Luận văn Tuyển chọn, nuôi cấy chủng aspergillus oryzae sinh tổng hợp endo-Β-1,4-glucanase và xác định tính chất lý hóa của nó

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN HỮU QUÂN TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA NÓ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC HÀ NỘI-2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN HỮU QUÂN TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA NÓ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Quyền Đình Thi Thực hiện tại: Viện Công nghệ Sinh học Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam HÀ NỘI-2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Quyền Đình Thi trƣởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Phó viện trƣởng Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hƣớng ý tƣởng nghiên cứu, tận tình hƣớng dẫn nghiên cứu, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện về hóa chất cũng nhƣ trang thiết bị nghiên cứu để tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đỗ Thị Tuyên, CN. Đào Thị Tuyết và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học đã tận tình hƣớng dẫn thí nghiệm, thƣờng xuyên chỉ bảo kiến thức chuyên môn, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi học tập và rèn luyện trong suốt quá trình thực tập. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong khoa Sinh trƣờng ĐHSP - Đại học Thái Nguyên đã giảng dạy và tạo điều kiện chu đáo cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận. Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những ngƣời thân đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập để tôi có đƣợc kết quả nhƣ ngày hôm nay. Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quí báu đó ! Thái Nguyên, tháng 10 năm 2009 Học Viên Nguyễn Hữu Quân Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 2 1.1. ĐỊNH NGHĨA ......................................................................................... 2 1.2. NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI............................................................. 2 1.2.1. Nguồn gốc ............................................................................................ 2 1.2.2. Phân loại enzyme ................................................................................. 3 1.3. CẤU TRÚC ............................................................................................. 5 1.3.1. Cấu trúc bậc nhất .................................................................................. 5 1.3.2. Cấu trúc không gian ............................................................................. 6 1.4. CƠ CHẾ XÚC TÁC ................................................................................ 8 1.5. Khái quát về Aspergillus oryzae ............................................................ 10 1.6. Ứng dụng .............................................................................................. 11 1.6.1. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy ...................................... 11 1.6.2. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm .............................................. 12 1.6.3. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi ................................... 13 1.6.4. Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ .................................... 14 1.6.5. Trong công nghệ sử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh .............. 14 1.7. ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE ......................................... 16 1.7.1. Nguồn carbon ..................................................................................... 16 1.7.2. Nguồn nitrogen .................................................................................. 17 1.7.3. Nhiệt độ nuôi cấy ............................................................................... 18 1.7.4. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng ........................................................... 18 1.8. TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENZYME ............................................... 19 1.8.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ..................................................................... 19 1.8.2. Ảnh hƣởng của pH ............................................................................. 20 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1.8.3. Ảnh hƣởng của các ion kim loại ......................................................... 20 1.8.4. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ và các chất tẩy rửa ......................... 21 Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ...................................... 22 2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT ........................................................ 22 2.1.1. Chủng giống ....................................................................................... 22 2.1.2. Thiết bị ............................................................................................... 22 2.1.3. Hóa chất ............................................................................................. 22 2.1.4. Dung dịch và đệm phá tế bào ............................................................. 23 2.1.5. Môi trƣờng ......................................................................................... 24 2.2. PHƢƠNG PHÁP ................................................................................... 25 2.2.1. Nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme ......................................................... 25 2.2.2. Định tính endo-β-1,4-glucanase.......................................................... 25 2.2.3. Xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase............................................ 25 2.2.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng lên khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase .................................................................... 27 2.2.5. Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase ................................................ 29 2.2.6. Điện di SDS-PAGE ............................................................................ 30 2.2.7. Xác định tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase ........................... 30 2.2.8. Các phƣơng pháp sinh học phân tử ..................................................... 32 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 36 3.1. Sàng lọc chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4- glucanase cao ............................................................................................... 36 3.2. Phân loại chủng nấm sợi A. oryzae VTCC-F-045 dựa vào đoạn gene 28S rRNA............................................................................................................ 37 3.3. Tối ƣu các điều kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase ..................... 39 3.3.1. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian ........................... 39 3.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất cảm ứng ........................................... 40 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3.3.3. Ảnh hƣởng của nguồn carbon ............................................................. 41 3.3.4. Ảnh hƣởng của nồng độ carbon .......................................................... 43 3.3.5. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen .......................................................... 44 3.3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ nitrogen ....................................................... 45 3.3.7. Nhiệt độ nuôi cấy ............................................................................... 46 3.3.8. Ảnh hƣởng của pH nuôi cấy ............................................................... 47 3.4. Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase ................................................... 48 3.5. Tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase ............................................ 50 3.5.1. Nhiệt độ phản ứng tối ƣu .................................................................... 50 3.5.2. pH phản ứng tối ƣu ............................................................................. 51 3.5.3. Độ bền nhiệt ....................................................................................... 52 3.5.4. Độ bền pH .......................................................................................... 54 3.5.5. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ ....................................................... 55 3.5.6. Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa .................................................... 56 3.5.7. Ảnh hƣởng của ion kim loại ............................................................... 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 59 KẾT LUẬN .................................................................................................. 59 KIẾN NGHỊ ................................................................................................. 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 61 TIẾNG VIỆT ............................................................................................... 61 TIẾNG ANH ................................................................................................ 64 PHỤ LỤC .................................................................................................... 69 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Thiết bị đƣợc sử dụng trong thí nghiệm ....................................... 22 Bảng 2.2. Các hóa chất đƣợc sử dụng trong thí nghiệm ............................... 23 Bảng 2.3. Danh sách các dung dịch và đệm đƣợc sử dụng trong thí nghiệm 23 Bảng 3.1. Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của 35 chủng A. oryzae .............. 37 Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của nguồn carbon đến khả năng sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 42 Bảng 3.2. Tóm tắt quá trình tinh sạch endo-β-1,4-glucanase từ chủng A. oryzae VTCC-F-045 ..................................................................................... 49 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của ion kim loại lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................................................... 57 Bảng 4.1. Đƣờng chuẩn glucose................................................................... 69 Bảng 4.2. Trình tự nucleotide của đoạn gene 28S rRNA từ chủng A. oryzae VTCC-F-045 ................................................................................................ 69 Bảng 4.3. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian ..................... 70 Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 70 Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 71 Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của nồng độ lactose tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 71 Bảng 4.7. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 72 Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của nồng độ bột đậu tƣơng tới khả năng sinh endo-β- 1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 72 Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 72 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Bảng 4.10. Ảnh hƣởng của pH nuôi cấy tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 73 Bảng 4.11. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 73 Bảng 4.12. Ảnh hƣởng của pH phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 74 Bảng 4.13. Độ bền nhiệt của endo-β-1,4-glucanase...................................... 75 Bảng 4.14. Độ bền pH của endo-β-1,4-glucanase......................................... 76 Bảng 4.15. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 77 Bảng 4.16. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ tới hoạt tính endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 77 Bảng 4.17. Ảnh hƣởng của ion kim loại tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 78 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc không gian từ trên xuống (A) và từ bên sang (B) của Cel12A từ H. grisea ....................................................................................... 7 Hình 1.2. Cấu trúc vùng liên kết enzyme - cơ chất của Cel12A từ H. grisea .. 8 Hình 1.3. Cơ chế thủy phân cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) của cellulase ......................................................................................................... 9 Hình 1.4. Sự thủy phân của 3 loại enzyme trong phức hệ cellulase .............. 10 Hình 1.5. Cấu trúc bộ gene của A. oryzae .................................................... 11 Hình 2.1. Đƣờng chuẩn glucose ................................................................... 26 Hình 2.2. Quy trình tinh sạch endo-β-1,4-glucanase từ chủng A. oryzae VTCC-F-045 ................................................................................................ 29 Hình 3.1. Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của một số chủng A. oryzae ........ 36 Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm PCR từ khuôn DNA của chủng A. oryzae (A); Sản phẩm Plasmid (B) và Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng XhoI và XbaI (C). ............................................................................................................... 38 Hình 3.3. Cây phân loại chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................... 39 Hình 3.4. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ..................................................................................... 40 Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC đến khả năng sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 41 Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ lactose đến khả năng sinh tổng hợp endo- β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................... 44 Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen đến khả năng sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 45 Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ bột đậu tƣơng đến khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................. 46 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Hình 3.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới khả năng sinh tổng hợp enzyme endo- β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................... 47 Hình 3.10. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng tới khả năng sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 48 Hình 3.11. Sắc kí đồ trên cột Sephadex G100 (A) Điện di đồ SDS-PAGE của chủng A. oryzae VTCC-F-045 (B) ................................................................ 49 Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 51 Hình 3.13. Ảnh hƣởng của pH phản ứng lên hoạt tính endo-β-1,4-glucanase ở chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................................................... 52 Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................................................... 53 Hình 3.15. Ảnh hƣởng của pH lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ..................................................................................... 54 Hình 3.16. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 55 Hình 3.17. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................................................... 56 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT g Microgram l Microliter APS Ammonium persulphate Cel Cellulose CMC Carboxyl methyl cellulase cs Cộng sự EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid kb Kilobase kDa Kilo Dalton M Marker (thang protein chuẩn) MTK Môi trƣờng khoáng MW Molecular Weight OD Optical density PCR Polymerase chain reaction SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis TEMED N,N’,N,N’- Tetramethyl ethylene diamine Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane U Unit v/v Volume/volume w/v Weight/volume Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỞ ĐẦU Endo-β-1,4-glucanase là một trong ba dạng của cellulase. Chúng thuộc nhóm enzyme thủy phân, có khả năng phân cắt liên kết β-1,4-glucosidie một cách ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số chất tƣơng tự khác có cầu nối β-glucan. Endo-β-1,4-glucanase phân giải mạnh mẽ cellulose vô định hình. Endo-β-1,4-glucanase đƣợc sinh tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau nhƣ động vật (thuộc các nhóm thân mềm, lợn, gà); thực vật (mầm của các hạt ngũ cốc nhƣ đại mạch, yến mạch, lúa mì, mạch đen) và vi sinh vật. Tuy nhiên, nguồn thu enzyme chủ yếu vẫn từ vi sinh vật. Vi sinh vật sinh enzyme hết sức đa dạng nhƣ nấm sợi (Aspergillus niger, A. oryzae, A. aculeatus, Trichoderma viride) và vi khuẩn (thuộc họ Bacillus). Endo-β-1,4-glucanase đƣợc ứng dụng rộng rãi vào nhiều ngành khác nhau nhƣ công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy; công nghiệp chế biến thực phẩm; công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi; công nghiệp chế biến dung môi hữu cơ; hay công nghiệp xử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh. Với tiềm năng ứng dụng to lớn của endo-β-1,4-glucanase và nguồn vi sinh vật tổng hợp enzyme rất đa dạng, đồng thời nhằm tận dụng các phế phụ phẩm trong nông nghiệp, chúng tôi đã chọn đề tài: Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus oryzae sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase và xác định tính chất lý hóa của nó Với mục tiêu: a) Tuyển chọn chủng nấm A. oryzae sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase cao; b) Tối ƣu điều kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase ngoại bào từ chủng A. oryzae và xác định tính chất hóa lý của endo-β-1,4- glucanase. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. ĐỊNH NGHĨA Endo-β-1,4-glucanase hay CMCase là một trong ba dạng cellulase. Chúng thuộc nhóm enzyme thủy phân liên kết β-1,4-glucoside bên trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tƣơng tự khác để giải phóng ra cellulosedextrin, cellobiose và glucose. Enzyme này thể hiện hoạt tính mạnh mẽ trên cellulose vô định hình. 1.2. NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI 1.2.1. Nguồn gốc Endo-β-1,4-glucanase đƣợc thu từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau nhƣ động vật (các nhóm thân mềm, lợn, bò, gà); thực vật (trong hạt ngũ cốc nảy mầm là đại mạch, yến mạch, lúa mì, mạch đen) và vi sinh vật (nấm sợi, nấm men, xạ khuẩn và vi khuẩn). Tuy nhiên, vi sinh vật là nguồn thu enzyme chủ yếu vì thời gian sống ngắn nên thu đƣợc nhiều lần trong năm và chủ động sử dụng nguồn nguyên liệu rẻ tiền để nuôi cũng nhƣ dễ dàng điều khiển có định hƣớng nguồn enzyme hoặc gia tăng lƣợng enzyme. Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật nên dễ dàng áp dụng các phƣơng pháp sinh học phân tử để tạo ra những chủng mới mang những đặc điểm nổi bật mà các đối tƣợng động vật, thực vật ít áp dụng nhƣ gây đột biến nhân tạo. Trong vi sinh vật, rất nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và một số loài nấm men có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase. Các loài vi khuẩn cả hiếu khí lẫn kị khí đều có khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase nhƣ Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. pumilis (Gordon et al.,1973), Acidothermus cellulobuticus (Bergquist et al., 1999, Nguyễn Lan Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 Hƣơng and Hoàng Đình Hòa, 2003). Ngoài ra còn có các loài ƣa kiềm nhƣ Cephalosporium sp. RYM-202 (Kang and Rhee, 1995). Các nhóm xạ khuẩn thuộc chi Actinomyces griseus (Nguyễn Đức Lƣợng and Đặng Vũ Bích Hạnh, 1999, Lê Thị Thanh Xuân et al., 2005) và Streptomyces reticuli cũng có khả năng tổng hợp mạnh enzyme. Các loại nấm mốc thuộc chi Aspergillus nhƣ A.niger (Coral et al., 2002, Hoàng Quốc Khánh et al., 2003, Omojasola and Jilani, 2008), A. candidus (Hong et al., 2001, Milala et al., 2009), A. flavus (Ojumu et al., 2003), A. fumigatus (Dahot and Noomrio, 1996), A. oryzae và các chủng Trichoderma (Claeyssens et al., 1989, de la Mata et al., 1992, Cao Cƣờng and Nguyễn Đức Lƣợng, 2003) đều có khả năng sinh enzyme. Các nhóm thuộc chi Penicillium (Claeyssens et al., 1989, Bhat et al., 1990, Trịnh Đình Khá, 2006, Chinedu et al., 2008) cũng có khả năng tổng hợp enzyme cao. 1.2.2. Phân loại enzyme 1.2.2.1. Phân loại theo hội đồng danh pháp quốc tế Endo-β-1,4-glucanase hay CMCase (EC 3.2.1.4) là một trong ba dạng enzyme của hệ cellulase, thuộc nhóm enzyme thủy phân liên kết -1,4-glucoside bên trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tƣơng tự khác để giải phóng ra cellulosedextrin, cellobiose và glucose (Chellapandi et al., 2008). Dựa trên đặc tính cấu trúc, endo-β-1,4-glucanase đƣợc gọi là endoglucanase hoặc 1,4--D-glucan-4-glucanohydrolase hay CMCase (EC 3.2.1.4). Endo-β-1,4-glucanase thuộc vào dạng 1 của phức hệ celulase. Dạng 2 là exoglucanase, gồm 1,4--D-glucan-4-glucanohydrolase (giống nhƣ cello dextrinase) (EC 3.2.1.74) và 1,4--D-glucan cellobiohydrolase (cellobio Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 hydrolase) (EC 3.2.1.91). Dạng 3 là -glucosidase hoặc -glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21). Endoglucanase thủy phân ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose tạo ra các loại oligosaccharide có chiều dài khác nhau. Exoglucanase thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử của chuỗi cellulose để giải phóng ra glucose (glucanohydrolase) hoặc cellobiose (cellobiohydrolase) (Lee et al., 2002). 1.2.2.2. Phân loại theo đặc điểm phân tử Endo-β-1,4-glucanase đƣợc phân chia dựa vào đặc điểm phân tử nhƣ khối lƣợng phân tử, điểm đẳng điện và cấu trúc tinh thể. Dựa theo đặc tính và trình tự amino acid chứa gốc nitơ tự do, nhóm enzyme thủy phân cellulose đƣợc chia làm 3 nhóm là Cel-1, Cel-2 và Cel-3. Trong đó Cel-1 và Cel-3 là endo-β-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4) có khối lƣợng là 62 kDa và 34 kDa. Cel-1 và Cel-3 có trình tự amino acid chứa gốc nitơ tự do là QQVGTTADAH và QELAQYDSAS. Trình tự amino acid của Cel-1 giống với endo-β-1,4-glucanase CelB, là enzyme thuộc họ 7 cellulase và có độ tƣơng đồng 72% với cellobiohydrolase I và exo-cellobiohydrolase I. Trình tự amino acid của Cel-3 có độ tƣơng đồng 90% với endo-β-1,4-glucanase CelA, là enzyme thuộc họ 12 cellulase. Khối lƣợng phân tử của Cel-1 và Cel-3 giống với CelB và CelA. Cel-2 là β-glucosidase (EC 3.2.1.21) có khối lƣợng phân tử là 120 kDa và trình tự amino acid chứa gốc nitơ tự do của Cel-2 chƣa đƣợc xác định (Yamane et al., 2002). Khi nghiên cứu trên A. niger về hai gene mã hóa cellobiohydrolase (CbhA và CbhB) (Gielkens et al., 1990) cho thấy, cả hai enzyme này đều thuộc nhóm 7 của glycosyl hydrolase (GH7); trong đó CbhB bao gồm cấu trúc cellulose-bindingomin (CBD) với sự xúc tác riêng bởi các amino acid giàu liên kết peptide; còn CbhA chỉ gồm sự xúc tác, thiếu CBD và liên kết Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 peptide. Sự phiên mã của gene CbhA và CbhB đƣợc cảm ứng bởi D-xylose. Ở chủng A. kawachi, (Hara et al., 2003) đã phát hiện ba gene mã hóa endoglucanase là cel5A, cel5B và cel61A. Trong đó, cel5A và cel61A có liên kết CBD1; còn cel5A và cel5B thuộc glycosyl hydrolase nhóm 5 (GH5), cel5B có cấu trúc rất giống cel5A, nhƣng thiếu CBD1 và sự liên kết. Cel5A gồm 4 đoạn intron, cel5B gồm 5 đoạn intron, còn cel61A thuộc nhóm GH61 không có intron. Dựa vào cấu trúc bậc một cơ bản, phức cellulase đƣợc chia làm 6 họ là A, B, C, D, E và F (Henrissat et al., 1989). Dựa vào trung tâm xúc tác phức cellulase đƣợc chia ra làm 9 họ A, B, C, D, E, F, G, H và I (Gilkes et al., 1991). Hiện nay, cellulase đƣợc xếp thành 12 họ khác nhau là 5, 6, 7, 8, 9, (10), 12, 44, 45, 48, 61 và 74. Trong đó, họ 9 chứa cellulases của vi khuẩn (hiếu khí và kỵ khí), nấm, thực vật và động vật (protozoa và mối); họ 7 gồm hydrolase nấm và họ 8 gồm hydrolase vi khuẩn (Lee et al., 2002). 1.3. CẤU TRÚC Endo-β-1,4-glucanase đƣợc tạo ra từ các loài khác nhau có thành phần cấu tạo và cấu trúc khác nhau. Endo-β-1,4-glucanase từ nấm A. oryzae có khối lƣợng phân tử khoảng 34 kDa và 62 kDa (Yamane et al., 2002), chủng A. oryzae KBN616 là 31 kDa và 53 kDa (Kitamoto et al., 1996), chủng Trametes hirsuta khoảng 40,6 kDa (Nozaki et al., 2007), chủng A. terreus M11 khoảng 25 kDa (Gao et al., 2008). 1.3.1. Cấu trúc bậc nhất Nghiên cứu của Nozaki và cs (2007) cho thấy, endo-β-1,4-glucanase thuộc họ 5 (GH 5) chứa CBM ở đầu nitơ, có trọng lƣợng phân tử khoảng 44 kDa và đƣợc gọi là ThEG. ThEG từ chủng Trametes hirsuta là một chuỗi polypeptide có chứa 384 amino acid và có độ tƣơng đồng cao với En-1 từ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 chủng Irpex lacteus (73%); EG từ chủng Humicola grisea (46%) và EglB từ chủng A. niger (49%). Ở chủng A. oryzae KBN616, Kitamoto và cs (1996) đã nhân dòng phân tử, tinh sạch và mô tả đặc điểm của 2 gene mã hóa endo-β-1,4-glucanase là CelA và CelB. Gene CelA gồm 877 pb với 2 đoạn intron. Protein do CelA mã hóa gồm 239 amino acid và đƣợc xếp vào họ cellulase H. Gene CelB chứa 1248 bp không chứa đoạn intron. Protein do CelB mã hóa gồm 416 amino acid và đƣợc xếp vào họ cellulase C. Sau khi tinh sạch, protein của CelA và CelB có khối lƣợng phân tử khoảng 31 kDa và 53 kDa. Ở chủng nấm chịu nhiệt Humicola grisea, (Sandgren et al., 2003) đã có những nghiên cứu chi tiết về cấu trúc Cel12A, enzyme này thuộc họ 12 (GH 12) endoglucanase là một chuỗi polypeptide gồm 224 amino acid cấu tạo nên các chuỗi α, β và các vùng nối. 1.3.2. Cấu trúc không gian Phân tử Cel12A đƣợc cấu tạo bởi 15 chuỗi β tạo thành 2 phiến gấp nếp β là A và B. Phiến A gồm 6 chuỗi β (A1-A6) và phiến B gồm 9 chuỗi β (B1-B9). Hai phiến này xếp chồng lên nhau thành hình bánh kẹp. Bề mặt lõm của phiến B tạo nên khe dài 35 Å để liên kết với cơ chất, khe này chạy dọc bề mặt của enzyme. Trung tâm hoạt động của enzyme là hai gốc glutamyl 120 và 205 ở chủng H. grisea. Sáu gốc phía ngoài phân bố phía trên phân tử giống nhƣ gài các amino acid tự do. Hai trong số các gốc đó nằm ở đầu nitơ. Các dải xoắn β đƣợc nối với nhau bởi các vùng nối, có 4 vùng nối với các gốc từ 29-32, 40-47, 92-96 và 165-169; các vùng này nối tiếp tƣơng ứng với chuỗi β: B2 đến A2, A2 đến A3, A5 đến B5 và A6 đến B7. Ba gốc cysteine là C175, C206 và C216 đƣợc định vị trên chuỗi β là A6, B4 và A4. Các chuỗi bên tập Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 trung trong lõi giữa hai phiến β, nơi mà bề mặt xúc tác đƣợc tăng lên (Hình 1.1). Gốc cysteine 175 nằm ở chuỗi β A6 trên phiến nhỏ A và tạo ra mấu lồi ở bề mặt của enzyme gần cấu trúc xoắn α. Chuỗi bên ở trong lõi giữa hai phiến β, liên kết với 6 amino acid T85, T123, A144, F175, I177 và F180 bằng lực vanderval. Liên kết giữa các amino acid có kích thƣớc từ 3,5 đến 4,1 Å (Hình 1.2A). Gốc cysteine 206 nằm gần trung tâm xúc tác Glu 205 trên chuỗi B4. Đầu của chuỗi bên ở lõi phiến β, nơi có hệ thống tƣơng tác chặt chẽ với các chuỗi bên của 8 gốc Q34, W52, W54, S63, P65, Y91, A98 và T204; cùng với sự tách rời giữa các nguyên tử trong chiều dài từ 3,3-4,9 Å (Hình 1.2B). Gốc cysteine 216 nằm trên chuỗi A4 ở phiến A, phiến này làm tăng bề mặt xúc tác của enzyme. Gốc cysteine này có chuỗi bên trong vùng lõi bên dƣới điểm hoạt động, nơi tƣơng tác với chuỗi bên của 5 gốc W48, V87, W89, F214 và F219 có kích thƣớc từ 3,3 đến 4,8 Å (Hình 1.2C). Hình 1.1. Cấu trúc không gian từ trên xuống (A) và từ bên sang (B) của Cel12A từ H. Grisea (Sang et al., 2003) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 Hình 1.2. Cấu trúc vùng liên kết enzyme - cơ chất của Cel12A từ H. Grisea 1.4. CƠ CHẾ XÚC TÁC Endo-β-1,4-glucanase thủy phân ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose tạo ra các loại oligosaccharide có chiều dài khác nhau. Tuy nhiên, để thủy phân cellulose thành glucose thì cần có sự hiệp đồng của các dạng enzyme trong phức hệ cellulase. Mỗi dạng enzyme trong phức hệ cellulase sẽ thủy phân phân tử có liên kết β-1,4-glucosidie theo những cách khác nhau. Ban đầu, endo-β-1,4-glucanase thủy phân sơ bộ các liên kết 1,4-β-glucan của sợi cellulose để tạo nên các phần tử nhỏ hơn (sợi cellobiose). Sau đó các sợi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 này sẽ chịu tác động của exoglucanase ở đầu khử và đầu không khử để giải phóng ra glucose (Lee et al., 2002) (Hình 1.3). Hình 1.3. Cơ chế thủy phân cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) của cellulase (Lee et al., 2002) Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase cùng các enzyme khác nhƣ exo-β-1,4- glucozidase (cellobiase) sẽ tham gia thủy phân cellulose theo cơ chế ban đầu endo-β-1,4-glucanase tác động vào vùng vô định hình trên phân tử cellulose và tạo ra các đầu mạch tự do. Sau đó, exo-β-1,4-glucosidase sẽ cắt từng đoạn cellobiose. Kết quả tạo ra các cello oligosacharide mạch ngắn, cellobiose và glucose. Các cellobiase sẽ thủy phân tiếp tạo thành glucose (Hình 1.4). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 Hình 1.4. Sự thủy phân của 3 loại enzyme trong phức hệ cellulase 1.5. Khái quát về Aspergillus oryzae A. oryzae thuộc chi Aspergillus, họ Trichocomaceae, bộ Eurotiales, lớp Eurotiomycetes, ngành Ascomycota và thuộc giới nấm (Kitamoto, 2002). Bào tử của A. oryzae có màu vàng hoa cau, không chứa độc tố aflatoxin. A. oryzae tiết ra môi trƣờng các enzyme thủy phân nhƣ cellulase, pectinase, xylanase và hemicellulase khi sống trên môi trƣờng có nguồn cơ chất tƣơng ứng cellulose, pectin, xylan và hemicellulose. Nên A. oryzae đã đƣợc ứng dụng rất rộng rãi trong quá trình sản xuất, chế biến đồ ăn và trong công nghiệp sản xuất các enzyme. Ở Nhật Bản A. oryzae đƣợc sử dụng trong quá trình sản xuất thức ăn nhƣ xì dầu, rƣợu sakê và trong công nghiệp sản xuất enzyme nhƣ amylase, protease, hemicellulose, cellulase, oxidoreductase, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 lipase, phytase và pectinase. Ở Việt Nam A. oryzae đƣợc sử dụng chủ yếu trong quá trình làm tƣơng. Năm 2001, bộ gene di truyền của A. oryzae đã đƣợc phân tích và giải mã. Hệ gene gồm 8 nhiễm sắc thể với 12 ngàn gene và 37 triệu cặp base (Galagan et al., 2005, Machida et al., 2005) (Hình 1.5). Hình 1.5. Cấu trúc bộ gene của A. Oryzae (Machida et al., 2005) 1.6. Ứng dụng Với khả năng thủy phân liên kết β-glucoside, endo-β-1,4-glucanase đƣợc ứng dụng rộng rãi vào nhiều ngành công nghiệp khác nhau nhƣ công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy, công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi, công nghiệp chế biến dung môi hữu cơ, hay công nghiệp xử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh. 1.6.1. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy Trong công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy, bổ sung các loại enzyme trong khâu nghiền bột, tẩy trắng và xeo giấy có vai trò rất quan trọng. Nguyên liệu ban đầu chứa hàm lƣợng cao các chất khó tan là lignin và một phần Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 hemicellulose, nên trong quá trình nghiền để tách riêng các sợi gỗ thành bột mịn gặp nhiều khó khăn. Trong công đoạn nghiền bột giấy, bổ sung endoglucanase sẽ làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lƣợng cho quá trình nghiền cơ học. Trƣớc khi nghiền hóa học, gỗ đƣợc xử lý với endoglucanase và hỗn hợp các enzyme hemicellulase, pectinase sẽ làm tăng khả năng khuếch tán hóa chất vào phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin. Trong công nghệ tái chế giấy, các loại giấy thải cần đƣợc tẩy mực trƣớc khi sản xuất các loại giấy in, giấy viết. Endoglucanase và hemicellulase đã đƣợc dùng để tẩy trắng mực in trên giấy. Kỹ thuật này mở ra triển vọng đầy hứa hẹn trong ngành công nghiệp giấy và bột giấy (Đặng Thị Thu et al., 2004). 1.6.2. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm Trong quá trình sản xuất các loại nƣớc quả và nƣớc uống không cồn dựa trên việc trích li dịch quả từ thịt nghiền. Các loại quả sau khi tách vỏ bỏ hạt đƣợc nghiền, thu đƣợc thịt quả nghiền có dạng dịch nhuyễn. Từ thịt quả nghiền đã ép bã thu đƣợc dịch quả. Dịch này thƣờng chứa các thành phần tế bào thịt quả và các thành phần của polysaccharide làm cho dịch quả có độ nhớt cao. Để tăng hiệu suất trích li dịch quả, giảm bớt độ nhớt, tăng mức cảm quan nƣớc quả và giảm bớt một số công đoạn, việc bổ sung endoglucanase rất quan trọng. Enzyme này là điểm mấu chốt cải thiện hiệu suất dịch hóa. Sự kết hợp của glucanase và pectinase sẽ phá hủy hoàn toàn màng tế bào. Trong quá trình sản xuất, ở giai đoạn dịch hóa bổ sung hỗn hợp các enzyme cellulase, hemicellulase sẽ đem lại hiệu quả của chế phẩm, làm cho độ đồng thể của nƣớc quả có thịt sẽ tốt hơn. Trong công nghệ sản xuất bia, các chế phẩm enzyme amylase, protease và glucanase đã đƣợc sử dụng để ngăn chặn sự tạo thành các diacetyl, do đó Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 giảm lƣợng diacetyl đƣợc tạo thành, rút ngắn thời gian cần thiết để ủ bia. Trong dịch lên men có chứa một lƣợng β-glucan, chất này ảnh hƣởng tới khả năng lọc và gây đục cho bia (Đặng Thị Thu et al., 2004). Trong quá trình sản xuất cà phê ở Việt Nam, cà phê chủ yếu đƣợc sản xuất bằng phƣơng pháp khô, phƣơng pháp này cho chất lƣợng cà phê không cao. Để tiến hành nâng cao chất lƣợng cà phê, phƣơng pháp lên men đã đƣợc áp dụng. Đó là quá trình sử dụng phức hệ enzyme cellulase và pectinase để xử lý bóc vỏ cà phê và làm tăng khả năng ly trích dịch quả. Trong khâu bóc vỏ, cellulose gây hiện tƣợng thẫm mầu, làm giảm chất lƣợng sau khi sấy, đồng thời cản trở cho việc bóc vỏ. Khi sử dụng chế phẩm A. niger có tên thƣơng mại là Biovina-09 có hoạt tính pectinase và cellulase cho thấy số lƣợng cà phê đƣợc bóc vỏ tăng, hạt cà phê đƣợc bóc vỏ bằng chế phẩm không còn nhớt nhƣ hạt không sử dụng chế phẩm enzyme và hiệu suất bóc vỏ khá cao. Trong quá trình ly trích dịch quả, cellulose và pectin cản trở sự thoát các chất hòa tan trong tế bào ra ngoài tế bào. Khi sử dụng chế phẩm Biotin-09 hiệu suất trích ly cao hơn mẫu không sử dụng là 46% (Nguyễn Đức Lƣợng, 2003). 1.6.3. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi Nguồn thức ăn cung cấp năng lƣợng cho gia súc và gia cầm chủ yếu là ngũ cốc và phụ phẩm của ngũ cốc. Ngoài protein, lipit, chất dinh dƣỡng cung cấp năng lƣợng chủ yếu của ngũ cốc và phụ phẩm là carbohydrate. Trong đó, các polysaccharide gồm cellulose, β-glucan là các chất chứa cầu nối β-1,4 glucoside. Các chất này làm tăng độ nhớt trong ruột, cản trở tế bào vách ruột hấp thụ các chất dinh dƣỡng. Các chất này có trong vách tế bào thực vật, ngăn trở các enzyme nội sinh tiếp cận với các chất dinh dƣỡng nhƣ protein, tinh bột và lipit có trong bào chất, từ đó cản trở sự tiêu hóa, hấp thụ các chất dinh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 dƣỡng này. Bổ sung β-glucanase trực tiếp vào thức ăn sẽ cho phép tăng khả năng hấp thu và chuyển hóa thức ăn của động vật. Việc ứng dụng phức hệ cellulase trong phân giải các nguồn thức ăn giàu cellulose nhƣ rơm, rạ, bã mía, bã khoai, bã sắn đã và đang đƣợc triển khai ở nhiều nƣớc, trong mọi lĩnh vực nhƣ sản xuất protein đơn bào làm thức ăn cho gia súc. Trong lĩnh vực này, nấm sợi thƣờng đƣợc sử dụng lên men các nguồn phế thải giàu cellulose tạo ra sinh khối protein chứa hàm lƣợng các amino acid cân đối, các vitamin và tạo hƣơng thơm có lợi cho tiêu hóa của vật nuôi (Đặng Thị Thu et al., 2004, Vũ Duy Giảng, 2009). 1.6.4. Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ Trong giai đoạn đƣờng hóa của quá trình sản xuất ethanol, amylase là thành phần chính trong quá trình thủy phân tinh bột. Tuy nhiên, bổ sung một số enzyme phá hủy thành tế bào nhƣ cellulase, hemicellulase có vai trò quan trọng, giúp tăng lƣợng đƣờng tạo ra và đẩy nhanh tốc độ tiếp xúc của tinh bột với amylase, dẫn tới hiệu suất thu hồi rƣợu tăng lên 1,5% (Đặng Thị Thu et al., 2004). 1.6.5. Trong công nghệ sử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh Rác thải là nguồn chính gây nên ô nhiễm môi trƣờng dẫn tới mất cân bằng sinh thái và phá hủy môi trƣờng sống, đe dọa tới sức khỏe và cuộc sống con ngƣời. Thành phần hữu cơ chính trong rác thải là cellulose, nên việc sử dụng công nghệ vi sinh trong xử lý rác thải cải thiện môi trƣờng rất có hiệu quả. Hiện nay, có rất nhiều những nghiên cứu về việc sử dụng cellulase do các chủng vi sinh vật tiết ra nhằm thủy phân cellulose trong rác thải. Sau khi nghiên cứu sản xuất cellulase của một số chủng vi sinh vật ƣa nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải (Lý Kim Bảng et al., 1999) đã tuyển chọn đƣợc 3 chủng xạ khuẩn, 4 chủng vi khuẩn ƣa nhiệt trong bể rác thải có khả năng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 phân giải cellulose mạnh. Đặng Minh Hằng (1999) cũng phân lập đƣợc 2 chủng nấm có khả năng phân giải cellulose mạnh và đã tối ƣu đƣợc các điều kiện nuôi cấy 2 chủng nấm đó nhằm nâng cao khả năng tổng hợp cellulase. Hai mƣơi chủng xạ khuẩn, 40 chủng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose đã đƣợc phân lập và khi bổ sung các chủng đó vào bể ủ sẽ rút ngắn thời gian ủ 5-7 ngày (Nguyễn Lan Hƣơng et al., 1999). 192 chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose đã đƣợc phân lập và thuần khiết từ các mẫu đất rác, rơm mục, gỗ mục; trong đó số chủng có khả năng phân giải cellulose rất mạnh chiếm 42% (Phạm Thị Ngọc Lan et al., 1999). Nguyễn Lan Hƣơng và Hoàng Đình Hòa (2003) cũng đã phân lập đƣợc 15 chủng Bacillus có hoạt tính CMCase từ các mẫu rác sinh hoạt chứa cacboxymetyl cellulose. Ngoài việc bổ sung trực tiếp vi sinh vật vào bể ủ để xử lý rác thải thì việc tạo ra các chế phẩm vi sinh có chứa các vi sinh vật sinh ra cellulase đã đƣợc nghiên cứu và sản xuất. Chế phẩm Micromix 3 đƣợc tạo ra bằng cách tuyển chọn các chủng vi sinh vật chịu nhiệt, phân giải cellulose cao đã đƣợc bổ sung vào bể ủ rác thải có thổi khí sẽ rút ngắn đƣợc thời gian ủ 15 ngày, giảm một nửa thời gian lên men, đồng thời lƣợng mùn tạo thành cũng cao hơn 29% và các chất dinh dƣỡng cao hơn 10% so với bể đối chứng (Lý Kim Bảng et al., 1999). Phức hệ cellulase đƣợc sử dụng để xử lý nguồn nƣớc thải do các nhà máy giấy thải ra. Nguyên liệu làm giấy là gỗ (sinh khối của thực vật bậc cao). Sinh khối này chứa rất nhiều loại polysaccharide, trong đó các polysaccharide quan trọng quyết định tới chất lƣợng, số lƣợng giấy là cellulose. Vì vậy, nƣớc thải của các nhà máy giấy, các cơ sở chế biến gỗ, các xƣởng mộc khi bổ sung các chế phẩm chứa phức hệ cellulase đem lại hiệu quả cao (Trần Đình Toại and Trần Thị Hồng, 2007). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 1.7. ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE Nấm sợi A. oryzae chủ yếu sống hoại sinh phân giải nguồn cơ chất trong môi trƣờng nơi chúng sống dựa vào hệ enzyme ngoại bào do chúng tiết ra để sinh trƣởng và phát triển. Tốc độ tiết enzyme phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trƣờng nhƣ nhiệt độ, pH, nguồn carbon và nguồn nitrogen. 1.7.1. Nguồn carbon Tùy loài vi sinh vật mà nguồn carbon đƣợc sử dụng để sinh endo-β-1,4- glucanase là khác nhau, có loài chỉ thích hợp với một hoặc một số ít nguồn carbon, có loài lại thích hợp với nhiều nguồn carbon. Nguồn carbon có thể là các loại carbohydrate đơn giản nhƣ đƣờng đơn, đƣờng đôi hoặc phức tạp nhƣ tinh bột, cellulose, xylan. Nguồn carbon phức tạp này thƣờng tồn tại ở hầu hết các sản phẩm, phế phẩm nhƣ trấu cám, vỏ quýt, sơ dừa, lõi ngô, bã mía, vỏ cà phê, mùn cƣa. Những chất này thƣờng đƣợc sử dụng làm nguồn carbon thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase. Kawamori và cs (1987) khi nghiên cứu trên chủng Thermoascus aurantiacus A-131 và Thermoascus reese QM 9414 cho thấy Avicel là nguồn carbon thích hợp nhất để chủng T. reese QM 9414 sinh tổng hợp CMCase, tiếp đến là bã mía, cellulose, lactose, CMC và xylan. Trong khi lõi ngô và xylan lại là nguồn carbon thích hợp cho chủng T. aurantiacus A-131 sinh tổng hợp CMCase (Kawamori et al., 1987). Nguồn phế phẩm từ quả cam ngọt (vỏ, cùi) đã đƣợc sử dụng làm nguồn carbon thích hợp cho quá trình sinh cellulase ở chủng A. niger, T. longi và Saccharomyces cerevisae (Omojasola and Jilani, 2008). Các loài Penicillium pinophilum, P. persicium, P. brasilianum sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất đối với nguồn cellulose tự nhiên, còn đối với nguồn carbon là xylan hoặc birchwood xylan thì khả năng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 sinh tổng hợp cellulase rất kém (Henning et al., 2005). Lê Thị Thanh Xuân và cs (2005) khi nghiên cứu chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces cho thấy chúng sinh trƣởng mạnh nhất trên nguồn carbon là glucose và tinh bột, nhƣng nguồn carbon thích hợp để chủng sinh tổng hợp cellulase là cellulose và CMC. Trịnh Đình Khá (2006), khi nghiên cứu chủng Penicillium sp. DQT- HK1 cho thấy, chủng sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất trên nguồn carbon là rơm với nồng độ 0,6%. 1.7.2. Nguồn nitrogen Nguồn nitrogen ảnh hƣởng mạnh tới tốc độ tiết enzyme của các loài vi sinh vật. Nguồn nitrogen tồn tại ở dạng vô cơ nhƣ urea, ammonium sulfate, natri nitrate và ở dạng các hợp chất hữu cơ cao phân tử nhƣ cao thịt, cao thịt bò, bột đậu tƣơng, bột cá hay peptone. Tùy loài vi sinh vật mà nguồn nitrogen đƣợc sử dụng là khác nhau. Đa số các loài có khả năng sử dụng cả nguồn nitrogen vô cơ và hữu cơ, tuy nhiên mức độ đồng hóa từng loại nitrogen để sinh enzyme lại phụ thuộc vào từng loài. Tang và cs (2004) khi tối ƣu điều kiện nuôi cấy chủng B. subtilis nhận thấy nguồn nitrogen vô cơ không thích hợp cho sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase; còn nguồn nitrogen là cao nấm men và bột đậu tƣơng rất thích hợp cho khả năng sinh enzyme (Tang et al., 2004). Nguồn nitrogen là urea và bột đậu tƣơng ảnh hƣởng mạnh mẽ tới quá trình tổng hợp cellulase của chủng A. niger NRRL-363 (Hoàng Quốc Khánh et al., 2003); Acharya và cs (2008) khi nghiên cứu trên chủng A. niger cho thấy peptone, ammonium sulfate và urea là nguồn nitrogen thích hợp cho chủng A. niger sinh tổng hợp cellulase. Ở một số chủng xạ khuẩn ƣa nhiệt nguồn nitrogen vô cơ là KNO3 thích hợp cho tổng hợp cellulase mạnh nhất (Lê Thị Thanh Xuân et al., 2005). Bột đậu tƣơng là nguồn nitrogen thích hợp cho chủng Penicillium sp. DQT-HK1 sinh tổng hợp cellulase (Trịnh Đình Khá, 2006). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 1.7.3. Nhiệt độ nuôi cấy Nhiệt độ ảnh hƣởng sâu sắc tới quá trình sống của vi sinh vật nói chung và của nấm mốc nói riêng. Mỗi loài vi sinh vật thích nghi với một vùng nhiệt độ khác nhau, căn cứ vào sự thích nghi nhiệt độ, các loài vi sinh vật đƣợc chia làm 3 nhóm là nhóm vi sinh vật ƣa lạnh và chịu lạnh; nhóm vi sinh vật ƣa ấm và nhóm vi sinh vật chịu nhiệt. Các loài ƣa lạnh sinh trƣởng đƣợc trong điều kiện nhiệt độ dƣới 15°C; các loài ƣa ấm sinh trƣởng và phát triển tốt ở khoảng nhiệt độ 20-37°C. Các loài chịu nhiệt sinh trƣởng và phát triển tốt ở nhiệt độ cao trên 50°C. Khi nghiên cứu các chủng vi sinh vật sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase cho thấy, ở chủng vi khuẩn B. subtilis nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp enzyme là 37°C (Tang et al., 2004). Đối với các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt thì nhiệt độ thích hợp để các chủng này sinh enzyme cao từ 45-55°C (Nguyễn Lan Hƣơng et al., 1999, Tăng Thị Chính et al., 1999). Ở các chủng nấm mốc nhiệt độ thích hợp để sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase nằm trong khoảng từ 28-50°C (Hoàng Quốc Khánh et al., 2003, Ojumu et al., 2003, Narasimha et al., 2006, Omojasola and Jilani, 2008). Chủng Penicillium sp. DQT-HK1 sinh tổng hợp cellulase tối đa ở nhiệt độ 30°C (Trịnh Đình Khá, 2006). 1.7.4. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng pH môi trƣờng ảnh hƣởng rất lớn tới khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Mỗi loài vi sinh vật có pH nuôi cấy khác nhau phù hợp cho việc sinh tổng hợp enzyme. pH thích hợp cho mỗi loài có thể là acid, trung tính hay kiềm. pH thích hợp đối với các chủng vi khuẩn ƣa ấm sinh tổng hợp cellulase là 6,5-7,0 và pH tối ƣu là 7,0; còn các chủng xạ khuẩn ƣa nhiệt là 7,0-7,5 và pH tối ƣu là 7,5 (Trần Đình Toại et al., 2008). Chủng Bacillus sinh tổng hợp mạnh nhất ở pH 7,5. Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt sinh tổng hợp Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 cellulase mạnh trong môi trƣờng có pH ban đầu là 8,0 (Tăng Thị Chính et al., 1999). Chủng xạ khuẩn Actinomyces griseus lại thích hợp ở pH trung tính (Nguyễn Đức Lƣợng and Đặng Vũ Bích Hạnh, 1999). Các chủng nấm Aspergillus lại thích hợp trong khoảng pH từ 4,5-6,0 (Đặng Minh Hằng, 1999, Hoàng Quốc Khánh et al., 2003, Trịnh Đình Khá, 2006, Omojasola and Jilani, 2008). 1.8. TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENZYME Mỗi loại enzyme đƣợc tổng hợp từ các loài khác nhau có cấu trúc và hoạt tính sinh học khác nhau. Nhiệt độ, pH, các dung môi hữu cơ, chất tẩy rửa hay các ion kim loại có ảnh hƣởng rất lớn tới hoạt tính của enzyme. 1.8.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong một giới hạn nhất định, chƣa ảnh hƣởng đến cấu trúc enzyme. Hoạt tính enzyme đạt cực đại ở nhiệt độ thích hợp và khoảng nhiệt độ thích hợp của nhiều enzyme vào khoảng 40-50°C. Ở nhiệt độ cao, enzyme bị biến tính làm hoạt độ giảm mạnh hoặc mất hoạt tính, còn ở nhiệt độ thấp dƣới 0°C hoạt độ của enzyme giảm nhiều nhƣng lại có thể phục hồi khi đƣa về nhiệt độ thích hợp. Endo-β-1,4-glucanase gồm Cel 1 và Cel 3 từ chủng A. oryzae hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ lần lƣợt là 50C và 60C (Fukuda et al., 2002). Endo-β- 1,4-glucanase gồm Cel A và Cel B từ chủng A. oryzae KBN616 có hoạt tính mạnh nhất ở nhiệt độ lần lƣợt là 55C và 45C (Kitamoto et al., 1996). Endoglucanse III từ Trichoderma reesei có hoạt tính tối đa đạt 55C (Macarron et al., 1993), nhiệt độ tối ƣu của -glucosidase từ chủng Trichoderma reesei QM 9414 và chủng Trametes hirsuta là 50C (de la Mata et al., 1992, Nozaki et al., 2007). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 1.8.2. Ảnh hƣởng của pH Hoạt độ của enzyme phụ thuộc vào pH môi trƣờng, những biến đổi dù nhỏ trong nồng độ của các ion H+ và OH- cũng ảnh hƣởng rõ rệt đến tốc độ phản ứng của enzyme. Tùy thuộc vào bản chất của các enzyme mà pH thích hợp có thể là trung tính, kiềm hoặc là acid. Endo-β-1,4-glucanase do các loài khác nhau có pH tối ƣu khác nhau. Theo những nghiên cứu trƣớc đây, pH thích hợp để endo-β-1,4-glucanase của chủng A. niger NRRL-363 hoạt động mạnh nhất là 5,5 (Hoàng Quốc Khánh et al., 2003). Endo-β-1,4-glucanase của Chủng Trametes hirsuta là 5,0 và chủng A. oryzae gồm Cel-1 và Cel-3 lần lƣợt là 3,5 và 4,5 (Fukuda et al., 2002). CMCase của A. niger Z10 hoạt động ở dải pH rộng từ 3,0-9,0 và hoạt động mạnh nhất ở pH 4,5 và 7,5 (Coral et al., 2002). 1.8.3. Ảnh hƣởng của các ion kim loại Các ion kim loại làm biến đổi vận tốc phản ứng của enzyme, chúng có thể kích thích hoặc ức chế hoạt động của enzyme. Một số ion kim loại có khả năng liên kết phối trí với các nguyên tử oxy hoặc nguyên tử nitơ của nhóm cacboxyl, amine hoặc peptide của các enzyme, làm cho trung tâm hoạt động của enzyme có độ bền rất lớn; đồng thời các ion kim loại này tạo ra một dạng thuận lợi cho enzyme hoặc làm cho enzyme kết gắn đƣợc với cơ chất. Do đó tốc độ thủy phân của enzyme đƣợc tăng lên. Các ion kim loại nặng ở nồng độ gây biến tính có thể kìm hãm không thuận nghịch hoạt độ của enzyme. Theo những nghiên cứu trƣớc đây cho thấy, các ion kim loại nhƣ Cu2+; Hg2+, Ag+ ức chế mạnh hoạt tính của các enzyme nhƣ xylanase, endoglucanase, mannanase, protease, cellulase (Nguyễn Thị Thảo, 2005, Trịnh Đình Khá, 2006, Đỗ Thị Tuyên et al., 2008, Gao et al., 2008). Trong khi đó ion Ca2+ làm tăng hoạt tính cellulase của Bacillus sp. D04 lên 40% so với đối chứng, Mg2+ làm giảm nhẹ hoạt tính (chỉ đạt 92%) và Zn2+ ức chế mạnh hoạt tính so với Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 đối chứng (đạt 37%) (Sang et al., 1995). Chinedu và cs (2008) nghiên cứu trên chủng Penicillium chrysogemum PCL501 cho thấy ion kim loại Mn2+ và Fe 2+ ở nồng độ 2,0 mM làm tăng hoạt tính enzyme so với đối chứng (đạt 320% và 162%); trong khi Mg 2+ , Cu 2+ , Zn 2+ , Hg 2+ và EDTA ức chế mạnh hoạt động của enzyme (đạt 20% với EDTA và 43% với Hg2+) (Chinedu et al., 2008). 1.8.4. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ và các chất tẩy rửa Các chất tẩy rửa và dung môi hữu cơ có ảnh hƣởng rất mạnh tới hoạt tính của enzyme, tùy từng loại enzyme mà sự ảnh hƣởng của các dung môi hữu cơ và chất tẩy rửa là khác nhau. Trịnh Đình Khá (2006) khi nghiên cứu trên chủng Penicillium sp. DTQ-HK1 cho thấy các chất tẩy rửa Tween 20, Tween 80, Trixton X-100, SDS đều làm giảm hoạt tính của cellulase và SDS làm giảm mạnh nhất, hoạt tính cellulase chỉ còn 18-34%. Các dung môi hữu cơ (methanol, ethanol, isopropanol và aceton) đều ức chế hoạt tính cellulase, riêng n-butanol ức chế mạnh mẽ hoạt tính cellulase chỉ còn 33-63%. Đỗ Thị Tuyên và cs (2008) các dung môi hữu cơ methanol, ethanol, isopropanol không ảnh hƣởng mạnh tới hoạt tính xylanase từ chủng A. ozyzae DSM1863, riêng n-butanol làm tăng và aceton làm giảm nhẹ hoạt tính xylanase. Tween 20 và Triton X-100 không ảnh hƣởng mạnh ở nồng độ thấp (0,2-1%) nhƣng làm giảm hoạt tính xylanase ở nồng độ cao 2%, trong khi đó SDS làm giảm hoạt tính enzyme mạnh ở tất cả các nồng độ. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT 2.1.1. Chủng giống Ba mƣơi lăm chủng nấm A. oryzae do Viện vi sinh vật và Công nghệ sinh học (Đại học Quốc gia Hà Nội) cung cấp đƣợc sử dụng để tuyển chọn chủng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase cao nhất. 2.1.2. Thiết bị Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm đƣợc liệt kê trong bảng 2.1. Bảng 2.1. Thiết bị đƣợc sử dụng trong thí nghiệm Tên thiết bị Hãng sản xuất Bể ổn nhiệt Trung Quốc Box cấy LB-1234 Việt Nam Box cấy vi sinh vật clean bench (TTCG công nghệ) Việt Nam Cân phân tích AB 240 Sartorius (Thụy Sỹ) Cân phân tích BL 150S Sartorius (Đức) Hệ thống chụp ảnh gel-doc Pharmacia (Thụy Điển) Hệ thống điện di ngang Mupid α (Nhật Bản) Hệ thống điện di SDS-PAGE Biometra (Đức) Lò vi sóng SamSung (Hàn Quốc) Máy chuẩn pH tự động 718 Stat Titrino Metrohm (Thụy Sỹ) Máy lắc nuôi cấy Certomat HK (Đức) Máy li tâm lạnh Mikro 22R Hettich (Đức) Máy PCR Mastercycler personal Eppendorf (Đức) Máy quang phổ UV-2500 LaboMed Inc (Mỹ) Nồi khử trùng ES-315 Tomy (Nhật Bản) Tủ lạnh 4C, -20C, -80C Toshiba, Sanyo (Nhật bản) 2.1.3. Hóa chất Các hóa chất dùng trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết (bảng 2.2) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 Bảng 2.2. Các hóa chất đƣợc sử dụng trong thí nghiệm Hóa chất Hãng sản xuất (nƣớc) Cao nấm men Difco (Mỹ) CMC Sigma (Mỹ) Kit tinh sạch plasmide QIA prep Spin Miniprep Qiagen (Mỹ) Peptone Merck (Mỹ) Sephadex G100 Pharmacia Sodium dodecylsulfate Sigma (Mỹ) Triton X-100 Merck (Đức) Tween-20 BioBasic Inc (Mỹ) 2.1.4. Dung dịch và đệm phá tế bào Bảng 2.3. Danh sách các dung dịch và đệm đƣợc sử dụng trong thí nghiệm Dung dịch Thành phần, nồng độ Dung dịch A Đệm 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 Dung dịch Amp gốc 100 mg/ml ampicillin Dung dịch APS 10% ammonium persulfate Dung dịch arsenomolypdate 5% (w/v) ammonium molybdate; 5% (v/v) H2SO4 đặc; 0,6% (w/v) Na2HAsO4.7H2O Dung dịch B Đệm 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 Dung dịch Bradford gốc 100 ml 95% ethanol; 350 mg serva Blue G; 200 ml 88% phosphoric acid Dung dịch Bradford thí nghiệm 425 ml H2O; 15 ml 95% ethanol; 30 ml 88% phosphoric acid; 30 ml dung dịch Bradford gốc Dung dịch C 30% acrylamide; 0,8% bis-acrylamide Dung dịch D 10% SDS; 25mM EDTA Dung dịch muối A 20% (w/v) Na2SO4; 2,5% (w/v) Na2CO3; 2,5% (w/v) muối Seignett; 2% (w/v) NaHCO3 Dung dịch muối B 15% CuSO4.5H2O; thêm vài giọt H2SO4 đặc Dung dịch nhuộm 0,1% (w/v) Coomassie Brilliant Blue; 30% (v/v) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 methanol; 10% (v/v) acetic acid Dung dịch nhuộm gel 0,1 μg/ml ethidium bromide Dung dịch phá tế bào 100 mM Tris, 100 mM EDTA, 2% SDS, pH 8,0 Dung dịch protease K 20 μg/ml protease K Dung dịch RNase 10 μg/ml Rnase Dung dịch rửa PAGE 30% (v/v) methanol; 10% (v/v) acid acetic Dung dịch Sol I 50 mM glucose; 25 mM Tris-HCl; 10 mM EDTA; pH 8,0 Dung dịch Sol II 0,2 N NaOH; 1% SDS Dung dịch Sol III 60% potassium acetate; 11,5% (v/v) acid glacial acetic Đệm điện di protein (biến tính) 25 mM Tris-HCl; 192 mM glycine; 0,1% SDS, pH 8,4 Đệm TBE 10x 108 g Tris base; 55 g boric acid; 40 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 Đệm TE 100 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA; pH 8,0 Đệm tra mẫu protein 5X (biến tính) 0,05% Brommophenol blue; 50% glycerol 100%; 10% SDS; 10% 2 mecaptho ethanol pha trong đệm 0,312 M Tris-HCl, pH 6,8 Đệm tra mẫu DNA 5x 0,09% (w/v) brommophenol blue; 0,09% (w/v) xylene xyanol (FF); 60% (v/v) glycerol Hỗn hợp muối AB Dung dịch muối A: dung dịch muối B = 25:1 2.1.5. Môi trƣờng Các chủng A. oryzae đƣợc nuôi cấy trong 3 ml môi trƣờng khoáng (MTK): 0,1% (w/v) peptone; 0,2% (w/v) KH2PO4; 0,03% (w/v) CaCl2.2H2O; 0,14% (w/v) (NH4)2SO4; 0,03% MgSO4.7H2O; 0,1% (w/v) cao nấm men; 1 ml dung dịch muối (18 mM FeSO4; 6,6 mM MnSO4; 4,8 mM ZnSO4.7H2O; 15 mM CoCl2); pH 6,5 khử trùng (Hong et al., 2001). Cazpek: 0,1% (w/v) NaNO3; 0,1% (w/v) K2HPO4; 0,05% (w/v) MgSO4; 0,05% (w/v) KCl; 2% sucrose; pH 6,5 khử trùng. Môi trƣờng đặc bổ sung 2% (w/v) agar. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 Chủng E. coli DH5α đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng LB (Luria-Bertani): 1% (w/v) peptone; 0,5% (w/v) cao nấm men; 1% (w/v) NaCl; pH 6,5 khử trùng, với môi trƣờng đặc bổ sung 2% (w/v) agar. Đối với việc chọn chủng mang plasmid tái tổ hợp, môi trƣờng đƣợc bổ sung 100 μg/ml ampicillin. 2.2. PHƢƠNG PHÁP 2.2.1. Nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme Chủng nấm A. oryzae sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng khoáng MTK chứa 0,5% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng ở nhiệt độ 30C, lắc 200 vòng/phút, sau 72 giờ. 2.2.2. Định tính endo-β-1,4-glucanase Hoạt tính enzyme đƣợc định tính theo phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Đĩa thạch chứa 0,5% cơ chất CMC trong nƣớc cất dày khoảng 0,5 cm, đƣợc đục lỗ đƣờng kính 0,5 cm. Năm mƣơi μl dịch enzyme đƣợc cho vào lỗ rồi ủ 12 giờ trong 4C cho enzyme khuếch tán. Sau đó, đĩa thạch đƣợc ủ 4-6 giờ ở 37C lấy ra và nhuộm bằng lugol 1%. Bán kính vòng thủy phân Rhalo = R-r (với R là bán kính vòng ngoài tính từ tâm lỗ đến mép ngoài cùng vòng thủy phân và r là bán kính lỗ), biểu thị hoạt tính tƣơng đối của enzyme. 2.2.3. Xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase Hoạt tính enzyme đƣợc xác định theo phƣơng pháp định lƣợng đƣờng khử của Nelson/Samogi (Nelson N, 1944). Đơn vị hoạt độ là lƣợng enzyme phân giải cơ chất CMC thành đƣờng khử tƣơng đƣơng 1 l glucose trong một phút ở điều kiện thí nghiệm. Xây dựng đường chuẩn: Glucose đƣợc pha trong 100 mM đệm natri acetate pH 5,0 với các nồng độ chuẩn khác nhau từ 20-100 µg/ml. Một ml dung dịch glucose chuẩn đƣợc đo ở bƣớc sóng 660 nm. Độ hấp phụ và nồng độ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 glucose đƣợc vẽ theo chƣơng trình Excel. Kết quả cho thấy, đƣờng nồng độ chuẩn tuyến tính trong dải nồng độ từ 20-90 µg/ml. Đƣờng chuẩn có phƣơng trình y = 0,0064x - 0,0024. Trong đó, y là độ hấp phụ (OD) ở bƣớc sóng 660 nm, x là nồng độ glucose (µg/ml) (Hình 2.1). Hình 2.1. Đƣờng chuẩn glucose Ống thí nghiệm (lặp lại 3 lần): 0,5 ml dung dịch 0,5% CMC pha trong 100 mM đệm natri acetate pH 5,0 đƣợc cho vào ống nghiệm, thêm 0,5 ml dịch enzyme. Hỗn hợp đƣợc lắc đều và ủ 5 phút ở 50C sau đó bổ sung ngay các hóa chất định lƣợng đƣờng khử tạo thành. Ống kiểm tra: Hút 0,5 ml cơ chất CMC, thêm các hóa chất định lƣợng đƣờng khử, sau đó bổ sung 0,5 ml dịch enzyme và tiến hành định lƣợng đƣờng khử ngay. Một ml dung dịch cần định lƣợng đƣờng khử đƣợc cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml hỗn hợp muối AB. Hỗn hợp đƣợc đun sôi cách thủy đúng 20 phút, làm lạnh đến nhiệt độ phòng, thêm 1 ml dung dịch asenomolybdate lắc đều đến khi hết bọt khí. Sau đó hỗn hợp đƣợc ly tâm 8000 vòng/phút loại bỏ tủa y = 0.0064x - 0.0024 R 2 = 0.9943 0 0.2 0.4 0.6 0 20 40 60 80 100 Nồng độ glucose (µg/ml) O D (6 60 nm ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 cơ chất còn dƣ và so màu ở bƣớc sóng 660 nm. Mẫu đối chứng thay dung dịch cần định lƣợng đƣờng khử bằng nƣớc cất. Đối chiếu với đồ thị chuẩn suy ra hàm lƣợng đƣờng khử. 2.2.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng lên khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase 2.2.4.1. Khảo sát thời gian sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase Chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MTK pH 6,5 ở 30C, có 0,5% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng. Dịch enzyme đƣợc thu ở những khoảng thời gian khác nhau từ 24-56 giờ (cách nhau 12 giờ) để xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase. 2.2.4.2. Tối ƣu nồng độ cơ chất cảm ứng Chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MTK pH 6,5 ở 30C và bổ sung cơ chất CMC ở các nồng độ khác nhau 0,5; 0,7; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 và 2,7. Dịch enzyme đƣợc thu ở 120 giờ để xác định hoạt tính. 2.2.4.3. Tối ƣu nguồn carbon Chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi trong môi trƣờng MTK pH 6,5 ở 30C và bổ sung 1% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng. Trong đó, nguồn cao nấm men đƣợc thay bằng các nguồn carbon khác là lactose, glucose, lõi ngô, bã mía, vỏ lạc, vỏ cà phê, trấu cám, CMC, vỏ quýt ở cùng nồng độ ban đầu (0,1%). Dịch enzyme đƣợc thu ở 120 giờ để xác định hoạt tính. Sau khi xác định đƣợc nguồn carbon tốt nhất, để tối ƣu nồng độ carbon, chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi trong môi trƣờng MTK Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 pH 6,5 ở 30C có nồng độ carbon khác nhau: 0,1% và 0,2-2,2% (cách nhau 0,2%). Sau 120 giờ nuôi cấy, hoạt tính enzyme đƣợc xác định. 2.2.4.4. Tối ƣu nguồn nitrogen Trong môi trƣờng MTK nuôi cấy chủng nấm A. oryzae VTCC-F-045 ban đầu, nguồn nitrogen sử dụng là peptone nhƣng không phù hợp để sản xuất chế phẩm enzyme do giá thành chi phí sản xuất rất cao. Với mục tiêu là sử dụng nguyên liệu sẵn có, peptone đƣợc thay thế bằng các nguồn nitrogen khác nhƣ NaNO3, (NH4)2SO4, bột cá, bột đậu tƣơng, urea với cùng nồng độ ban đầu (0,1%), bổ sung 1% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng và nguồn carbon đã đƣợc tối ƣu ở 30C, pH 6,5. Dịch enzyme đƣợc thu ở 120 giờ để xác định hoạt tính. Sau khi xác định đƣợc nguồn nitrogen tốt nhất, để tối ƣu nồng độ nitrogen chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi trong môi trƣờng có nồng độ nitrogen khác nhau: 0,1; 0,5; 1; 1,5; 1,8 và 2%. Sau 120 giờ nuôi cấy, hoạt tính enzyme đƣợc xác định. 2.2.4.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy Chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MTK bổ sung 1% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng cùng nguồn carbon và nitrogen đã đƣợc tối ƣu, nuôi lắc 200 vòng/phút ở pH 6,5 và các nhiệt độ khác nhau: 28, 30 và 37C. Dịch enzyme đƣợc thu ở 120 giờ để xác định hoạt tính. 2.2.4.6. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng Chủng nấm A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi cấy 120 giờ trong môi trƣờng MTK có pH thay đổi từ 3,5-8,5 ở 28C, lắc 200 vòng/phút để xác định pH môi trƣờng tối ƣu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 2.2.5. Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase Dịch enzyme thô ↓ Ly tâm 10 phút ở12500 vòng/phút ↓ Dịch trong ↓ Tủa muối ammonium sulfate 65% ↓ Thẩm tích loại muối ↓ Qua cột Sephadex G100 ↓ Enzyme tinh sạch Hình 2.2. Quy trình tinh sạch endo-β-1,4-glucanase từ chủng A. oryzae VTCC-F-045 Bốn mƣơi ml dịch enzyme sau khi ly tâm 10 phút ở 12500 vòng/phút đƣợc tủa với ammonium sulfate ở nồng độ 65% và để ở 4C qua đêm. Sau khi ly tâm thu tủa ở 12500 vòng/phút, tủa đƣợc hòa vào đệm 100 mM acetate pH 5,5 và thẩm tích loại muối (Hong et al., 2001). Để thấm tích loại muối, 15 ml mẫu đƣợc hút vào trong túi thẩm tích đã hoạt hóa và kẹp chặt hai đầu. Cho túi vào cốc chứa 200 ml nƣớc cất có khuấy từ liên tục và đặt cốc vào trong đá. Sau 3 giờ mẫu đƣợc thay nƣớc một lần để loại muối. Dịch tủa sau khi loại muối đƣa qua cột sắc ký lọc gel Sephadex G100. Cột có kích thƣớc 2,6 x 60 cm. Cột đƣợc cân bằng với đệm phosphate 50 mM, pH 7,5. Tốc độ chảy là 25 ml/h. Thể tích mỗi phân đoạn đƣợc thu 2 ml (thu 20 phân đoạn). Hàm lƣợng protein và số đơn vị hoạt tính enzyme đƣợc xác định trong mỗi phân đoạn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 2.2.6. Điện di SDS-PAGE Khối lƣợng tƣơng đối của enzyme tách chiết và độ tinh sạch của enzyme đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide theo Laemmli (1970). Thành phần Gel tách (l) Gel co (l) H2O 1940 1180 Dung dịch A 1500 0 Dung dịch B 0 500 Dung dịch C 2500 300 Dung dịch D 60 20 APS 10% 24 10 TEMED 7 5 Tổng 6031 2015 Bản điện di đƣợc chạy với cƣờng độ dòng điện 18-20 mA cho gel co và 25-30 mA cho gel tách. 2.2.7. Xác định tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase 2.2.7.1. Xác định nhiệt độ tối ƣu và pH tối ƣu Để tìm nhiệt độ phản ứng tối ƣu, dịch enzyme đã tinh sạch (0,028 mg/ml protein) đƣợc ủ với cơ chất 0,5% CMC trong đệm 0,1 M natri acetate pH 5,0 ở các nhiệt độ khác nhau từ 30-80C trong 5 phút. Để tìm pH tối ƣu, dịch enzyme đã tinh sạch đƣợc ủ với cơ chất 0,5% CMC trong đệm ở các pH khác nhau từ 3,5-7,5 ở nhiệt độ tối ƣu là 55C trong 5 phút. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 2.2.7.2. Xác định độ bền nhiệt và độ bền pH Để xác định độ bền nhiệt của endo-β-1,4-glucanase ở chủng A. oryzae VTCC-F-045, dịch enzyme đã tinh sạch (0,028 mg/ml protein) đƣợc ủ ở các nhiệt độ khác nhau từ 30-60C trong các khoảng thời gian là 1; 2; 4; 6 và 8 giờ. Dịch enzyme sau khi ủ đƣợc xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase với thời gian phản ứng là 5 phút và nhiệt độ tối ƣu là 55C. Để xác định độ bền pH, dịch enzyme đƣợc ủ ở các đệm có nồng độ 0,1 M ở các pH khác nhau từ 4,5-7,5 (đệm natri acetate pH từ 4,5-5,5; đệm phosphate pH từ 6,0-7,5). Sau khi ủ 1; 2; 4 và 6 giờ ở nhiệt độ phòng, hoạt tính enzyme còn lại đƣợc xác định trong thời gian phản ứng là 5 phút. 2.2.7.3. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ Để đánh giá ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ lên hoạt tính của endo-β- 1,4-glucanase, dịch enzyme tinh sạch (0,028 mg/ml protein) đƣợc ủ với các dung môi hữu cơ methanol, ethanol, isopropanol, acetone và n-butanol nồng độ 80% ở nhiệt độ phòng. Sau 4 giờ ủ, hoạt tính còn lại đƣợc xác định ở 55C trong thời gian phản ứng là 5 phút. 2.2.7.4. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa Để đánh giá ảnh hƣởng của chất tẩy rửa lên hoạt tính của endo-β-1,4- glucanase, dịch enzyme tinh sạch (0,028 mg/ml protein) đƣợc ủ với các chất tẩy rửa Tween 20, Tween 80, Triton X-100 và SDS với các nồng độ 0,4-2,0% ở nhiệt độ phòng. Sau 4 giờ ủ, hoạt tính còn lại đƣợc xác định ở 55C trong thời gian 5 phút để đánh giá ảnh hƣởng của chúng lên hoạt tính endo-β-1,4- glucanase. 2.2.7.5. Ảnh hƣởng của ion kim loại Để đánh giá mức độ ảnh hƣởng của ion kim loại lên hoạt tính của endo-β-1,4-glucanase, dịch enzyme tinh sạch (0,028 mgml protein) đƣợc ủ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 với các ion kim loại Ag+, Ca2+, Co2+, Cu2+, Fe2+, Zn2+, Ni+, Mn2+, K+ và EDTA với các nồng độ 4 mM, 8 mM và 12 mM ở nhiệt độ phòng. Hoạt tính còn lại đƣợc xác định sau 4 giờ ủ, thời gian phản ứng 5 phút ở nhiệt độ phản ứng là 55C. 2.2.8. Các phƣơng pháp sinh học phân tử 2.2.8.1. Tách chiết DNA tổng số Tế bào nấm sợi đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng Czapek ở 30C, lắc 200 vòng/phút, sau 96 giờ dịch nuôi đƣợc ly tâm 10 phút với 10000 vòng/phút. Tủa tế bào đƣợc nghiền nhẹ trong nitơ lỏng, sau đó bổ sung 600 µl đệm phá tế bào lắc nhẹ và 65 µl lysozyme, ủ 45 phút ở 37°C. Sau đó hỗn hợp đƣợc bổ sung 5 µl protease K ủ 2-3 giờ ở 56°C. Bổ sung chloroform : isoamyl alcohol (24:1) với tỷ lệ 1:1 và ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C. 500 µl dịch nổi phía trên đƣợc thu sang ống eppendorf mới và bổ sung isopropanol tỷ lệ 1:1 để ở -20°C trong 2 giờ. Tủa sau khi ly tâm 15 phút ở 4°C với 12000 vòng/phút đƣợc làm khô dƣới ánh sáng đèn và bổ sung 500 µl ethanol 70% để rửa DNA, loại muối và isopropanol. Sau khi ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, tủa đƣợc làm khô và hòa trong 40 µl đệm TE và bảo quản ở -20°C (Sandgren et al., 2003). 2.2.8.2. Khuếch đại gene bằng PCR Để khuếch đại đoạn gene 28S rRNA từ chủng nấm A. oryzae VTCC-F- 045 cặp mồi NL1 (5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3') và NL4 (5'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3') đƣợc sử dụng. Nhiệt độ gắn mồi của cặp NL1 và NL4 là 50°C. Hỗn hợp phản ứng PCR gồm: 1 µl mồi mỗi loại; 2 µl dNTP; 2,5 µl MgCl2 25 mM; 2,5 µl đệm PCR 10x; 0,35 µl Taq; 1 µl khuôn DNA và bổ sung H2O cất tiêm lên tổng thể tích 25 µl. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 Phản ứng đƣợc thực hiện ở điều kiện: 95°C/5 phút, 35 chu kỳ (95°C/1 phút; 52°C/1 phút; 72°C/1 phút); 72°C/10 phút. 2.2.8.3. Gắn dính sản phẩm PCR vào pJET1.2 Phản ứng gắn dính sản phẩm PCR vào vector tách dòng pJET1.2 đƣợc thực hiện theo bài thí nghiệm (Fermentas). Hỗn hợp gồm 5 µl đệm 2x; 1,5 µl sản phẩm PCR; 0,5 µl enzyme blunting; 2,5 µl H2O và hỗn hợp đƣợc ủ ở 70°C trong 15 phút. Bổ sung 0,5 µl pJET1.2 và 0,5 µl T4 DNA ligase rồi ủ qua đêm ở nhiệt độ 22°C tạo plasmid tái tổ hợp. 2.2.8.4. Biến nạp plasmid hóa học Plasmid đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α theo phƣơng pháp sốc nhiệt và hóa học. Một khuẩn lạc E. coli đƣợc cấy chuyển vào 3 ml môi trƣờng LB, lắc 200 vòng/phút ở 37°C qua đêm. Một trăm ml môi trƣờng LB đƣợc tiếp giống với 1 ml dịch tế bào qua đêm, nuôi lắc ở 37°C với 200 vòng/phút. Khi OD600nm đạt 0,4-0,6 (khoảng 2-3 giờ nuôi cấy), dịch nuôi cấy đƣợc đặt vào đá lạnh 1 giờ, rồi ly tâm 10 phút ở 4°C với 6000 vòng/phút. Tủa tế bào đƣợc hòa đều trong 100 ml dung dịch 100 mM CaCl2 lạnh và vô trùng, ủ đá 15 phút và ly tâm nhƣ trên. Tủa tế bào lại đƣợc hòa đều trong 40 ml CaCl2 100 mM lạnh vô trùng, ủ đá khoảng 1 giờ và ly tâm 10 phút với 4000 vòng/phút. Tủa tế bào lại đƣợc hòa vào 500 μl dung dịch 100 mM CaCl2 lạnh, vô trùng chứa 15% glycerol. Dịch hỗn hợp tế bào và glycerol đƣợc chia nhỏ vào các ống eppendorf, dùng để biến nạp ngay hoặc bảo quản ở -84°C. Năm μl plasmid tái tổ hợp đƣợc trộn với 40 μl dịch tế bào làm khả biến, ủ 20-30 phút ở 4°C. Hỗn hợp đƣợc sốc nhiệt 45 giây ở 42°C. Sau đó đặt ngay vào đá lạnh 5 phút rồi bổ sung 250 μl môi trƣờng LB đã khử trùng. Sau khi nuôi lắc hỗn hợp khoảng 60 phút ở 37°C với 200 vòng/phút, 50-200 μl dịch tế Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 bào đã biến nạp đƣợc cấy trải trên môi trƣờng LB đặc chứa kháng sinh ampinillin ủ qua đêm ở 37°C. 2.2.8.5. Tách chiết DNA plasmid Một khuẩn lạc đã đƣợc biến nạp trên đĩa thạch đƣợc cấy vào 3 ml môi trƣờng LB chứa ampicillin, nuôi lắc qua đêm ở 37°C, 200 vòng/phút. Dịch tủa tế bào thu đƣợc sau khi ly tâm 5 phút với 6000 vòng/phút đƣợc lắc rung 30 giây trong 150 µl Sol I thành dịch đồng nhất, ủ 15-20 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó 150 µl Sol II đƣợc bổ sung vào hỗn hợp và đảo nhẹ, tiếp tục bổ sung 150 µl Sol III vào hỗn hợp đảo nhẹ. Hỗn hợp đƣợc bổ sung 450 µl chloroform/isoamyl alcohol 24:1, lắc nhẹ và ly tâm 10 phút với 12500 vòng/phút trong. 450 µl pha trên đƣợc hút sang ống mới, bổ sung 320 µl isopropanol, lắc nhẹ và ủ 5 phút ở -80°C để tủa DNA plasmid. Tủa DNA plasmid sau khi ly tâm 12500 vòng/phút trong 5 phút đƣợc rửa với 500 µl 70% ethanol ở 4°C để loại muối và isopropanol, làm khô trong không khí ở nhiệt độ phòng. Tủa plasmid đƣợc hòa trong đệm TE pH 8,0 hoặc nƣớc khử ion vô trùng và điện di kiểm tra sản phẩm tách plasmid rồi bảo quản ở -20°C. 2.2.8.6. Cắt DNA tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn DNA plasmid tái tổ hợp đƣợc cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn XhoI và XbaI qua đêm ở 37C để kiểm tra phân đoạn chèn. Hỗn hợp phản ứng gồm 3,5 µl DNA plasmid tái tổ hợp; 0,25 µl enzyme giới hạn mỗi loại; 2 µl đệm Tango Y + và bổ sung H2O cất tiêm đến 10 µl. Sau phản ứng, sản phẩm cắt đƣợc điện di trên gel 0,8% agarose để kiểm tra. 2.2.8.7. Giải trình tự nucleotide Sau khi tinh sạch plasmid tái tổ hợp, đoạn DNA chèn vào plasmid đƣợc giải trình tự nucleotide theo nguyên lý của phƣơng pháp Sanger cải tiến dựa trên các dideoxy. DNA polymerase xúc tác gắn các dideoxynucleotide vào Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 đầu 3'-OH mạch đơn DNA đang tổng hợp, quá trình tổng hợp sẽ dừng lại khi gặp dideoxynucleotide đánh dấu huỳnh quang không có nhóm 3'-OH. Kết quả là hỗn hợp sản phẩm sau phản ứng bao gồm các polynucleotide có kích thƣớc hơn kém nhau một nucleotide và đƣợc phát hiện bằng mẫu dò huỳnh quang trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer. Vector pJET1.2 đƣợc gắn hai trình tự mồi xuôi và mồi ngƣợc M13 (-20) để đọc trình tự phân đoạn chèn DNA ngoại lai. Kết quả đọc trình tự đƣợc phân tích, xử lý bằng phần mềm DNAStar để so sánh trình tự nucleotide, tính khoảng cách di truyền và xây dựng cây phân loại. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Sàng lọc chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4- glucanase cao Các chủng A. oryzae đƣợc nuôi ở cùng môi trƣờng MTK bổ sung 0,5% CMC ở 30C, pH 6,5 lắc 200 vòng/phút; sau 72 giờ dịch nổi nuôi cấy đƣợc xác định hoạt tính trên đĩa thạch. Kết quả khảo sát trên 35 chủng A. oryzae cho thấy, trên đĩa thạch đều xuất hiện vòng phân giải cơ chất CMC với đƣờng kính vòng phân giải rất khác nhau. Nhƣ vậy, các chủng A. oryzae đƣợc khảo sát đều sinh ra endo-β-1,4-glucanase ngoại bào. Tuy nhiên, chỉ một số chủng A. oryzae sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase cao nhƣ VTCC-F-037, 043, 045, 050, 187 và 189 mới đƣợc chọn ra (Hình 3.1). Hình 3.1. Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của một số chủng A. oryzae Song song với định tính, khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase từ 35 chủng A. oryzae trên môi trƣờng khoáng MTK cũng đƣợc định lƣợng. Sau 72 giờ nuôi cấy chủng A. oryzae VTCC-F-045 có khả năng sinh endo-β- 1,4-glucanase cao nhất với hoạt tính đạt 0,97 U/ml (Bảng 3.1). Chủng A. oryzae VTCC-F-045 có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase tốt nhất đƣợc chọn để tối ƣu môi trƣờng nuôi cấy và đánh giá tính chất lý hóa của chúng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 Bảng 3.1. Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của 35 chủng A. oryzae Chủng Hoạt tính Chủng Hoạt tính U/ml % U/ml % A. oryzae VTCC-F-022 0,78 81 A. oryzae VTCC-F-174 0,54 56 A. oryzae VTCC-F-037 0,88 91 A. oryzae VTCC-F-176 0,44 45 A. oryzae VTCC-F-040 0,45 46 A. oryzae VTCC-F-178 0,52 53 A. oryzae VTCC-F-041 0,89 92 A. oryzae VTCC-F-183 0,47 48 A. oryzae VTCC-F-042 0,73 76 A. oryzae VTCC-F-185 0,45 46 A. oryzae VTCC-F-043 0,84 87 A. oryzae VTCC-F-187 0,62 64 A. oryzae VTCC-F-044 0,76 79 A. oryzae VTCC-F-189 0,74 76 A. oryzae VTCC-F-045 0,97 100 A. oryzae VTCC-F-201 0,45 47 A. oryzae VTCC-F-046 0,56 58 A. oryzae VTCC-F-206 0,47 49 A. oryzae VTCC-F-047 0,59 61 A. oryzae VTCC-F-210 0,55 57 A. oryzae VTCC-F-049 0,76 79 A. oryzae VTCC-F-233 0,35 36 A. oryzae VTCC-F-050 0,64 66 A. oryzae VTCC-F-243 0,27 28 A. oryzae VTCC-F-051 0,70 72 A. oryzae VTCC-F-254 0,30 31 A. oryzae VTCC-F-053 0,52 54 A. oryzae VTCC-F-310 0,39 41 A. oryzae VTCC-F-056 0,50 52 A. oryzae VTCC-F-314 0,31 32 A. oryzae VTCC-F-111 0,50 52 A. oryzae VTCC-F-351 0,32 33 A. oryzae VTCC-F-122 0,62 64 A. oryzae VTCC-F-357 0,37 38 A. oryzae VTCC-F-173 0,47 49 3.2. Phân loại chủng nấm sợi A. oryzae VTCC-F-045 dựa vào đoạn gene 28S rRNA DNA của A. oryzae VTCC-F-045 sau khi tách chiết, đƣợc điện di trên gel agarose 0,8 % cho thấy DNA tinh sạch và đủ để tiến hành nhân dòng và đọc trình tự. Phản ứng PCR đƣợc tiến hành với cặp mồi NL1 và NL4. Sau khi điện di, một vạch có kích thƣớc khoảng 614 bp xuất hiện (Hình 3.2A). Sản phẩm PCR đƣợc gắn trực tiếp vào vector pJET1.2 sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào E. coli DH5. Các dòng plasmid tái tổ hợp đƣợc chọn lọc và cắt Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 kiểm tra bằng enzyme hạn chế XhoI và XbaI. Sản phẩm cắt kiểm tra trên gel 0,8% agarose (Hình 3.2C) có 2 băng DNA kích thƣớc khoảng 2974 bp tƣơng ứng với vector pJET1.2 và băng còn lại có kích thƣớc khoảng 600 bp tƣơng ứng với đoạn DNA ngoại lai. A B C Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm PCR từ khuôn DNA của chủng A. oryzae (A); Sản phẩm Plasmid (B) và Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng XhoI và XbaI (C). P1: plasmid mang gene 28S rRNA; ĐC: plasmid không mang gene 28S rRNA Plasmid tái tổ hợp mang đoạn gene mong muốn đã đƣợc tách và tinh sạch bằng kit QIAGEN để đọc trình tự nucleotide. Đoạn gene 28S rRNA của chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc xác định trình tự nucleotide trên máy giải trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer. Sau khi phân tích và xử lý số liệu, nhận đƣợc đoạn gene 28S rRNA của chủng A. oryzae VTCC-F-045 dài 614 bp (Bảng 4.2). Trình tự đoạn gene 28S rRNA của chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc so sánh với trình tự gene 28S rRNA của các chủng nấm sợi đã công bố trên GenBank bằng phần mềm DNAstar. Trình tự đoạn gene 28S rRNA của chủng A. oryzae VTCC-F-045 có quan hệ họ hàng gần gũi với một số đại diện thuộc chi Aspergillus. Trong đó, có độ tƣơng đồng 99,7% với các chủng A. oryzae RIB40 (AP007172), A. flavus IFM (AB363745), A. oryzae NRRL 506 ĐC P1 M 1 2 750 500 250 1000 614 bp 1500 3000 750 500 250 1000 1500 3000 614 bp Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 (AF459735), A. parasiticus NRRL 6433 (EF661568), A. oryzae MN (GQ38275), A. flavus UWFP 570 (AY216669) và A. parasiticus NRRL 424 (EF661557) (Hình 3.2). Trình tự 28S rRNA của chủng A. oryzae VTCC-F- 045 đã đƣợc đăng kí trong GenBank với mã số là GQ382276. Nucleotide Substitutions (x100) 0 0.2 Ap68 Ap57 Ao35 Af69 Ao75 Ao72 Af45 Ao76 Hình 3.3. Cây phân loại chủng A. oryzae VTCC-F-045 Ao68: A. parasiticus NRRL 6433, Ap57: A. parasiticus NRRL 424, Ao75: A. oryzae MN; Af69: A. flavus UWFP570; Af45: A. flavus IFM 5436; Ao35: A. oryzae NRRL 506; Ao76: A. oryzae VTCC-F-045, Ao72: A. oryzae RIB40 3.3. Tối ƣu các điều kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase 3.3.1. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian Để đánh giá khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase theo thời gian, chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng khoáng MTK ở 30°C, lắc 200 vòng/phút. Dịch enzyme đƣợc thu ở các thời gian khác nhau để xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase. Kết quả cho thấy, ở 24 giờ hoạt tính đạt 1,96 U/ml. Hoạt tính enzyme đạt tối đa ở 120 giờ (2,34 U/ml). Sau 120 giờ hoạt tính giảm dần và trở về mức ổn định, hoạt tính đạt 1,75 U/ml sau 156 giờ nuôi cấy (Hình 3.4 và Bảng 4.3). Nhƣ vậy, thời gian thích hợp nhất cho chủng A. oryzae VTCC-F-045 sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase là 120 giờ. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 Hình 3.4. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian của chủng A. oryzae VTCC-F-045 Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu trên thế giới. 120 giờ cũng là thời gian để chủng A. niger sinh tổng hợp cellulase cao nhất (Narasimha et al., 2006, Omojasola and Jilani, 2008). Nhƣng cũng ở chủng A. niger, cellulase tạo ra nhiều nhất sau 96 giờ (Acharya et al., 2008). CMCase đƣợc tạo ra từ 3 chủng Trichoderma harzianam, Phanerochaete chrysosporium và Trichoderma spp cao nhất sau 4 ngày lên men với hoạt tính lần lƣợt là 1,88; 2,4 và 1,53 U/ml (Khan et al., 2007). Ojumu và cs (2003) khi nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp glucanase ở chủng A. flavus cho thấy hàm lƣợng cellulase tạo ra cao nhất sau 12 giờ lên men. Nhƣ vậy, các chủng khác nhau thì thời gian sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase là khác nhau. 3.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất cảm ứng Cơ chất cảm ứng đóng vai trò là chất cảm ứng cho quá trình sinh tổng hợp một loại enzyme tƣơng ứng. Khi sử dụng CMC vào môi trƣờng nuôi cấy sẽ tác động mạnh đến sinh trƣởng và sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045. Chủng A. oryzae VTCC-F-045 nuôi trong môi 0 40 80 120 160 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168 Thời gian (giờ) H oạ t t ín h en do -β -1 ,4 -g lu ca na se tư ơn g đố i ( % ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 trƣờng MTK pH 6,5 ở 30C và bổ sung CMC ở các nồng độ khác nhau, lắc 200 vòng/phút sau 120 giờ. Kết quả cho thấy ở các nồng độ 0,7; 1,0 và 1,5% hoạt tính endo-β-1,4-glucanase tăng cao hơn so với đối chứng (ở 0,5%), tăng cao nhất ở nồng độ 1,0% (tăng 32%) và hoạt tính enzyme đạt 11,27 U/ml. Các nồng độ CMC còn lại, hoạt tính enzyme giảm tuyến tính so với đối chứng, giảm mạnh nhất ở nồng độ 2,7% (giảm 57%) và đạt 3,66 U/ml (Hình 3.5 và Bảng 4.4). Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC đến khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 Cao Cƣờng và Nguyễn Đức Lƣợng (2003) khi sử dụng CMC, bột cellulose hay chitinaza vách tế bào nấm làm cơ chất cảm ứng, chúng đều có khả năng cảm ứng sinh tổng hợp cellulase cao; trong đó cao nhất là CMC. Nhƣ vậy, với nồng độ 1% CMC enzyme đƣợc cảm ứng sinh ra đủ để thủy phân các cao phân tử trong môi trƣờng và cơ chất cho sự sinh trƣởng của tế bào. 3.3.3. Ảnh hƣởng của nguồn carbon Chủng A. oryzae VTCC-F-045 nuôi trong môi trƣờng MTK pH 6,5 bổ sung 1% CMC ở 30C, cao nấm men đƣợc thay bằng các nguồn carbon khác và môi trƣờng có nguồn cao nấm men làm đối chứng, lắc 200 vòng/phút. Sau 0 40 80 120 160 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 Nồng độ CMC (%) H oạ t t ín h en do -β -1 ,4 -g lu ca na se tư ơn g đố i ( % ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 120 giờ nuôi cấy, khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase của chủng nghiên cứu trong môi trƣờng có nguồn carbon là lactose và glucose cao hơn đối chứng, hoạt tính đạt 11,81 U/ml và 2,61 U/ml. Endo-β-1,4-glucanase đƣợc sinh ra trong môi trƣờng có lõi ngô, vỏ quýt giảm không đáng kể so với nguồn cao nấm men, hoạt tính đạt 2,29 U/ml (lõi ngô) và 1,93 U/ml (vỏ quýt) (Bảng 3.3 và Bảng 4.5). Nhƣ vậy, lactose là nguồn carbon tốt nhất cho chủng A. oryzae VTCC-F-045 sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase. Tuy nhiên, lõi ngô là nguyên liệu dễ kiếm, nên có thể sử dụng cho lên men lƣợng lớn sau này. Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của nguồn carbon đến khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 Nguồn carbon Hoạt tính U/ml % Bã mía 0,82 35 Cao nấm men 2,32 100 CMC 2,11 91 Glucose 2,61 112 Lactose 11,81 508 Lõi ngô 2,29 99 Sucrose 1,93 83 Trấu cám 1,09 47 Vỏ cà phê 1,62 70 Vỏ lạc 1,01 43 Vỏ quýt 2,10 90 Acharya và cs (2008) nhận thấy, chủng nấm A. niger sinh cellulase mạnh nhất trong môi trƣờng có nguồn carbon là mùn cƣa, hoạt tính đạt 0,18 U/ml. Ở chủng A. flavus NSPR 101 mùn cƣa cũng là nguồn carbon tốt nhất cho quá trình sinh tổng hợp cellulase (0,074 U/ml) (Ojumu et al., 2003). Trong khi đó 3 chủng Trichoderma longi, A. niger và Saccheromyces Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 cerevisae khi sử dụng nguồn carbon là vỏ quýt rất thích hợp cho quá trình sinh cellulase (Omojasola and Jilani, 2008). Hoàng Quốc Khánh và cs (2003) khi nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase ở chủng A. niger NRRL-363 cho thấy môi trƣờng chứa nguồn carbon trấu xay và rỉ mật đƣờng rất thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp cellulase. Ở các chủng xạ khuẩn phân lập từ vỏ cà phê, nguồn carbon thích hợp nhất cho sinh tổng hợp cellulase là bột cellulose và CMC (Lê Thị Thanh Xuân et al., 2005). Chellapandi và cs (2008) khi nghiên cứu quá trình tổng hợp endoglucanase ở chủng Streptomyces sp BRC1 và BRC2 cho thấy nguồn carbon thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp endoglucanase lần lƣợt là glucose và cellobiose. Từ các số liệu thu đƣợc cũng nhƣ tham khảo các tài liệu trong nƣớc và trên thế giới, chúng tôi nhận thấy các chủng khác nhau sẽ thích hợp với nguồn carbon tối ƣu là khác nhau để sinh tổng hợp enzyme tốt nhất. 3.3.4. Ảnh hƣởng của nồng độ carbon Sau khi xác định đƣợc nguồn carbon là lactose có khả năng cảm ứng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase cao nhất trong số các nguồn carbon đƣợc khảo sát, lactose đƣợc đƣa vào môi trƣờng với các nồng độ khác nhau từ 0,1% và 0,2-2,2% (cách nhau 0,2). Sau 120 giờ nuôi cấy, hoạt tính endo-β-1,4- glucanase từ chủng A. oryzae VTCC-F-045 đạt cao nhất (15,47 U/ml) ở nồng độ 0,4% lactose, cao gấp 3,64 lần so với đối chứng ở 0,1%. Còn ở nồng độ 0,8% lactose, hoạt tính giảm mạnh nhất, giảm tới 51% so với đối chứng (Hình 3.6 và Bảng 4.6). Nhƣ vậy, với nồng độ 0,4 % lactose endo-β-1,4-glucanase đƣợc cảm ứng sinh tổng hợp cao nhất để phân hủy nguồn carbon dinh dƣỡng cho sự sinh trƣởng của tế bào. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ lactose đến khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 3.3.5. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen Chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MTK bổ sung 1% CMC và 0,4% lactose ở 30C, lắc 200 vòng/phút sau 120 giờ, nguồn peptone đƣợc thay bằng các nguồn nitrogen khác. Kết quả cho thấy khả năng tổng hợp endo-β-1,4-glucanase trong môi trƣờng chứa bột đậu tƣơng tăng 89% so với peptone, còn nguồn nitrogen là NaNO3 và bột cá giảm khá nhiều so với peptone, giảm tới 50-59%. Ở nguồn nitrogen bột đậu tƣơng hoạt tính đạt 12,92 U/ml (Hình 3.7 và Bảng 4.7). Nhƣ vậy, bột đậu tƣơng đƣợc chọn làm nguồn nitrogen trong quá trình nuôi thu enzyme. Đây là nguồn nitrogen tốt và dễ kiếm nên thuận tiện cho việc lên men lƣợng lớn sau này. Những nghiên cứu ở chủng A. niger cho thấy, khi sử dụng nguồn nitrogen là peptone, ammonium sulfate, urea đều thích hợp cho quá trình sinh cellulase và ammonium sulfate làm tăng khả năng sinh cellulase cao nhất (Acharya et al., 2008). Trong khi đó, urea và bột đậu tƣơng lại là nguồn nitrogen thích hợp nhất cho quá trình sinh cellulase ở chủng A. niger (Hoàng Quốc Khánh et al., 2003, Narasimha et al., 2006). Đối với các chủng xạ khuẩn đƣợc phân lập từ mẫu vỏ cà 0 100 200 300 400 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 Nồng độ lactose (%) H oạ t t ín h en do -β -1 ,4 -g lu ca na se tư ơn g đố i ( % ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 phê, sinh tổng hợp mạnh nhất trong môi trƣờng có nguồn nitrogen là KNO3 (Lê Thị Thanh Xuân et al., 2005). Tăng Thị Chính và cs (1999) khi nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi khuẩn chịu nhiệt nhận thấy nguồn nitrogen hữu cơ (peptone, cao nấm men và bột đậu tƣơng) rất thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp cellulase. Bột đậu tƣơng cũng là nguồn nitrogen tốt nhất cho chủng Penicillium sp. DQT-HK1 sinh tổng hợp cellulase (Trịnh Đình Khá, 2006). Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen đến khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 PT: pepton, NO3: NaNO3, NH4: (NH4)2SO4, BC: bột cá, BĐT: bột đậu tƣơng 3.3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ nitrogen Sau khi xác định đƣợc nguồn nitrogen là bột đậu tƣơng có khả năng cảm ứng sinh endo-β-1,4-glucanase cao nhất trong số các nguồn nitrogen đƣợc khảo sát, bột đậu tƣơng đƣợc đƣa vào môi trƣờng với các nồng độ khác nhau: 0,1; 0,5; 1; 1,5; 1,8 và 2%. Sau 120 giờ nuôi cấy, endo-β-1,4-glucanase đƣợc chủng A. oryzae VTCC-F-045 sinh tổng hợp cao nhất (16,39 U/ml) ở nồng độ bột đậu tƣơng 1% cao hơn so 38% so với đối chứng. Bột đậu tƣơng ở 0 50 100 150 200 PT NO3 Ure NH4 BC BĐT Nguồn nitrogen Ho ạt tí nh e nd o- β- 1, 4- gl uc an as e tư ơn g đố i ( % ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 các nồng độ còn lại đều làm giảm sinh tổng hợp enzyme so với đối chứng, giảm mạnh nhất ở nồng độ 0,5% (giảm 58%) (Hình 3.8 và Bảng 4.8). Bột đậu tƣơng nồng độ 1% thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp endo-β-1,4- glucanase ở chủng A. oryzae VTCC-F-045. Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ bột đậu tƣơng đến khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 3.3.7. Nhiệt độ nuôi cấy Chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi cấy ở các nhiệt độ khác nhau 28, 30 và 37C trong môi trƣờng khoáng MTK có 0,4% lactose; 1% bột đậu tƣơng, lắc 200 vòng/phút, ở pH 6,5. Sau 120 giờ, nuôi cấy sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase đạt cao nhất (14,23 U/ml) ở nhiệt độ 28C và giảm dần khi tăng nhiệt độ lên 30C và 37C. Giảm nhiều nhất ở nhiệt độ 37C, hoạt tính đạt 5,86 U/ml (Hình 3.9 và Bảng 4.9). 0 50 100 150 0 0.5 1 1.5 2 2.5 Nồng độ bột đậu tương (%) H oạ t t ín h en do -β -1 ,4 -g lu ca na se tư ơn g đố i ( % ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 Hình 3.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới khả năng sinh tổng hợp enzyme endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 Những nghiên cứu ở chủng A. niger cho thấy, cellulase đƣợc tạo ra nhiều nhất ở 28C (Narasimha et al., 2006, Acharya et al., 2008) và 50C thích hợp cho chủng A. niger NRRL-363 sinh tổng hợp cellulase (Hoàng Quốc Khánh et al., 2003). Ba chủng Trichoderma longi, A. niger và Saccheromyces cerevisae có nhiệt độ tối ƣu là 45C (Omojasola and Jilani, 2008). Các chủng nấm sợi ƣa ấm sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất ở nhiệt độ 31-34C (Đặng Minh Hằng, 1999). Trong khi đó nhiệt độ tối ƣu cho chủng Penicilium sp. DQT-HK1 là 30C (Trịnh Đình Khá, 2006). Nhƣ vậy, ở nhiệt độ 28C thích hợp để chủng A. oryzae VTCC-F-045 sinh tổng hợp endo-β-1,4- glucanase. 3.3.8. Ảnh hƣởng của pH nuôi cấy Chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi cấy trong MTK có 0,4% lactose và 1% bột đậu tƣơng, lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 28C và ở các pH khác nhau. Sau 120 giờ nuôi cấy, khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase đạt cao nhất ở pH 5,5 (100%) là 35,7 U/ml. Ở dải pH 4,0-6,5, chủng A. oryzae 0 40 80 120 28 30 37 Nhiệt độ H oạ t t ín h en do -β -1 ,4 -g lu ca na se tư ơn g đố i ( % ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 VTCC-F-045 sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase tƣơng đối ổn định từ 34,12-31,48 U/ml đạt 86-88% so với pH tối ƣu 5,5. Ở pH 7,0 endo-β-1,4- glucanase đƣợc tổng hợp thấp nhất (10,37 U/ml) giảm 71 % so với ở pH 5,5 (Hình 3.10 và Bảng 4.10). Hình 3.10. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng tới khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 Nhƣ vậy, chủng A. oryzae VTCC-F-045 sinh tổng hợp endo-β-1,4- glucanase mạnh trong điều kiện pH môi trƣờng ban đầu nghiêng về phía acid. Theo những nghiên cứu trƣớc đây, các chủng Aspergillus thích hợp trong khoảng pH 4,5-6,0 (Đặng Minh Hằng, 1999, Trịnh Đình Khá, 2006, Omojasola and Jilani, 2008). Trong khi, pH môi trƣờng 5,5 lại thích hợp cho chủng A. niger NRRL-363 sinh cellulase (Hoàng Quốc Khánh et al., 2003). 3.4. Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase Để tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase, 40 ml dịch nổi sau khi nuôi cấy đƣợc tủa với ammonium sulfate ở nồng độ 65% và giữ ở 4C qua đêm. Tủa thu đƣợc hòa với 0,1 M đệm acetate pH 5,0 và thẩm tích loại muối. Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase riêng của dịch tủa sau loại muối đạt 24,46 U/mg protein và độ sạch enzyme đạt 1,6 lần so với dịch thô ban đầu. 0 40 80 120 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 pH môi trường H oạ t t ín h en do -β -1 ,4 -g lu ca na se tư ơn g đố i ( % ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 Dịch tủa sau khi loại muối cho qua cột sắc ký lọc gel Sephadex G-100 với thể tích 10 ml, tốc độ dòng chảy là 25 ml/h. Thu thể tích mỗi phân đoạn 2 ml (thu 20 phân đoạn). Sắc kí đồ trên cột Sephadex G100 (Hình 3.11A) cho thấy, protein đƣợc phân tách thành 2 peak, trong đó peak ở phân đoạn 10 cao nhất. Hoạt tính riêng của peak 10 đạt 40,36 U/mg protein. Các phân đoạn có hoạt tính cao đƣợc điện di trên gel 12,5% polyacrylamide với chất chỉ thị phân tử. Điện di đồ hình 3.11B cho thấy, peak 10 xuất hiện một băng đậm, có khối lƣợng phân tử khoảng 36 kDa. Chứng tỏ, enzyme thu đƣợc khá sạch với độ sạch 2,6 lần so với dịch enzyme thô ban đầu (Bảng 3.2). Bảng 3.2. Tóm tắt quá trình tinh sạch endo-β-1,4-glucanase từ chủng A. oryzae VTCC-F-045 Bƣớc tinh sạch Protein tổng số (mg/ml) Hoạt tính enzyme Độ tinh sạch (Lần) Hiệu suất thu hồi (%) U/ml U/mg Dịch thô 0,213 3,31 15,54 1,0 100 Tủa (NH4)2SO4 0,074 1,81 24,46 1,6 55 Sephadex G-100 0,028 1,13 40,36 2,6 34 Hình 3.11. Sắc kí đồ trên cột Sephadex G100 (A) Điện di đồ SDS-PAGE của chủng A. oryzae VTCC-F-045 (B) Giếng 1: dịch nổi; 2: dịch tủa; 3: phân đoạn 8; 4: phân đoạn 9; 5: phân đoạn 10; 6: marker A B 1 2 3 4 5 6 0 100 200 300 400 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Các phân đoạn H oạ t t ín h en do -β -1 ,4 -g lu ca na se (U /m g pr ot ei n) 0.0 0.1 0.2 0.3 H àm lư ợ ng p ro te in ( m g/ m l) U/mg mg/ml kDa 116 66 45 35 25 36 kDa Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với một số kết quả nghiên cứu trên thế giới. Hong và cs (2001) khi tinh sạch endo-β-1,4- glucanase tái tổ hợp (Eng1) ở nấm men sau hai bƣớc tinh sạch: tủa ammonium sulfate (60-100%) và đƣa qua cột DEAE-sephadex A-50 đã thu đƣợc Eng1 có độ sạch 1,73 lần so với dịch enzyme thô, khối lƣợng phân tử khoảng 37 kDa. Endo-β-1,4-glucanase (gồm Cel-1 và Cel-3) từ chủng A. oryzae có khối lƣợng phân tử lần lƣợt là 62 và 34 kDa (Fukuda et al., 2002); Kitamoto và cs (1996) đã tinh sạch endo-β-1,4-glucanase (gồm CelA và Cel B) từ chủng A. oryzae KBN616 sau khi qua cột DEAE (CelA) và SE-sephadex C50 có khối lƣợng lần lƣợt là 31 kDa và 53 kDa. Endo-β-1,4- glucanase (eng1) từ chủng Trametes hirsuta có khối lƣợng khoảng 40,6 kDa (Nozaki et al., 2007). 3.5. Tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase 3.5.1. Nhiệt độ phản ứng tối ƣu Nhiệt độ phản ứng ảnh hƣởng mạnh tới tốc độ xúc tác thủy phân cơ chất của enzyme. Mỗi enzyme có một nhiệt độ phản ứng thích hợp. Để khảo sát nhiệt độ tối ƣu của endo-β-1,4-glucanase, dịch enzyme tinh sạch và cơ chất CMC đƣợc ủ ở các nhiệt độ khác nhau từ 30-80°C, trong 5 phút. Hoạt tính tăng dần trong khoảng từ 19-100% ở dải nhiệt độ từ 30-55C và đạt tối đa 67,69 U/mg ở 55C. Khi nhiệt độ tiếp tục tăng thì hoạt tính enzyme giảm dần, chỉ đạt 63% ở 80C (Hình 3.12 và Bảng 4.12). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 Theo những nghiên cứu trƣớc đây, endo-β-1,4-glucanase từ chủng A. oryzae KBN616 là Cel A và Cel B có nhiệt độ tối ƣu lần lƣợt ở 55C và 45C (Kitamoto et al., 1996); trong khi endo-β-1,4-glucanase gồm Cel-1 và Cel-3 của A. oryzae là 50C và 60C (Fukuda et al., 2002); endo-β-1,4- glucanase (eng1) từ chủng A. niger IFO31125 hoạt động tốt nhất ở 70C (Hong et al., 2001); còn CMCase của chủng A. niger Z10 là 40C (Coral et al., 2002). 3.5.2. pH phản ứng tối ƣu pH môi trƣờng có ảnh hƣởng lớn tới hoạt tính xúc tác của enzyme, vì nó ảnh hƣởng tới mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và ảnh hƣởng tới độ bền protein enzyme. Để khảo sát pH tối ƣu của endo-β-1,4-glucanase, phản ứng giữa enzyme với cơ chất CMC (CMC đƣợc pha trong các đệm có pH khác nhau từ 3,5-7,5) ở 55C và sau 5 phút ủ. Hoạt tính đạt cực đại 95,88 U/mg ở pH 5,5 và tƣơng đối cao ở dải pH từ 5,5-6,5 (48,03-95,88 U/mg) (Hình 3.13 và Bảng 4.13). 0 40 80 120 20 30 40 50 60 70 80 90 Nhiệt độ H oạ t t ín h en do -β -1 ,4 -g lu ca na se tư ơn g đố i ( % ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 Hình 3.13. Ảnh hƣởng của pH phản ứng lên hoạt tính endo-β-1,4-glucanase ở chủng A. oryzae VTCC-F-045 Theo nghiên cứu trƣớc đây, pH thích hợp để endo-β-1,4-glucanase của chủng Trametes hirsuta hoạt động mạnh nhất là 5,0; endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae gồm Cel-1 và Cel-3 lần lƣợt là 3,5 và 4,5 (Fukuda et al., 2002). Endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae KBN616 gồm CelA và CelB lần lƣợt là 5,0 và 4,0; CMCase của chủng A. niger Z10 hoạt động ở dải pH rộng từ 3,0-9,0 và hoạt động mạnh nhất ở pH là 4,5 và 7,5 (Coral et al., 2002). 3.5.3. Độ bền nhiệt Dƣới tác động của nhiệt độ, enzyme đều bị biến tính ít nhiều và bị ảnh hƣởng tới hoạt tính. Một số liên kết hydro tham gia vào giữ vững cấu trúc và trung tâm hoạt động của enzyme bị đứt gãy bởi nhiệt độ. Mức độ ảnh hƣởng tùy thuộc vào thời gian và nhiệt độ ủ enzyme. Dịch enzyme tinh sạch đƣợc ủ ở các nhiệt độ khác nhau 30, 45, 50, 55 và 60C. Kết quả cho thấy, từ 0-4 giờ ở các nhiệt độ 30, 45, 55 và 60C hoạt tính vẫn đạt từ 47,61-68,81 U/mg. Đặc biệt ở 4 giờ đối với 30C và 55C hoạt tính đạt 65,74-68,81U/mg, tăng 21-27% 0 40 80 120 3 4 5 6 7 8 pH phản ứng H oạ t t ín h en do -β -1 ,4 -g lu ca na se tư ơn g đố i ( % ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 so với đối chứng. Từ 6-8 giờ ủ ở 45C và 30C hoạt tính enzyme vẫn duy trì đƣợc từ 68-85%. Ở nhiệt độ còn lại giảm khá mạnh, chỉ đạt 38% ở 50C (Hình 3.14 và Bảng 4.14). Nhƣ vậy, endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 bền ở dải nhiệt độ 30-45C. Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 Kitamoto và cs (2006) khi nghiên trên chủng A. oryzae KBN616 cho rằng CelA bền ở nhiệt độ dƣới 55C sau 20 giờ ủ, nhiệt độ trên 60C CelA không có hoạt tính; trong khi đó CelB thì bền ở nhiệt độ dƣới 50C và mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 55C. Cũng ở chủng A. oryzae sau khi ủ enzyme (Cel-1 và Cel-3) ở dải nhiệt độ khác nhau (10-80C) trong 30 phút, Yamane và cs (2002) nhận thấy Cel-1 bền ở dải nhiệt độ dƣới 50C và Cel-3 bền ở dải nhiệt độ dƣới 60C. Ở chủng A. niger endo-β-1,4-glucanase sau khi ủ ở 80C hoạt tính còn lại 56% (Hong et al., 2001). Endo-β-1,4-glucanase của chủng A. terreus M11 vẫn còn duy trì đƣợc 60% hoạt tính sau khi ủ ở 70C trong 1 giờ (Gao et al., 2008). 0 50 100 150 0 2 4 6 8 10 Thời gian ủ (giờ) Ho ạt tí nh e nd o- β- 1, 4- glu ca na se tư ơn g đố i ( % ) 30 45 50 55 60 0 50 100 150 0 2 4 6 8 10 Thời gian ủ (giờ) Hoạt tính e ndo-β-1,4-g lucanase tư ơng đối (% ) 30 45 50 55 60 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 3.5.4. Độ bền pH pH ảnh hƣởng tới độ bền enzyme, nên việc lựa chọn pH thích hợp để bảo quản enzyme là rất quan trọng. Tùy loại protein enzyme mà có độ bền trong một môi trƣờng pH nhất định. Ở đây, độ bền của endo-β-1,4-glucanase đƣợc khảo sát trong các đệm khác nhau với dải pH 4,5-7,5. Kết quả cho thấy sau 1 giờ ủ, chỉ có ở pH 6,0 hoạt tính tƣơng đối của enzyme vẫn giữ đƣợc 88%, trong khi ở các pH còn lại giảm khá mạnh, giảm mạnh nhất ở pH 6,5 hoạt tính tƣơng đối chỉ đạt 60%. Ở các thời gian ủ 2, 4 và 6 giờ hoạt tính còn lại của enzyme ở các pH khảo sát giảm khá mạnh, giảm mạnh nhất ở pH 6,5 hoạt tính chỉ đạt 53% và giảm ít nhất ở pH 6,0 hoạt tính đạt 64%. Nhƣ vậy, endo-β-1,4-glucanase ở chủng A. oryzae VTCC-F-045 bền ở pH 6,0 sau 1 giờ ủ (Hình 3.15 và Bảng 4.15). Hình 3.15. Ảnh hƣởng của pH lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 Những nghiên cứu trƣớc đây cho thấy, endo-β-1,4-glucanase gồm CelA và CelB của chủng A. oryzae KBN616 bền ở dải pH từ 3,0-7,0 sau 20 giờ ủ ở 30C, tuy nhiên CelB không bền ở pH 3,0 và 7,0 giống CelA (Kitamoto et al., 0 40 80 120 0 2 4 6 8 Thời gian ủ (giờ) Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase tƣơn g đối (%) pH 4.5 pH 5.0 pH 5.5 pH 6,0 pH 7.5 40 80 120 0 2 4 6 8 Thời gian ủ (giờ) Ho ạt tín h en do -β -1 ,4 -g lu ca na se tƣ ơn g đố i ( % ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 1996); Trong khi enzyme từ chủng A. niger bền ở dải pH từ 3,0-10,0 sau 1 giờ ủ (Hong et al., 2001). CMCase gồm C-I và C-II của chủng Cephalosporium sp RYM-202 bền ở dải pH rộng và hoạt tính vẫn còn duy trì trên 80% ở pH 11 sau 24 giờ ủ (Kang and Rhee, 1995). Endo-β-1,4-glucanase của chủng A. terreus M11 bền ở dải pH từ 2,0-5,0 (Gao et al., 2008). 3.5.5. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ Trong dung dịch enzyme, dung môi hữu cơ làm giảm hằng số điện môi và tăng lực hút tĩnh điện giữa các phân tử protein enzyme. Để đánh giá ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ, dịch enzyme đƣợc ủ cùng với các dung môi khác nhau ở nhiệt độ phòng. Kết quả cho thấy, cả 5 dung môi khảo sát làm giảm hoạt tính của endo-β-1,4-glucanase. Trong đó, n-butanol ảnh hƣởng mạnh nhất làm giảm hoạt tính tƣơng đối của enzyme chỉ còn 43%. Acetone và ethanol làm hoạt tính tƣơng đối của enzyme còn 56% và 76%. Isopropanol và methanol làm giảm hoạt tính ít hơn so với đối chứng (80-81%) (Hình 3.16 và Bảng 4.16). Nhƣ vậy, các dung môi hữu cơ khảo sát ít ảnh hƣởng tới hoạt tính của endo-β- 1,4-glucanase trừ n-butanol. Hình 3.16. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 0 40 80 120 ĐC MetOH EtOH IsOH Act n-BtOH Dung môi hữu cơ H oạ t t ín h en do -β -1 ,4 -g lu ca na se tư ơn g đố i ( % ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 3.5.6. Ảnh hƣởng của