Luận văn Tuyển chọn và khảo sát khả năng sinh amylase của một số chủng nấm sợi từ rừng ngập mặn Cần Giờ thành phố Hồ Chí Minh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SỰ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ------------------------ Nguyễn Thị Lan Hương TUYỂN CHỌN VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH AMYLASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ TP. HỒ CHÍ MINH CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT Mã số: 604240 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS.TRẦN THANH THỦY Tp.Hồ Chí Minh - 2009 Trang 1 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Trần Thanh Thủy đã dìu dắt giúp đỡ tôi từ khi thực hiện luận văn tốt nghiệp đến khi thực hiện luận văn thạc sĩ sinh học. Cô luôn có mặt bên cạnh, giúp đỡ những khi em gặp khó khăn trong suốt quá trình nghiên cứu, thực hiện luận văn này. Tôi cũng xin ghi nhớ công ơn PGS.TS. Lương Đức Phẩm đã luôn tận tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Tôi cũng gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa, trường Đại học Sư phạm đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành công viêc nghiên cứu thực hiện luận văn này. Xin chân thành cảm ơn các bạn học viên Cao học khóa 17 và 18 ngành Vi sinh vật học, trường Đại học Sư phạm TpHCM đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu thực hiện luận văn. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. TpHCM, tháng 8 năm 2009. NGUYỄN THỊ LAN HƯƠNG Trang 2 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan những số liệu trong luận văn này là trung thực thể hiện qua kết quả thí nghiệm và chưa ai công bố. Tác giả luận văn Nguyễn Thị Lan Hương MỞ ĐẦU RNM Cần giờ là một quần thể TV đa dạng sinh học. Chiến tranh, bom đạn và các loại chất độc hóa học đã hủy hoại gần như hoàn toàn khu rừng này. Từ năm 1978 đến nay, Thành ủy và UBND Tp.HCM đã phục hồi thành công HST RNM đa dạng độc đáo này. Đồng thời, cũng từ đó tạo nên một địa điểm lý tưởng phục vụ cho nghiên cứu khoa học và du lịch sinh thái. Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ là nơi lưu giữ nhiều nguồn gen SV quý hiếm, bền vững và có khả năng chịu đựng được điều kiện khắc nghiệt của MT sống. Trong đó, ĐV và TV đã được nghiên cứu và thống kê rất chi tiết. Riêng hệ VSV phong phú của RNM Cần Giờ vẫn còn nhiều bí ẩn và chưa được khai thác đúng mức. Trong số các VSV tại đây thì NS chiếm số lượng rất lớn, giữ vai trò quan trọng trong tuần hoàn vật chất và năng lượng nhờ có hệ enzym phong phú như cellulase, protease, amylase,… Nổi bật nhất cũng như được ứng dụng nhiều nhất trong hệ enzym thủy phân của NS là amylase. Loại enzym phân giải tinh bột này mang lại vị ngọt cho thiên nhiên và con người đã được nghiên cứu từ rất lâu, đến nay các nhà khoa học đã biết khá rõ về nó. Hiện nay amylase là một trong những hệ enzym quan trọng nhất của ngành công nghệ sinh học vì chúng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, công nghiệp lên men, công nghiệp dệt,..Tiếp tực tìm hiểu, khám phá những bí ẩn về cấu trúc và đặc tính của amylase để nâng cao hiệu suất xúc tác của chúng là đề tài hấp dẫn đối với nhiều nhà nghiên cứu. Tuy vậy, nước ta chưa lưu ý nhiều đến lĩnh vực nghiên cứu và sản xuất các chế phẩm amylase từ VSV cũng như NS. Việc sản xuất amylase từ NS có rất nhiều ưu việt như rút ngắn quá trình sản xuất, tận dụng được các nguồn nguyên liệu, phế phẩm nông nghiệp góp phần giảm ô nhiễm MT, enzym có hoạt tính cao và giảm giá thành sản phẩm.... so với các enzym có nguồn gốc từ TV và ĐV. Đặc biệt nếu thu được các chủng NS có khả năng sinh amylase cao và sinh trưởng trong những điều kiện khắc nghiệt như RNM Cần Giờ sẽ rất có ích vì bổ sung thêm được những chủng NS có đặc tính quý, đầy tiềm năng và ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi. Mặc dù vậy, việc nghiên cứu NS sinh amylase từ RNM hiện vẫn chưa được khai thác đúng mức. Trước thực tế này, nhằm đa dạng hóa nguồn thu nhận amylase từ NS, cũng như mong muốn thu nhận được nguồn amylase mang đặc tính quý, chúng tôi tiến hành đề tài “Tuyển chọn và khảo sát khả năng sinh amylase của một số chủng NS từ RNM Cần Giờ Tp.HCM”. Mục đích của đề tài. Tuyển chọn được các chủng NS sinh amylase cao từ RNM Cần Giờ. Nhiệm vụ của đề tài. - Phân lập các chủng NS thu nhận được từ RNM Cần Giờ. - Tuyển chọn một số chủng NS có khả năng sinh amylase cao. - Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và phân loại đến loài các NS đã tuyển chọn. - Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng, tổng hợp amylase của các chủng NS đã chọn. - Nghiên cứu một số tính chất của enzym thu được. - Khảo sát các đặc tính sinh học khác. - Thu nhận amylase bán tinh khiết và so sánh với enzym thương mại trên thị trường. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu - Các chủng NS phân lập từ 5 xã: Long Hòa, Lý Nhơn, An Thới Đông, Tam Thôn Hiệp và Bình Khánh ở RNM Cần Giờ, Tp.HCM. - Đề tài được tiến hành nghiên cứu tại PTN Vi sinh – Sinh hóa, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm Tp.HCM trong thời gian từ tháng 9 năm 2008 đến tháng 5 năm 2009. Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vài nét khái quát về RNM Cần Giờ . RNM (Mangrove) là thuật ngữ dùng để chỉ các loài TV hoặc một khu rừng có nhiều loài sống ở vùng giao thoa giữa đất liền và biển. Chúng có thể mọc tốt ở những vùng khí hậu nóng ẩm [4]. Theo GS. Phan Nguyên Hồng (1995), diện tích RNM trên thế giới khoảng 16.670.000 ha, và khu vực Châu Á chiếm diện tích lớn nhất trong đó. Theo số liệu Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn cho thấy, năm 1943 diện tích RNM Việt Nam trên 400.000 ha, đến năm 1996 giảm còn 290.000 ha và 279.000 vào năm 2006. Với diện tích này thì RNM Việt Nam cũng chiếm một phần khá lớn trong khu vực. RNM nguyên sinh tự nhiên hiện nay hầu như không còn. Đa số RNM hiện nay là rừng trồng (62%) còn lại là rừng thứ sinh nghèo hoặc rừng mới tái sinh trên bãi bồi. HST RNM phân bố dọc bờ biển Việt Nam thuộc 28 tỉnh và thành phố, tập trung chủ yếu ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, bán đảo Cà Mau và hai tỉnh phía Bắc là Nam Định và Thái Bình. Các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long có diện tích RNM chưa đến 100.000 ha. Riêng RNM Cần Giờ hay rừng Sác, sau những nỗ lực khôi phục thành công, hiện nay có diện tích rừng và đất rừng là 38.664 ha [74]. Với diện tích đạt được như trên, cùng với độ đa dạng sinh học bậc nhất trong các RNM ở Đông - Nam Á , RNM Cần Giờ đã được Tổ chức Văn hóa, Khoa học và Giáo dục LHQ (UNESCO) công nhận là Khu dự trữ sinh quyển của thế giới từ tháng 1-2000. Đây cũng là Khu dự trữ sinh quyển RNM đầu tiên của nước ta và cũng được xem lá “lá phổi” rất quan trọng của Tp.HCM [69]. Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ được hình thành ở hạ lưu sông Đồng Nai – Sài Gòn nằm ở cửa ngõ Đông Nam Tp.HCM: Về tọa độ địa lý: vĩ độ Bắc 10o22’ – 100o40’09”, kinh độ Đông 106046’ – 107°00’59”. Về ranh giới, phía Bắc Cần Giờ giáp tỉnh Đồng Nai, phía Nam giáp biển Đông, phía Tây giáp tỉnh Tiền Giang và Long An, phía Đông giáp tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu. Chiều dài khu vực từ Bắc xuống Nam là 35km, từ Đông sang Tây là 30km. Tổng diện tích Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ là 75.740 ha, trong đó: vùng lõi 4.721 ha, vùng đệm 41.139 ha, và vùng chuyển tiếp 29.880 ha [5]. RNM Cần Giờ phát triển trên nền một đầm mặn mới, do phù sa sông mang đến và lắng đọng tạo thành nền đất. Đất được tạo ra bởi tổng hợp các quá trình lắng tụ trầm tích đất sét, phèn hóa và nhiễm mặn. Cho đến nay các lớp đất sâu chưa kết chặt nên không có khả năng tạo thành đất nền rắn chắc, có hàm lượng lưu huỳnh dạng khử khá cao và một lượng muối cao không có lợi cho nông nghiệp [21]. Khí hậu nóng ẩm và chịu chi phối của quy luật gió mùa cận xích đạo với mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 10, mùa khô từ tháng 1 đến tháng 4. Lượng mưa trung bình từ 1300 đến 1400mm hàng năm. Độ ẩm cao hơn các nơi khác trong khu vực Tp.HCM: mùa mưa là 79 – 83%, mùa khô là 74 – 77%. Nhiệt độ trung bình là 25,8oC, biên độ dao động nhiệt trong ngày từ 5 đến 7oC. Chế độ bán nhật triều không đều. Độ mặn dao động 1,8 – 3% [5]. RNM Cần Giờ có trên 150 loài TV, các loài chủ yếu như bần trắng, mấm trắng, các quần hợp đước đôi - bần trắng cùng xu ổi, trang, đưng v.v… và các loại nước lợ như bần chua, các quần hợp mái dầm – ô rô, dừa lá, ráng, v.v… Thảm cỏ biển với các loài ưu thế Halophyla sp., Halodule sp., và Thalassia sp.; đất canh tác nông nghiệp được trồng lúa, khoai mỡ, các loại đậu, dừa v.v…; các vườn cây ăn trái. Thảm TV này là MT sống cho nhiều loài ĐV, theo thống kê năm 1999 như: trên 700 loài ĐV thuỷ sinh không xương sống, 9 loài lưõng thê, 31 loài bò sát, trên 137 loài cá, khoảng 130 loài chim và nhiều ĐV có xương sống có trong sách đỏ Việt Nam. Ngoài ra còn có 63 loài phiêu SV, 130 loài tảo [4]. Tuy chưa có nhiều số liệu thống kê về hệ NS RNM Cần Giờ, nhưng chúng ta có thể thấy các loài TV và ĐV trên chính là nguồn thức ăn tốt nhất cung cấp cho hệ NS RNM Cần Giờ. NS chính là một mắt xích quan trọng trong chuỗi thức ăn, là tác nhân phân giải các chất hữu cơ, cung cấp thức ăn cho các SV khác trong HST, là một nhân tố không thể thiếu tham gia khép kín chu trình sinh địa hóa của RNM Cần Giờ. HST này nằm ở lưu vực ven bờ có nhiều thành phần C phức tạp do thủy triều đưa vào. NS có khả năng sinh các loại amylase, protease, cellulase, chitinase,...phân hủy các chất hữu cơ đó để sử dụng và đồng thời góp phần làm giảm ô nhiễm MT ở RNM Cần Giờ. Đặc biệt nơi đây có nguồn tinh bột sẵn có trong lá cây, thân cây (nhất là lá mục và thân mục) sẽ là nguyên liệu cho amylase phân giải tạo glucose cho hoạt động sống của chúng. Hình 1.1. Bản đồ tổng quan về RNM Cần Giờ và vị trí 5 xã thu mẫu [65] Ký hiệu : vị trí thu mẫu. Do những đặc điểm trên, RNM Cần Giờ có vai trò là “lá phổi xanh” làm giảm ô nhiễm MT, giảm sự nóng lên của Trái đất và ngăn ngừa tình trạng dâng lên của nước biển. RNM Cần Giờ còn là “chiếc lọc sinh học” trong xử lý chất thải, xử lý chất dinh dưỡng từ đất liền và giữ vai trò vùng đệm chống lại các dòng chảy ô nhiễm đồng thời lọc thức ăn cho các ĐV biển; giúp bảo vệ các loài ĐV trên đất liền khi nước triều lên cao và sóng lớn; bảo vệ bờ biển và cửa sông tránh tình trạng tác hại và xói lở của bão, sóng đối với hệ thống đê biển, giảm chi phí tu bổ đê điều hàng năm; là nơi có lợi nhuận kinh tế cao, cung cấp nguồn hải sản phong phú để sử dụng trong nước và xuất khẩu cũng như các nguồn lợi khác từ rừng,....RNM chính là HST có năng suất sinh học cao nhất trong các HST, nơi hội tụ sự đa dạng của cả SV biển và đất liền. Vì thế, nó còn là PTN sống để nghiên cứu về khả năng chịu đựng và phục hồi của các tổ hợp gen, khả năng phát tán và định cư của các dạng sống [74]. 1.2. Sơ lược về NS. 1.2.1. Hình thái và cấu trúc NS. NS là VSV có nhân chuẩn, dị dưỡng. Sợi nấm có thể có vách ngăn như các lớp nấm bậc cao như Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes hay không có vách ngăn như các nấm bậc thấp Oomycetes và Zygomycetes. Các sợi nấm vừa phát triển theo chiều dài do tăng trưởng ở ngọn và phân nhánh tạo hệ sợi nấm còn gọi là khuẩn ty. Hệ sợi nấm phát triển thành các dạng KL khác nhau tùy theo cơ chất rắn, lỏng hay mềm. KL NS phát triển từ một bào tử có dạng tròn hay gần tròn. Bề mặt KL có thể mượt, nhung mịn, nhẵn bóng, dạng bột, dạng sợi, dạng hạt, dạng xốp, phẳng, có vết khía xuyên tâm, có rãnh hay lồi lõm không đều; mép KL có thể trơn hay răng cưa tùy vào từng loại nấm khác nhau [11, 13, 61, 78]. Phần lớn sợi nấm có dạng trong suốt, ở một số sợi nấm mang sắc tố tạo nên màu tối hay màu sặc sỡ. Sắc tố của một số nấm còn tiết ra ngoài MT và làm đổi màu khu vực có nấm phát triển. Một số nấm còn tiết ra các chất hữu cơ tạo nên các tinh thể trên bề mặt KL. Vì bào tử của nấm thường cũng có màu nên cả KL thường có màu. Hình thái, kích thước màu sắc, bề mặt của KL…có ý nghĩa nhất định trong việc định tên nấm [3, 61]. NS sinh sản chủ yếu bằng bào tử. Bào tử của NS có thể hình thành theo kiểu vô tính hay hữu tính. Bào tử vô tính gồm các dạng bào tử trần hay bào tử kín, trong đó bào tử trần là phổ biến nhất. Trong sinh sản hữu tính, NS có các hình thức đẳng giao, dị giao và tiếp hợp [11]. NS ngày càng được quan tâm nghiên cứu ngày càng sâu rộng hơn do chúng có khả năng sinh nhiều các chất có hoạt tính sinh học cao được ứng dụng rộng rãi đem lại nhiều nguồn lợi kinh tế cao như tạo ra các loại enzym, các chất KS, các axit hữu cơ, các chất có khả năng phân giải các nguồn cacbuahydro (ứng dụng trong xử lý ô nhiễm MT do tràn dầu),... Hình 1.2. Sự phát triển của sợi nấm [61] Hình 1.3. KL của chủng Penicillium [64] Hình 1.4. Một số dạng bào tử của NS [68, 70, 79]  Khả năng sinh các enzym ngoại bào. Enzym được sản xuất từ VSV ngày càng nhiều. VSV là nhóm đối tượng duy nhất được sử dụng như nguồn sản xuất enzym theo quy mô công nghiệp. So với ĐV và TV, việc thu nhận enzym từ VSV nói chung và NS nói riêng có rất nhiều ưu điểm như: tốc độ sinh sản nhanh, enzym thu được có hoạt tính rất cao, quá trình sinh trưởng phát triển và tổng hợp enzym của VSV hoàn toàn không phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài, nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzym theo quy mô công nghiệp rẻ tiền và dễ kiếm (đây là lợi thế rất quan trọng) và VSV có thể sinh tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzym khác nhau. Ngày nay, nhiều loại enzym ngoại bào của NS đã được nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng phổ biến như: amylase, protease, cellulase, pectinase, chitinase,....[9, 25].  Khả năng sinh các chất KS. KS là một trường hợp riêng biệt của tính đối kháng, là hiện tượng một VSV với sản phẩm trao đổi chất của mình có tác dụng kìm hãm hoặc ức chế sự phát triển của VSV khác. KS được tạo ra từ VSV đang rất được quan tâm và ngày càng phát triển mạnh mẽ trong thời đại hiện nay. Các chất KS có nguồn gốc từ NS chiếm tỉ lệ khá lớn, đa số thuộc lớp Nấm bất toàn. Các chất KS được sử dụng chủ yếu trong y tế hiện nay như Penicillin, Cephaco-sporin-C,...[11].  Khả năng sinh các axit hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng [19,73]. Ngày nay, nhu cầu sử dụng các axit hữu cơ ngày càng nhiều trong thực phẩm, công nghiệp. Một số axit hữu cơ phổ biến được sản xuất từ NS như: axít xitric từ Asp.niger; axít gluconic thu nhận từ Asp.niger và Asp. foetidus; axít lactic sản xuất từ Rhizopus oryzae (Mattey, 1992). Tại Nhật Bản, các nhà khoa học đã tổng hợp được chất kích thích sinh trưởng Giberelin từ hai chủng NS Furasium monoforme và Furasium oxysporum. Ngoài lên men sản xuất KS, enzym, các axit hữu cơ,..., Penicillium chrysogenum và Asp. niger còn tạo ra một lượng lớn sản phẩm phụ của sự lên men. Khuẩn ty của nấm không độc là một thành phần thức ăn lý tưởng bởi vì nó có hàm lượng đạm thô cao (xấp xỉ 12% trên trọng lượng tươi). Khuẩn ty được sử dụng như thành phần thức ăn gia súc. NS cũng được sử dụng làm giàu thêm đạm cho thức ăn gia súc,.... Tuy vậy, rất nhiều loài NS cũng gây ra những tác hại cho đời sống như mọc trên các nguyên vật liệu, đồ dùng, thực phẩm là hư hỏng hay giảm chất lượng sản phẩm. Một số NS cũng tiết ra độc tố gây ung thư (Asp.flavus sinh độc tố Aflatoxin gây ung thư gan), gây bệnh cho người, ĐV và TV,...[56, 72, 73, 74]. 1.2.2. Phân loại NS. Hiện nay chỉ mới định tên được khoảng 10.000 chi và 70.000 loài trong số khoảng 1 triệu đến 1,5 triệu loài nấm có trong tự nhiên. Riêng các loài nấm thuộc Nấm bất toàn ở nước ta hiện mới chỉ phát hiện được 338 loài thuộc 306 chi khác nhau (Bùi Xuân Đồng, 2004). Bảo tàng giống chuẩn VSV (VTCC) thuộc Trung tâm Công nghệ sinh học Đại học Quốc gia Hà Nội đang hợp tác với Viện NITE của Nhật Bản điều tra nghiên cứu khu hệ vi nấm ở Việt Nam và có nhiều khả năng tìm thấy những loài mới nữa. Về phân loại nấm, hiện nay tồn tại các hệ thống phân loại nấm không thống nhất với nhau, chủ yếu là các hệ thống phân loại theo Ainsworth và cộng sự (1973), V.Arx (1981), Ainsworth & Bisby (1983), Kendrich (1992), Ainsworth & Bisby (1995), Alexopoulos & Mins (1996). Trong luận văn này, chúng tôi phân loại nấm dựa vào các đặc điểm mô tả theo hệ thống phân loại của Ainsworth và cộng sự (1973), Bùi Xuân Đồng (1977, 1984, 2004), Đặng Hồng Miên, Nguyễn Lân Dũng (2006) [61]. Ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, để phân loại VSV nói chung, NS nói riêng, người ta thường dùng phương pháp nhân gen và giải trình tự gen (PCR – Plymerase Chain Reaction) để thu được kết quả nhanh và chính xác. Nguyên tắc của phương pháp PCR là khuếch đại một trình tự lên nhiều lần bằng một cặp mồi chuyên biệt. Phản ứng PCR là một chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước: - Bước 1 (biến tính): trong một dung dịch đầy đủ thành phần cho sự sao chép, DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tmax của phân tử, thường là 94 – 95oC trong vòng 30 giây đến 1 phút. - Bước 2 (lai): nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 – 70oC và kéo dài 30 giây đến 1 phút. - Bước 3 (tổng hợp): nhiệt độ được nâng lên đến 72oC để DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài ngắn của trình tự DNA, thường kéo dài khoảng 30 giây đến vài phút. Sau đó, người ta sẽ tiến hành giải trình tự các axit nucleic Các phương pháp nhằm xác định trình tự axit nucleic đều dựa vào 2 nguyên tắc. - Nguyên tắc hóa học (Phương pháp Maxam và Gilbert): dựa vào các phản ứng thủy giải hóa học đặc hiệu phân tử DNA tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước chênh nhau 1 nucleotid. - Nguyên tắc enzym học (phương pháp Sanger và phương pháp cải biên) : dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ DNA polymerase. Với việc tổng hợp thêm các deoxynucleotid cùng với các deoxynucleotid thông thường. Kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước chênh nhau 1 nucleotid. Ở cả 2 phương pháp, các phân đoạn DNA sẽ được phân tách qua điện di trên gel polyacrylamid. Nếu sử dụng đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ thì kết quả trình tự cần xác định sẽ được đọc trên bản phóng xạ ghi từ bản điện di [61]. 1.2.3. Tình hình nghiên cứu NS sinh amylase. Ở nước ta và trên thế giới đã có rất nhiều các công trình nghiên cứu về NS sinh amylase đặt nền móng cho việc sản xuất chế phẩm enzym này và là cơ sở để ứng dụng vào đời sống. Trên thế giới, trong thời gian gần đây có một số công trình nghiên cứu về amylase của NS khá nổi bật như: Từ năm 1990, Marianne Graber và Didier Combes đã có công trình nghiên cứu “Kiểu hoạt động của anpha-amylase từ chủng Asp.oryzae trong MT đậm đặc” [52]. Trong công trình nghiên cứu năm 1997, P.Woloshuk đã nghiên cứu về các chất gây cảm ứng sự sinh tổng hợp aflatoxin từ hạt ngô bị xâm nhập tạo ra bởi hoạt tính amylaza từ Asp. flavus [56]. Để tận dụng các phế phẩm nông nghiệp trong sản xuất men phân giải tinh bột, Akpan M.o.Bankole A.M.Adesemowo, đã sử dụng Asp.niger trong công trình nghiên cứu năm 1999 [50]. Năm 2001, nhà khoa học Nhật Bản B. N. Okolo đã tiến hành tinh sạch và xác định một số tính chất của amylaza phân giải tinh bột sống mới từ Asp.carbonarius vào năm 2001 [55]. Gần đây, tạp chí khoa học United States Patent Application có đăng công trình nghiên cứu “Nghiên cứu về alpha amylase ngoại bào của chi Aspergillus”, (2008) của Baldwin, Toby M,.. cho thấy sự liên quan giữa việc sinh alpha amylase và glucoamylase của chi nấm này. [42] Tại Việt Nam, vào năm 1974, D.V. Hợp nghiên cứu sản xuất chế phẩm glucoamylase từ Asp.niger và L.V Chứ, Đ.T.T Thu nghiên cứu với đối tượng Asp.awamorii năm 1977 [14]. Đến năm 1984, N.B.Ngà và N.L.Dũng nghiên cứu chọn lọc các chủng thuộc các loài Asp.awamorii, Asp.niger và Asp.oryzae có hoạt tính α – amylase và glucoamylase cao để thủy phân tinh bột sắn [14]. Năm 1977, cũng với đối tượng nghiên cứu Asp.niger, L.V.Nhương và cộng sự đã thành công khi thu nhận và sử dụng pectinase, amylase để xử lý dược liệu nguồn gốc TV [14]. Nghiên cứu về glucoamylase có công trình “Nghiên cứu chọn lọc được chủng Asp.niger TH3 – 19K của Nhật Bản có hoạt tính glucoamylase cao dùng để thủy phân tinh bột sống” của D.V.Hợp và cộng sự, năm 1993 [14]. Asp.niger BS cũng được Đặng Văn Lợi, Lê Văn Hoàng đưa vào nghiên cứu nhằm tối ưu hoá quá trình sinh tổng hợp enzim amylase và cellulase [23]. Năm 1998, Hoàng Kim Anh, Ngô Kế Sương, Nguyễn Thị Phương Thủy có công trình “Thu nhận amylase từ nấm mốc Asp. sp”. [2] Nổi bật nhất trong các nghiên cứu gần đây nhất là các nhà khoa học thuộc Viện Sinh học Nhiệt đới đã nghiên cứu và sản xuất thành công hai loại thức ăn kích thích tăng trưởng cho mọi vật nuôi (kể cả thuỷ sản) là sản phẩm lên men từ bã sắn và góp phần giải quyết ô nhiễm MT. Hai sản phẩm đó có tên gọi là ProBio-S và Bio-E (quá trình lên men tạo ra ba loại enzym là α – amylase, glucoamylase và cellulase) . Kết quả thử nghiệm sơ bộ trên 15-20 lợn con một tháng tuổi cho thấy sau ba tháng được ăn hai chế phẩm trên, lợn tăng trọng nhanh hơn 1,1-1,3kg so với những con đối chứng [14, 40]. 1.3. Tinh bột và hệ enzym amylase. 1.3.1. Tinh bột. Tinh bột gồm hai cấu tử là amylose (chiếm 20 – 30%) và amilopectin (chiếm khoảng 70 – 80%). Amylose có phân tử lượng thấp, phân bố phía bên trong hạt tinh bột, cấu trúc thẳng, các phân tử glucose liên kết với nhau bằng liên kết α-1,4-glucoside, dài khoảng 300 – 1000 gốc glucose xoắn theo kiểu lò xo, mỗi vòng xoắn có khoảng 6 gốc glucose. Nhờ cấu trúc xoắn amylose có thể kết hợp với các nguyên tử khác, tạo màu xanh khi kết hợp với iod. Nếu đun nóng liên kết hydro bị cắt đứt, chuỗi amylose duỗi thẳng iod tách khỏi amylose và dung dịch mất màu xanh. Amilopectin có các gốc glucose gắn với nhau không chỉ nhờ liên kết α-1,4- glucoside mà còn nhờ liên kết α-1,6-glucoside, chính liên kết này hình thành cấu trúc nhánh trong amilopectin. Phân tử amilopectin chứa khoảng 200.000 đến 1.000.000 phân tử glucose, phân bố ở mặt ngoài hạt tinh bột. Amilopectin chỉ hoà tan khi đun nóng và tạo nên dung dịch có độ nhớt cao, amilopectin tạo màu đỏ với iod. [7, 8, 29, 33] 1.3.2. Hệ enzym amylase. Amylase là tên gọi của một nhóm enzym có tác dụng xúc tác thủy phân liên kết glucoside trong polysaccharide (tinh bột) và các dextrin cuối. Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen. Sản phẩm tạo thành của quá trình thủy phân là glucose, maltose và dextrin. [8,11] Cơ chất chủ yếu của amylase là tinh bột. Đây là một polysaccharide phổ biến ở TV, được tích lũy nhiều trong các hạt hòa thảo, trong củ, thân cây và lá cây . Tinh bột có vai trò dinh dưỡng đặc biệt lớn vì trong quá trình tiêu hóa chúng bị thủy phân thành đường glucose là chất tạo nên nguồn năng lượng chính cho SV. Các amylase chủ yếu thủy phân tinh bột thường gặp là: a. α – amylase hay α-1,4-glucohydrolase là enzym phân cắt các liên kết α-1,4- glucoside trong mạch amylose và amilopectin một cách ngẫu nhiên. Đây là enzym có ở TV, ĐV và đặc biệt có nhiều ở VSV, thủy phân tinh bột chủ yếu tạo thành maltose và glucose. Dưới tác động của α – amylase, tinh bột sẽ mất khả năng tạo màu với iod và độ nhớt của tinh bột giảm nhanh. Nếu thời gian tác dụng dài thì sản phẩm thủy phân amylose chứa 13% glucose và 87% maltose, còn với amilopectin sẽ tạo thành maltose, maltotriose và dextrin phân tử thấp cùng 5-10% glucose. Enzym này hầu như không tác dụng trên tinh bột nguyên thủy nhưng thủy phân hồ tinh bột rất nhanh. Một số đặc tính của α – amylase: - Dễ tan trong nước, dung dịch muối, rượu loãng. Phân tử lượng α – amylase giảm (14.000 – 15.000) còn canxi tăng theo nhiệt độ nuôi cấy VSV. Nếu tách hoàn toàn canxi khỏi phân tử enzym thì α – amylase mất khả năng thủy phân cơ chất vì canxi tham gia hình thành và ổn định enzym. Canxi còn có tác dụng đảm bảo α – amylase có độ bền cực lớn với các tác động gây biến tính và phân hủy bởi các protease. [7, 29] - pH tối thích α – amylase từ NS là 4,5 – 4,8 (hoạt động 4,5 – 5,8), từ đại mạch và thóc mầm là 5,3 (4,7 – 5,4), và VK là 5,8 – 6,0 (5,8 – 7,0). pH tối thích của α – amylase từ Asp.oryzae là 4,8 – 5,8. pH <3, đa số α – amylase bị bất hoạt hoàn toàn, trừ α – amylase của Asp.niger có thể chịu được pH 2,5 – 2,8. [7, 25, 29] - α – amylase của NS rất nhạy cảm với nhiệt độ (tối thích 50oC), thóc mầm và malt 58 – 60oC trong khi nhiều VK, chúng có thể giữ hoạt tính ở 70 – 90oC. Tính bền nhiệt của α – amylase do sự có mặt của canxi trong phân tử enzym. [6, 27, 28] Thủy phân tinh bột bằng α – amylase thường xảy ra hai giai đoạn: - Giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): chỉ một số liên kết trong phân tử cơ chất bị thủy phân, tạo một lượng dextrin và độ nhớt từ hồ tinh bột giảm nhanh. Giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): thủy phân các dextrin phân tử lớn vừa hình thành tiếp tục tạo các dextrin phân tử thấp hơn, maltose, isomaltose và glucose. Tuy nhiên, thông thường trong một thời gian ngắn (30 – 60 phút), α – amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp và một ít đường maltose. Khả năng dextrin hóa cao của α – amylase là tính chất đặc trưng của nó. Vì vậy người ta còn gọi loại amylase này là amylase dextrin hay amylase dịch hóa. Những chủng VSV có khả năng tổng hợp α – amylase có ý nghĩa công nghiệp: Baccillus subtilis, Baccillus licheniformis, Asp.oryzae [7]. b. β – amylase (α -1,4 – glucan – mantohidrolase) chỉ phân cắt các liên kết α – 1,4 glucoside ở đầu mạch. Enzym này phổ biến ở TV, nhiều ở hạt nảy mầm. β – amylase kém bền ở nhiệt độ cao, vô hoạt hoàn toàn ở 70oC nhưng trong dịch nấu thì nhiệt độ tối thích là 60 – 65oC. Enzym này khá bền trong MT axit ở pH 3 – 4. Đa số β – amylase hoạt động mạnh hơn ở MT pH 4,5 – 5 và vẫn giữ được hoạt tính khi không có canxi. Điểm khác biệt cùa enzym này so với α – amylase là hầu như không tác dụng lên tinh bột sống mà chỉ phân giải mạnh hồ tinh bột. Chúng phân giải 100% amylose và 54 – 58% amylopectin thành maltose. β – amylase vẫn giữ được hoạt tính khi không có canxi. [15, 29]. c. Glucoamylase (γ – amylase hay α – 1,4 – glucan – glucohydrolase) thủy phân liên kết α-1,4 glucosid và α-1,6 glucosid trong chuỗi polysaccharide. Enzym này có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glycogen, amylopectin dextrin cuối, panose, isomatose và maltose tới glucose (Azarova, 1981; Jerebtxov, Pankratov, 1977; Dobrolinxkaia, Rodzevits, 1974; Logina Karpukhina, 1978). Phân tử lượng gucoamylase thường không ổn định, dao động từ 50.000 đến 95.000 dalton. Đa số chế phẩm glucoammylase của VSV đều hoạt động tốt ở vùng axit, pH tối thích 4,5 – 5,0. Tuy hoạt động tốt trong vùng axit nhưng glucoamylase của một số chủng VSV cũng bền ở pH kiềm. Ví dụ glucoamylase của loài Coniphora cerebella và Corticum rolfsii tương đối bền ở pH 9, glucoamylase của Mucor rouxianus bền ở pH 8 [25]. Nhiệt độ tối thích của glucoamylase 50 – 60oC. Hầu hết các glucoamylase bị mất hoạt tính khi đun nóng trên 70oC. Tuy nhiên cũng có trường hợp glucoamylase hoạt động tốt nhất ở 65 – 70oC, ví dụ như ở loài C. thermosaccharolytium. Enzym này bị ức chế mạnh bởi Hg+ nhưng các ion Mn2+ và Fe2+ lại có tác dụng kích thích. Sản phẩm của giai đoạn đường hóa chủ yếu tạo ra glucose. Một số VSV có khả năng tổng hợp glucoamylase có ý nghĩa công nghiệp: nấm mốc Rhizopus, Asp.awamori, Asp.niger; nấm men Endomycopsis. [25, 29] 1.3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp amylase của VSV. a. Giống VSV Giống VSV là điều kiện đầu tiên và cơ bản nhất quyết định sự hình thành và lượng amylase. Không phải tất cả các chủng VSV đều có khả năng tổng hợp amylase như nhau. Các chủng cùng chi và thậm chí cùng loài vẫn rất khác nhau về lượng enzym tổng hợp được. Vì thế, để thu được lượng amylase cao, công việc tuyển chọn chủng NS có khả năng sinh enzym này cao là điều quan trọng đầu tiên. Ngoài ra chủng NS thu được cũng cần được bảo quản và nuôi cấy trong những điều kiện tốt nhất, nhằm hạn chế việc bị biến tính, nhất là trong điều kiện NS phân lập từ RNM. Trong nghiên cứu cũng như sản xuất, việc tuyển chọn và bảo quản giống là điều rất quan trọng. Vì nếu chủng VSV tuyển chọn không giữ được hoạt tính ban đầu thì những thành quả thu được cũng vô ích. Vì tầm quan trọng như vậy, nhiều nước trên thế giới đã đưa công tác này lên tầm cỡ quốc gia và đã thành lập các trung tâm, các chi nhánh giữ giống gọi là bảo tàng VSV [31,33]. b. Nguồn dinh dưỡng. Các yếu tố trong thành phần MT ảnh hưởng lớn đến hoạt động sống và tạo thành enzym của VSV. MT nuôi cấy VSV phải bảo đảm có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng và tỉ lệ các chất dinh dưỡng hợp lý, phù hợp với nhu cầu của từng VSV cụ thể.  Ảnh hưởng của nguồn C. Thành phần và hàm lượng C có ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp enzym. Nhiều tác giả cho rằng: muốn thu được hàm lượng amylase cao thì trong MT nuôi cấy VSV không được chứa nguồn C dễ hấp thu. Nói chung amylase thủy phân tinh bột là enzym cảm ứng nên sự có mặt của cơ chất tinh bột thường thúc đẩy quá trình tạo amylase [25]. Theo Grigorev, ảnh hưởng nguồn C đến cường độ sinh tổng hợp amylase có thể xếp theo thứ tự sau: - Đối với α – amylase: tinh bột > dextrin > maltose > lactose > glucose > saccharose > galactose > manose > arabinose. - Đối với glucoamylase: tinh bột > dextrin > maltose > saccharose > glucose > lactose > arabinose > galactose > manose [31]. Nồng độ nguồn C trong MT cũng ảnh hưởng lớn đến sự tạo thành enzym. Mỗi loài VSV chỉ có thể tạo lượng amylase cao nhất ở một nồng độ hydratcacbon nhất định. Ví dụ trên MT Czapek, nồng độ tinh bột ảnh hưởng rõ rệt đến sinh tổng hợp enzym amylase. Nồng độ tinh bột tối thích cho sinh tổng hợp α – amylase là 6% , đối với glucoamylase là 3%. Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy NS thu amylase thường là những nguyên liệu có nguồn gốc tự nhiên như cám mì, cám gạo, gạo, ngô mảnh, đậu nành và các loại hạt ngũ cốc khác. Trong đó, cám gạo, cám mì được sử dụng nhiều hơn cả vì có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho VSV phát triển. Mặt khác khi tạo MT, chúng thường có tính chất vật lý rất thích hợp để vừa đảm bảo khối kết dính cần thiết, vừa đảm bảo lượng không khí lưu chuyển trong khối nguyên liệu [25]. Bảng 1.1. Ảnh hưởng cơ chất đến sinh tổng hợp α – amylase và glucoamylase của Asp.oryzae [25]. Hoạt độ enzym (đv/100ml) Hoạt độ enzym (đv/100ml) Nguồn C α - amylase glucoamylase Nguồn C α - amylase glucoamylase Tinh bột % Bột 6 300 800 Ngô 250 760 4 220 800 Mì 250 760 2 110 800 Mì đen 300 770 1 70 710 Đậu nành Vết 810 Ngoài ra, để giảm giá thành sản phẩm khi ứng dụng sản xuất amylase cho chăn nuôi, người ta có thể dùng khoai mì hay bã khoai mì như một chất cảm ứng rẻ tiền và thường có sẵn trong thức ăn gia súc. Ở nước ta, các phụ phẩm nông nghiệp trên như: rơm, cám gạo, cám mì, bã khoai mì, trấu,.. có đến hàng 20 – 30 tấn/năm. Đây là nguồn thức ăn tốt cho chăn nuôi cũng như là các cơ chất lên men rẻ tiền trong công nghệ lên men VSV [47,56].  Ảnh hưỏng của nguồn N. N cần cho sự hình thành các axit amin để cấu tạo nên protein cấu trúc cũng như các enzym. Nguồn N bổ sung vào MT nuôi cấy có thể là N vô cơ hay N hữu cơ. Việc chọn nguồn N bổ sung vào MT nuôi cấy là rất cần thiết để bảo đảm hiệu suất sinh tổng hợp cao đồng thời có lợi về mặt kinh tế. Nguồn N vô cơ thường dùng là nitrat amon, nitrat natri (có hiệu quả hơn các loại khác) hay sulfat amon, urê,..Nitrat natri là nguồn dinh dưỡng N thường dùng để nuôi nhiều loại NS sinh amylase với hàm lượng 0,91%. Các hợp chất N hữu cơ có thể là nguyên liệu giàu đạm như cao ngô, bột đậu tương, khô lạc, khô đâu,..Ngoài ra, một số axit amin cũng thường được bổ sung vào MT nuôi cấy VSV. [7]. Khi sử dụng nguồn N nhất định cho vào MT nuôi cấy VSV có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác. Theo mức độ tiêu thụ muối, MT bị acid hóa, quá trình tổng hợp enzym sẽ chuyển theo hướng tích cực tổng hợp glucoamylase và ức chế tổng hợp α – amylase. Sự cân bằng giữa C và N trong MT có ý nghĩa lớn đối với sinh tổng hợp sinh khối VSV và sự tạo thành amylase. Khi MT có đủ lượng C và N cần thiết sẽ tích lũy được lượng amylase cực lớn. Tỉ lượng tối ưu của C và N cho sinh tổng hợp amylase là 10:1 đến 40:1. Trong MT Czapeck, tỉ lượng giữa tinh bột và NaNO3 tối ưu cho sinh tổng hợp các amylase vào khoảng 18:1.[25]  Các nguồn dinh dưỡng khoáng. Magie ảnh hưởng đến độ bền nhiệt của enzym. Thiếu MgSO4 sẽ ảnh hưởng xấu đến tổng hợp mọi amylase của NS (Fenikxova, Muxaeva, 1967). Nồng độ tối ưu của muối này cho sự tổng hợp α – amylase và glucoamylase là 0,05%. Phosphore ảnh hưởng trực tiếp đến sinh sản của NS nên sẽ tăng cường tổng hợp các amylase. Khi bổ sung phosphore hữu cơ vào MT sẽ làm tăng giá trị dinh dưỡng MT và làm tăng tổng hợp amylase 2- 3 lần. Canxi cần cho tổng hợp và ổn định α – amylase hoạt động vì là thành phần không thể thiếu được của enzym này và bảo vệ amylase khỏi tác động của protease. Ngoài ra, sự có mặt của Mn, Cu, Hg sẽ kìm hãm sự tổng hợp amylase. Nguồn S thích hợp nhất đối với sự sinh tổng hợp amylase là methionin, muối sulfat (trừ CuSO4).  Điều kiện nuôi cấy Ngoài các yếu tố dinh dưỡng, trong MT nuôi cấy VSV các yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm, pH, thời gian nuôi cấy cũng ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp amylase của VSV. - Nhiệt độ Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng của đa số NS là 28 – 32oC. Chu kì sinh trưởng NS có thể chia làm 3 thời kì: thời kì trương và nảy mầm của đính bào tử (10 – 11giờ đầu tiên), nhiệt độ cần cung cấp không thấp hơn 23 – 30oC. Thời kì sinh trưởng nhanh hệ sợi (4 – 18giờ), nấm hô hấp mạnh nên giữ nhiệt độ phòng nuôi khoảng 28 – 29oC. Ở thời kì sinh amylase mạnh (10 – 12giờ), nên giữ nhiệt độ khoảng 28 – 29oC. Đây chính là nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng và sinh tổng hợp amylase của đa số NS trên MT rắn. - pH của MT. Khi nuôi cấy VSV bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt thì pH MT ít bị thay đổi trong quá trình nuôi do MT có dung đệm cao và hàm độ ẩm thấp. Tuy nhiên, pH ban đầu cũng ảnh hưởng không nhỏ đến sự phát triển và hình thành enzym của VSV. Ở pH 4,5 – 5,0 NS tạo hệ amylase tốt nhất sau đó đến hệ pectinase còn protease thì kém hơn. Đa số NS phát triển và tạo amylase ở MT axit yếu trong khi VK lại phát triển và sinh enzym cao ở MT trung tính. pH MT không chỉ ảnh hưởng đến lượng enzym tổng hợp mà còn ảnh hưởng đến chủng loại enzym được tổng hợp. Ví dụ, A.oryzae khi MT pH 6,5 thì ưu thế tổng hợp thuộc về α – amylase, trong khi đó ưu thế thuộc về glucoamylase khi pH MT là 4,5 [45]. Trong suốt quá trình nuôi cấy NS, ta có thể điều chỉnh pH MT bằng axit HCl, H2SO4, NaOH, KOH. Việc điều chỉnh pH thích hợp trong quá trình nuôi cấy NS còn hạn chế sự tạp nhiễm do VK làm ảnh hưởng đến hoạt tính enzym [54]. - Độ ẩm MT Khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt, độ ẩm MT là một trong những yều tố cần thiết cho sự sinh trưởng NS. Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu thích hợp với NS là 58 - 60%, độ ẩm MT cần phải được duy trì trong quá trình sản xuất. Độ ẩm cao sẽ làm giảm độ thoáng khí của MT, còn khi độ ẩm thấp lại kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của VSV cũng như kìm hãm sự tạo amylase [25, 31]. - Thời gian nuôi cấy Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng rất lớn đến sự tạo thành enzym. Trong quá trình nuôi cấy NS, sự hình thành bào tử làm giảm khả năng tạo amylase. Tùy thuộc vào tính chất sinh lý của từng chủng nấm và sự ngừng tổng hợp enzym mà có thể ngừng sinh trưởng NS vào lúc cần thiết. Ở đa số NS, sự hình thành amylase cực đại thường kết thúc khi NS bắt đầu sinh bào tử. Thời gian kết thúc sự tạo thành amylase thường từ 30 đến 42 giờ. [31, 33]. 1.3.4. Các phương pháp thu nhận amylase từ NS. a. Phương pháp nuôi bề mặt - MT nuôi dạng rắn. NS phát triển trên bề mặt MT chất dinh dưỡng dạng rắn, xốp, ẩm. Nguyên liệu chính thường là cám mì, cám gạo, cám nếp, bắp xay nhỏ, tấm gạo, gạo nếp,…được bổ sung lượng nhỏ (10 – 20%) trấu, mạt cưa,..MT sau khi được bổ sung thêm một số chất dinh dưỡng khác thì hấp thanh trùng ở 1 – 1,5 atm/45 – 60 phút, để nguội rồi cho bào tử nấm hay NS vào. MT đã cấy giống được trải trên khay nuôi ở điều kiện tối thích. Sau khoảng thời gian thích hợp, người ta thu nhận MT đem sấy nhẹ ở 40oC để đạt độ ẩm 8 – 12%, nghiền nhỏ. Đây chính là chế phẩm enzym dạng rắn – thô. Sau đó, chế phẩm này còn phải trải qua giai đoạn tinh chế để thu được enzym bán tinh khiết hay tinh khiết. b. Phương pháp nuôi bề sâu (chìm) - MT nuôi dạng lỏng. Nguyên liệu chính thường dùng là dịch đường hay dịch thủy phân cellulose, tinh bột có bổ sung nguồn N vô cơ (NaNO3). Để tạo điều kiện cho NS sinh trưởng tốt và tổng hợp nhiều amylase, người ta thường bổ sung thêm vào MT một số chất thích hợp như: nước chiết mầm mạch, nước chiết ngô,….Phương pháp này đòi hỏi phải có cánh khuấy hay máy lắc để đảo trộn MT cung cấp oxy cho NS phát triển. Để thu nhận enzym, dịch lên men được cô đặc ở nhiệt độ thấp. Phương pháp nuôi cấy bề mặt được sử dụng từ rất lâu và hiện nay cũng được ứng dụng nhiều hơn so với phương pháp nuôi bề sâu vì chi phí thấp mà khả năng sinh tổng hợp enzym cao [26]. 1.3.5. Một số ứng dụng amylase trong công nghệ sinh học. a. Công nghệ rượu, bia, cồn. Vài chục năm gần đây, người ta đã bắt đầu sử dụng chế phẩm amylase từ NS Asp. oryzae hay Asp.awamori, VK Baccillus subtilis để thay thế malt trong việc đường hóa tinh bột sản xuất rượu, bia từ nguyên liệu có chứa tinh bột. Việc sử dụng chế phẩm amylase từ VSV thay malt đã tiết kiệm được hàng vạn tấn đại mạch tốt, giảm giá thành sản phẩm và rút ngắn quá trình sản xuất [35]. Trước đây, sản xuất cồn từ nguyên liệu chứa tinh bột thường sử dụng malt giống trong sản xuất bia. Sau đó, các nhà khoa học Nhật Bản đưa ra phương pháp sản xuất amylase từ NS thay thế amylase của malt và được ứng dụng đến nay. Amylase đầu tiên sử dụng trong sản xuất cồn là amylase thu được từ Asp.oryzae. Tại Việt Nam hiện nay, người ta thường dùng chế phẩm Asp.usamii để sản xuất rượu từ tinh bột [26]. b. Sản xuất bánh mì. Khi thêm 0,002 – 0,003% chế phẩm amylase vào bột nhào sẽ nâng cao chất lượng bánh mì về hương vị, màu sắc, thể tích riêng và độ xốp. Nhiệt độ vô hoạt α – amylase của NS tương đối cao (70oC) nên có thể dùng enzym này với liều lượng lớn mà vẫn không có hiện tượng dextrin hóa khi nướng. Hơn nữa, hoạt độ α – amylase cao nên có thể đạt đến độ đường hóa cần thiết rất nhanh chóng, sau đó bị vô hoạt ngay. Tuy nhiên, chế phẩm enzym NS (thường dùng từ Asp.oryzae) thường là phức hệ enzym. Trong đó protease có thể làm cho chất lượng bánh mì xấu đi, do đó phải loại bỏ protease trước khi sử dụng [26]. c. Sản xuất thức ăn chăn nuôi. Bổ sung chế phẩm amylase của Asp.oryzae, Asp. awamorii vào khẩu phần ăn của ĐV nhất là ĐV non làm tăng khả năng đồng hóa dẫn đến tăng trọng nhanh. Amylase là một trong những enzym được chú trọng trong chăn nuôi gia súc, đặc biệt là lợn con cai sữa và sau cai sữa (từ 5 – 20kg). Đây là giai đoạn mà việc bổ sung enzym vào thức ăn có tác dụng nhất để tăng trọng vả bảo vệ lợn. Enzym bổ sung sử dụng theo 2 cách: trộn vào thức ăn hay dùng enzym xử lý thức ăn rồi mới cho ĐV ăn nhằm làm tăng hệ số sử dụng thức ăn [36]. Tại Việt Nam, các nhà khoa học thuộc Viện Sinh học Nhiệt đới đã nghiên cứu và sản xuất thành công hai loại thức ăn kích thích tăng trưởng cho mọi vật nuôi, kể cả thuỷ sản từ bã sắn là sản phẩm lên men từ bã sắn sử dụng làm thức ăn gia súc và giải quyết ô nhiễm MT: ProBio-S và Bio-E. d. Một số ứng dụng khác. -Trong y học và lâm sàng, chế phẩm amylase cho phép phát hiện các oligosaccharide phân tử lượng lớn với độ nhạy cao. - Trong công nghệ dệt, chế phẩm amylase được dùng để phân hủy tinh bột trên sợi vải. Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu 2.1.1. Giống VSV - Các chủng NS phân lập từ các mẫu đất, thân, lá cây,.. vào mùa khô ở RNM Cần Giờ tại các xã: Long Hòa, Lý Nhơn, Tam Thôn Hiệp, An Thới Đông, Bình Khánh. - Các VSV kiểm định: Escherichia coli, Bacillius subtilis. 2.1.2. Hoá chất và thiết bị. a. Hóa chất - Cồn, NaNO3, NaNO2, (NH4)2SO4, K2HPO4, MgSO4.7H2O, KCl, FeSO4.7H2O, NaCl, HCl, NaH2PO4, Na2HPO4, Dinitrosalisilic, sodium potassium tartrate (Trung Quốc), dầu DO (Việt Nam)..... - Glucose, maltose, lactose, sucrose, galactose, tinh bột tan, pepton, cao thịt, casein (Trung Quốc) , thuốc thử lugol, HgCl2, nước chiết khoai tây, agar (Việt Nam), cao nấm men (Mỹ), cao malt (Đức), cao thịt (Đức),... - Cám, bã khoai mì, bột bắp, bột đậu nành, trấu (Việt Nam) - Chế phẩm amylase Ter của Viện sinh học nhiệt đới cung cấp. b. Dụng cụ Bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, pipet, que cấy, que gạt, bông không thấm nước, bông thấm nước, khoan nút chai, đèn cồn, cốc thủy tinh, cối, chày, phiến kính, lá kính,.. c. Thiết bị Tủ cấy vô trùng (Việt Nam), tủ lạnh National (Nhật Bản), tủ giữ mẫu Sanyo (Nhật Bản), máy giập mẫu, máy lắc Gerhardt (Đức), cân điện Sartorius (Đức), tủ ấm, tủ sấy Memmert (Đức), nồi hấp lực Huxley (Đài Loan), máy đo mật độ quang, kính hiển vi, máy chụp hình kỹ thuật số Olympus 5.1 (Nhật), máy đo pH Pometer KL-009 (II) (Trung Quốc), máy ly tâm Rotina (Đức), thiết bị đo độ ẩm.. 2.1.3. Các MT sử dụng trong thí nghiệm a. MT phân lập, nuôi cấy, giữ giống và định danh NS. - MT1 - MT Czapek – Dox cải tiến: 3,5g NaNO3; 1,5g K2HPO4; 0,5g KCl ; 0,5g MgSO4.7H2O; 0,01g FeSO4.7H2O; 20g glucose; 20g agar; 1000ml nước biển; pH = 6.5; khử trùng 1atm/ 30 phút. - MT2 - MT cao nấm men-YEA (Glucose Yeast Extract Agar): 4g cao nấm men; 20g glucose; 20g agar; 1000ml nước biển; pH = 5,5 – 6,0; khử trùng 1atm/ 30 phút. b. MT định tính khả năng phân giải các hệ enzym thủy phân amylase, cellulose, protease, pectinase. - MT3 - MT cảm ứng tổng hợp amylase: 35g NaNO3; 1,5g K2HPO4; 0,5g MgSO4.7H2O; 0,5g KCl; 0,01g FeSO4.7H2O; 10g tinh bột tan; 20g agar; 1000ml nước biển; pH = 6,5; khử trùng 1atm/ 30 phút. - MT4 - MT cảm ứng tổng hợp cellulose: Tương tự MT3 nhưng thay 10g tinh bột tan bằng 10g CMC - MT5 - MT cảm ứng tổng hợp protease: Tương tự MT3 nhưng không sử dụng NaNO3 và thay 10g tinh bột tan bằng 10g casein. - MT6 - MT cảm ứng tổng hợp chitinase: Tương tự MT3 nhưng thay 10g tinh bột bằng 10g bột chitin. - MT7 - MT cảm ứng tổng hợp pectinase: 200g cà rốt gọt vỏ, xay nhỏ, đun với 1000ml nước biển trong 60 phút, thêm một tít CaCO3 để trung hòa MT. Lọc lấy nước trong, bổ sung 20g agar. Chỉnh MT để có pH = 6,5. Khử trủng 1atm/30phút. - MT8: MT phát hiện khả năng phân giải dầu: 0,3g KH2PO4; 0,4g MgSO4; 3g KNO3; 0,7g Na2HPO4; 1000ml nước biển; 5ml dầu DO; pH = 5,5 – 6,0; khử trùng 1atm/30phút. c. MT khảo sát khả năng sinh tổng hợp amylase. - MT9: 70% cám gạo; 25% trấu; 5% bã khoai mì; độ ẩm 60%; pH = 5 – 5,5; khử trùng 1atm/ 30 phút. - MT10 [16]: 50% cám gạo; 33% bắp mảnh; 17% trấu; pH = 5 – 5,5; độ ẩm 60%; khử trùng 1atm/ 30 phút. - MT11: 50% cám gạo; 16,5% bã khoai mì; 16,5% bắp mảnh; 17% trấu; độ ẩm 60%; pH = 5 – 5,5; khử trùng 1atm/30 phút. - MT12 [22]: 90% bã khoai mì; 10% trấu; bổ sung dung dịch khoáng (K2HPO4 0,1%; NH4Cl 0,1%; KNO3 0,3%; MgSO4 0,05%) cho đủ độ ẩm 60%; khử trùng 1atm/30 phút. - MT13: 50% cám gạo; 33% bã khoai mì; 17% trấu; độ ẩm 60%; pH = 5 – 5,5; khử trùng 1atm/30 phút. d. MT nuôi cấy giống VK kiểm định. MT14 - MT MPA (Meat peptone agar): 5g pepton; 5g NaCl; 5g cao thịt; 20g agar; 1000ml nước biển; pH = 7,5; khử trùng 1atm/ 30 phút. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp vi sinh. 2.2.1.1. Phương pháp phân lập mẫu trực tiếp và pha loãng mẫu a. Phương pháp phân lập mẫu truyền thống (F.Uyenco, 1988) - Lấy mẫu và pha loãng mẫu: lấy 10g mẫu lá, đất, thân cho vào túi lọc mẫu, thêm 90ml nước biển vô trùng, dập mẫu bằng máy nghiền mẫu trong 2 phút, tốc độ 230 vòng/phút. Túi lọc mẫu giữ lại chất hữu cơ, phần dịch hơi đục chảy ra bên ngoài. Lấy dịch lọc ta được dung dịch pha loãng 10-1. Lắc đều rồi hút 1ml dung dịch 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước biển vô trùng ta được dung dịch pha loãng nồng độ 10-2, tiếp tục pha loãng như thế ta được dung dịch nồng độ 10-3, 10-4, 10-5. - Cấy mẫu: Nhỏ 2 giọt dung dịch ở mỗi nồng độ lên đĩa petri chứa MT1. Dùng que trang trải đều khắp mặt thạch. Sau đó sử dụng que trang đó gạt trên 2 đĩa tiếp theo. - Ủ mẫu: Lật ngược đĩa petri, gói vào giấy báo cũ, ủ ở nhiệt độ phòng 3 – 7 ngày. Chọn KL riêng rẽ cấy truyền sang ống nghiệm thạch nghiêng - Làm thuần: Lấy một KL riêng rẽ trong ống thạch nghiêng hòa vào nước biển vô trùng, trải lên đĩa lần 2. Nếu các dạng KL mọc lên đồng đều, màu sắc giống nhau, soi dưới kính hiển vi đều có một dạng tế bào chứng tỏ giống phân lập thuần khiết. Sau đó chọn KL riêng rẽ cấy truyền sang ống thạch nghiêng để bảo quản và nghiên cứu các đặc điểm hình thái sinh lý, sinh hóa. - Quy ước chủng. + Chữ cái đầu tiên: cơ chất lấy mẫu (L: lá vàng; LM: lá mục; CM: cành mục; CK: cành khô; Đ: đất sâu; ĐM: đất mặt). + Chữ số kế tiếp: số thự tự mẫu thu được từ cơ chất nào đó + Chữ số cuối cùng: xã lấy mẫu (1: Long Hoà; 2: Lý Nhơn; 3: Anh Thới Đông; 4: Tam Thôn Hiệp). b. Phương pháp phân lập có mục tiêu. Sử dụng MT cảm ứng có sẵn cơ chất tinh bột đặt tại RNM Cần Giờ trong 07 ngày rồi thu mẫu. - MT cảm ứng có cơ chất tinh bột: Sử dụng 2 loại MT: MT11 và MT13; cân 15 g mẫu MT11 hay MT13 cho vào bình tam giác 250ml, hấp tiệt trùng rồi đặt tại các gốc cây, trên mặt đất, trên thân cây; số lượng bình cảm ứng: 02 bình mỗi loại/địa điểm; 03 địa điểm/xã. - Lấy mẫu: Sau 07 ngày, thu lại các bình tam giác chứa MT cảm ứng đã có các loại NS mọc trong đó; dùng que cấy lấy các sợi nấm trong mỗi bình, cấy chấm điểm vào đĩa petri đã có sẵn MT1. Các bước ủ mẫu và làm thuần tiến hành tương tự phương pháp phân lập truyền thống. - Quy ước chủng: + Chữ cái: vị trí xã đặt bình cơ chất cảm ứng. (LH: Long Hòa; LN: Lý Nhơn; A: An Thới Đông; T: Tam Thôn Hiệp; B: Bình Khánh). + Chữ cái kế tiếp: cơ chất cảm ứng sử dụng (KM: khoai mì; KMB: khoai mì và bắp). + Chữ số tiếp theo: số thứ tự chủng thu được từ bình cơ chất đặt tại xã nhất định 2.2.1.2. Phương pháp giữ giống trên MT thạch dưới lớp dầu khoáng (Lumiere và Chevrotier). Chuẩn bị ống giống đã nuôi ở nhiệt độ phòng và thời gian thích hợp. Dầu khoáng chứa trong ống eppendoff hấp vô trùng ở 121oC trong 2 giờ rồi sấy khô ở 170oC trong 1-2 giờ, để nguội. Dùng que cấy lấy một ít bào tử cho vào eppendoff chứa dầu khoáng vô trùng. Hàn kín eppendoff bằng paraffin, bảo quản ở nhiệt độ 4oC. Phương pháp này có thể bảo quản 1 -3 năm. 2.2.1.3. Phương pháp quan sát đại thể NS. NS sau khi cấy truyền sang thạch nghiêng, ta tiến hành tạo KL khổng lồ theo các bước sau: - Cho vào ống nghiệm 5ml nước biển vô trùng, dùng que cấy lấy một ít bào tử từ ống giống thạch nghiêng cho vào ống nghiệm, lắc đều tạo dung dịch huyền phù. - Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi nhanh chóng chấm điểm vào giữa mặt thạch ở giữa hộp petri. Làm 2, 3 hộp. - Ủ ấm trong một tuần để tạo KL . Hàng ngày lấy ra quan sát. - Quan sát dưới kính lúp 3 chiều để mô tả các đặc điểm: + Kích thước KL để biết tốc độ phát triển của nó + Hình dạng KL + Màu sắc KL mặt phải, mặt trái và sự thay đổi màu sắc. + Màu sắc của MT do sắc tố NS tạo ra. + Dạng sợi nấm mọc ở mặt trên MT. + Đặc điểm của mép KL. + Giọt nước đọng, chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt KL,… 2.2.1.4. Phương pháp quan sát vi thể NS - Phương pháp cấy khối thạch (J. T. Dunean) - Chuẩn bị MT thích hợp, đổ một lớp thật mỏng (khoảng 1mm) trong các đĩa petri. - Dùng khoan nút chai vô trùng có d = 8mm, khoan các khối thạch. - Chuẩn bị các đĩa petri sạch, phiến kính, lá kính, bông thấm nước, nước cất vô trùng. - Đặt 1 hay 2 khối thạch trên mỗi phiến kính. Cấy một ít bào tử lên bề xung quanh khối thạch. Đặt lá kính vô trùng lên bề mặt các khối thạch. - Các phiến kính có khối thạch cấy NS nghiên cứu được đặt trong các hộp petri có sẵn một ít bông thấm nước được làm ẩm bằng nước cất vô trùng. Giữ các hộp petri trong tủ ấm 3 – 4 ngày. - Khẽ gỡ lá kính ra, úp lên một phiến kính sạch có một giọt thuốc nhuộm lactophenol, được tiêu bản thứ nhất. - Gỡ bỏ lớp thạch và để nguyên phần NS trên phiến kính, nhỏ giọt lactophenol, đậy lá kính lên trên, được tiêu bản thứ hai. - Dùng kính hiển vi quan sát và vẽ mô tả các đặc điểm: * Hình dạng cuống sinh bào tử. * Hình dạng thể bình * Hình dạng các thể bọng * Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn * Đặc điểm bào tử đính * Màu sắc, kích thước bào tử…. - Chụp hình trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 – 1000 lần. 2.2.1.5. Xác định hoạt tính enzym ngoại bào của NS bằng phương pháp khuếch tán trên thạch (William, 1983). a. Nguyên tắc Dùng thuốc thử với cơ chất màu đặc trưng, phần cơ chất bị NS phân hủy sẽ không tạo màu mà tạo vòng phân giải trong suốt quanh KL. b. Cách tiến hành - Dùng MT định tính khả năng phân giải các loại enzym ngoại bào. - Phương pháp cấy chấm điểm: Chuẩn bị các chủng NS nghiên cứu và MT thử hoạt tính enzym ngoại bào tương ứng (MT3, MT4, MT5, MT6, MT7), cấy chấm điểm các chủng NS nghiên cứu lên các đĩa MT (3 điểm/đĩa), giữ các đĩa trong 28- 30oC, 3-4 ngày. - Phương pháp đục lỗ trên thạch: + Thu dịch nuôi cấy: dùng que cấy vô trùng lấy 1 vòng NS vào bình tam giác 50ml MT dịch thể vô trùng (MT3, MT4, MT5, MT6, MT7). + Nuôi cấy trên máy lắc (160 vòng/phút), 4 ngày, 25-28oC + Ly tâm 20ml dịch nuôi cấy 3000 vòng/phút, 20 phút. + Loại bỏ sinh khối, phần dịch ly tâm cho vào các bình vô trùng là dịch enzym thô, bổ sung 0,04% NaN3 để khử trùng; có thể giữ dịch ly tâm 1 tháng trong tủ lạnh sâu ở -20oC. + Dùng khoan nút chai vô trùng (d = 8mm) khoan các lỗ thạch trên MT nghiên cứu tương ứng trong các đĩa. + Dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1ml dịch enzym thô vào các lỗ khoan trên các MT thử hoạt tính tương ứng. Giữ các hộp petri ở tủ lạnh 4oC, 2-4 giờ, sau đó chuyển sang tủ ấm 28-30oC trong vòng 24giờ. + Thuốc thử lugol (hỗn hợp 0,05% I2 với 2,65%KI) cho amylase, cellulase, chitinase, dung dịch 10%HgCl2 cho protease. c. Kiểm tra kết quả. - Kiểm tra hoạt tính amylase, cellulase, kitinase. + Nếu NS có hoạt tính amylase sẽ tạo vòng trong suốt quanh KL hay lỗ khoan chứa dịch enzym do tinh bột đã bị phân giải. Vùng tinh bột chưa bị phân giải có màu xanh tím đậm. + Nếu NS có hoạt tính cellulase sẽ tạo vòng trong suốt quanh KL hay lỗ khoan chứa dịch enzym do cellulose đã bị phân giải. Vùng cellulose chưa bị phân giải có màu tím hồng nhạt. + Nếu NS có hoạt tính chitinase, vùng chitin chưa bị phân giải có màu nâu đỏ nhạt. - Kiểm tra hoạt tính protease. Nếu NS sinh ra protease, sẽ có một vòng trong suốt quanh KL hay quanh lỗ khoan chứa dịch enzym do các phân tử protein bị phân giải không phản ứng với HgCl2. Vùng chứa protein chưa bị phân giải có màu trắng đục do khi phản ứng với HgCl2 bị kết tủa. d. Đánh giá khả năng tạo enzym. - Đặt sấp hộp petri. Dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) và đường kính KL (d) hay đường kính lỗ thạch (d = 8mm). - Dựa vào kết quả (D – d, mm) để đánh giá hoạt tính enzym của các chủng NS. Giá trị (D – d) càng lớn thì khả năng sinh enzym của các chủng NS càng cao. -Quy ước: D – d >= 25mm: hoạt tính enzym mạnh; D – d >= 20mm: khá mạnh; D – d >= 15mm: trung bình; D – d <= 10mm: yếu. 2.2.1.6. Phương pháp xác định hoạt tính KS (Egorov và cộng sự, 1969). a. Nguyên tắc. Chất KS do NS sinh ra sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định làm cho VSV không phát triển được xung quanh lỗ khoan chứa dịch KS hay khối thạch chứa nấm tạo thành vòng vô khuẩn trong suốt. b. Cách tiến hành. - Phương pháp khối thạch. + Cấy các chủng NS nghiên cứu vào MT2 (thay nước biển bằng nước cất) + Dùng khoan nút chai vô trùng khoan các khối thạch có NS cần thử hoạt tính KS. + Đặt các khối thạch vào đĩa petri có MT14 đã cấy VSV kiểm định. - Phương pháp khuếch tán trên MT thạch. + Cách thu dịch KS tương tự thu dịch enzym. Sau đó điều chỉnh pH của dịch thể về pH trung tính. Các VSV kiểm định được cấy truyền từ ống giống sang MT lỏng. + Dùng pipet vô trùng lấy 0,1ml MT lỏng có chứa VSV kiểm định nhỏ vào đĩa petri có chứa MT dinh dưỡng tương ứng (MT14). Dùng que trang vô trùng dàn đều giọt dịch VSV kiểm dịnh trên bề mặt thạch. + Dùng khoan nút chai vô trùng (d = 8mm) khoan các lỗ trên MT thạch có chứa VSV kiểm định. + Dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1ml dịch chiết KS nghiên cứu vào các lỗ khoan. + Để các đĩa petri vào tủ lạnh 4oC trong 4-8 giờ để dịch KS khuếch tán vào trong thạch rồi chuyển sang tủ ấm 30oC. Kiểm tra vòng ức chế sau 24 giờ. c. Kiểm tra kết quả. Khả năng sinh KS được đánh giá bằng hiệu số (D – d, mm). D: đường kính vòng phân giải, d: đường kính KL (lỗ thạch). D – d >= 25mm: hoạt tính KS rất mạnh; D – d >= 20mm: mạnh; D – d = 15 – 18mm: trung bình; D – d <10mm: yếu. 2.2.1.7. Phương pháp thử khả năng phân giải dầu. a. Cách tiến hành. Cấy NS trong bình tam giác 100ml chứa 50ml dầu khoáng (MT8). Sau 15 ngày nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ phòng, đo sinh khối của NS, kiểm tra sự phân bố các giọt dầu và mùi dầu để đánh giá khả năng phân giải dầu của NS. b. Cách đo sinh khối NS. Cấy bào tử NS vào bình tam giác và cân trọng lượng ban đầu bằng cân phân tích. Sau khi nuôi cấy 15 ngày, cân lại bình tam giác để biết được sinh khối NS. 2.2.1.8. Phương pháp định danh vi nấm bằng di truyền phân tử (PCR) - Lấy mẫu nấm nuôi cấy một lượng khoảng ½ hạt gạo cho vào một tube eppendorf. - Cho thêm 180μl TE1X và 20μl Prokprep rồi đem ủ ở 56oC qua đêm. - Thêm 500μl Phenol Buffer và 500μl L2 vào vortex khoảng 15 giây rồi đun sôi ở 100oC trong 15 phút. - Sấy nhẹ rồi thêm vào 250μl Chloroform/Isoamyl Alcohol vào vortex, lắc đều. Ly tâm 14.000 vòng/ phút trong 10 phút. - Hút 450 μl dịch nổi sang một tube eppendorf mới. Sau đó thêm vào 500μl Isopropanol. Giữ tube ở nhiệt độ - 20oC trong 1 đến 2 giờ. - Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC. Đổ bỏ dịch nổi. - Rửa cặn DNA 2 lần, mỗi lần cho 500μl Ethanol 70% vào, úp ngửa tube 3 – 4 lần. Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 15 phút. Đổ bỏ dịch nổi. - Làm khô cặn DNA ở 56oC trong 10 – 15 phút. - Hòa tan cặn DNA trong 50μl TE1X. Lấy 5μl dịch ly trích DNA này để thực hiện kỹ thuận PCR nấm. - Lấy 5μl DNA của vi nấm sau khi ly trích cho vào PCR mix. - Phân tích kết quả: Phát hiện sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di nhúng chìm trên gel agarose 2% hoặc điện di trên DNA chip trên hệ thống Bio Analyzer. Sản phẩm PCR có độ dài 260bp. - Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch và tiến hành giải trình tự trên hệ thống ABI 3130X hoặc CEQ 8000. Sau khi có trình tự gen của NS nghiên cứu, tiến hành so sánh với trình tự gen trong hệ thống ngân hàng gen của Mỹ để xác định chi và loài của chúng. 2.2.1.9. Phương pháp nuôi cấy NS trên MT xốp [41,42] Cho vào mỗi bình tam giác (250ml) 15g MT xốp, hấp khử trùng. Cho 10ml nước cất vào ống thạch nghiêng nuôi NS, hòa đều. Dùng que cấy, móc cà nhẹ lên bề mặt thạch để lấy hết bào tử, đánh nhẹ cho bào tử ở dạng huyền phù. Lấy 2ml dịch bào tử (khoảng 105 – 106 bào tử/1g MT). Nuôi cấy ở điều kiện thích hợp. 2.2.2. Phương pháp hóa sinh. 2.2.2.1. Phương pháp tách chiết dịch amylase thô từ canh trường nuôi cấy. Sau thời gian nuôi cấy NS, dịch chiết enzym thô được tách chiết theo phương pháp sau: Cho 100ml nước cất vào mỗi bình tam giác MT xốp đang nuôi NS. Lắc đều, giữ ở nhiệt độ 3 – 4oC, trong 30 – 45 phút để enzym khuếch tán. Sau đó, đem hỗn hợp lọc qua vải và ly tâm dịch lọc 5000 vòng/ phút trong 15 phút. Thu dịch ly tâm, rồi định mức 100ml. Ta thu được dịch enzym thô và đem xác định hoạt độ amylase. 2.2.2.2. Phương pháp xác định hoạt độ dịch hóa (Phương pháp Henkeil, 1956). a. Nguyên tắc Amylase xúc tác phản ứng thủy giải tinh bột thành đường. Lượng tinh bột còn lại sẽ phản ứng màu với iod. Xác định lượng tinh bột bị thủy giải, từ đó tính ra hoạt độ amylase theo định nghĩa: Hoạt độ amylase được biểu thị là số mg tinh bột bị thủy giải bởi 1ml dịch enzym (hay mg nguyên liệu chứa enzym) trong 1 phút ở điều kiện chuẩn 50oC, pH 6. b. Hóa chất Dung dịch NaH2PO4 0,05M Dung dịch Na2HPO4 0,05M - Dung dịch đệm phosphate 0,05M pH6: trộn 87,7ml dung dịch NaH2PO4 0,05M và 12,3ml dung dịch Na2HPO4 0,05M, thêm 100ml nước cất, đo lại pH bằng máy đo pH. - Dung dịch tinh bột 1% pha trong pH 6: lấy 50ml dung dịch đệm phosphate 0,05M đem đun sôi. Cân 1g tinh bột tan, hòa vào một ít đệm, khuấy đều, đổ vào dung dịch đệm đang sôi, vừa khuấy vừa đun sôi trong 3 phút cho đến khi dung dịch trong suốt. Định mức đến 100ml bằng dung dịch đệm. - Dung dịch iod: 1gI2 và 2gKI, thêm nước thành 100ml, bảo quản lạnh. Khi dùng pha loãng 500 lần. - Dung dịch HCl 1N: 8,4ml HCl đậm đặc pha thành 100ml. - Dung dịch HCl 0.1N: pha loãng từ dung dịch HCl 1N. c. Tiến hành thí nghiệm - Dựng đường chuẩn tinh bột. Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 Tinh bột 10mg/ml (ml) 0 1 2 3 4 5 Dung dịch đệm 10 9 8 7 6 5 Nồng độ tinh bột (mg/ml) 0 1 2 3 4 5 + Hút 1ml dung dịch từ các ống nghiệm, thêm vào 5ml dung dịch I2KI đã pha loãng 500 lần. + Đo OD ở bước sóng 560nm. + Vẽ đồ thị mối tương quan giữa nồng độ tinh bột và giá trị ΔOD. -Phản ứng enzym. Thử thật (3 ống) Thử không (3 ống) Tinh bột 1% (ml) 5 5 Dung dịch enzym (ml) 0,5 0 Để ổn nhiệt ở 50oC, 10 phút Dung dịch HCl 0,1N 5 5 Dung dịch enzym (ml) 0 0,5 * Hút 1ml dung dịch từ các ống nghiệm trên. Thêm vào mỗi ống nghiệm 5ml dung dịch I2KI đã pha loãng. * Lắc đều đem đo OD tại bước sóng 560nm. Công thức tính hoạt độ α – amylase trong 1ml dịch enzym: X * V * k Hoạt độ enzym (UI/g/phút) = t * v * m X: số tinh bột suy ra từ đường chuẩn (mg) V: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng enzym (ml) k: hệ số pha loãng v: thể tích enzym cho vào hỗn hợp phản ứng enzym (ml) t: thời gian enzym phản ứng (phút) m: khối lượng canh trường NS (g) 2.2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng đường khử (theo Miller) a. Nguyên tắc Dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử DNS. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử. Dựa theo đồ thị đường chuẩn glucose tinh khiết với thuốc thử dinitrosalisylic sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu. b. Hóa chất Thuốc thử DNS: cân 1g DNS pha trong 20ml dung dịch NaOH 2N, thêm vào 50ml nước cất và 30g muối sodium potassium tartrate. Đun nhẹ cho tan rồi định mức đến 100ml. Dung dịch glucose mẫu (500μ/ml) cân 0,5g D – glucose pha trong nước cất thành 1l. c. Cách tiến hành - Dựng đồ thị chuẩn glucose: Từ dung dịch glucose 500μ/ml chuẩn, pha các dung dịch glucose chuẩn có nồng độ 50 - 250 μg/ml - Xây dựng đường chuẩn glucose Nồng độ glucose (μg /ml) 0 50 100 150 200 250 Thể tích dung dịch glucose mẫu (ml) 0 10 20 30 40 50 Nước cất 100 90 80 70 60 50 + Cho 0,5ml dung dịch glucose chuẩn vào các ống nghiệm sạch và khô, thêm vào 0,5 ml thuốc thử DNS. Đun cách thủy trong 3 phút, làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Thêm vào mỗi ống 5ml nước cất và đo mật độ quang ở bước sóng 530nm với ống đối chứng là nước cất. + Vẽ đường chuẩn là glucose với trục tung là mật độ quang, trục hoành là nồng độ glucose. + Mẫu thí nghiệm: Phản ứng của dung dịch đường cần phân tích với thuốc thử DNS được tiến hành như trong phần xây dựng đồ thị chuẩn. + Nồng độ đường trong mẫu được xác định nhờ vào đường chuẩn glucose đã dựng. 2.2.2.4. Phương pháp xác định khả năng đường hóa. - Dịch enzym được pha loãng thêm 10 lần. - Lần lượt cho các dung dịch vào ống nghiệm theo thứ tự Thử thật Thử không Tinh bột 1% (ml) 2 2 Nước cất (ml) 5 5 Đặt vào nồi cách thủy 30oC, 10 phút Dung dịch enzym (ml) 0.5 0 Khuấy nhẹ và giữ ở nồi cách thủy 30oC, 30 phút Dung dịch HCl 1N (ml) 0.5 0.5 Dung dịch enzym (ml) 0 0.5 - Hút 0,5ml dung dịch từ mỗi ống nghiệm trên vào các ống nghiệm sạch và khô, thêm vào 0,5 ml thuốc thử DNS. Đun cách thủy trong 3 phút, làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Thêm vào mỗi ống 5ml nước cất và đo mật độ quang ở bước sóng 530nm với ống đối chứng là nước cất. - Công thức tính: Một đơn vị hoạt độ tương ứng với 1μg glucose trong thời gian thủy phân cơ chất tinh bột trong 30 phút ở nhiệt độ 30oC. a * n * V Hoạt độ enzym (UI/g/phút) = t * v * m a: hàm lượng glucose (μg/ml) V: thể tích hỗn hợp phản ứng (ml) n: hệ số pha loãng v: thể tích enzym ban đầu (ml) t: thời gian phản ứng (phút) m: khối lượng canh trưởng (g) 2.2.2.5. Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng các chủng NS. a. Xác định ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng NS. - Cấy chấm điểm các chủng NS lên MT1 trong đĩa petri. - Quan sát sự phát triển KL sau 1, 2, 3, 4, 5, 6 và 7 ngày. Đo đường kính KL mỗi ngày để xác định tốc độ sinh trưởng của KL. Quy ước: d = 1 – 2mm: mọc yếu; d = 2,1 – 5mm: mọc trung bình; d = 5,5 – 10mm: mọc tốt; d = 11 – 30mm: mọc rất tốt. b. Xác định khả năng đồng hóa nguồn C. - Sử dụng MT1, glucose lần lượt được thay thế bằng các nguồn C khác nhau: tinh bột, lactose, surcrose, maltose và galactose. Trọng lượng các chất thay thế được lấy đúng bằng hàm lượng C trong MT1. - Cấy chấm điểm các chủng NS lên các MT nghiên cứu trong đĩa petri, ủ trong tủ ấm 3 ngày. - Mẫu đối chứng là MT1. c. Xác định khả năng đồng hóa nguồn N - Sử dụng MT1 và NaNO3 lần lượt được thay bằng các nguồn N khác: NaNO2, (NH4)2SO4, NaNO3, pepton, cao thịt, cao nấm men, cao malt, bột đậu nành với hàm lượng tương tự. - Cấy chấm điểm các chủng NS lên MT nghiên cứu, ủ trong tủ ấm 3 ngày. d. Xác định khả năng chịu nhiệt của NS. Cấy chấm điểm NS nghiên cứu lên MT1, ủ ở các nhiệt độ khác nhau: 25, 30, 35, 40, 45 và 50oC trong 3 ngày. Đánh giá mức độ sinh trưởng KL dựa vào đường kính KL d (mm). e. Xác định khả năng chịu mặn của NS. - Chuẩn bị MT2 bổ sung các nồng độ muối NaCl khác nhau: 2; 3; 5; 7; 10 và 20%. - Cấy chấm điểm chủng NS nghiên cứu lên MT với các nồng độ NaCl khác nhau. - Nuôi trong tủ ấm 3 ngày. - Đo đường kính KL d (mm) của các chủng NS nghiên cứu để đánh giá khả năng chịu mặn. - Mẫu đối chứng không có nước biển. f. Xác định ảnh hưởng pH đến sự sinh trưởng NS. - Sử dụng MT1, điều chỉnh pH bằng NaOH 10% hay HCl 10% để có các giá trị pH khác nhau: 3; 4; 5; 6; 7; 8. Thanh trùng MT rồi cấy chấm điểm chủng NS nghiên cứu, ủ ấm 3 ngày. Đánh giá mức độ sinh trưởng dựa vào đường kính KL d (mm). - Mẫu đối chứng có pH là 6,5. 2.2.2.6. Xác định các yếu tố MT ảnh hưởng đến khả năng sinh amylase của NS. a. Ảnh hưởng của các nguồn tinh bột. - Cấy NS nghiên cứu vào các loại MT xốp: MT9, MT10, MT11, MT12, MT13. Sau 3 ngày, thu dịch enzym thô, tiến hành đo OD để chọn loại MT thích hợp. - Từ MT đã chọn, tiến hành chọn tỉ lệ tinh bột thích hợp cho sự tổng hợp amylase. b. Ảnh hưởng của các nguồn N. - Cấy các chủng NS nghiên cứu vào MT xốp có nguồn tinh bột tối ưu đã chọn. - Bổ sung vào MT xốp các nguồn N (tỉ lệ 0,5%) khác nhau: bột đậu nành, NaNO3, cao nấm men, cao thịt, pepton, (NH4)2SO4 . - Sau 3 ngày nuôi cấy, thu dịch enzym thô, tiến hành đo OD để chọn MT có bổ sung nguồn N thích hợp. - Sau khi chọn được nguồn N thích hợp, tiến hành chọn tỉ lệ N tối ưu cho sự tổng hợp amylase của các chủng NS nghiên cứu. Các tỉ lệ nghiên cứu: 0,5%, 1%, 2%, 3% v à 5%. c. Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả năng sinh amylase của NS. - Cấy chủng NS nghiên cứu vào MT xốp thích hợp. - Xác định ảnh hưởng nhiệt độ khả năng sinh amylase các chủng NS ở các nhiệt độ nuôi cấy từ 25, 30, 35, 40, 45 v à 50oC. - Khảo sát khả năng sinh amylase bằng đo OD. d. Ảnh hưởng của độ mặn MT đến khả năng sinh amylase của NS. - Nuôi cấy các chủng NS trên MT xốp có nguồn C và N tối ưu, với các nồng độ muối khác nhau NaCl 0, 2, 3, 5, 7 v à 10%. - Ủ ở nhiệt độ tối ưu. e. Ảnh hưởng của pH MT đến khả năng sinh amylase của NS. - Nuôi cấy các chủng NS ở những pH khác nhau 4 đến 8 (bước nhảy 0,5) để xác định ảnh hưởng pH đến khả năng sinh amylase của các chủng NS. - Dùng HCl 5% và NaOH 5% điều chỉnh pH thích hợp. f. Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh amylase của NS. - Cấy mỗi chủng NS vào MT xốp với các điều kiện tối ưu trên. - Thu dịch enzym thô sau các thời gian khác nhau: từ 12 đến 120 giờ (bước nhảy là 12) để tiến hành đo OD chọn thời gian tối ưu. 2.2.2.7. Phương pháp thu enzym bán tinh khiết [27] Chế phẩm enzym thô thu được từ nuôi cấy theo phương pháp bề mặt được giã bằng cối, chày sứ với sự trợ giúp của cát thạch anh hay bột thủy tinh. Sau đó, bổ sung lượng nước gấp 4 – 5 lần khối lượng canh trường để hòa tan enzym từ khối canh trường. Lọc và thu dịch lọc, bảo quản lạnh 4oC. Dùng cồn lạnh (4oC) lượng gấp 2 – 2.5 lần lượng dịch enzym đổ từ từ vào dịch lọc enzym, khuấy rất nhẹ để cồn hòa đều với dịch enzym. Đưa hỗn hợp vào tủ lạnh. Sau 15 -24 giờ, hỗn hợp phân thành 2 lớp. Đem ly tâm hay lọc để thu enzym dạng tủa. Sấy khô nhẹ ở nhiệt độ < 40oC để thu chế phẩm amylase bán tinh khiết. 2.2.2.8. Xác định các điều kiện ảnh hưởng đến hoạt tính và độ bền của amylase. a. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính và độ bền của amylase [43, 80]. - Xác định ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt động của amylase: cho dịch amylase và dịch tinh bột 1% phản ứng với nhau ở các nhiệt độ khác nhau: 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100oC trong 5 phút. Xác định hoạt độ amylase bằng đo OD theo Henkeil hay Miller. - Xác định độ bền nhiệt của amylase: dịch amylase được giữ trong dung dịch đệm có pH thích hợp ở các nhiệt độ khác nhau 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90,100oC. Sau đó xác định hoạt độ amylase. Độ bền enzym được tính bằng số % hoạt độ còn lại trong các dịch đã xử lý nhiệt độ, đối chứng là hoạt độ của dịch enzym không xử lý nhiệt độ và giữ ở nhiệt độ 4oC. b. Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của amylase. [43, 80]. Cho amylase phản ứng với tinh bột trong 5 phút trong các dung dịch đệm có pH khác nhau: 2 đến 8 (bước nhảy là 0,5). Các dung dịch đệm sử dụng là: pH = 2 – 3,5 : dung dịch đệm Theorella và Steinhagen pH = 3,5 – 5,5 : dung dịch đệm acetate pH = 5,5 – 8,0 : dung dịch đệm phosphate. Xác định hoạt độ amylase bằng đo OD. 2.2.2.9. So sánh hoạt độ của amylase thu được từ các chủng nấm nghiên cứu với amylase đang lưu hành trên thị trường. Enzym chuẩn được sử dụng là chế phẩm amylase Ter của Viện sinh học nhiệt đới. Các mẫu enzym được pha loãng ở nồng độ thích hợp rồi xác định hoạt độ bằng đo OD. Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng NS có khả năng sinh amylase từ RNM Cần Giờ. 3.1.1. Phân lập theo truyền thống. Với nguồn phân lập từ các mẫu đất mặt, đất sâu, lá mục, lá vàng, cành mục, cành khô tại RNM Cần Giờ, chúng tôi thu được 192 chủng với phân bố như sau. Bảng 3.1. Sự phân bố các chủng NS. Cơ chất phân lập Số lượng chủng NS Tỉ lệ % Đất -Đất mặt -Đất sâu 55 40 15 28,64 20,83 7,81 Cành -Cành khô -Cành mục 81 4 78 42,71 2,08 40,63 Lá -Lá vàng -Lá mục 56 15 40 28,65 7,81 20,84 Kết quả trên cho thấy RNM Cần Giờ có hệ NS khá phong phú. Chúng phân bố rộng rãi với số lượng khá lớn. Các chủng NS có mặt ở hầu hết mọi cơ chất tại RNM Cần Giờ. Số lượng các chủng cao nhất ở cành mục (40,63%), sau đến đất mặt, lá mục (20,84%). Có lẽ cành mục là nguồn ủ chất đang phân hủy có đủ độ ẩm và các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng của VSV hiếu khí như NS. Trong đó, số chủng nấm có mặt ở thân cây chiếm tỉ lệ cao (42,71%), nhất là thân mục. Kết quả thu được cũng cho thấy vai trò quan trọng của NS trong việc phân giải xác TV ở RNM Cần Giờ. Bảng 3.2. Kết quả khảo sát hoạt tính phân giải tinh bột của các chủng NS phân lập theo truyền thống STT Chủng D-d (mm) STT Chủng D-d (mm) 1 CK1.2P 3.0 44 CM40.1A 0.0 2 CK2.2A 0.0 45 CM41.1P 10.0 3 CK4.2P 0.0 46 CM42.1P 5.7 4 CK3.2P 1.0 47 CM43.1P 7.0 5 CM1.4P 0.0 48 CM44.1 2.3 6 CM2.4P 0.0 49 CM45.1 2.0 7 CM3.4P 0.0 50 CM46.1 3.0 8 CM4.3P 0.0 51 CM47.1 4.0 9 CM5.1P 10.0 52 CM48.3 1.5 10 CM6.3P 0.0 53 CM49.1 4.0 11 CM7.4P 0.0 54 CM50.1 2.3 12 CM8.4P 0.0 55 CM51.1 5.3 13 CM9.4P 1.0 56 CM52.1 3.3 14 CM10.3P 0.0 57 CM53.1 0.0 15 CM11.4P 0.0 58 CM54.1 0.0 16 CM12.4P 0.0 59 CM55.4 1.0 17 CM13.4P 0.0 60 CM56.2 6.0 18 CM14.4P 0.0 61 CM57.4 1.0 19 CM15.1A 0.0 62 CM58.2 2.0 20 CM16.1P 0.0 63 CM59.2 2.0 21 CM17.1P 1.0 64 CM60.3 1.0 22 CM18.3A 8.0 65 CM61.4 25.3 23 CM19.2P 0.0 66 CM62.1 4.0 24 CM20.4P 0.0 67 CM63.2 20.3 25 CM21.3A 18.0 68 CM64.1 16.0 26 CM22.3P 0.0 69 CM65.2 0.0 27 CM23P 0.0 70 CM66.1 1.5 28 CM24.3P 3.0 71 CM67.4 3.7 29 CM25.1P 0.0 72 CM68.3 0.0 30 CM26.1A 2.3 73 CM69.4 0.0 31 CM27.3P 0.0 74 CM70.3 0.0 32 CM28.1P 0.0 75 CM71.1 0.0 33 CM29.2P 0.0 76 CM72.1 0.0 34 CM30.1P 0.0 77 CM73.4 0.0 35 CM31.1P 0.0 78 CM74.1 0.0 36 CM32.3P 1.3 79 CM75.1 4.0 37 CM33.2A 0.0 80 CM76.4 0.0 38 CM34.1A 0.0 81 CM77.3 0.0 39 CM35.1P 0.0 82 CM78.1 2.0 40 CM36.3P 3.0 83 Đ1.2A 0.0 41 CM37.1P 3.3 84 Đ2.3A 8.3 42 CM38.1P 0.0 85 Đ3.1A 2.0 43 CM39.1A 0.0 86 Đ4.4P 0.5 Bảng 3.2 (tt) STT Chủng D-d (mm) STT Chủng D-d (mm) STT Chủng D-d (mm) 87 Đ5.3A 0.0 123 ĐS1.3A 0.0 158 LM6.1A 0.0 88 Đ6.1P 0.0 124 ĐS2.3P 6.0 159 LM7.3A 0.0 89 Đ7.3A 1.0 125 ĐS3.3A 0.0 160 LM8.1A 0.0 90 Đ8.2A 0.0 126 ĐS4.1P 0.0 161 LM9.1A 0.0 91 Đ9.2A 4.7 127 ĐS5.1P 4.0 162 LM10.3A 6.0 92 Đ10.3A 2.7 128 ĐS6.1P 0.0 163 LM11.2P 5.0 93 Đ11.3P 15.0 129 ĐS7.3P 8.0 164 LM12.3A 0.0 94 Đ12.3A 0.0 130 ĐS8.3A 0.0 165 LM13.3A 0.0 95 Đ15.3A 0.0 131 ĐS9.3P 0.0 166 LM14.3P 5.0 96 Đ16.2P 0.0 132 ĐS10.2P 14.7 167 LM15.3A 5.0 97 Đ17.3A 0.0 133 ĐS11.2P 0.0 168 LM16.1A 0.0 98 Đ18.2P 1.0 134 ĐS12.1P 0.0 169 LM17.1P 15.7 99 Đ19.3P 0.0 135 ĐS13.3P 4.0 170 LM18.1P 7.0 100 Đ20.3P 0.0 136 ĐS14.1P 0.0 171 LM19.1P 0.0 101 Đ21.2A 0.0 137 ĐS15.1P 0.0 172 LM20.4P 8.0 102 Đ22.3P 0.0 138 L1.1P 5.0 173 LM21.1P 5.0 103 Đ23.3A 0.0 139 L2.3P 11.3 174 LM22.4P 6.0 104 Đ24.1A 0.0 140 L3.3A 10.0 175 LM23.4P 7.0 105 Đ25.1A 0.0 141 L4.3A 3.3 176 LM24.2P 0.0 106 Đ26.3P 0.0 142 L5.3A 8.0 177 LM25.2P 15.7 107 Đ27.2P 0.0 143 L6.3A 12.0 178 LM26.2 27.0 108 Đ28.3A 8.0 144 L7.2A 11.7 179 LM27.1 2.3 109 Đ29.3A 0.0 145 L8.2A 6.7 180 LM28.2 0.0 110 Đ30.1P 18.3 146 L9.2A 7.0 181 LM29.1 2.0 111 Đ31.3A 0.0 147 L10.4 0.0 182 LM30.1 2.3 112 Đ32.3 12.0 148 L11.4 1.0 183 LM31.4 1.0 113 Đ33.2 0.0 149 L12.2 1.0 184 LM32.1 0.0 114 Đ34.4 0.0 150 L13.2 1.3 185 LM33.3 20.3 115 Đ35.1 0.3 151 L14.4 6.0 186 LM34.1 1.0 116 Đ36.4 0.0 152 L15.3 14.3 187 LM35.1 1.0 117 Đ37.1 0.0 153 LM1.1P 0.0 188 LM36.2 28.3 118 Đ14.2 0.7 154 LM2.1A 6.0 189 LM37.1 0.0 119 Đ13.2 0.2 155 LM3.1P 0.0 190 LM38.2 1.0 120 Đ40.2 0.0 156 LM4.2A 8.7 191 LM39.2 14.0 121 Đ39.2 2.3 157 LM5.4A 0.0 192 LM40.1 15.8 122 Đ38.3 10.0 3.1.2. Phân lập nhanh các chủng NS có hoạt tính amylase. Theo phương pháp này, chúng tôi thu được 97 chủng NS có khả năng sinh amylase. Kết quả theo bảng 3.3. Bảng 3.3. Kết quả khảo sát hoạt tính phân giải tinh bột của các chủng NS phân lập có mục tiêu STT Chủng D-d (mm) STT Chủng D-d (mm) STT Chủng D-d (mm) 1 BKMB1.1 14.2 34 LHKM3.2 14.0 66 TKM1.7 10.7 2 BKMB1.2 9.0 35 LHKM3.3 10.0 67 TKM2.1 3.3 3 BKMB2 12.0 36 LHKM3.5 7.0 68 TKM2.2 4.0 4 BKMB2.2 4.0 37 LHKM3.6 23.0 69 TKM2.3 3.0 5 BKMB3.1 15.3 38 LHKM4.1 14.0 70 TKM2.4 17.0 6 BKMB3.2 8.0 39 LNKM1.1 4.0 71 TKM2.5 18.7 7 BKMB3.3 11.8 40 LNKM1.2 12.0 72 TKM2.6 3.0 8 BKMB3.4 10.0 41 LNKM1.3 8.0 73 TKM2.7 3.0 9 BKKMB4.1 16.0 42 LNKM1.4 8.7 74 TKM3 30.0 10 BKMB4.2 8.0 43 LNKM1.5 6.0 75 TKM3.2 20.0 11 BKMB4.3 6.2 44 LNKM2.1 7.2 76 TKM3.3 3.5 12 BKMB5.1 29.0 45 LNKM2.2 13.8 77 TKM3.4 10.0 13 BKMB5.2 2.2 46 LNKM2.3 8.0 78 TKM3.5 7.0 14 LHKMB1 9.0 47 LNKM2.4 5.0 79 TKM3.6 20.7 15 LHKMB1.2 9.2 48 LNKM2.5 10.0 80 TKM3.7 5.7 16 LHKMB1.3 9.3 49 LNKM3.1 10.0 81 TKM4.1 5.8 17 LHKMB1.4 18.2 50 LNKM3.2 14.0 82 TKM4.2 12.0 18 LHKMB2.1 10.3 51 LNKM3.3 29.5 83 TKM4.3 14.3 19 LHKMB2.2 10.0 52 LNKM3.4 11.8 84 TKM4.6 6.7 20 LHKMB2.3 6.0 53 LNKM3.5 24.3 85 TKM5.1 7.3 21 LHKMB2.5 11.0 54 LNKM4 19.0 86 TKM5.2 15.0 22 LHKMB2.6 9.7 55 LNKM1.1 30.0 87 TKM5.3 18.0 23 LHKMB3 8.0 56 LNKM1.2 8.5 88 TKM5.4 8.0 24 LHKMB3.2 12.0 57 LNKMB2 3.0 89 TKM6 11.0 25 LHKMB4 5.0 58 LNKMB3 8.0 90 TKMB1 6.2 26 LHKMB4.2 12.0 59 LNKMB4 18.0 91 TKMB2 12.0 27 LHKMB4.3 24.0 60 TKM1.1 14.0 92 TKMB2.1 7.7 28 LHKMB4.4 10.0 61 TKM1.2 12.0 93 TKMB3 20.5 29 LHKMB4.5 8.2 62 TKM1.3 10.0 94 TKMB4.1 10.0 30 LHKM2.4 12.0 63 TKM1.4 4.0 95 TKMB5.1 6.0 31 LHKM2.5 11.8 64 TKM1.5 6.0 96 TKMB5.2 12.0 32 LHKM3.4 10.0 65 TKM1.6 8.0 97 TKMB5.3 4.0 33 LHKM3 4.3 Bảng 3.4. Tóm tắt kết quả khảo sát khả năng sinh amylase các chủng NS theo phương pháp phân lập Hoạt tính amylase dựa theo vòng phân giải (D – d mm) Hình thức phân lập Mạnh Khá mạnh Trung bình Yếu Không có Truyền thống 3 (1,56%) 2 (1,05%) 5 (2,60%) 88 (45,83%) 94 (48,96%) Có mục tiêu 4 (4,12%) 6 (6,19%) 10 (10,31%) 77 (79,38%) 0 Tổng cộng 7 (2,42%) 8 (2,77%) 15 (5,19%) 165 (33,91%) 55,71% Phương pháp phân lập theo truyền thống cho thấy số chủng có khả năng sinh amylase chiếm tỉ lệ rất thấp 98 chủng, trong đó có 3 chủng mạnh (1,56%), 2 chủng khá mạnh (1,05%). Trong khi đó, phương pháp phân lập có mục tiêu (sử dụng MT có chất cảm ứng) cho 97/97 chủng NS có hoạt tính amylase. Trong số này có 4 chủng rất mạnh (4,12%), 6 chủng mạnh (6,19%). Kết quả này cũng cho thấy số lượng các chủng NS ở RNM Cần Giờ có hoạt tính amylase mạnh chiếm tỉ lệ rất ít (2,42%), trong khi đó tỉ lệ các chủng NS sinh amylase yếu hoặc không có amylase chiếm rất cao. Điều này cũng dễ hiểu vì RNM Cần Giờ có lượng cơ chất tinh bột không nhiều so với lượng chất hữu cơ giàu cellulose và chitine.. Ngoài ra, quá trình phân giải các hợp chất chứa tinh bột trong tự nhiên diễn ra rất chậm không chỉ dựa vào hệ NS mà còn có sự tham gia của nhiều VSV khác như VK, xạ khuẩn,.. Từ kết quả này, chúng tôi chọn 07 chủng NS có hoạt tính amylase mạnh nhất tiếp tục nghiên cứu. 3.1.3. Tuyển chọn lần 2 các chủng NS có khả năng sinh amylase cao. Để đánh giá chính xác khả năng sinh amylase của các chủng thu được, chúng tôi tiến hành xác định hoạt độ α – amylase và glucoamylase của các chủng nấm trên theo phương pháp trong phần 2.2.2.1 và 2.2.2.3. Kết quả thu được theo bảng 3.5, minh họa ở biểu đồ 3.1 và 3.2. Qua bảng 3.5, chúng ta thấy các chủng đều có hoạt độ amylase khá cao. Kết quả định tính và định lượng enzym của các chủng tương đối phù hợp. Chúng tôi quyết định chọn hai chủng BKMB5.1 và TKM3 vừa có vòng phân giải tinh bột lớn, vòng phân giải trong suốt và có giá trị hoạt độ amylase cao nhất để nghiên cứu tiếp. Bảng 3.5. Hoạt độ amylase của các chủng NS tuyển chọn. Hoạt độ STT Chủng Nguồn gốc phân lập Hoạt tính amylase (D-d,mm) α – amylase Glucoamylase 1 LM26.2 Lá mục 27 39,02 2018,67 2 CM61.4 Cành mục 25,3 21,12 1763,91 3 LM36.2 Lá mục 28,3 32,42 1905,82 4 BKMB5.1 Phân lập có mục tiêu 29 42,12 2273,16 5 LNKM4.2 Phân lập có mục tiêu 28,5 38,62 2003,42 6 LNKM3.4 Phân lập có mục tiêu 29 36,32 1943,01 7 TKM3 Phân lập có mục tiêu 30 42,32 2317,98 0 10 20 30 40 50 H oạ t đ ộ e nz ym a m yl as e LM26.2CM61.4LM36.2BKMB5.1LNKM4.2LNKM3.4TKM3 Chủng Biểu đồ 3.1. Hoạt độ α –amylase của 7 chủng NS 0 500 1000 1500 2000 2500 H oạ t đ ộ e nz ym a m yl as e LM26.2 CM61.4 LM36.2 BKMB5.1 LNKM4.2 LNKM3.4 TKM3 Chủng Biểu đồ 3.2. Hoạt độ glucoamylase của 7 chủng NS TKM3 BKMB5.1 LNKM3.4 Hình 3.1.Vòng phân giải tinh bột của một số chủng NS. 3.2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái và phân loại 2 chủng NS. 3.2.1. Phân loại đến chi. Chúng tôi tiến hành cấy 2 chủng NS đã tuyển chọn được theo phương pháp 2.2.1.3. trên MT1. Các đặc điểm đại thể và vi thể được mô tả trong bảng 3.6.và minh họa bởi hình 3.2 cho thấy 2 chủng trên đều thuộc chi Aspergillus (Bùi Xuân Đồng, 2004). Bảng 3.6. Đặc điểm hình thái đại thể, vi thể và phân loại đến chi của 2 chủng nấm. Đặc điểm chủng NS nghiên cứu Đặc điểm phân loại tương ứng theo Bùi Xuân Đồng (2004) B K M B 5. 1 - Hình thái đại thể: KL tròn, bề mặt trơn, nhung mịn, có rãnh nhăn đồng tâm, có vết lõm giữa. KL khi non có màu trắng sữa, khi già có màu xanh xám nhạt. Mặt trái khi non có màu vàng nhạt, càng về già càng ngả màu nâu đỏ về sau chuyển thành nâu sậm. Không tiết sắc tố, không có giọt tiết. - Hình thái vi thể: Sợi nấm có vách ngăn, có phân nhánh màu trắng xám. Cuống sinh bào tử không phân nhánh, đầu phình to thành bọng ngắn, mang thể bình hình chai một tầng. Bào tử trần có hình bầu dục đến hình cầu, vách dày, sần sùi. TK M 3 - Hình thái đại thể: KL có dạng tròn, bột rời. Bào tử khi non có màu vàng lục về già chuyển thành màu nâu lục. Mặt trái có màu trắng. Không có gịọt tiết và sắc tố. - Hình thái vi thể: Khối bào tử trần, đỉnh bọng hình tia tỏa tròn. Cuống sinh bào tử không phân nhánh, đầu phình to thành bọng ngắn, mang thể bình hình chai một tầng. Bào tử trần hình cầu nhẵn. As pe rg ill us - Hình thái đại thể: KL tròn dạng nhung mịn hay bột rời. Hệ sợi nấm gồm các sợi ngăn vách, phân nhánh, không màu hay màu nhạt. - Hình thái vi thể: Khối bào tử trần đỉnh bọng có hình cột, hình cầu hay hình tia tỏa tròn, giá bào tử trần nhẵn hay ráp. Bọng đỉnh giá hình chùy hay gần cầu, mang cuống thể bình và thể bình hay chỉ thể bình. Bào tử hình cầu hay elip, nhẵn, ráp hay gai mịn. Hình thái đại thể (mặt phải và mặt trái) và vi thể của chủng TKM3 Hình thái đại thể (mặt phải và mặt trái) và vi thể của chủng BKMB5.1 Hình 3.2. Hình thái đại thể và vi thể của hai chủng NS. Từ kết quả này chúng tôi tiến hành định danh đến loài hai chủng nấm tại NK-Biotek (Công ty Nam Khoa). 3.2.2. Phân loại đến loài bằng di truyền phân tử. (PCR). Kết quả: Chủng BKMB5.1 có tên loài là Aspergillus protuberus và chủng TKM3 có tên loài là Aspergillus oryzae. 3.3. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và hoạt độ amylase của hai chủng NS đã tuyển chọn. 3.3.1. Ảnh hưởng nguồn C đến sinh trưởng. Kết quả được trình bày ở bảng 3.7. Từ kết quả bảng 3.7, chúng ta thấy cả hai chủng NS đều sinh trưởng và phát triển được ở các loại MT có nguồn C khác nhau. Tuy nhiên, chúng sinh trưởng chỉ mạnh bằng hoặc kém hơn ở MT đối chứng. Cả hai chủng đều phát triển được ở MT tinh bột với đường kính KL tương đương hay kém hơn một chút so với MT đối chứng. Điều này chứng tỏ nguồn C cung cấp từ tinh bột thích hợp cho sinh trưởng và phát triển của hai chủng này. Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nguồn C đến sinh trưởng của hai chủng NS. Mức độ phát triển Nguồn C Asp.oryzae Asp.protuberus Đối chứng 32,0 4,5 Tinh bột 29,0 4,5 Galactose 26,3 4,0 Lactose 23,5 3,5 Maltose 29,0 2,5 Succrose 25,5 4,0 Ngoài ra, trong hai chủng NS ta cũng có thể thấy rõ chủng Asp.oryzae sinh trưởng rất mạnh ở nhiều loại MT có nguồn C khác nhau và mạnh hơn hẳn so với chủng Asp.protuberus. Chủng Asp.protuberus có mức độ phát triển rất yếu ở các loại MT. 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 M ức độ p há t t ri ển (m m ) Đối chứng Tinh bột Galactose Lactose Maltose Succrose Nguồn cacbon Asp.oryzae Asp.protuberus Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của nguồn C đến sinh trưởng của hai chủng NS. 3.3.2. Ảnh hưởng của nguồn tinh bột đến hoạt độ amylase. Bảng 3.8. Ảnh hưởng của MT tinh bột đến hoạt độ α-amylase của hai chủng NS. Hoạt độ amylase (UI/g/phút) Asp.oryzae Asp.protuberus MT α - amylase Glucoamylase α - amylase glucoamylase MT9 44,26 2385,19 31,12 2011,85 MT10 35,31 2322,96 41,46 2285,63 MT11 42,26 2322,96 42,38 2290,82 MT12 41,46 2385,19 41,77 2240,00 MT13 38,91 2115,56 41,48 1711,11 Xét về ảnh hưởng của MT tinh bột đến khả năng sinh amylase, kết quả trình bày ở bảng 3.8, chúng ta thấy cả hai chủng NS đều cho hoạt lực amylase tương đối cao. Chủng Asp.oryzae có sự sinh trưởng mạnh hơn chủng Asp.protuberus nhiều, do đó hoạt lực cả hai loại amylase đều cao hơn hẳn. Do sự thích ứng với từng MT khác nhau nên ta thấy mỗi chủng cho hoạt độ amylase cao ở những MT khác nhau. MT13 có thành phần bã khoai mì cao hơn các MT khác tạo nên độ xốp nhiều nhưng làm cho MT có phần nghiêng về cơ chất cellulose nhiều hơn là tinh bột. Do đó ta thấy hoạt độ cả hai loại amylase ở hai chủng đều thấp. 0.000 5.000 10.000 15.000 20.000 25.000 30.000 35.000 40.000 45.000 H oạ t đ ộ e nz ym a m yl as e MT9 MT10 MT11 MT12 MT13 Nguồn cacbon Asp.oryzae Asp.protuberus Biểu đồ 3.4: Ảnh hưởng của nguồn C đến khả năng sinh α – amylase của hai chủng NS. 0 500 1000 1500 2000 2500 H oạ t đ ộ e nz ym a m yl as e MT9 MT10 MT11 MT12 MT13 Nguồn cacbon Asp.oryzae Asp.protuberus Biểu đồ 3.5: Ảnh hưởng của nguồn C đến khả năng sinh glucoamylase của hai chủng NS. Chủng Asp.oryzae cho hoạt độ enzym này cao nhất ở MT9 do có khả năng phân giải được tinh bột trong cám gạo và cả trong bã khoai mì. Điều này chứng tỏ MT9 có hàm lưọng tinh bột thích hợp làm cơ chất cảm ứng và cũng tạo độ xốp phủ hợp cho việc sinh α – amylase và glucoamylase của chủng Asp.oryzae. Do đó, chúng tôi quyết định chọn MT này để nghiên cứu sâu hơn về chủng Asp.oryzae. Trong khi đó, chủng Asp.protuberus sinh trưởng yếu hơn nên với MT có bổ sung thêm bắp và bã khoai mì với tỉ lệ như nhau thì sinh α – amylase mạnh hơn hẳn các MT khác. Chủng nấm này sinh 2 loại amylase có hoạt độ cao nhất ở MT11. Từ kết quả này, chúng tôi quyết định chọn MT9 cho chủng Asp.oryzae và MT11 cho chủng Asp.protuberus để nghiên cứu tiếp về ảnh hưởng tỉ lệ cám gạo và trấu đến hoạt độ amylase của hai chủng NS. Kết quả được trình bày ở bảng 3.9. Các MT được sử dụng cho chủng Asp.oryzae là: - 90% cám gạo; 5% trấu; 5% bã khoai mì (MT9A) - 70% cám gạo; 25% trấu; 5% bã khoai mì (MT9) - 50% cám gạo; 45% trấu; 5% bã khoai mì (MT9B). - 30% cám gạo; 65% trấu; 5% bã khoai mì (MT9C). Các MT được sử dụng cho chủng Asp.protuberus là: - 90% cám gạo; 0% trấu; 5% bắp mảnh; 5% bã khoai mì (MT11A). - 70% cám gạo; 0% trấu; 15% bắp mảnh; 15% bã khoai mì (MT11B). - 50% cám gạo; 17% trấu; 16,5% bắp mảnh; 16,5% bã khoai mì (MT11). - 30% cám gạo; 37% trấu; 16,5% bắp mảnh; 16,5% bã khoai mì (MT11C). Bảng 3.9. Ảnh hưởng của tỉ lệ cám-trấu đến hoạt độ α-amylase và glucoamylase của hai chủng NS. Hoạt độ amylase (UI/g/phút) của chủng Asp.oryzae Hoạt độ amylase (UI/g/phút) của chủng Asp.protuberus MT α - amylase glucoamylase MT α – amylase glucoamylase 9 44,19 2374,82 11 42,62 2285,63 9A 38,73 2157,04 11A 33,45 1659,26 9B 40,61 2322,96 11B 42,12 2115,56 9C 36,00 2136,30 11C 42,00 2188,15 Kết quả trên cho thấy, tỉ lệ cám-trấu đều ảnh hưởng đến hoạt độ của hai loại amylase. Trong đó, ảnh hưởng đến hoạt độ α-amylase rõ nét hơn glucoamylase. Những MT có tỉ lệ cám quá cao (MT9A và MT11A) sẽ làm MT có độ bết, thiếu không khí nên NS không sinh trưởng được nên có hoạt độ enzym thấp. MT có tỉ lệ trấu cao sẽ có độ thoáng khí, nhưng tỉ lệ cám thấp cũng làm hạn chế sinh trưở ng và sinh amylase của NS. Vậy, theo chúng tôi, MT9 và MT11 là MT cung cấp nguồn tinh bột thích hợp cho NS sinh hai loại amylase mạnh. Kết quả được minh họa ở biểu đồ 3.6 và 3.7. 0 10 20 30 40 50 H oạ t đ ộ a m yl as e 9 9A 9B 9C MT Asp.oryzae 0 10 20 30 40 50 H oạ t đ ộ a m yl as e 11 11A 11B 11C MT Asp.protuberus Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của tỉ lệ cám-trấu đến hoạt độ α-amylase của hai chủng NS. 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 H oạ t đ ộ a m yl as e 9 9A 9B 9C MT Asp.oryzae 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 H oạ t đ ộ a m yl as e 11 11A 11B 11C MT Asp.protuberus Biểu đồ 3.7. Ảnh hưởng của tỉ lệ cám-trấu đến hoạt độ glucoamylase của hai chủng NS. 3.3.3. Ảnh hưởng của nguồn N. Tiến hành nghiên cứu với MT9 (đối với chủng Asp.oryzae) và MT11 (đối với chủng Asp.protuberus) có bổ sung các nguồn N khác nhau theo mục 2.2.2.6. Kết quả được trình bày ở bảng 3.10 và minh họa bằng biểu đồ 3.8 cho thấy cả hai chủng đều có khả năng đồng hóa các nguồn N hữu cơ và vô cơ khác nhau. Với các nguồn N khác nhau này, cả hai chủng đều có sự sinh trưởng và phát triển rất mạnh so với mẫu đối chứng. Tuy nhiên, với những nguồn N khác nhau ta thấy màu sắc của KL ở hai chủng cũng có sự khác nhau so với mẫu đối chứng. Chủng Asp.oryzae có sự phát triển mạnh ở MT có bổ sung cao thịt và cao nấm men. Tuy nhiên, ở MT này KL không có màu sắc đặc trưng của chủng, màu sắc rất nhạt. Ở MT bổ sung bột đậu nành và NaNO3, chúng ta thấy KL phát triển tốt và có màu sắc rất đẹp, đặc trưng của chủng Asp.oryzae. Do đó, chúng tôi cho rằng ở MT có bổ sung bột đậu nành hay NaNO3 thì chủng Asp.oryzae phát triển tốt nhất, trong đó bột đậu nành kích thích KL phát triển mạnh hơn NaNO3. Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nguồn N đến sinh trưởng của hai chủng NS. Mức độ phát triển (mm) Nguồn N Aspergillus oryzae Asppergillus protuberus Đối chứng 32 4.5 NaNO3 29.5 5.5 NaNO2 30.5 5.5 Cao nấm men 48.5 8 Cao malt 46 7.5 Cao thịt 50.5 8.5 Bột đậu nành 45 7 Pepton 47 9 Trong khi đó, chủng Asp.protuberus lại phát triển mạnh ở MT có bổ sung cao nấm men, cao thịt hay pepton. Với MT có bổ sung pepton, chủng nấm này phát triển mạnh nhất. Đây cũng là điều dễ hiểu vì chủng này có sự phát triển rất yếu so với chủng Asp.oryzae. Các nguồn N từ cao nấm men, cao thịt hay pepton đều là nguồn N dễ tiêu, dễ sử dụng cho sinh trưởng và phát triển hơn là bột đậu nành, nitrat và nitrit. Ngoài ra, chúng ta cũng có thể thấy cả hai chủng đều có thể phát triển được ở MT có bổ sung nitrit (NaNO2), chứng tỏ chúng thích nghi được với MT tự nhiên ở RNM Cần Giờ, nơi có nhiều xác động TV phân hủy và sử dụng được các nguồn đạm này cho sinh trưởng. Đồng thời, khi nghiên cứu ảnh hưởng các nguồn N khác nhau đến khả năng sinh amylase cao của hai chủng nấm này cũng cho kết quả tương ứng. Bột đậu nành Cao malt NaNO3 NaNO2 Pepton Cao nấm men Cao thịt Đối chứng Hình 3.3. Ảnh hưởng của các nguồn N khác nhau đến sinh trưởng của chủng Asp.oryzae Bột đậu nành Cao malt NaNO3 NaNO2 Pepton Cao nấm men Cao thịt Đối chứng Hình 3.4. Ảnh hưởng của các nguồn N khác nhau đến sinh trưởng của chủng Asp.protuberus Bảng 3.11. Ảnh hưỏng của nguồn N đến hoạt độ α - amylase và glucoamylase của hai chủng NS. Hoạt độ amylase (UI/g/phút) Asp.oryzae Asp.protuberus Nguồn N (0,5%) Α - amylase Glucoamylase α - amylase glucoamylase Bột đậu 44,26 2571,82 32,32 2322,96 NaNO3 44,15 2520,00 42,47 2302,22 (NH4)2SO4 42,50 2322,96 35,93 1389,63 Cao nấm men 43,11 2602,96 43,11 2177,78 Pepton 43,82 2405,93 43,58 2260,74 Cao thịt 42,50 2136,30 43,53 2240,00 Từ bảng 3.11, chúng ta có thể thấy khi được bổ sung N, cả hai chủng NS đều sinh amylase mạnh hơn hẳn, đặc biệt với MT có bổ sung nguồn N là bột đậu nành của chủng Asp.oryzae. Đây là một ưu điểm vì bột đậu nành là nguồn N tự nhiên dễ kiếm và rẻ tiền, thích hợp cho việc nuôi cấy NS sinh enzym với số lượng lớn. Kết quả này cho thấy có sự phù hợp giữa sinh trưởng và khả năng sinh amylase cao khi MT nuôi cấy được bổ sung bột đậu nành. Đây chính là một điểm thuận lợi khi đưa chủng NS này vào sản xuất với số lượng lớn. Trong khi đó, pepton chính là nguồn đạm bổ sung hợp lý cho sinh trưởng sinh tổng hợp α - amylase của chủng Asp.protuberus, nhưng hoạt độ glucoamylase của chủng này thì cao nhất với bột đậu nành. Vì pepton là nguồn đạm có giá thành khá cao, nên chúng tôi quyết định tiến hành nghiên cứu tiếp về nguồn N bột đậu nành với các nồng độ khác nhau để thu được kết quả khả quan hơn về khả năng sinh amylase cao của chủng nấm này. Ngược lại, chúng ta cũng thấy việc bổ sung (NH4)2SO4 vào MT đều gây ức chế khả năng sinh cả hai loại enzym ở cả hai chủng. Kết quả khảo sát ở bảng 3.12 cho thấy, tỉ lệ bột đậu bổ sung vào MT ảnh hưởng khá mạnh đến khả năng sinh amylase của hai chủng nấm. Tuy có sự khác nhau về tỉ lệ, nhưng nhìn chung, sự sinh tổng hợp cả hai loại amylase của hai chủng đều tăng rõ rệt, đặc biệt là chủng Asp.protuberus, khi được bổ sung tỉ lệ bột đậu nành phù hợp. Vì MT tinh bột có sự khác nhau, do đó nhu cầu bổ sung thêm tỉ lệ N của hai chủng cũng có khác nhau. Bột bắp ở MT11 đã có sẵn một lượng N tương đối, do đó nhu cầu bổ sung thêm bột đậu nành của chủng Asp.protuberus thấp hơn so với chủng Asp.oryzae. 0 10 20 30 40 50 60 M ức độ p há t t riể n (m m ) Đối chứng NaNO3 NaNO2 Cao nấm men Cao malt Cao thịt Bột đậu Pepton Nguồn nitơ Asp.oryzae Asp.protuberus NaNO3 NaNO2 Biểu đồ 3.8. Ảnh hưởng của nguồn N đến sinh trưởng của hai chủng NS. 0 10 20 30 40 50 60 M ức độ p há t t riể n (m m ) Đối chứng NaNO3 NaNO2 Cao nmen Cao malt Cao thịt Bột đậu Pepton Nguồn nitơ Asp.oryzae Asp.protuberus 3 NaNO2 Biểu đồ 3.9. Ảnh hưởng của nguồn N đến hoạt độ α – amylase của hai chủng NS. 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 H oạ t đ ộ e nz ym a m yl as e Đậu NaNO3 (NH4)2SO4 Cao nấm men Pepton Cao thịt Nguồn nitơ Asp.oryzae Asp.protuberus NaNO3 ( 4)2SO4 Biểu đồ 3.10. Ảnh hưởng của nguồn N đến hoạt độ glucoamylase của hai chủng NS. Bảng 3.12. Ảnh hưởng tỉ lệ bột đậu nành đến hoạt độ amylase của hai chủng NS. Hoạt độ amylase (UI/g/phút) Asp.oryzae Asp.protuberus Tỉ lệ bột đậu nành Α - amylase Glucoamylase α - amylase Glucoamylase 0,5% 44,26 2571,85 32,32 2322,96 1% 44,29 2706,67 43,60 2520,00 2% 45,97 2768,89 42,90 2623,70 3% 44,55 2862,22 41,79 2561,48 5% 43,79 2852,22 37,13 2395,56 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 H oạ t đ ộ e nz ym a m yl as e 0.50% 1% 2% 3% 5% Tỉ lệ bột đậu (%) Asp.oryzae Asp.protuberus Biểu đồ 3.11. Ảnh hưởng của các tỉ lệ bột đậu khác nhau đến hoạt độ α – amylase của hai chủng NS. 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 H oạ t đ ộ e nz ym a m yl as e 0.50% 1% 2% 3% 5% Tỉ lệ bột đậu (%) Asp.oryzae Asp.protuberus Biểu đồ 3.12. Ảnh hưởng của các tỉ lệ bột đậu khác nhau đến hoạt độ glucoamylase của hai chủng NS. Qua kết quả trên, chúng ta thấy, tỉ lệ bột đậu nành bổ sung có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt độ cả hai loại amylase của hai chủng nấm. Khi tỉ lệ bột đậu dần tăng lên thì hoạt độ cả hai loại enzym đều tăng mạnh. Hoạt độ glucoamylase tăng lên nhiều so với α – amylase. Đồng thời, tỉ lệ bột đậu bổ sung thích hợp cho sự sinh tổng hợp glucoamylase cũng cao hơn cho α – amylase. Tuy vậy, khi lượng bột đậu nành bổ sung quá cao sẽ làm mất cân bằng tỉ lệ C:N nên hoạt độ của các amylase giảm dần sau tỉ lệ bột đậu tối ưu trên. Vậy tỉ lệ bột đậu nành tối ưu cho sinh tổng hợp α – amylase là 2% (đối với chủng Asp.oryzae) và 1% (đối với chủng Asp.protuberus); glucoamylase là 3% (đối với chủng Asp.oryzae) và 2% (đối với chủng Asp.protuberus). Kết quả này cũng phù hợp với nhận định của Đoàn Văn Thược khi cho là nguồn N thích hợp nhất cho hoạt độ amylase mạnh của Asp.oryzae là bột đậu nành [36]. 3.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ được trình bày ở bảng 3.13 và 3.14. Bảng 3.13. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của hai chủng NS. Mức độ phát triển (mm) Nhiệt độ (0C) Aspergillus oryzae Asppergillus protuberus 25 12 1.5 30 32,5 5 35 35 3 40 34 0,5 45 15 0 50 0 0 Từ kết quả này, chúng ta thấy hai chủng nấm nghiên cứu sinh trưởng mạnh và có khả năng sinh amylase cao ở nhiệt độ dao động trong khoảng 30 – 40oC. Nhiệt độ cao quá, ở 50oC, cả hai chủng nấm đều không sống được và cũng không sinh enzym. Điều này cho thấy hai chủng nấm này không thuộc loại nấm ưa nhiệt và thích hợp với điều kiện sống ở RNM Cần Giờ Bảng 3.14. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ hai loại amylase của hai chủng NS. Hoạt độ amylase (UI/g/phút) Asp.oryzae Asp.protuberus Nhiệt độ (oC) α - amylase glucoamylase α - amylase glucoamylase 25 40,75 2416,30 34,54 2312,59 30 44,92 2779,26 43,56 2592,59 35 44,59 2665,19 33,12 2333,33 40 41,15 2084,44 14,30 311,11 45 25,32 902,22 0,09 73,59 50 0,35 165,93 0,00 0,00 0 5 10 15 20 25 30 35 40 20 25 30 35 40 45 50 55 Nhiệt độ (oC) M ức độ p há t t riể n (m m ) Asp.oryzae Asp.protuberus Đồ thị 3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của hai chủng NS. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 20 25 30 35 40 45 50 55 Nhiệt độ nuôi cấy (oC) H oạ t đ ộ e nz ym a m yl as e Asp.oryzae Asp.protuberus Đồ thị 3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ α – amylase của hai chủng NS. 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 25 30 35 40 45 50 Nhiệt độ (oC) H oạ t đ ộ e nz ym a m yl as e Asp.oryzae Asp.protuberus Đồ thị 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ glucoamylase của hai chủng NS. Riêng chủng Asp.protuberus có giới hạn chịu nhiệt rất hẹp. Chủng này chỉ sinh trưởng mạnh nhất ở 30oC, còn đến 40oC thì mức độ sinh trưởng đã giảm rất đáng kể. Song song đó, hoạt độ cả hai loại amylase của chủng này cũng giảm rất mạnh ở 40oC. Chủng Asp.oryzae sinh trưởng mạnh nhất và cho hoạt độ hai loại amylase cao ở khoảng nhiệt độ 30 – 40oC, trong đó nhiệt độ tối ưu là 30oC. Đồng thời, với kết quả này chúng ta thấy cả hai chủng nấm đều sinh trưởng và sinh tổng hợp amylase ở mức tốt nhất thích hợp với điều kiện nhiệt độ của RNM Cần Giờ (25 – 30oC). Kết quả được minh họa ở đồ thị 3.1, 3.2 và 3.3. Kết quả thu được này cũng phù hợp với nhiều kết quả nghiên cứu khác về NS sinh amylase, như nhiệt độ lên men sinh amylase tốt nhất của chủng Asp.niger là 32,4oC và Asp.oryzae là 33,6oC của Đoàn Văn Thược [36] và 28 – 30oC của Đồng Thị Thanh Thu [35] cũng như của Nguyễn Đức Lượng [25]. 3.3.5. Ảnh hưởng của độ mặn. Tiến hành nuôi cấy hai chủng NS theo phương pháp ở phần 2.2.2.5. Sau khi ủ các chủng nấm 3 ngày trên các MT có độ mặn khác nhau và mẫu đối chứng là MT1 không có muối, pH 6.5. Chúng tôi thu được kết quả theo bảng 3.15 và minh họa bằng đồ thị 3.4. Khảo sát ảnh hưởng độ mặn đến khả năng sinh amylase cao, chúng tôi tiến hành thí nghiệm như mục 2.2.2.6. Kết quả thu được ở bảng 3.16 và minh họa bằng đồ thị 3.5 và 3.6. Khả năng chịu mặn chính là một đặc trưng của NS RNM Cần Giờ. Kết quả bảng 3.15 và 3.16 cho thấy cả hai chủng đều có thể sinh trưởng tốt và cho hoạt độ amylase cao trên MT cả nước ngọt lẫn nước mặn. Điều này chứng tỏ chúng có nguồn gốc từ đất liền du nhập vào RNM Cần Giờ và thích nghi với điều kiện sống tại đây. Chúng là các NS có khả năng chịu mặn cao. Cả hai chủng này đều sinh trưởng mạnh nhất ở nồng độ muối 3% (riêng chủng Asp.protuberus vẫn sinh trưởng mạnh ở độ mặn 5%), đây chính là độ mặn của RNM Cần Giờ. Ở độ mặn này, chúng sinh trưởng và cho hoạt độ amylase mạnh hơn ở MT không có muối và các nồng độ muối khác. Do đó, tuy là những chủng du nhập nhưng chúng thích nghi với MT nước lợ của RNM Cần Giờ. Bảng 3.15. Ảnh hưởng của độ mặn đến sinh trưởng của hai chủng NS. Mức độ phát triển (mm) Nồng độ muối (%) Aspergillus oryzae Asppergillus protuberus Đối chứng 36,0 3,5 2 42,5 8,0 3 44,0 10,0 5 41,0 10,0 7 33,0 8,5 10 19,5 4,5 20 0,5 0,0 Bảng 3.16. Ảnh hưởng của độ mặn đến hoạt độ α- amylase và glucoamylase của hai chủng NS. Hoạt độ amylase (UI/g/phút) Độ mặn (%) Asp.oryzae Asp.protuberus 0 43,82 1669,63 35,85 1783,70 2 44,41 2717,04 42,31 2229,63 3 44,90 2893,33 43,46 2634,07 5 44,08 2654,82 43,35 2602,96 7 41,46 1866,67 42,33 1877,04 10 36,18 829,63 35,45 311,11 Ở đây chúng ta vẫn thấy có sự tương ứng giữa sinh trưởng và hoạt độ amylase của hai chủng. Với độ mặn tối ưu 3% thì hoạt độ cả hai loại amylase cũng đạt giá trị cao nhất. Điều này chứng tỏ chẳng những hai chủng nấm này thích nghi tốt với điều kiện nước lợ của RNM Cần Giờ (độ mặn 18 - 30‰), mà còn sinh ra hệ amylase phân giải tinh bột mạnh tại đây, giúp giải quyết một phần vấn nạn ô nhiễm MT. Đây cũng là một thuận lợi trong việc nuôi cấy để vừa thu được sinh khối cao nhất vừa có được hoạt độ amylase cao nhất. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Độ mặn (%) M ức độ p há t t riể n (m m ) Asp.oryzae Asp.protuberus 52 3 107 20Đối chứng Đồ thị 3.4. Ảnh hưởng của độ mặn đến sinh trưởng của hai chủng NS. 20 25 30 35 40 45 50 0 2 3 5 7 10 Độ mặn (%) H oạ t đ ộ e nz ym a m yl as e Asp.oryzae Asp.protuberus Đồ thị 3.5. Ảnh hưởng của độ mặn đến hoạt độ α – amylase của hai chủng NS. 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 0 2 3 5 7 10 Độ mặn (%) H oạ t đ ộ e nz ym a m yl as e Asp.oryzae Asp.protuberus Đồ thị 3.6. Ảnh hưởng của độ mặn đến hoạt độ glucoamylase của hai chủng NS. Riêng chủng Asp.protuberus có khả năng chịu mặn cao hơn chủng Asp.oryzae vì vẫn có thể sinh trưởng mạnh và cho hoạt độ enzym cao ở độ mặn 5%. Trong khi đó, khả năng sinh trưởng cũng như hoạt độ enzym của chủng Asp.oryzae bắt đầu giảm nhanh từ độ mặn này. Vậy độ mặn thích hợp nhất cho sinh trưởng và hoạt độ amylase cao hai chủng là 3%. 3.3.6. Ảnh hưởng của độ ẩm. Tiến hành nuôi hai chủng NS trên các MT thích hợp như mục 2.2.2.5 và mục 2.2.2.6 để nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm đến sinh trưởng. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ mặn đến khả năng sinh amylase của hai chủng NS được thực hiện với MT: -Chủng Asp.oryzae ở MT9, bổ sung 2% bột đậu nành (với α-amylase) và 3% (với glucoamylase). -Chủng Asp.protuberus ở MT11, bổ sung 1% bột đậu nành (với α-amylase) và 2% (với glucoamylase). Pha nước muối có độ mặn 3%, rồi bổ sung vào MT nuôi của hai chủng với các độ ẩm: 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%. Nuôi cấy hai chủng ở 30oC trong 3 ngày. Đo hoạt độ hai loại amylase. Kết quả thu được ở bảng 3.17. Bảng 3.17. Ảnh hưởng của độ ẩm đến hoạt độ amylase của hai chủng NS.. Hoạt độ amylase (UI/g/phút) Asp.oryzae Asp.protuberus Độ ẩm (%) α – amylase glucoamylase α – amylase Glucoamylase 50 37,31 2395,56 35,01 2177,78 55 44,55 2986,67 44,05 2779,26 60 45,25 2872,59 43,70 2613,33 65 43,86 2696,30 39,98 2167,41 70 36,35 2271,11 34,51 1576,30 75 19,46 1306,67 6,15 694,82 Kết quả cho thấy chủng Asp.oryzae cho hoạt độ α – amylase mạnh nhất ở độ ẩm 60% và glucoamylase mạnh nhất ở độ ẩm 55%. Trong khi đó, chủng Asp.protuberus cho cả hai loại enzym mạnh nhất ở độ ẩm 55%. Chúng ta cũng biết, độ ẩm là yếu tố rất quan trọng đối với sự lên men bề mặt. Ở độ ẩm 50%, MT nuôi cấy NS quá khô nên kìm hãm sự sinh trưởng của NS đồng thời cũng kìm hãm sự sinh tổng hợp enzym. Trong khi đó, độ ẩm quá cao, trên 60% (đối với chủng Asp.oryzae) và trên 55% (đối với chủng Asp.protuberus) cũng gây ức chế sinh trưởng NS vì làm giảm độ thoáng khí của MT. Do đó ở những độ ẩm này, hoạt độ amylase giảm mạnh. Đặc biệt ở độ ẩm 75%, MT bị bết lại vì quá nhiều nước làm NS sinh trưởng rất yếu nên hoạt độ enzym giảm rất mạnh. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 40 45 50 55 60 65 70 75 80 Độ ẩm (%) H oạ t đ ộ e nz ym a m yl as e Asp.oryzae Asp.protuberus . Đồ thị 3.7. Ảnh hưởng của độ ẩm đến hoạt độ α – amylase của hai chủng NS. 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 50 55 60 65 70 75 Độ ẩm (%) H oạ t đ ộ e nz ym a m yl as e Asp.oryzae Asp.protuberus Đồ thị 3.8. Ảnh hưởng độ ẩm đến hoạt độ glucoamylase của hai chủng NS. Tuy RN