy trình này là: mẫu được thu bằng cách dùng que bông vô trùng quẹt một diện tích nhất định trên bề mặt dụng cụ, thiết bị. Sau đó que bông được cho vào dung dịch ly trích ATP, xử lý với ATPase và cho phản ứng ánh sáng [8]. 1.3.2.2. Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) Nguyên tắc của phương pháp miễn dịch này là phản ứng kết hợp giữa một kháng nguyên với một kháng thể đặc hiệu. Tín hiệu của phản ứng miễn dịch có thể nhận biết thông qua sự ngưng tủa hay kết dính của kháng nguyên-kháng thể hoặc bằng cách sử dụng những kháng thể đã được đánh dấu bằng chất nhuộm phát huỳnh quang, đồng vị phóng xạ hay enzyme [3]. Cụ thể là ta sử dụng kháng thể phủ bên ngoài những đĩa giếng (microplate). Kháng nguyên (nếu có) trong mẫu sẽ được giữ lại trên bề mặt giếng. Các kháng nguyên này sẽ được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn với enzyme như: horseradish peroxidase hoặc alkaline phosphatase [9]. Khi bổ sung một cơ chất đặc hiệu của enzyme vào giếng, enzyme sẽ xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra sản phẩm có màu hoặc phát sáng [8]. Theo dõi sự thay đổi màu có thể phát hiện và định lượng được lượng kháng nguyên trong mẫu [4]. Phương pháp hấp phụ miễn dịch dùng enzyme (ELISA) được quan tâm nhiều do tính đơn giản và hiệu quả cao. 1.3.2.3. Phương pháp lai phân tử (Hybridization) Từ những năm 1980, nhiều nghiên cứu được tiến hành nhằm ứng dụng các thành tựu kỹ thuật di truyền, sinh học phân tử vào lĩnh vực thực phẩm [8]. Đây là phương pháp sử dụng mẫu dò để phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm dựa trên sự phát hiện một đoạn gen đặc trưng của vi sinh vật qua quá trình lai. Cơ sở của sự lai phân tử là sự tách rời hai mạch đơn của chuỗi xoắn kép DNA khi nhiệt độ môi trường vượt quá nhiệt độ nóng chảy (Tm ) và sự tái bắt cặp trở lại giữa hai mạch khi nhiệt độ được giảm từ từ. Một trong hai mạch DNA bổ sung (thường là DNA mục tiêu) được cố định trên một giá thể rắn hoặc nằm ngay trên tế bào hay mô. Sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa hai trình tự hoàn toàn bổ sung. Các trình tự bổ sung có thể là DNA hay RNA, dẫn đến sự hình thành các phân tử lai DNA-DNA hay DNA-RNA [10]. Quá trình lai phân tử chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi các yếu tố: nồng độ DNA trong môi trường, nhiệt độ và thời gian phản ứng, kích thước các trình tự lai và lực ion của môi trường. 1.3.2.4. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Phương pháp PCR là một phương pháp in vitro để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme DNA polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA đó [8], [11]. Kỹ thuật này do Karl Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh vào năm 1985. Hiện nay, kỹ thuật PCR được sử dụng rộng rãi để phát hiện, chuẩn đoán bệnh, phát hiện các vi sinh vật có trong thực phẩm. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc là: tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ khuôn. Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho loài vi sinh vật mục tiêu hoặc là gen quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật này. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn. Nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn mồi này được nối dài để hình thành mạch mới có trình tự bổ sung ngược chiều với mạch khuôn. Nếu có hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung ở hai đầu của một trình tự DNA, ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase trong phản ứng PCR, số lượng bản sao của đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được nhân lên (khuếch đại) đến mức có thể thấy được vạch của DNA sau khi nhuộm bằng Ethidium bromide [3], [7], [8]. Để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo được cặp mồi chuyên biệt. Cặp mồi này gồm một mồi xuôi (sense primer) và một mồi ngược (antisense primer) so với chiều phiên mã của gen. Ngoài các phương pháp không truyền thống trên, hiện nay còn sử dụng một số phương pháp thử nhanh khác như: + Kỹ thuật phân tách và tăng mật độ: nhằm tách các tế bào vi sinh vật mục tiêu với các tế bào vi sinh vật khác, bằng cách sử dụng những hạt có từ tính cao được bao bọc bên ngoài bởi những kháng thể của vi sinh vật mục tiêu [8], [17]. Các hạt này giúp hấp phụ chọn lọc các vi sinh vật mục tiêu và giữ chúng lại trênbờ mặt các hạt từ và tách chúng ra khỏi các quần thể vi sinh vật khác [8], [12]. + Kỹ thuật màng Petri (Petrifilm): kỹ thuật này đã được dùng trong các ứng dụng kiểm tra tổng vi khuẩn hiếu khí, số coliform, nấm mốc, nấm men. Ưu điểm của kỹ thuật này là dễ thao tác, tiết kiệm không gian ủ và bảo quản, thời hạn sử dụng lâu và không cần hấp khử trùng môi trường [8]. + Kỹ thuật độ dẫn điện, trở kháng (Conductance/ impedance): kỹ thuật này nhằm phát hiện và định lượng nhanh vi sinh vật dựa trên sự tăng độ dẫn điện của môi trường do sản phẩm trao đổi chất có tính ion được tiết vào môi trường bởi vi sinh vật. Môi trường nuôi cấy chọn lọc có tác dụng như dung dịch điện phân. Sự thay đổi về độ dẫn điện được ghi nhận bởi các thiết bị đo, nhờ vậy giúp phát hiện các vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy [8], [24]. 1.3.3. Ưu điểm và nhược điểm của các phương pháp - Phương pháp truyền thống để phát hiện vi sinh vật gây bệnh được xem là phương pháp chuẩn và đang được sử dụng phổ biến trong các phòng thí nghiệm và các trung tâm phân tích. Tuy nhiên, việc phát hiện bằng phương pháp này tốn nhiều thời gian (5 - 7 ngày), tốn kém và mất nhiều công sức [8]. - Phương pháp ELISA có ưu điểm và độ nhạy cao, nhưng độ đặc hiệu lại thấp, do có thể hình thành các phản ứng chéo không đặc hiệu giữa các chủng khác nhau, phương pháp này đòi hỏi độ tinh sạch của mẫu cao nhằm tránh sự ức chế bởi các protein trong thực phẩm. Mặt khác, mẫu cần nguyên vẹn, không bị biến tính để tránh trường hợp cho kết quả âm tính giả [58]. - Phương pháp lai phân tử và phương pháp PCR đang được ứng dụng nhiều nhất hiện nay. Phương pháp lai dùng mẫu dò không đánh dấu bằng phóng xạ (được khuyến cáo sử dụng) chỉ phát hiện được vi sinh vật ở mức 106 - 108 tế bào/g mẫu. Trong khi đó, thông thường độ nhạy của phản ứng PCR có thể là 1 - 10 tế bào/g mẫu [23], [68]. Nhìn chung, so với các phương pháp hiện đại đã đề cập trên, phương pháp PCR có một số ưu điểm sau: + Thời gian cho kết quả nhanh: phương pháp PCR có thể phát hiện vi sinh vật trong mẫu thực phẩm trong khoảng 1 - 2 ngày, trong khi đó, phương pháp nuôi cấy truyền thống là 5 - 7 ngày [8]. + Thao tác đơn giản, có thể phân tích những vi sinh vật khó nuôi cấy, việc nuôi cấy tăng sinh đơn giản không cần qua giai đoạn tăng sinh chọn lọc. + Hoá chất cần cho phản ứng PCR dễ tìm, dễ bảo quản. Không sử dụng nhiều môi trường nuôi cấy phức tạp như phương pháp nuôi cấy [4]. + Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp PCR cao do nguyên tắc phát hiện dựa trên kiểu gen chuyên biệt của từng vi sinh vật đích [7]. Hiện nay, phòng thí nghiệm sinh học phân tử Trường Đại học Khoa học tự nhiên ĐHQG TP. HCM đã chuyển giao các quy trình và bộ kit PCR xét nghiệm các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm với giá 30.000 VND, với giá thành này có thể cạnh tranh với các phương pháp khác [57]. Chính vì những ưu điểm trên mà phương pháp PCR đang ngày càng được sử dụng rộng rãi trong các xét nghiệm vi sinh. 1.4. Tình hình ứng dụng kỹ thuật PCR vào việc kiểm tra các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm trên thế giới và tại Việt Nam 1.4.1. Lịch sử ra đời kỹ thuật PCR Phương pháp PCR được Kary Mullis người Mỹ phát minh vào năm 1985 và được thừa nhận chính thức từ năm 1993, ông đã đoạt giải Nobel về Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này, chỉ sau 7 năm khi ông đưa ra ý tưởng. Ý kiến của Mullis phát triển và đã được sử dụng tại nhiều nước trên toàn thế giới, trong nhiều lĩnh vực [57], chẳng hạn: + Vân tay di truyền [54] + Kiểm tra huyết thống [55] + Chẩn đoán bệnh di truyền [57] + Tách dòng gene [60] + Gây đột biến điểm [54] + Phân tích mẫu DNA cổ [67] + Xác định kiểu gene của các đột biến [62] + Kiểm tra sự hiện diện của các vi sinh vật [70] + So sánh mức độ biểu hiện của gene [65],… 1.4.2. Tình hình ứng dụng kỹ thuật PCR trên thế giới Từ khi ra đời vào năm 1985, trên thế giới đã có rất nhiều ứng dụng kỹ thuật PCR trong phân tích sinh học và ngày càng được sử dụng trong nhiều lĩnh vực và đã đạt được một số thành tựu nổi bật: Một trong những nghiên cứu thành công đầu tiên là do Eisenach, Sifford , Cave và cộng sự, 1991 sử dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán bệnh lao trực tiếp từ dịch đờm của bệnh nhân lao phổi, đã phân biệt được trực khuẩn lao với các Mycobacterium không lao khác bằng cách sử dụng đoạn trình tự IS 6110 [63]. Ứng dụng nổi bật khác là do Berenguer, Moreno và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán lao màng não [66]. Kỹ thuật PCR còn được sử dụng trong chẩn đoán trực khuẩn lao kháng thuốc INH do thiếu gen catalase (gen Kat G) do Zhang và cộng sự, 1993 [73]. Một thành tựu khác là ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán sự hiện diện của vi khuẩn Whipple (TW) gây ra bệnh đường ruột và có thể làm tổn thương hệ thần kinh trung ương. Vi khuẩn TW không nuôi cấy được, cũng không chẩn đoán huyết thanh được. Nhờ kỹ thuật PCR đã giúp chẩn đoán dễ dàng vi khuẩn Tropheryma whippelii. Qua các nghiên cứu cho thấy kỹ thuật PCR có độ nhạy là 83,5%, độ đặc hiệu là 99% [71]. Trên đây chỉ là một vài thành tựu điển hình, hiện nay kỹ thuật PCR đã và đang phát triển mạnh mẽ trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong lĩnh vực y học. 1.4.3. Tình hình ứng dụng kỹ thuật PCR ở Việt Nam Năm 1988, GS. Lê Đình Lương (Trung tâm Công nghệ Sinh học - ĐH Quốc gia Hà Nội) là người đầu tiên của Việt Nam mua một chiếc máy PCR. Đến nay, kỹ thuật PCR đã trở thành một công cụ hữu hiệu trong chẩn đoán bệnh, trong việc xác định di truyền, xét nghiệm để phát hiện các vi sinh vật có hại trong thực phẩm, thủy sản,… [56], với chi phí thấp hơn hẳn so với việc sử dụng các phương pháp khác. Hiện nay, việc ứng dụng kỹ thuật PCR ở nước ta đã đem lại nhiều hiệu quả cao [72]. Sau đây là một số ứng dụng kỹ thuật PCR tiêu biểu, ứng dụng kỹ thuật PCR trong: - Chẩn đoán viêm gan siêu vi B và viêm gan siêu vi C của ĐH Y Dược TP. HCM, với giá mỗi lần xét nghiệm chỉ từ 150.000 - 300.000 đồng và chỉ mất 4 giờ; trước kia phải tốn 100 USD, với thời gian là 1 tháng [57]. - Phát hiện nhanh nhóm vi khuẩn gây bệnh trong dịch não tủy của người, trước kia việc xét nghiệm (theo phương pháp nuôi cấy) phải mất từ 12 đến 24 giờ, thì nay, chỉ cần chạy PCR với một lượng nhỏ mẫu dịch não, trong vòng 6 giờ đã có kết quả [57]. - Trong xét nghiệm quan hệ huyết thống tại Trung tâm Công nghệ Sinh học ĐHQG Hà Nội, chi phí cho một lần xét nghiệm, giá khoảng 1 - 1,5 triệu đồng. So với việc xét nghiệm quan hệ huyết thống ở nước ngoài, giá thành cho một lần xét nghiệm giảm hơn 30% (giá một xét nghiệm huyết thống tại Mỹ là 250 - 500 USD) [57]. - Không những thế, kỹ thuật PCR còn là một công cụ xét nghiệm hữu hiệu và quen thuộc của nhiều nông dân nuôi tôm ở Sóc Trăng [57]. - Trong đề tài “Nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ sinh học”, Mã số KC.04. và ELISA, GS.TS. Nguyễn Thị Kê (Viện vệ sinh y tế công cộng TP. HCM) đã ứng dụng kỹ thuật PCR trong xác định nhanh nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật (Salmonella, E. coli, Staphylococ- -cus aureus,...) chỉ trong vài giờ [31]. - Tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, ĐHQG TP.HCM, đã tiến hành nghiên cứu và xây dựng quy trình (bộ kit) phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm bằng kỹ thuật PCR nhằm phục vụ cho nhu cầu cấp bách hiện nay. Và đã ứng dụng bộ kit để kiểm tra sự hiện diện của vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm. Qua đó phần nào khẳng định sử dụng phương pháp PCR để khảo sát sự nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm là khoa học và đáng tin cậy. Trong lĩnh vực thực phẩm đường phố cũng đã có ứng dụng, khảo sát, tuy nhiên chưa nhiều và đầy đủ. Trong đề tài Luận văn thạc sỹ Y tế công cộng, Đại học Y tế Công Cộng. Kiều Mai Phương, 1998, đã “Khảo sát thực trạng ô nhiễm vi khuẩn trong thức ăn đường phố tại các cửa hàng ăn dọc quốc lộ 1a thuộc huyện Tiên sơn, Bắc Ninh”. Với tình hình ngộ độc thực phẩm do thức ăn đường phố ở nước ta hiện nay thì cần khảo sát và đưa ra những kết luận về tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm đường phố là vấn đề rất cần thiết và đang được sự quan tâm của toàn xã hội. Trong luận văn này, chúng tôi ứng dụng những quy trình, bộ kit PCR dựa trên kết quả các công trình xây dựng quy trình PCR đã công bố trên thế giới, trong nước và phương pháp nuôi cấy để khảo sát sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh trong nhóm thực phẩm đường phố bao gồm các nhóm: kem, sữa và nước giải khát trên địa bàn TP. HCM. Từ đó đưa ra kết luận về tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm đường phố trên địa bàn TP. HCM hiện nay so với tiêu chuẩn của Bộ Y tế (QĐ-BYT, 04/1998) đối với nhóm thực phẩm đường phố ở nước ta hiện nay. Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1. Dụng cụ và thiết bị - Máy dập mẫu Stomacher 400 Circulator (Seward, Anh). - Máy ly tâm lạnh Mikro (Hetlich Zentrifugen). - Tủ ấm. - Máy vortex. - Máy luân nhiệt Mastercycler Personal (Eppendorf, Đức). - Bộ điện di ngang Horizon 58 (Life technology). - Hộp soi đèn tử ngoại Hoefer (model no UVTM-19-23V). - Máy đo quang phổ UV-VIS UItrospec 2000. - Ống nghiệm. - Máy chụp hình gel IMAGEMATERS VDS (Amersham Pharmacia Biotech). 2.1.2. Hoá chất và môi trường 2.1.2.1. Hoá chất dùng cho phản ứng PCR + Đệm TE (10mM, Tris-HCl, 1mM EDTA): dùng cho quá trình tách chiết DNA khuôn cho phản ứng PCR. + PCR mix cho các chỉ tiêu: B. cereus, C. perfringens, E. coli, Salmonella, S. aureus và Taq polymerase được giữ trong đệm 50mM Tris-HCl (pH: 7,5); 0,1mM EDTA; 5mM DTT; 50% glycerol bảo quản ở -200C. 2.1.2.2. Hóa chất dùng cho điện di và xem kết quả + Agarose. + Đệm tải mẫu điện di (loading dye): 0,15% bromophenolblue, 30% glycerol, 200mM Tris, 20mM EDTA. + Đệm TAE 1X: 4,48g Tris; 2ml Na2EDTA 0,5M, pH: 8; 1,14ml glacial acid acetic; thêm nước cất để đủ 1000ml. + Ethidium Bromide (BET): 1mg/ml. + Thang DNA: được sử dụng để ước lượng kích thước của sản phẩm DNA được khuyếch đại bằng phản ứng PCR, do hãng Fermentas cung cấp, có số vạch và kích thước được minh họa ở hình 2.1. Hình 2.1. Thang DNA 100bp 2.1.2.3. Môi trường - Môi trường TSB (Tryptone Soya Broth): dùng để tăng sinh E. coli, S. aureus, Salmonella và B. cereus. - Môi trường Fluid Thioglycolate: dùng để tăng sinh C. perfringens. - Các môi trường nuôi cấy và thử nghiệm sinh hóa cho quá trình phân tích mẫu bằng phương pháp truyền thống được cung cấp bỡi Merck, chẳng hạn một số môi trường: Tryptic Soy Agar (TSA), Brilliant Green Bile Lactose (BGBL), EMB Agar, Baird Parker Agar (BPA), Rappaport Vassiliadis (RV), Xylose Lysine Desoxycholate (XLD), Simmon Citrate Agar, Brain Heart Infusion (BHI), Kligler Iron Agar (KIA), Urea Broth, Mannitoll phenol red broth, Lysine decarboxylase broth (LDC), EC Broth, MR-VP Broth, Triple Sugar Iron Agar (TSI). 2.1.3. Nguyên vật liệu 2.1.3.1. Các chủng vi sinh vật Các chủng Salmonella, E. coli, C. perfringens, S. aureus và B. cereus đã sử dụng được cung cấp bởi: Viện Vệ sinh Y tế công cộng, Viện Pasteur TP.HCM và Viện Công nghệ Hoàng gia Melbourne RMIT-Úc. 2.1.3.2. Mẫu thực phẩm Các mẫu thực phẩm thuộc nhóm: sữa, kem, nước giải khát được mua tại các quán ăn trên lề đường, trước các trường học; công viên; tại các Quận: 3, 5, 8, 10 và quận Tân Bình trên địa bàn TP. HCM. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Nguyên tắc phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) PCR là một phản ứng tổng hợp dây chuyền được dùng để khuyếch đại một trình tự DNA đích dựa trên sự bắt cặp đặc hiệu giữa mồi với DNA mạch khuôn và hoạt tính kéo dài cuả enzyme polymerase. Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 bước tương ứng với sự thay đổi nhiệt độ trong phản ứng, theo đó, số lượng bản sao DNA ngày càng tăng. Quá trình này được minh họa ở Hình 2.2 và Hình 2. 3 [57]. Hình 2.2. Các bước của phản ứng PCR Hình 2.3. Số bản sao DNA tăng theo từng chu kỳ trong phản ứng PCR - Bước 1: (biến tính, denaturation): tách rời 2 mạch đơn của phân tử DNA được thực hiện ở nhiệt độ cao (cao hơn Tm của DNA) để hai mạch DNA bị biến tính và tách thành hai mạch đơn. Nhiệt độ phản ứng khoảng 94oC - 95oC, trong vòng 30 - 60 giây [8, 10]. - Bước 2: (bắt cặp, annealing): các cặp mồi bắt cặp với DNA mạch khuôn tại những vị trí chuyên biệt, trong bước này, nhiệt độ hạ thấp hơn Tm của các mồi, cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn. Nhiệt độ phản ứng dao động khoảng 40oC - 70oC, tùy thuộc vào Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 - 60 giây [10]. - Bước 3: (kéo dài, elongation): dưới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào mồi theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn. Mạch mới được tạo thành từ mồi được nối dài. Nhiệt độ phản ứng khoảng 72oC (ở nhiệt độ này DNA polymerase tổng hợp tốt nhất), thời gian của bước này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút [10]. Trong phản ứng PCR, một chu kỳ gồm ba bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần. Mỗi chu kỳ làm tăng gấp đôi số lượng bản sao. Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân. Sau 30 - 40 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ cho ra khoảng 106 bản sao so với số lượng mẫu ban đầu. Sau phản ứng PCR, người ta phát hiện sự có mặt của các trình tự DNA đặc trưng thông qua sự xuất hiện các sản phẩm khuyếch đại sau phản ứng PCR bằng phương pháp điện di DNA trên gel và ngâm trong dung dịch Ethidium bromide. Vạch DNA mục tiêu được phát hiện bằng cách soi, quan sát dưới tia UV ở bước sóng phù hợp. 2.2.2. Quy trình phân tích mẫu bằng kỹ thuật PCR và phương pháp truyền thống 2.2.2.1. Qui trình phân tích mẫu bằng kỹ thuật PCR a. Kiểm Salmonella - Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh (TSB hoặc BPW), ủ 37oC từ 18 - 22 giờ. - Hút 1ml dịch tăng sinh vào eppendorf, xử lý mẫu và chạy PCR. Kết quả: + Mẫu không đạt tiêu chuẩn khi kết quả PCR dương tính. + Mẫu đạt tiêu chuẩn khi kết quả PCR âm tính. b. Kiểm E. coli - Không pha loãng hoặc pha loãng 25g mẫu. - Hút 0,99ml dịch đồng nhất cho vào 9ml môi trường tăng sinh, ủ 37oC, tăng sinh sau 18 - 22 giờ. - Hút dịch tăng sinh sau 18 - 22 giờ vào 2 eppendorf (1ml/ 1 eppendorf), xử lý mẫu, chạy PCR. Kết quả: + Mẫu không đạt tiêu chuẩn khi PCR cho kết quả dương tính. + Mẫu đạt tiêu chuẩn khi PCR cho kết quả âm tính. c. Kiểm S. aureus, B. cereus - Hút 0,99ml dịch đồng nhất cho vào 9ml môi trường tăng sinh, ủ 37oC, tăng sinh sau 18 - 22 giờ. - Hút dịch tăng sinh sau 18 - 22 giờ vào 2 eppendorf (1ml/ 1 eppendorf), xử lý mẫu, chạy PCR. Kết quả: + Mẫu không đạt tiêu chuẩn khi PCR cho kết quả dương tính. + Mẫu đạt tiêu chuẩn khi PCR cho kết quả âm tính. d. Kiểm C. Perfringens - Hút 0,99ml dịch đồng nhất cho vào 9ml môi trường tăng sinh, ủ 37oC, tăng sinh sau 18 - 22 giờ. - Hút dịch tăng sinh sau 18 - 22 giờ vào 2 eppendorf (1ml/ 1 eppendorf), xử lý mẫu, chạy PCR. Kết quả: + Mẫu không đạt tiêu chuẩn khi PCR cho kết quả dương tính. + Mẫu đạt tiêu chuẩn khi PCR cho kết quả âm tính. 2.2.2.2. Quy trình phân tích mẫu bằng phương pháp truyền thống a. Kiểm Salmonella: theo TCVN 4829:2001 - Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh, ủ 37oC từ 18 - 22 giờ. Chuyển sang môi trường RV, ủ 42oC/24 giờ và Selenite, ủ 37oC/24 giờ. - Ria cấy trên môi trường XLD, ủ 37oC/24 giờ. - Thử tính chất sinh hóa - Thử ngưng kết kháng huyết thanh. - Tính kết quả dựa theo số khuẩn lạc có đúng tính chất sinh hóa. b. Kiểm E. coli: theo TCVN 5155:90 - Pha loãng mẫu (không pha loãng). Hút 0,2ml dung dịch mẫu, cấy láng trên bề mặt thạch môi trường EMB. - Đếm những khuẩn lạc E. coli điển hình. Chọn 5 khuẩn lạc điển hình thử tính chất sinh hóa. - Tính kết quả dựa theo số khuẩn lạc có đúng tính chất sinh hóa. c. Kiểm S. aureus: theo TCVN 5156:1990 - Pha loãng mẫu hoặc không pha loãng. Hút 0,2ml dung dịch mẫu, cấy láng trên bề mặt thạch Chapman. - Đếm những khuẩn lạc S. aureus điển hình. Chọn 5 khuẩn lạc điển hình thử tính chất sinh hóa. - Tính kết quả dựa theo số khuẩn lạc có đúng tính chất sinh hóa như trên. d. Kiểm B. cereus: theo AOAC 2000 (980.31) - Pha loãng mẫu hoặc không pha loãng. Hút 0,2ml dung dịch mẫu, cấy láng trên bề mặt thạch MYP. - Đếm những khuẩn lạc B. cereus điển hình. Chọn 5 khuẩn lạc điển hình thử tính chất sinh hóa. - Tính kết quả dựa theo số khuẩn lạc có đúng tính chất sinh hóa như trên. e. Kiểm C. perfringens: theo QĐ 3348/QĐ-BYT ngày 31/7/2001 của Bộ Y tế - Pha loãng mẫu hoặc không pha loãng. Hút 1ml dung dịch mẫu, cấy sâu vào 2 ống môi trường TSN. - Đếm những khuẩn lạc C. perfringens điển hình. Chọn vài khuẩn lạc điển hình thử tính chất sinh hóa. - Tính kết quả dựa theo số khuẩn lạc có đúng tính chất sinh hóa như trên. 2.2.3. Ứng dụng phương pháp nuôi cấy và quy trình, bộ kit PCR để khảo sát sự nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm đường phố trên địa bàn TP. HCM 2.2.3.1. Mục tiêu Ứng dụng quy trình và bộ kit PCR để phân tích nhanh các nguyên nhân gây ngộ độc trong nhóm thực phẩm đường phố tại địa bàn TP.HCM và so sánh với kết quả theo phương pháp nuôi cấy. Từ đó nhận định khả năng ứng dụng các quy trình, bộ kit PCR để kiểm tra và giám sát an toàn vệ sinh thực phẩm, mặt khác qua đó thấy được tình hình nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong các mẫu thực phẩm đường phố trên địa bàn TP. HCM so với tiêu chuẩn của Bộ Y tế. - Đơn vị hợp tác: Viện Vệ sinh y tế công cộng TP. HCM. - Loại mẫu: Nhóm thực phẩm đường phố gồm: nhóm sữa, nước giải khát và kem . - Số lượng mẫu: 77 mẫu. - Địa điểm lấy mẫu: Mẫu được lấy từ các quầy bán thức ăn trên vỉa hè, trước các chợ, công viên, trường học, tại các quận: Q. 3, Q. 5, Q. 8, Q. 10 và quận Tân Bình. 2.2.3.2. Tiêu chuẩn phân tích Các mẫu được phân tích bằng phương pháp PCR và nuôi cấy theo tiêu chuẩn của Bộ Y tế (QĐ867/98) đối với các chỉ tiêu vi sinh phân tích được chọn của đề tài (E. coli, Salmonella, S. aureus, B. cereus và C. perfringens) tương ứng với nhóm thực phẩm (sữa, nước giải khát và kem) được thể hiện ở Bảng 2.1, Bảng 2.2 và Bảng 2.3 [2]. Bảng 2.1. Chỉ tiêu phân tích vi sinh của Bộ Y tế đối với nhóm sữa STT Vi sinh vật kiểm tra Mức độ tối đa cho phép (CFU/g) 1 E. coli/g 3 2 S. aureus/g 0 3 B. cereus/g 0 4 Salmonella/25g 0 Bảng 2.2 Chỉ tiêu phân tích vi sinh của Bộ Y tế đối với các loại nước giải khát STT Vi sinh vật kiểm tra Mức độ tối đa cho phép (CFU/g) 1 E. coli/g 0 2 S. aureus/g 0 3 C. perfringens/g 0 Bảng 2.3. Chỉ tiêu phân tích vi sinh của Bộ Y tế đối với nhóm kem STT Vi sinh vật kiểm tra Mức độ tối đa cho phép (CFU/g) 1 E. coli/g 0 2 S. aureus/g 10 3 C. perfringens/g 10 4 Salmonella/25g 0 2.2.3.3. Địa điểm thực hiện Phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật bằng kỹ thuật PCR và bằng phương pháp nuôi cấy được thực hiện tại phòng Thí nghiệm Công Nghệ Sinh học Phân tử Trường ĐHKHTN, ĐHQG, TP. HCM và phòng Vi sinh Thực phẩm - Viện Vệ sinh y tế Công Cộng, TP. HCM. 2.2.3.4. Quy trình kiểm nghiệm * Quy trình phân tích mẫu bằng kỹ thuật PCR Các quy trình PCR xét nghiệm vi sinh gây ngộ độc dùng trong nghiên cứu này được xây dựng trên cơ sở định tính sự hiện diện của vi sinh gây ngộ độc trong thực phẩm (0CFU/g hay 0CFU/25g). Tuy nhiên, một số chỉ tiêu vi sinh như E. coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Clostridium perfringens ở một số thực phẩm đường phố lại được phép hiện diện ở một mật độ nhất định trong thực phẩm (thường trong khoảng 3 - 10CFU/g). Trong trường hợp này, các quy trình PCR định tính cũng được áp dụng để xét nghiệm mẫu có đạt hay không bằng cách thêm một bước pha loãng mẫu sau khi được đồng nhất thành một độ pha loãng tương ứng với mật độ cho phép trước khi thực hiện bước ủ tăng sinh (ví dụ pha loãng 3 lần nếu mật độ cho phép là 3CFU/g hoặc pha loãng 10 lần nếu mật độ cho phép là 10CFU/g). Quy trình xét nghiệm định tính và xét nghiệm định lượng chỉ khác nhau ở bước đồng nhất mẫu và pha loãng trước khi tăng sinh. Các bước còn lại của hai quy trình xét nghiệm này là như nhau. Quy trình xét nghiệm này bao gồm 5 bước: a. Bước 1: Đồng nhất mẫu, pha loãng và tăng sinh * Chỉ tiêu E. coli (0CFU/g hoặc cho phép 3CFU/g tùy loại thực phẩm) - Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh TSB. - Pha loãng và tăng sinh tùy theo từng chỉ tiêu cụ thể như sau: + Đối với chỉ tiêu 0CFU/g (nhóm nước giải khát và kem) Hút 10ml dịch đồng nhất (tương đương 1g mẫu) để tăng sinh ở 37oC trong 18 - 22 giờ trước khi thực hiện phản ứng PCR. Nếu phản ứng PCR dương tính thì kết luận mẫu chứa E. coli ít nhất 1CFU/g  mẫu không đạt. + Đối với chỉ tiêu 3CFU/g (nhóm sữa) Hút 10ml dịch đồng nhất (tương đương 1g mẫu) pha loãng 3 lần bằng cách trộn với 20ml môi trường TSB. Nếu mẫu chứa 3CFU/g thì 30ml dịch pha loãng này chứa 3CFU hay 1CFU/10ml. Hút 9,9ml dịch pha loãng để tăng sinh ở 37oC trong 18 - 22 giờ trước khi thực hiện phản ứng PCR. Nếu phản ứng PCR dương tính thì kết luận mẫu chứa trên 3CFU/g  mẫu không đạt. * Chỉ tiêu Staphylococcus aureus (không cho phép hoặc cho phép 10 CFU/g tùy loại thực phẩm) - Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh TSB. - Pha loãng và tăng sinh theo từng chỉ tiêu cụ thể như sau: + Đối với chỉ tiêu 0CFU/g (nhóm sữa và nước giải khát) Hút 10ml dịch đồng nhất (tương đương 1g mẫu) để tăng sinh ở 37oC trong 18 - 22 giờ trước khi thực hiện phản ứng PCR. Nếu phản ứng PCR dương tính thì kết luận mẫu chứa S. aureus ít nhất 1CFU/g  mẫu không đạt. + Đối với chỉ tiêu 10CFU/g (nhóm kem) Hút 10ml dịch đồng nhất (tương đương 1g mẫu) pha loãng 10 lần bằng cách trộn với 90ml môi trường TSB. Nếu mẫu chứa 10CFU/g thì 100ml dịch pha loãng này chứa 10CFU hay 1CFU/10ml. Hút 9,9ml dịch pha loãng để tăng sinh ở 37oC trong 18 - 22 giờ trước khi thực hiện phản ứng PCR. Nếu phản ứng PCR dương tính thì kết luận mẫu chứa S. aureus trên 10CFU/g  mẫu không đạt. * Chỉ tiêu Bacillus cereus (không cho phép ở cả 3 nhóm kem, nước giải khát và sữa) - Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh TSB. - Pha loãng và tăng sinh như sau: Hút 10ml dịch đồng nhất (tương đương 1g mẫu) để tăng sinh ở 37oC trong 18 - 22 giờ trước khi thực hiện phản ứng PCR. Nếu phản ứng PCR dương tính thì kết luận mẫu chứa B. cereus ít nhất 1CFU/g  mẫu không đạt. * Chỉ tiêu Clostridium perfringens (không cho phép hoặc cho phép 10CFU/g tùy loại thực phẩm) - Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh Thioglycolate. - Pha loãng và tăng sinh tùy theo từng chỉ tiêu cụ thể như sau: + Đối với chỉ tiêu 0CFU/g (nhóm nước giải khát) Hút 10ml dịch đồng nhất (tương đương 1g mẫu) để tăng sinh ở 37oC trong 18 - 22 giờ trước khi thực hiện phản ứng PCR. Nếu phản ứng PCR dương tính thì kết luận mẫu chứa C. perfringens ít nhất 1CFU/g  mẫu không đạt. + Đối với chỉ tiêu 10CFU/g (nhóm kem, chỉ tiêu này không quy định ở nhóm sữa). Hút 10ml dịch đồng nhất (tương đương 1g mẫu) pha loãng 10 lần bằng cách trộn với 90ml môi trường Thioglycolate. Nếu mẫu chứa 10CFU/g thì 100ml dịch pha loãng này chứa 10CFU hay 1CFU/10ml. Hút 9,9ml dịch pha loãng để tăng sinh ở 37oC trong 18 - 22 giờ trước khi thực hiện phản ứng PCR. Nếu phản ứng PCR dương tính thì kết luận mẫu chứa trên 10CFU/g  mẫu không đạt. * Chỉ tiêu Salmonella (không cho phép hiện diện 0CFU/25g) Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh TSB, ủ 37oC trong 18 - 22 giờ trước khi thực hiện phản ứng PCR. Nếu phản ứng PCR dương tính thì kết luận mẫu chứa trên 1CFU/25g  mẫu không đạt. b. Bước 2: Tách chiết DNA mẫu - Lấy 1ml dịch sau tăng sinh cho vào ống eppendorf 1,5 - 2,0ml. - Ly tâm 800vòng/phút, chuyển dịch trên qua một ống eppendorf khác. - Ly tâm 5000vòng/5phút, bỏ dịch nổi, lấy cặn. - Thêm 1ml nước cất vô trùng vào ống eppendorf, vortex để huyền phù cặn. - Ly tâm 5000vòng/5phút, bỏ dịch nổi, lấy cặn. - Thêm 300l TE, vortex. - Đun ở 100oC/5phút (chú ý mở hờ nắp đậy trong khi đun). - Ly tâm 12.000 vòng/5 phút thu dịch nổi là DNA bản mẫu. - Bảo quản dịch DNA ở nhiệt độ 4oC. c. Bước 3: Thực hiện phản ứng PCR - Hút 21l PCR mix bao gồm các thành phần: PCR buffer (500mM KCl, 100mM Tris-HCl), MgCl2, dNTP, mồi, khuôn DNA. - Cho thêm 3l DNA bản mẫu vừa xử lý nhiệt vào ống PCR. - Bổ sung 1l Taq DNA polymerase vào ống. Tổng thể tích phản ứng PCR là 25l. - Ly tâm nhẹ kéo dung dịch xuống đáy ống và cho vào máy PCR. Hình 2.4. Đưa mẫu vào máy PCR d. Bước 4: Thực hiện chương trình PCR như sau: Biến tính 94oC / 5 phút 35 chu kỳ 94oC / 30 giây 55oC / 40 giây 72oC / 45 giây Giai đoạn kéo dài: 72oC / 5 phút Giai đoạn cuối: 10oC/ 5 phút Sau khi thực hiện xong phản ứng PCR, sản phẩm PCR bảo quản trong tủ mát 4oC cho đến khi chạy điện di. e. Bước 5: Điện di và đọc kết quả - Trộn đều 8l sản phẩm PCR và 2l dung dịch nạp mẫu, sau đó hút 10l sản phẩm PCR này vào giếng gel, điện di trong gel agarose 1,5%, trong đệm TAE 1X với thời gian từ 30 - 45 phút, ở điện thế 100V. - Nhuộm gel bằng Ethidium bromide 1mg/ml trong 10 - 15 phút. - Xem kết quả dưới đèn UV ở bước sóng 312nm. Tìm vạch sản phẩm PCR với các kích thước khuếch đại đặc trưng theo từng vi sinh vật như trình bày ở Bảng 2. 4. Bảng 2.4. Kích thước vạch khuếch đại của các vi khuẩn nghiên cứu STT Vi khuẩn Kích thước sản phẩm PCR (bp) 1 E. coli 299 2 Staphylococcus aureus 276 3 Bacillus cereus 365 4 Clostridium perfringens 283 5 Salmonella 520 Nếu có vạch sản phẩm PCR này thì kết luận mẫu không đạt theo chỉ tiêu đang phân tích. Trình tự mồi sử dụng trong phản ứng PCR được trình bày ở Bảng 2.5. Bảng 2.5. Trình tự các mồi được sử dụng trong phản ứng PCR STT Vi khuẩn Trình tự mồi từ 5’ - 3’ 1 E. coli EC1: CTTCACCCGGTTGCCAGAGG Ec2: GGTGATTACCGACGAAAACGG 2 Staphylococcus aureus SA1: GCGATTGATGGTGATACGGTT SA2: AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC 3 Bacillus cereus BC1: ATTGGTGACACCGATCAAACA BC2: GAATAACATCCATACGTATGA 4 Clostridium perfringens Pl3: AAGTTACCTTTGCTGCATAATCCC Pl7: ATAGATACTCCATATCATCCTGCT 5 Salmonella invA1: TTGTTACGGCTATTTTGACCA invA2: CTGACTGCTACCTTGCTGATG * Quy trình phân tích mẫu bằng phương pháp truyền thống a. Kiểm Salmonella (Theo TCVN 4829:2001) Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml BPW ủ 37oC 18 - 22 giờ Hút 0,2ml dịch tiền tăng sinh sang môi trường RV ủ 42oC 24 giờ Ria cấy trên môi trường XLD ủ 37oC 24 giờ. Chọn khuẩn lạc điển hình: trong suốt, có tâm đen Thử sinh hóa Thử kháng huyết thanh Đọc kết quả - Thử tính chất sinh hóa của vi khuẩn Salmonella, bao gồm các thử nghiệm sau: KIA/TSI (+); Urease (-); Indol (-); MR-VP (-) và LDC (+). - Kết quả khẳng định có sự hiện diện của Salmonella khi hội đủ tất cả các điều kiện thử nghiệm sinh hóa trên. b. Kiểm E. coli (TCVN 5155:90) Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml TSB Pha loãng 3 lần Dịch đồng nhất Hút 0,2ml dung dịch mẫu cấy láng trên EMB ủ 44oC 24giờ Đếm và chọn khuẩn lạc điển hình: màu tím thẩm, có hoặc không có ánh kim Thử tính chất sinh hóa bằng phản ứng IMViC (+/ +/ -/ -) Đọc kết quả - Thử tính chất sinh hóa của E. coli bao gồm các thử nghiệm sau: IMViC: Indol (+); MR (+); VP (-) và Citrate (-). - Kết quả khẳng định sự hiện diện của E. coli khi cho kết quả thử nghiệm sinh hóa IMViC là: +/ +/ -/- c. Kiểm S. aureus (TCVN 5156:1990) Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml đệm pepton Dịch đồng nhất Pha loãng mẫu 10 lần Hút 0,2ml dung dịch mẫu cấy láng trên môi trường Baird Paker ủ 37oC 24giờ Chọn khuẩn lạc điển hình: có bờ đều, lồi, màu vàng nhạt đến vàng sậm Thử tính chất sinh hóa Đọc kết quả - Thử tính chất sinh hóa của S. aureus bao gồm các thử nghiệm sau: Phản ứng đông huyết tương (+) và Catalase (+). Nhuộm Gram bắt màu gram (+), hình chùm nho. - Kết quả khẳng định sự hiện diện của vi khuẩn này khi hội đủ tất cả các điều kiện như trên. d. Kiểm B. cereus (AOAC 2000 - 980.30) Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml đệm pepton Hút 0,2ml dung dịch mẫu trải trên môi trường MYP ủ 44oC 24 giờ Chọn khuẩn lạc điển hình: bờ răng cưa, màu hồng, xung quanh có vòng đục Thử nghiệm sinh hóa Đọc kết quả - Thử tính chất sinh hóa của B. cereus bao gồm các thử nghiệm sau: Phản ứng Glucose kị khí (+), VP (+), Lysozym (+), Tyrosin (+), di động (+). - Khẳng định sự hiện diện của vi khuẩn này khi có phản ứng đúng với những thử nghiệm sinh hóa trên. e. Kiểm C. perfringens (QĐ 3348/QĐ-BYT) Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml đệm pepton Dịch đồng nhất Pha loãng mẫu 10 lần Hút 0,2ml dung dịch mẫu cấy sâu ống môi trường TSN ủ 37oC 24 giờ Chọn khuẩn lạc điển hình: hình tròn (bầu dục), màu đen Thử nghiệm sinh hóa Đọc kết quả - Thử tính chất sinh hóa của C. perfringens bao gồm các thử nghiệm sau: phản ứng Nitrit (+), Iron-milk (+), Lactose (+), Gelatin (+), hơi (+). - Khi kết quả phản ứng đúng với những thử nghiệm sinh hóa thì kết luận có sự hiện diện của C. pefringens trong mẫu. * Các quy trình thử nghiệm sinh hóa sử dụng trong phương pháp nuôi cấy được tóm tắt như sau: Sau khi nuôi cấy phân lập các vi khuẩn, chọn những khuẩn lạc điển hình đem thử nghiệm sinh hóa hoặc nuôi cấy chọn lọc trên môi trường thích hợp cho từng chủng, hút dịch nuôi cấy để tiến hành các thử nghiệm sinh hóa + Thử nghiệm KIA/TSI: (Salmonella) - Chọn khuẩn lạc trong suốt, có hoặc không có tâm đen cấy sâu và ria trên bờ mặt ống nghiệm thạch nghiên chứa môi trường KIA. Ủ ở 37oC trong 18 - 24 giờ - Xem kết quả: kết tủa nâu trong môi trường  (+), không có hiện tượng kết tủa  (-) + Thử nghiệm urease (Salmonella) - Chọn khuẩn lạc điển hình cấy vào ống nghiệm chứa 3ml môi trường RSUB, lắc nhẹ, ủ ở 37oC trong 48 giờ. - Xem kết quả: chuyển từ màu vàng cam sang đỏ tím  (+) + Thử nghiệm Indol (Salmonella và E. coli) - Cho 1ml mẫu (sau khi nuôi cấy) vào 10ml môi trường trypton water, ủ 37oC trong 24 giờ, bổ sung 1ml xylen, lắc  nhỏ 5 giọt thuốc thử kovac’c. Để yên theo dõi sự tạo màu. - Đọc kết quả: chuyển từ màu vàng sang màu đỏ  (+) + Thử nghiệm MR-VP (Salmonella, B. cereus và E. Coli) - Cho 1ml mẫu vào ống nghiệm chứa 10ml môi trường MR-VP, bổ sung 0,1ml methyl đỏ, lắc. - Đọc kết quả: có sự chuyển màu từ vàng/ cam sang màu đỏ  (+) + Thử nghiệm LDC (Salmonella) - Cho 1ml mẫu vào ống nghiệm chứa 5ml môi truừơng LDC, bổ sung 2 - 3 ml dầu khoáng, ủ 37oC trong 24 – 48 giờ - Đọc kết quả: môi trường đục, có màu tím  (+), môi trường trong, màu vàng  (-). + Thử nghiệm Citrate (E. coli) - Cấy 1ml mẫu vào ống thạch nghiên chứa môi trường Simon citrare agar, ủ ở 37oC trong 24 - 48 giờ. - Đọc kết quả: có sự chuyển màu của môi trường từ xanh lục sang xanh dương  (+) + Thử nghiệm nitrare (B. cereus, C. perfringens ) - Cấy 1ml mẫu vào ống nghiệm chứa môi trường Nitrate Broth lỏng, ủ 37oC, trong 24 giờ. Acid hóa môi trường bằng HCl 1N, bổ sung 0,5ml dung dịch sulphanilamide và N-napthylenediamine hydrochlo- -ride. - Đọc kết quả: kết luận (+) khi môi trường xuất hiện màu hồng + Thử nghiệm tính di động (B. cereus và C. perfringens) - Dùng que cấy khuẩn lạc chủng cần thử nghiệm vào ống nghiệm chứa môi trường thạch mềm chứa 0,5% agar/KIA, ủ ở 37oC trong 18 -24 giờ. - Đọc kết quả: thử nghiệm (+) khi vi sinh vật mọc lan khỏi đường cấy và làm đục môi trường xung quanh + Thử nghiệm gelatin (C. perfringens) - Cấy 2ml mẫu vào ống nghiệm chứa môi trường dinh dưỡng chứa gelatin nutrient, ủ ở 37oC trong 3 - 14 ngày. - Thử nghiệm (+) khi môi trường bị tan chảy + Thử nghiệm khả năng lên men Glucose (B. cereus) - Cấy 1ml mẫu vào ống nghiệm chứa môi trường phenol Red Glucose Broth, ủ ở 37oC trong 18 - 24 giờ trong điều kiện kỵ khí - Thử nghiệm (+) khi môi trường chuyển từ màu đỏ  màu vàng 2.2.3.5. Xử lý kết quả: Phương pháp nuôi cấy Phương pháp PCR Số kết quả dương tính Số kết quả âm tính Số kết quả dương tính PA PD Số kết quả âm tính ND NA Độ chính xác tương đối (AC%) ND PD NA PA 100)NA(PA   X Độ khác biệt giữa hai phương pháp ( 2 )   PDND PDND   21 Kết quả thu nhận được từ hai phương pháp sẽ được thống kê như sau: PA (positive agreement): tổng số mẫu dương tính (PCR (+) và nuôi cấy (+)) NA (negative agreement): tổng số mẫu âm tính (PCR (-) và nuôi cấy (-)) PD (positive deviation): độ lệch dương (PCR (+), nuôi cấy (-)) ND (negative deviation): độ lệch âm (PCR (-), nuôi cấy (+)) Phương pháp PCR được xem là tương đương với phương pháp nuôi cấy khi không có sự khác biệt về kết quả giữa hai phương pháp ( 2 < 3,84). Theo tiêu chuẩn “AOAC international methods committee guidelines for validation for qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis” [74]. Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Kết quả khảo sát tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm trong nhóm thực phẩm đường phố trên địa bàn TP. HCM Trong quá trình kiểm nghiệm mẫu bằng phương pháp nuôi cấy, để kết luận mẫu dương tính hay âm tính, mẫu sau khi tăng sinh và phân lập sẽ được tiến hành các thử nghiệm sinh hóa đặc trưng cho từng vi khuẩn. Kết quả nuôi cấy và khẳng định sinh hóa của các chủng vi sinh vật nghiên cứu được thể hiện ở Hình 3.1, Hình 3.2, Hình 3.3, Hình 3.4, Hình 3.5, Hình 3.6, Hình 3.7, Hình 3.8, Hình 3.9 và Hình 3.10. Hình 3.1. Khuẩn lạc Salmonella LDC (+) KIA (+) VP (-) Indole (-) Urê (-) (1): Đối chứng (2): Thử nghiệm Hình 3.2. Thử nghiệm sinh hóa khẳng định Salmonella 1 2 1 2 2 1 2 1 2 1 2 1 Hình 3.3. Khuẩn lạc E. coli Methyl red (+) Indol (+) VP (-) Citrate (-) (1): Đối chứng (2): Thử nghiệm Hình 3.4. Thử nghiệm sinh hóa khẳng định E. coli Hình 3.5. Khuẩn lạc S. aureus Hình 3.6. Thử nghiệm sinh hóa khẳng định S. aureus Hình 3.7. Khuẩn lạc B. cereus 2 1 2 2 1 1 2 1 1 2 1 2 2 2 1 Di động (+) Nitrate (+) VP (+) Lên men (kỵ khí) (1): Đối chứng Glucose (2): Thử nghiệm Hình 3.8. Thử nghiệm sinh hóa khẳng định B. cereus Đông tụ sữa (+) Di động (-) Nitrate (+) Gelatin (+) (1): Đối chứng (2): Thử nghiệm Hình 3.9. Thử nghiệm sinh hóa khẳng định C. perfringens Hình 3.10. Khuẩn lạc C. perfringens Để phân tích các chỉ tiêu vi sinh bằng kỹ thuật PCR, mỗi bộ kit PCR cho từng chủng đều sử dụng những cặp mồi đặc hiệu cho từng vi sinh vật và cho ra tín hiệu 1 2 2 1 1 2 2 1 1 1 2 2 1 2 1 2 khuếch đại với những kích thước nhất định cho mỗi chủng. Kết quả được xem dưới đèn UV tương ứng với những vạch khuếch đại đặc hiệu của từng vi sinh vật. Dựa trên những tín hiệu khuếch đại này mà xác định được sự có mặt hay không của các chỉ tiêu E. coli, Salmonella, B. cereus, S. aureus và C. perfringens trong mẫu phân tích. Kết quả phân tích các chỉ tiêu vi sinh hiện diện trong các mẫu thực phẩm đường phố được phân tích (sữa, kem và nước giải khát) bao gồm các vi khuẩn: E. coli, Salmonella, B. cereus, S. aureus và C. perfringens bằng phương pháp PCR. Kết quả của phản ứng PCR đối với các chủng trên được thể hiện ở Hình 3.11. Hình 3.11. Kết quả phát hiện E. coli, Salmonella, B. cereus, S. aureus và C. perfringens bằng kỹ thuật PCR Giếng 1: thang 100bp Giếng 2: vạch khuếch đại PCR của C. perfringens Giếng 3: vạch khuếch đại PCR của E. coli Giếng 4: vạch khuếch đại PCR của Salmonella Giếng 5: vạch khuếch đại PCR của S. aureus Giếng 6: vạch khuếch đại PCR của B. cereus Giếng 7: kết quả mẫu PCR âm tính 3.1.1. Kết quả phân tích mẫu sữa 3.1.1.1. Kết quả phân tích nhóm mẫu sữa bằng hai phương pháp được thống kê ở phần phụ lục. 3.1.1.2. Nhận xét về tình hình vệ sinh thực phẩm trên nhóm sữa 600bp 500bp 300bp 520bp 365bp 283bp 276bp 299bp 1 2 3 4 5 6 Trong 21 mẫu sữa kiểm tra bao gồm các loại: sữa đậu xanh, sữa chua, sữa đậu nành, sữa đậu phộng, được phân tích theo phương pháp PCR và nuôi cấy. Kết quả được ghi nhận theo Bảng 3.1 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát tình hình nhiễm vi sinh vật trên nhóm sữa tại TP. HCM theo phương pháp PCR và nuôi cấy Salmonella E. coli S. aureus B. cereus Chỉ tiêu thống kê PCR NC PCR NC PCR NC PCR NC Mẫu không đạt (N = 21) 0 0 1 10 7 6 9 8 Tỉ lệ mẫu không đạt (%) 0 0 47,62 47,62 33,33 28,57 42,86 38,1 NC: phương pháp nuôi cấy; PCR: phương pháp PCR Kết quả khảo sát tình hình nhiễm vi sinh vật trong nhóm sữa trên địa bàn TP. HCM bằng cả hai phương pháp được thể hiện trên Biểu đồ 3.1. 0 0 47.6247.62 33.33 28.57 42.86 38.1 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Salmonella E. coli S. aureus B. cereus PCR NC Biểu đồ 3.1. Tình hình nhiễm vi sinh vật trong nhóm sữa trên địa bàn TPHCM Trong quá trình khảo sát lấy mẫu thực tế ở hầu hết các điểm bán sữa (sữa tươi, sữa chua, sữa đậu xanh, sữa đậu nành) cho thấy tình trạng vệ sinh an toàn thực phẩm đều không được đảm bảo: - Sản phẩm sữa chứa trong những chai nhựa hoặc thủy tinh mà nắp đậy chỉ là một mảnh nilong nhỏ được buộc bởi một sợi thun, hay cho vào những can nhựa lớn mà nắp đậy chỉ là một mảnh nhựa, đôi khi chỉ là một mảnh giấy carton, nên các vi khuẩn gây bệnh dễ nhiễm vào sản phẩm; khi bán hết những chai nhựa hoặc thủy tinh nhỏ thì sản phẩm được lấy ra từ thùng nhựa lớn mà không cần vệ sinh dụng cụ, do vậy các vi sinh vật gây bệnh có thể nhiễm từ tay người sang dụng cụ và sang người tiếp theo; chưa kể đến tình trạng sản phẩm không đảm bảo chất lượng do còn thừa lại từ hôm trước mà vẫn được đem bán, với dụng cụ không đảm bảo vệ sinh cùng sự biến đổi chất lượng sữa là điều kiện thuận lợi cho sự nhiễm và phát triển của các vi sinh vật gây bệnh. - Mặt khác trong khi tìm hiểu thực tế cũng cho thấy, một số nơi đã dùng nước máy để làm sữa chua, sữa tươi (pha từ sữa đặc có đường đóng hộp) khuấy bằng tay, có thể làm S. aureus từ tay người nhiễm sang sản phẩm, vi khuẩn này có nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển rất cao: từ 5 - 50oC, tối ưu ở 28 - 40oC, bào tử của chúng có thể chịu được nhiệt độ trên 100oC và khả năng chịu nhiệt của S. aureus được gia tăng trong các thực phẩm có dầu và hàm lượng chất béo cao như sữa, nên khi đun tiệt trùng có thể chưa tiêu diệt hết. Chính vì vậy, các mẫu sữa rất dễ bị nhiễm loại vi khuẩn này. Trong thời gian lên men, sản phẩm được chứa trong một thau hoặc thùng nhựa không được vệ sinh sạch và không có nắp đậy, để dưới sàn bằng xi măng đã lâu ngày ẩm thấp, đây là điều kiện thuận lợi cho sự nhiễm của các loại vi sinh vật gây bệnh. - Hơn nữa, tại các tủ lạnh đựng các sản phẩm sữa còn chứa thêm các loại thực phẩm tươi sống như: rau, cá tươi, thịt tươi, hoặc các loại thực phẩm khác nhằm tận dụng không gian chứa và tiết kiệm chi phí. Như vậy dễ làm cho các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm tươi sống nhiễm sang các mẫu sữa. Vì vậy, kết quả khảo sát trên các mẫu sữa tại một số quận trên địa bàn TP. HCM đã cho kết quả như sau: * Kết quả kiểm tra theo phương pháp nuôi cấy - Phân tích 21 mẫu sữa: số mẫu không đạt tiêu chuẩn vệ sinh là: 10 mẫu (E. coli), 6 mẫu (S. aureus), 8 mẫu (B. cereus), số mẫu không đạt chung là 11 mẫu chiếm tỷ lệ 52,4% và nhiễm chủ yếu là E. coli (47,62%). * Kết quả kiểm tra theo phương pháp PCR - Phân tích 21 mẫu sữa: số mẫu không đạt tiêu chuẩn là: 10 mẫu (E. coli), 7 mẫu (S. aureus), 9 mẫu (B. cereus), số mẫu không đạt chung là 11 mẫu chiếm tỉ lệ 52,4% và chủ yếu cũng do nhiễm E. coli (47,62%). Như vậy, mẫu sữa không đạt tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm do nhiễm E. coli là chủ yếu chiếm 47,62% (cả phương pháp PCR và nuôi cấy), tiếp theo là do nhiễm B. cereus (42,86%: PCR và 38,1%: nuôi cấy) và sau đó là do nhiễm S. aureus (33,33%: PCR và 28,57%: nuôi cấy). Đây cũng là nguyên nhân của các vụ ngộ độc thực phẩm tại các trường học trên địa bàn TP. HCM, chẳng hạn vụ ngộ độc thực phẩm vào ngày 16/01/2006 tại 3 trường tiểu học Chu Văn An, Thanh Đa và Tầm Vu quận Bình Thạnh, với 238 học sinh bị ngộ độc. Nguyên nhân được xác định là do nhiễm E. coli và S. aureus trong sữa chua được cung cấp bởi cơ sở bánh Vinh Khoa (P. An Bình, Q.2). 3.1.1.3. Nhận xét về tính tương đồng kết quả phân tích của 2 phương pháp PCR và nuôi cấy trong mẫu sữa Trong 21 mẫu sữa được kiểm tra theo phương pháp PCR và phương pháp nuôi cấy, bao gồm các loại: sữa đậu xanh, sữa chua, sữa đậu nành và sữa đậu phộng. Tính tương đồng về kết quả của phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy được thống kê, phân tích và tổng hợp ở Bảng 3.2. Bảng 3.2. Thống kê kết quả kiểm tra trên mẫu sữa tại TP. HCM bằng phương pháp PCR và nuôi cấy Salmonella E. coli S. aureus B. cereus Chỉ tiêu thống kê PCR(+) PCR(-) PCR(+) PCR(-) PCR(+) PCR(-) PCR(+) PCR(-) NC (+) 0 0 9 1 5 1 8 0 NC (-) 0 21 1 10 2 13 1 12 Độ chính xác tương đối (AC%) 100% 90,48% 85,71% 95,24% Độ khác biệt giữa hai phương pháp ( 2 ) 0 0,5 1,33 0 NC: phương pháp nuôi cấy; PCR: phương pháp PCR Kết quả phân tích 21 mẫu sữa cho thấy tính tương đồng của phương pháp PCR và nuôi cấy như sau: a. Đối với chỉ tiêu Salmonella Kết quả giữa phương pháp PCR và phương pháp truyền thống hoàn toàn khớp nhau. Tỉ lệ tương đồng giữa hai phương pháp đạt 100%. Không có sự khác biệt giữa hai phương pháp. Chứng tỏ độ tin cậy của phương pháp PCR và nuôi cấy là như nhau . b. Đối với chỉ tiêu E. coli + Kết quả tương đồng (+) của cả hai phương pháp: 9/21 mẫu, chiếm tỉ lệ 42,86% + Kết quả tương đồng (-): 10/21 mẫu, chiếm tỉ lệ 47,62% + Kết quả PCR (+) và NC (-): 1/21 mẫu, chiếm tỉ lệ 4,76% + Kết quả PCR (-) và NC (+): 1/21 mẫu, chiếm tỉ lệ 4,76% Như vậy, bộ kit E. coli cho kết quả tương đồng giữa hai phương pháp PCR và NC là 90,48%, kết quả không tương đồng giữa PCR và NC là 9,52%. Độ khác biệt giữa hai phương pháp là 0,5 nhỏ hơn 3,84. Chứng tỏ không có sự khác biệt về kết quả giữa hai phương pháp PCR và nuôi cấy. c. Đối với chỉ tiêu S. aureus + Kết quả tương đồng (+) của cả hai phương pháp: 5/21 mẫu, chiếm tỉ lệ 23,81% + Kết quả tương đồng (-): 13/21 mẫu, chiếm tỉ lệ 61,9% + Kết quả PCR (+) và NC (-): 2/21 mẫu, chiếm tỉ lệ 9,52% + Kết quả PCR (-) và NC (+): 1/21 mẫu, chiếm tỉ lệ 4,76% Bộ kit S. aureus cho kết quả tương đồng giữa hai phương pháp PCR và NC là 85,71%, kết quả không tương đồng PCR (+), nuôi cấy (-) là 14,29%. Nguyên nhân là do số trường hợp PCR cho kết quả dương tính nhiều hơn so với nuôi cấy. Kết quả này có thể giải thích là do độ nhạy của phương pháp PCR cao hơn so với phương pháp nuôi cấy. Tuy nhiên, độ khác biệt giữa hai phương pháp là 1,33 vẫn nhỏ hơn 3,84. Điều này khẳng định độ tin cậy về kết quả giữa hai phương pháp PCR và nuôi cấy là tương đương nhau. d. Đối với chỉ tiêu B. cereus + Kết quả tương đồng (+) củ