Luận văn Tổng quan về enzyme urease

CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN 1.1 TOÅNG QUAN VEÀ ENZYME UREASE 1.1.1 Giôùi thieäu chung veà enzyme urease [2, 7, 77, 92] Urease coù teân heä thoáng laø carbamine amidohydrolase, laø enzyme xuùc taùc quaù trình thuûy phaân urea thaønh ammonia vaø khí cacbonic. Noù thuoäc nhoùm enzyme hydrolase (enzyme thuûy phaân). Trong baûng phaân loaïi enzyme theo quy öôùc quoác teá, urease mang maõ soá EC 3.5.1.5 trong đoù: soá 3 chæ nhoùm chính-hydrolase, soá 5 chæ nhoùm phuï enzyme taùc duïng leân lieân keát C-N, khaùc lieân keát peptid, soá 1 chæ phaân nhoùm phuï caét caùc amid thaúng (amidohydrolase), soá 5 chæ soá thöù töï cuûa urease trong phaân nhoùm phuï. Hình 1.1: Enzyme urease Nhö vaäy, töø teân kí hieäu quoác teá cuûa urease, ta coù theå bieát ñöôïc noù laø enzyme thuûy phaân thuoäc nhoùm amidase, xuùc taùc phaûn öùng thuûy phaân lieân keát C-N, khoâng phaûi lieân keát peptid. Urease laàn ñaàu tieân ñöôïc J.B.Sumner taùch chieát vaø keát tinh töø ñaäu röïa (jack bean - Canavalia ensiformis) vaøo naêm 1926. Hieän nay, urease töø ñaäu röïa laø loaïi urease ñöôïc söû duïng nhieàu nhaát. 1.1.2 Caáu taïo Bình thöôøng urease toàn taïi ôû daïng tinh theå 8 caïnh, trong suoát khoâng maøu, coù ñöôøng kính tuøy phöông phaùp chieát taùch vaø coù khoái löôïng cuõng nhö hình daïng khaùc nhau tuøy vaøo nguoàn thu nhaän [7]. Hình 1.2: Tinh theå urease ñöôïc J.B.Sumner taùch chieát vaø keát tinh. Urease laø moät enzyme caáu truùc baäc 4. Moãi phaân töû enzyme coù töø 3 – 4 taâm hoaït ñoäng. Caùc nghieân cöùu ñaõ chöùng minh raèng coù söï hieän dieän cuûa caùc nhoùm –SH taïi trung taâm hoaït ñoäng. Caùc nhoùm naøy ñoùng vai troø raát quan troïng ñoái vôùi khaû naêng xuùc taùc cuûa urease: goùp phaàn trong vieäc hình thaønh phöùc chaát enzyme – cô chaát, keát hôïp cô chaát vôùi caùc cofactor cuûa enzyme, duy trì caáu truùc khoâng gian cuûa enzyme ñeå ñaûm baûo hoaït löïc xuùc taùc. Caùc nghieân cöùu cho thaáy raèng hoaït tính cuûa urease giaûm khaù nhieàu neáu nhö caùc nhoùm –SH naøy bò voâ hoaït [7,92]. Ngoaøi ra, taïi trung taâm hoaït ñoäng, ngöôøi ta coøn tìm thaáy söï coù maët cuûa 2 ion Ni2+. Hai ion naøy lieân keát raát chaët cheõ vôùi phaân töû protein. Tuy nhieân, trong moâi tröôøng acid vôùi söï coù maët cuûa EDTA noàng ñoä 1mM thì caùc ion naøy bò giaûi phoùng khoûi lieân keát, daãn ñeán vieäc giaûm hoaït tính cuûa urease. Caùc ion Ni2+ taïo lieân keát vôùi caùc acid amin vaø taïo ra beà maët hoaït hoùa laøm taêng hoaït tính cuûa enzyme [2,7,92]. Hình 1.3: Trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme urease Veà khoái löôïng phaân töû, urease töø nhöõng nguoàn khaùc nhau coù phaân töû löôïng khaùc nhau. Theo caùc keát quaû nghieân cöùu cuûa Joseph vaø Evelyn, khoái löôïng phaân töû urease ñöôïc xaùc ñònh baèng phöông phaùp loïc gel treân coät Agarose A_15m seõ dao ñoäng trong khoaûng 420.000 Da ñeán 540.000 Da [45]. 1.1.3 Cô cheá xuùc taùc [2,7,92] Hình 1.4: Cô cheá xuùc taùc cuûa urease Cô cheá xuùc taùc cuûa enzyme urease ñöôïc chaáp nhaän nhieàu nhaát hieän nay laø cô cheá döïa treân vai troø khaùc nhau cuûa 2 ion Ni2+. Trong ñoù, moät ion seõ lieân keát vaø hoaït hoùa urea, coøn ion coøn laïi seõ lieân keát vaø hoaït hoùa nöôùc. Döïa treân hình veõ, ta nhaän thaáy, ban ñaàu ion Ni2+ - 1 taïo lieân keát vôùi nguyeân töû oxy trong nhoùm carbonyl vaø nhoùm OH- cuûa nöôùc laø caàu noái giöõa ion Ni2+ - 2 vôùi nguyeân töû C trong nhoùm carbonyl cuûa urea. ÔÛ giai ñoaïn sau, trong phöùc hôïp enzyme – cô chaát seõ dieãn ra söï chuyeån dòch ñieän töû vaø keát quaû laø ammoniac ñöôïc giaûi phoùng keát hôïp vôùi acid carbamic ñeå taïo thaønh ammonia carbamate, keøm theo laø söï taùi caáu truùc laïi trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme. Nhö vaäy, vai troø cuûa 2 ion kim loaïi Ni2+ laø raát quan troïng trong vieäc taïo lieân keát giöõa enzyme vôùi cô chaát ôû giai ñoaïn taïo phöùc chaát trung gian. Ñaây chính laø moät cofactor cuûa urease. Trong thöïc teá, nhieàu nghieân cöùu ñaõ chöùng minh, trong phaûn öùng thuûy phaân urea döôùi söï xuùc taùc cuûa enzyme urease, saûn phaåm chính laø ammonium carbamate NH4COONH2. Maëc duø vaäy, vaãn coù söï phaân huûy ammonium carbamate ñeå taïo thaønh khí CO2 vaø NH3 vaø söï phaân huûy naøy khoâng phuï thuoäc vaøo vieäc coù hay khoâng coù enzyme urease maø laïi phuï thuoäc vaøo baûn chaát cuûa dung dòch ñeäm söû duïng. Caùc loaïi ñeäm phosphate vaø maleate seõ taïo thuaän lôïi cho quaù trình phaân huûy taïo CO2 vaø NH3, ngöôïc laïi, ammonium carbamate beàn trong ñeäm citrate vaø tris. 1.1.4 Cô chaát cuûa enzyme urease [2,7,92] Enzyme urease coù tính ñaëc hieäu tuyeät ñoái ñoái vôùi cô chaát urea. Nghieân cöùu cuûa Jabri vaø coäng söï naêm 1995 ñaõ chöùng minh raèng vaän toác phaûn öùng thuûy phaân urea döôùi xuùc taùc cuûa enzyme urease cao hôn phaûn öùng thuûy phaân khoâng enzyme ñeán 1014 laàn. Ngoaøi ra, ngöôøi ta nhaän thaáy urease cuõng xuùc taùc phaûn öùng thuûy phaân moät soá cô chaát khaùc coù caáu truùc gaàn gioáng vôùi urea nhö semicarbazide, formamide, acetamide, methylurea, hydroxyurea, phenyl phosphorodiamidate, phosphoric triamide, diamidophosphate, phosphoramidate vaø moät soá amide, ester khaùc cuûa acid phosphoric. Tuy nhieân, toác ñoä phaûn öùng thuûy phaân caùc cô chaát khaùc cuûa enzyme urease thaáp hôn nhieàu so vôùi cô chaát laø urea. 1.1.5 Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán hoaït tính enzyme urease 1.1.5.1 AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä cô chaát [4] Toác ñoä cuûa phaûn öùng enzyme trong moät giôùi haïn naøo ñoù phuï thuoäc vaøo noàng ñoä cô chaát coù trong moâi tröôøng. Khi naøo chöa bò baõo hoøa bôûi cô chaát thì toác ñoä phaûn öùng vaãn tæ leä thuaän vôùi noàng ñoä cô chaát. 1.1.5.2 AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä Phaûn öùng döôùi söï xuùc taùc cuûa enzyme cuõng gioáng nhö caùc phaûn öùng hoùa hoïc khaùc nghóa laø khi nhieät ñoä taêng thì toác ñoä phaûn öùng cuõng taêng theo. Tuy nhieân, vì enzyme coù baûn chaát protein neân coù theå bò bieán tính neáu nhieät ñoä vöôït quaù moät giôùi haïn naøo ñoù. Vì vaäy, moãi enzyme seõ coù moät nhieät ñoä hoaëc moät khoaûng nhieät ñoä maø taïi ñoù, naêng löïc xuùc taùc cuûa noù laø cao nhaát. Ngöôøi ta goïi ñoù laø nhieät ñoä toái thích Topt cho enzyme hoaït ñoäng [4]. Ñoái vôùi urease coù nguoàn goác töø ñaäu röïa, theo caùc taùc giaû thì nhieät ñoä toái thích vaøo khoaûng 40 – 50oC. ÔÛ nhieät ñoä naøy, hoaït tính cuûa enzyme laø lôùn nhaát. Khi nhieät ñoä vöôït quaù 65oC, hoaït tính cuûa urease bò giaûm vaø coù theå maát haún khi nhieät ñoä ñaït 85oC. Tuy nhieân, nhieät ñoä toái thích cuûa urease khoâng coá ñònh maø phuï thuoäc vaøo nhieàu yeáu toá nhö: nguoàn thu nhaän, noàng đoä enzyme, noàng đoä cô chaát, pH, thôøi gian phaûn öùng… [2,7] Urease ôû dung dòch loaõng khoâng coù cô chaát thöôøng keùm beàn nhieät nhaát, coøn ôû daïng boät khoâ vaø coù cô chaát thì khaù beàn nhieät [2,7]. ÔÛ nhieät ñoä thaáp, hoaït tính cuûa urease giaûm nhöng urease khoâng bò bieán tính. 1.1.5.3 AÛnh höôûng cuûa pH pH aûnh höôûng raát lôùn ñeán hoaït tính enzyme do pH laøm thay ñoåi traïng thaùi ion hoùa cuûa phaân töû enzyme vaø cô chaát. Nghieân cöùu cuûa Howell vaø Sumner veà enzyme urease keát luaän urease coù pHopt = 6 khi noàng đoä cô chaát urea 8% vaø baèng 7,5 khi noàng đoä urea laø 1%. Đieàu naøy cho thaáy giaù trò pH toái öu cuûa urease khoâng coá đònh vaø noù coøn phuï thuoäc vaøo noàng đoä cô chaát, nhieät đoä cuõng nhö vaøo nguoàn thu nhaän. Ngoaøi ra, tính chaát cuûa dung dòch ñeäm cuõng aûnh höôûng ñeán hoaït tính cuûa enzyme urease [2,4,7]. Theo caùc taøi lieäu nghieân cöùu thì pH toái thích cuûa urease naèm trong khoaûng töø 6,4 – 7,6. Urease töø ñaäu röïa vaø haàu heát caùc loaïi vi sinh vaät coù pHopt dao ñoäng xung quanh giaù trò 7, urease töø taûo Spirulina maxima coù pHopt khoaûng 8,7, trong khi ñoù, caùc loaïi acid urease coù giaù trò pH toái thích töø 2 trôû xuoáng [92]. 1.1.5.4 AÛnh höôûng cuûa chaát hoaït hoùa, chaát kìm haõm Moãi enzyme ñeàu toàn taïi moät soá hôïp chaát voâ cô hoaëc höõu cô maø söï coù maët cuûa chuùng coù khaû naêng kích thích hoaëc kìm haõm hoaït ñoäng cuûa enzyme, goïi laø chaát kích thích (chaát hoaït hoùa) vaø chaát kìm haõm (chaát öùc cheá). Tuy nhieân khoâng coù söï phaân bieät roõ raøng chaát öùc cheá vaø kìm haõm vì moät chaát coù theå laø kích thích vôùi enzyme naøy nhöng laø kìm haõm cuûa enzyme khaùc hoaëc ôû noàng ñoä naøy laø kích thích, noàng ñoä khaùc laø kìm haõm [6]. Chaát hoaït hoùa Chaát hoaït hoùa laø caùc chaát coù khaû naêng laøm taêng hoaït ñoäng xuùc taùc cuûa enzyme hoaëc laøm cho enzyme chuyeån töø traïng thaùi khoâng hoaït ñoäng sang traïng thaùi hoaït ñoäng. Caùc chaát naøy coù theå laø caùc anion, caùc ion kim loaïi, caùc chaát höõu cô coù caáu truùc phöùc taïp, coù theå ñoùng vai troø nhoùm ngoaïi cuûa caùc enzyme 2 caáu töû hoaëc tham gia vaøo caáu taïo cuûa coenzyme, hoaëc laø caàu noái giöõa enzyme vôùi cô chaát, hoaëc laø caàu noái giöõa phaàn apoenzyme vôùi coenzyme [4]. Hoaït tính cuûa urease bò öùc cheá khi caùc nhoùm –SH bò voâ hoaït. Do vaäy, nhöõng chaát coù taùc duïng phuïc hoài chöùc naêng cuûa caùc nhoùm –SH taïi trung taâm hoaït ñoäng nhö L-cystein thì coù theå laøm hoaït hoùa urease [2,7,92]. Nhöõng nhoùm –SH taïi taâm hoaït ñoäng chòu söï oxy hoùa döôùi taùc ñoäng cuûa nhieàu yeáu toá, vaø söï oxy hoùa naøy xaûy ra vôùi toác ñoä ñaùng keå khi coù maët cuûa caùc ion kim loaïi xuùc taùc nhö Ag+, Cu2+, Hg2+… Khi duøng EDTA ñeå haáp thuï caùc ion kim loaïi trong dung dòch seõ laøm cho tính oån ñònh cuûa enzyme urease noùi rieâng vaø caùc enzyme chöùa nhoùm –SH trong taâm hoaït ñoäng taêng leân raát nhieàu [2,7,92]. Khi noàng ñoä EDTA-Na2 thaáp , EDTA seõ haáp thuï caùc ion kim loaïi, nghóa laø moät caùch giaùn tieáp cuõng laø moät chaát hoaït hoùa urease. Tuy nhieân, neáu noàng ñoä EDTA-Na2 ñaït ñeán moät ngöôõng naøo ñoù, noù seõ haáp thuï ion Ni2+ taïi trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme, laøm öùc cheá urease. Ñieàu naøy cuõng ñoàng nghóa vôùi vieäc EDTA laø moät chaát kìm haõm [92]. Chaát kìm haõm Chaát kìm haõm laø caùc chaát coù taùc duïng chuyeån enzyme töø traïng thaùi hoaït đoäng sang traïng thaùi khoâng hoaït đoäng, hoaëc töø traïng thaùi hoaït đoäng maïnh sang traïng thaùi hoaït đoäng yeáu. Caùc chaát naøy toàn taïi hai loaïi kìm haõm: caïnh tranh vaø khoâng caïnh tranh [4]. Kìm haõm caïnh tranh: xaûy ra trong tröôøng hôïp chaát kìm haõm coù caáu truùc töông đoàng vôùi cô chaát, vì vaäy cuõng coù khaû naêng keát hôïp vôùi enzyme, giaûm moái lieân keát giöõa enzyme vaø cô chaát. Nhö vaäy, caùc hôïp chaát nhö hydroxyurea, dihydroxyurea, thiourea hay hydroxamic acid laø nhöõng chaát öùc cheá đaëc hieäu caïnh tranh cuûa urease. Vì chuùng coù caáu taïo gaàn gioáng cô chaát (urea) neân chuùng cuõng coù khaû naêng keát hôïp vôùi enzyme. Do đoù söï coù maët cuûa chuùng trong dung dòch laøm giaûm toác đoä phaûn öùng thuûy phaân urea. Coù theå laøm giaûm taùc duïng cuûa nhöõng chaát öùc cheá naøy baèng caùch taêng noàng đoä cô chaát urea [2,4,7,92]. Kìm haõm khoâng caïnh tranh: xaûy ra trong tröôøng hôïp chaát kìm haõm coù khaû naêng keát hôïp vôùi enzyme hoaëc cô chaát, coù theå laø ion kim loaïi cuøng hoùa trò vôùi caùc ion kim loaïi laø nhoùm ngoaïi cuûa enzyme. Caùc ion kim loaïi nhö nhö Hg2+, Cu2+, Pb2+, Mn2+… laø nhöõng chaát kìm haõm khoâng caïnh tranh vì noù coù hoùa trò cuøng vôùi cofactor cuûa urease laø Ni2+. Caùc ion kim loaïi naøy seõ tranh giaønh caùc lieân keát vôùi Ni2+, vaø do đoù seõ laøm “khoùa”ù trung taâm hoaït đoäng cuûa urease. Urease raát nhaïy caûm vôùi söï coù maët cuûa caùc ion kim loaïi vì ngoaøi taùc duïng kìm haõm khoâng caïnh tranh nhö treân, caùc ion kim loaïi coøn coù theå laøm bieán tính enzyme do chuùng thuùc ñaåy phaûn öùng oxy hoùa caùc nhoùm –SH taïi taâm hoaït ñoäng. Söï kìm haõm urease cuûa caùc ion kim loaïi giaøm daàn theo thöù töï sau: Ag+> Hg2+> Cu2+> Zn2+> Cd2+> Au2+> Pb2+> Co2+> Ni2+> Ce2+> Mn2+. Ví duï: vôùi haøm löôïng AgNO3 laø 0,002 mg/ml đaõ laøm maát hoaït tính cuûa urease, đoái vôùi HgCl2 laø 0,004 mg/ml vaø đoái vôùi Cu2+ laø 0,01 mg/ml [2,4,7,92]. Ngoaøi ra, caùc acid hay kieàm ñaëc cuõng nhö caùc taùc nhaân gaây keát tuûa protein nhö acid tricloacetic (TCA) hay tannin cuõng laø nhöõng chaát coù taùc duïng kìm haõm enzyme urease. 1.1.6 Nguoàn thu nhaän enzyme urease [2,7,92] Urease đöôïc caùc nhaø khoa hoïc tìm thaáy khaù sôùm ôû nhöõng nguoàn nguyeân lieäu khaùc nhau. Naêm 1980, Miquel tìm thaáy urease ôû nhieàu loaøi vi sinh vaät, nhaát laø caùc vi sinh vaät trong đaát, trong thöïc vaät vaø moät soá ít ôû đoäng vaät. OÂng đaõ tìm ra hôn 200 loaøi vi khuaån, nhieàu loaïi naám men vaø ôû đa soá caùc loaïi thöïc vaät baäc cao coù khaû naêng sinh toång hôïp urease. Caùc vi khuaån coù chöùa urease tham gia vaøo quaù trình đoàng hoùa urea thaønh muoái amon coù nhieàu loaøi, chuùng coù teân chung laø Ureabacterium, haàu heát chuùng thuoäc 2 hoï: Cocoaceae vaø Bacilaceae [2,7,92]. Trong ngaønh coäng ngheä sinh hoïc, C.Palacco vaø A.Havir cuõng ñöa ra phöông phaùp thu nhaän enzyme töø nuoâi caáy moâ ñaäu. Nguoàn enzyme urease töï nhieân trong caùc caây hoï ñaäu raát phong phuù. Caùc nhaø khoa hoïc ñaõ taän duïng töø caùc nguoàn naøy ñeå trích ly ra enzyme urease vaø öùng duïng roäng raõi trong caùc ngaønh phaân tích thöïc phaåm vaø y hoïc. Baûng 1.1: Tính chaát cuûa moät soá loaïi urease töø caùc nguoàn khaùc nhau (Liu vaø coäng söï, 1996) [30] Nguoàn enzyme Hoaït tính rieâng (ñôn vò/ml) Km (mmol/l) Ñaäu naønh ñen 21.8 3.75 Ñaäu naønh xanh 25.2 3.71 Ñaäu röïa 137 1.54 Haït bí ngoâ 34 1.55 Haït bí ngoâ boû voû 26.5 1.89 Ñaäu naønh boû voû 31.3 3.46 Haït döa haáu boû voû 23.6 4.16 1.1.7 ÖÙng duïng cuûa enzyme urease Enzyme urease hieän nay ñöôïc öùng duïng nhieàu trong caùc ngaønh noâng nghieäp, thöïc phaåm, trong y hoïc vaø caùc lónh vöïc phaân tích khaùc. Trong noâng nghieäp, urease ñöôïc söû duïng ñeå thuùc ñaåy quaù trình thuûy phaân urea thaønh NH3 cung caáp thaønh phaàn Nitô cho caây troàng. Quaù trình thuûy phaân naøy ñöôïc thöïc hieän bôûi heä vi sinh vaät trong ñaát do chuùng saûn sinh ra moät löôïng ñaùng keå enzyme urease. Trong ngaønh thöïc phaåm: urease ñaõ ñöôïc öùng duïng ñeå phaùt hieän söï toàn taïi cuûa urea trong caùc loaïi saûn phaåm thòt caù, nöôùc giaûi khaùt, caùc saûn phaåm leân men vaø caùc saûn phaåm töø söõa. Urea laø moät hôïp chaát khoâng ñöôïc pheùp coù maët trong thöïc phaåm. Vì moät nguyeân nhaân khoâng mong muoán, hoaëc do coù chuû yù maø moät löôïng urea ñaõ coù maët trong caùc saûn phaåm thöïc phaåm. Do ñoù maø caùc cheá phaåm urease ñöôïc söû duïng ñeå phaùt hieän vaø, coù theå ñònh löôïng ñöôïc urea trong thöïc phaåm. Trong y hoïc, urease ñöôïc söû duïng ñeå xaùc ñònh haøm löôïng urea trong maùu vaø nöôùc tieåu cuûa ngöôøi. Ñaây laø phöông phaùp khaù chính xaùc, ít toán keùm vaø deã tieán haønh. Vieäc xaùc ñònh haøm löôïng urea trong maùu vaø nöôùc tieåu seõ cho bieát naêng löïc hoaït ñoäng cuûa caùc heä cô quan, maø quan trong nhaát laø thaän vaø heä baøi tieát. Ngoaøi ra, urease coøn ñöôïc gaén trong caùc tieåu vi caàu duøng ñeå loaïi urea cuûa maùu trong thaän nhaân taïo. Trong coâng ngheä moâi tröôøng: urease duøng ñeå phaân tích haøm löôïng caùc kim loaïi naëng trong caùc chaát thaûi vaø trong nguoàn nöôùc. Trong lónh vöïc phaân tích: urease ñöôïc öùng duïng laøm caùc ñieän cöïc urease ñeå xaùc ñònh haøm löôïng urea treân doøng lieân tuïc. 1.2 SÔ LÖÔÏC VEÀ ENZYME COÁ ÑÒNH [4] 1.2.1 Giôùi thieäu 1.2.1.1 Ñònh nghóa Enzyme coá ñònh coù theå ñöôïc hieåu theo 2 nghóa: Nghóa heïp: enzyme khoâng hoøa tan laø enzyme ñöôïc ñöa vaøo nhöõng pha rieâng reõ, pha naøy ñöôïc taùch rieâng vôùi dung dòch töï do. Pha enzyme khoâng hoøa tan trong nöôùc vaø ñöôïc gaén vôùi caùc polymer öa nöôùc coù troïng löôïng phaân töû lôùn. Nghóa roäng: caùc chaát xuùc taùc coá ñònh laø caùc enzyme, teá baøo, cô theå soáng ôû traïng thaùi cho pheùp söû duïng laïi. Nhö vaäy, theo nghóa roäng, enzyme khoâng hoøa tan bao goàm caû enzyme ñöôïc coá ñònh vaøo moät chaát mang, caû enzyme coù trong teá baøo soáng ñöôïc coá ñònh trong caùc bình phaûn öùng sinh hoïc coù söï gaén keát vaøo moät chaát mang cho pheùp ta söû duïng nhieàu laàn. Enzyme khoâng hoøa tan hay enzyme coá ñònh thöôøng laø nhöõng enzyme hoøa tan ñöôïc gaén vaøo moät chaát mang baèng nhieàu kyõ thuaät khaùc nhau. Nhôø quaù trình gaén naøy maø enzyme töø traïng thaùi hoøa tan chuyeån sang khoâng hoøa tan. 1.2.1.2 Ñaëc ñieåm cuûa enzyme coá ñònh [4] Enzyme coá ñònh coù caùc ñaëc ñieåm sau ñaây: Hoaït tính rieâng cuûa enzyme coá ñònh thöôøng nhoû hôn hoaït tính rieâng cuûa enzyme töï do cuøng loaïi. Sôû dó coù söï thay ñoåi veà hoaït tính rieâng cuûa enzyme coá ñònh laø do nhöõng nguyeân nhaân sau ñaây: Do aûnh höôûng ñieän tích cuûa chaát mang: khi ñieän tích cuûa chaát mang coù söï khaùc bieät vôùi ñieän tích cuûa enzyme thì khi gaén enzyme vaøo chaát mang, caáu truùc khoâng gian cuûa enzyme coù söï thay ñoåi ôû möùc ñoä nhaát ñònh. Chính vì söï thay ñoåi caáu truùc naøy maø khaû naêng keát hôïp giöõa enzyme vaø cô chaát seõ keùm ñi, daãn ñeán hoaït tính cuûa chuùng cuõng giaûm. Do enzyme bò nhoát vaøo maïng löôùi hoaëc bò lieân keát bôûi chaát mang khieán cho söï tieáp xuùc giöõa enzyme vaø cô chaát gaëp khoù khaên. Enzyme coá ñònh hoaøn toaøn tuaân theo ñònh luaät Michaelis – Menten nhöng coù moät soá sai khaùc nhaát ñònh: Coù theå xaûy ra söï caïnh tranh cô chaát vôùi enzyme vaø chaát mang. Xaûy ra hieän töôûng caûn trôû söï khueách taùn cuûa cô chaát vaø saûn phaåm laøm giaûm toác ñoä phaûn öùng. Enzyme coá ñònh thöôøng coù tính beàn nhieät hôn enzyme töï do nhôø taùc duïng che chôû cuûa caùc chaát mang. Enzyme coá ñònh thöôøng coù pH toái öu khoâng truøng vôùi pH toái öu cuûa enzyme töï do cuøng loaïi. Enzyme coá ñònh coù khaû naêng baûo quaûn toát hôn enzyme töï do. Enzyme coá ñònh coù theå taùi söû duïng nhieàu laàn do coù theå taùch rieâng enzyme ra khoûi cô chaát moät caùch deã daøng sau phaûn öùng vaø ñoä beàn cuûa enzyme coá ñònh cao hôn so vôùi enzyme töï do. 1.2.1.3 Öu, nhöôïc ñieåm cuûa enzyme coá ñònh [4] Enzyme coá ñònh coù caùc öu ñieåm sau: Enzyme coá ñònh coù theå söû duïng laëp laïi nhieàu laàn trong moät thôøi gian daøi. Enzyme coá ñònh khoâng laãn vaøo trong saûn phaåm cuoái cuûa phaûn öùng enzyme, do ñoù noù khoâng gaây aûnh höôûng xaáu ñeán chaát löôïng saûn phaåm, hay noùi caùch khaùc chuùng ta khoâng phaûi toán chi phí cho vieäc taùch enzyme ra khoûi saûn phaåm. Coù theå ngöøng phaûn öùng khi caàn thieát baèng caùch taùch heä chaát mang-enzyme ra khoûi dung dòch cô chaát. Enzyme coá ñònh töông ñoái beàn vôùi caùc taùc nhaân vaät lyù vaø hoùa hoïc hôn enzyme töï do. Deã daøng tieán haønh quaù trình saûn xuaát theo phöông phaùp lieân tuïc. Beân caïnh ñoù, enzyme coá ñònh vaãn coù moät soá nhöôïc ñieåm nhö sau: Söï coù maët cuûa chaát mang coù theå laøm giaûm hoaït tính cuûa enzyme. Trong ña soá tröôøng hôïp, enzyme coù theå bò giaûm hoaëc maát hoaït tính sau quaù trình coá ñònh. Tuy nhieân, nhöõng haïn cheá treân laø khoâng ñaùng keå so vôùi lôïi ích maø enzyme coá ñònh ñem laïi. Do vaäy, ngaøy caøng coù nhieàu nghieân cöùu veà coá ñònh enzyme cuõng nhö öùng duïng enzyme coá ñònh vaøo saûn xuaát coâng nghieäp. 1.2.2. Caùc phöông phaùp coá ñònh enzyme [4] Caùc phöông phaùp coá ñònh enzyme ñöôïc chia thaønh 2 nhoùm chính: Phöông phaùp hoùa hoïc: Gaén enzyme leân chaát mang baèng lieân keát coäng hoùa trò. Gaén caùc phaân töû enzyme laïi vôùi nhau baèng lieân keát coäng hoùa trò. Phöông phaùp vaät lyù: Haáp phuï enzyme leân chaát mang baèng lieân keát vaät lyù nhö: löïc mao quaûn, lieân keát ion, löïc Van der Waals… Phöông phaùp nhoát enzyme trong khuoân gel hoaëc maøng bao vi theå. Baûng 1.2: Öu – Nhöôïc ñieåm cuûa caùc phöông phaùp coá ñònh enzyme [4]. Phöông phaùp Öu ñieåm Nhöôïc ñieåm Phöông phaùp hoùa hoïc Phöông phaùp gaén enzyme leân chaát mang baèng lieân keát coäng hoùa trò - Lieân keát giöõa enzyme vaø chaát mang laø lieân keát beàn, do ñoù haïn cheá ñöôïc toái ña söï maát maùt enzyme trong quaù trình phaûn öùng. - Hoaït tính enzyme coù theå bò giaûm do nhöõng bieán ñoåi veà caáu truùc cuûa enzyme trong quaù trình coá ñònh. Phöông phaùp gaén caùc phaân töû enzyme laïi vôùi nhau baèng lieân keát coäng hoùa trò - Taïo ñöôïc lieân keát raát beàn tröôùc caùc taùc nhaân pH, nhieät ñoä. - Thöôøng ñöôïc duøng phoái hôïp vôùi caùc phöông phaùp coá ñònh khaùc. - Chi phí cao, thao taùc thöïc hieän töông ñoái phöùc taïp. - Hoaït tính enzyme coù theå bò giaûm do nhöõng bieán ñoåi veà caáu truùc cuûa enzyme trong quaù trình coá ñònh. Phöông phaùp vaät lyù Phöông phaùp gaén enzyme leân chaát mang baèng töông taùc vaät lyù. - Thao taùc thöïc hieän ñôn giaûn. - Ñieàu kieän tieán haønh coá ñònh enzyme oân hoøa neân khoâng laøm maát hoaïït tính cuûa enzyme trong quaù trình coá ñònh. - Coù khaû naêng taùi söû duïng chaát mang. - Do löïc töông taùc giöõa enzyme vaø chaát mang yeáu neân deã xaûy ra hieän töôïng nhaû haáp phuï trong quaù trình söû duïng enzyme coá ñònh do khuaáy troän hay do thay ñoåi nhieät ñoä, pH cuûa moâi tröôøng. Phöông phaùp nhoát enzyme - Thao taùc ñôn giaûn. - Khoâng ñoøi hoûi phaûi coù caùc nhoùm taïo lieân keát neân phuø hôïp vôùi nhieàu loaïi enzyme. - Hieäu quaû coá ñònh enzyme cao. - Coù theå coá ñònh ñoàng thôøi nhieàu enzyme. - Chæ thích hôïp cho phaûn öùng vôùi cô chaát coù khoái löôïng phaân töû nhoû. 1.3 TOÅNG QUAN VEÀ ENZYME UREASE COÁ ÑÒNH 1.3.1 Giôùi thieäu [92] Nghieân cöùu veà enzyme urease coá ñònh ñaõ ñöôïc tieán haønh khaù nhieàu keå töø thaäp nieân 1960. Nhieàu loaïi chaát mang ôû caùc daïng vaø kích côõ khaùc nhau, ñaëc bieät laø caùc maøng polymer ñaõ ñöôïc duøng ñeå coá ñònh urease. Caùc chaát mang ñoù coù theå laø caùc polymer sinh hoïc nhö alginate, chitosan, caùc loaïi protein, cellulose vaø caùc daãn xuaát cuûa noù. Beân caïnh ñoù, cuõng coù raát nhieàu nghieân cöùu tìm hieåu phöông phaùp coá ñònh treân nhöõng chaát mang höõu cô khaùc nhö polyacrylamide, caùc loaïi nylon, maøng PVC, caùc chaát lieäu silica nhö TEOS (tetraethoxysilane), TMOS (tetramethoxysilane)… Nhöõng nghieân cöùu treân ñaõ goùp phaàn môû roäng hieåu bieát veà enzyme urease cuõng nhö phaïm vi öùng duïng cuûa noù trong caùc lónh vöïc khaùc nhau trong thöïc teá. 1.3.2. Caùc phöông phaùp coá ñònh enzyme urease. Hieän nay, haàu heát caùc phöông phaùp coá ñònh enzyme neâu treân ñeàu coù theå ñöôïc aùp duïng ñeå coá ñònh enzyme urease. Tuy nhieân, tuøy vaøo moãi phöông phaùp cuõng nhö tính chaát cuûa caùc chaát mang maø hieäu quaû coá ñònh urease seõ khaùc nhau. Caùc nghieân cöùu veà phöông phaùp coá ñònh enzyme urease ñöôïc tieán haønh vôùi soá löôïng khaù ñaùng keå vaø cuõng ñaït ñöôïc moät soá thaønh coâng nhaát ñònh. Coù theå keå ñeán nhö sau: [92] Phöông phaùp coá ñònh urease baèng lieân keát coäng hoùa trò treân vaät lieäu hoãn hôïp goàm titanium (IV) chloride vaø silica ñöôïc Martins aùp duïng vaøo naêm 1987 cho keát quaû raát khaû quan: khi ñöôïc söû duïng ôû nhieät ñoä 37oC, hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh haàu nhö khoâng thay ñoåi so vôùi enzyme töï do trong suoát hôn 1200 giôø. Ngoaøi ra, pHopt cuûa enzyme coá ñònh cuõng dòch chuyeån töø 7.4 leân 8, coøn nhieät ñoä toái thích thì thay ñoåi töø 65oC leân 75oC. Martins cuõng thaáy khaû naêng baûo quaûn cuõng nhö ñoä beàn nhieät cuûa urease coá ñònh taêng leân roõ reät. Phöông phaùp coá ñònh urease treân chaát mang laø polymethylglutamate (PMG) cuûa Minamoto vaø coäng söï (1980) ñaõ giöõ laïi ñeán 95% hoaït tính ban ñaàu cuûa urease. Beân caïnh ñoù, ñoä beàn nhieät cuûa enzyme coá ñònh cuõng taêng leân ñaùng keå nhöng caùc thoâng soá khaùc nhö KM vaø pHopt cho thaáy khoâng coù söï thay ñoåi ñaùng keå. Urease coá ñònh trong caùc haït PMG ñöôïc nhoài trong caùc coät cuûa bình phaûn öùng coù theå giöõ ñöôïc 80% hoaït tính ban ñaàu trong voøng 1 naêm. Phöông phaùp coá ñònh urease leân chaát mang laø maøng chitosan baèng lieân keát coäng hoùa trò qua glutaraldehyde cuûa Krajewska vaø coäng söï (1990) giöõ laïi ñöôïc hôn 94% hoaït tính so vôùi enzyme töï do. Beân caïnh ñoù, caùc tính chaát khaùc cuûa enzyme coá ñònh ñöôïc caûi thieän ñaùng keå nhö tính beàn nhieät, ñoä beàn ôû pH thaáp, khaû naêng taùi söû duïng vaø khaû naêng baûo quaûn…[17] Urease coá ñònh treân chaát mang laø sôïi toång hôïp töø acrylamide vaø poly (ethylene terephthalate) sau khi ñöôïc hoaït hoùa baèng glutaraldehyde (Elcin vaø Sacak, 1996) coù ñoä beàn khi söû duïng vaø khaû naêng taùi söû duïng raát cao vôùi khoaûng hôn 85% hoaït tính ban ñaàu ñöôïc giöõ laïi sau 90 ngaøy. Baûng 1.3: Moät soá phöông phaùp coá ñònh enzyme urease Phöông phaùp coá ñònh Chaát mang Taùc giaû Phöông phaùp hoùa hoïc Lieân keát coäng hoùa trò Chitosan, taùc nhaân lieân keát laø glutaraldehyde Krajewska vaø coäng söï, 1990. [17] Krajewska vaø coäng söï, 2005. [18] Krajewska, 2000. [19] Nylon, taùc nhaân lieân keát laø glutaraldehyde Pietta vaø coäng söï, 1990. [65] George vaø coäng söï, 1996. [79] Anita vaø coäng söï, 1997. [10] Nhöïa Amberlite MB_1, taùc nhaân leân keát laø glutaraldehyde Anita vaø coäng söï, 1997. [9] Organosilane, taùc nhaân lieân keát laø glutaraldehyde Airoldi, 2003. [26] Cellulose George vaø coäng söï, 1996. [79] Silica George vaø coäng söï, 1996. [79] Aminopropyl triethoxysilane Mourzina, 2003. [41] Maøng trao ñoåi cation Turmanova, 2005. [75] Copolymer cuûa gelatin vaø poly HEMA Rao, 1995. [60] Polymethylglutamate, taùc nhaân lieân keát laø glutaraldehyde Kubo vaø coäng söï, 1986. [42] Phöông phaùp vaät lyù Nhoát trong gel Albumine huyeát thanh boø Joseph vaø coäng söï, 1984. [46] Boubriak vaø coäng söï, 1995. [64] Zhylyat vaø coäng söï, 1995. [39] Lee vaø coäng söï, 2000. [90] Milardovic vaø coäng söï, 1999. [80] Mourzina, 2003. [41] Chitosan vaø alginate Kara vaø coäng söï, 2006. [34] Polymer cuûa polyacrylamide vaø carrageenan Kara vaø coäng söï, 2006. [34] CMC vaø gelatin Sungur vaø coäng söï, 1992. [76] Gelatin Teke vaø coäng söï, 2007. [56] Vaät lieäu silica (phöông phaùp sol-gel) Craith vaø coäng söï, 1997. [22] Lee vaø coäng söï, 2002. [74] Sahney vaø coäng söï, 2005. [72] Ilangovan vaø coäng söï, 2006. [68] Nhoát enzyme trong heä sôïi Composite cuûa cellulose acetate vaø TiO2 Hatayama vaø coäng söï, 1995. [40] 1.3.3 Tính chaát cuûa enzyme urease coá ñònh 1.3.3.1 Hoaït ñoä xuùc taùc cuûa enzyme urease coá ñònh Caùc nghieân cöùu veà enzyme coá ñònh noùi chung vaø veà enzyme urease coá ñònh noùi rieâng ñeàu cho thaáy hoaït tính rieâng cuûa enzyme sau coá ñònh giaûm ñi so vôùi enzyme töï do. Nghieân cöùu cuûa Rao vaø coäng söï coá ñònh enzyme urease treân chaát mang laø moät copolymer cuûa gelatin vaø poly (HEMA) (1995) cho keát quaû hoaït tính rieâng cuûa enzyme coá ñònh chæ coøn laïi 75% so vôùi hoaït tính cuûa enzyme urease töï do [60]. Nghieân cöùu cuûa Turmanova vaø coäng söï veà vieäc coá ñònh urease leân maøng trao ñoåi ion (2005) vôùi maøng laø polymer cuûa acid acrylic vaø lôùp phim polyethene moûng cho thaáy hoaït tính cuûa urease sau coá ñònh coøn laïi khoaûng 80% so vôùi enzyme töï do [75]. Nguyeân nhaân xaûy ra hieän töôïng giaûm hoaït tính rieâng cuûa enzyme khi coá ñònh treân chaát mang coù theå laø do: [4] Khi gaén enzyme vaøo chaát mang, döôùi aûnh höôûng cuûa ñieän tích ôû chaát mang, hình theå cuûa phaân töû enzyme sau khi coá ñònh bò thay ñoåi laøm cho khaû naêng xuùc taùc cuûa enzyme cuõng bò thay ñoåi. Khi gaén enzyme leân chaát mang baèng lieân keát coäng hoùa trò, moät soá hoùa chaát söû duïng trong quaù trình coá ñònh coù theå laøm voâ hoaït baát thuaän nghòch enzyme. Töông taùc protein-protein giöõa caùc phaân töû enzyme ñaõ coá ñònh laøm bieán ñoåi moät phaàn caáu truùc khoâng gian cuûa phaân töû enzyme, do ñoù hoaït ñoä xuùc taùc cuõng giaûm. Ñoái vôùi tröôøng hôïp enzyme coá ñònh treân chaát mang baèng phöông phaùp nhoát enzyme trong khuoân gel, söï coù maët cuûa chaát mang coù theå haïn cheá khaû naêng tieáp xuùc cuûa cô chaát vôùi enzyme (nhaát laø caùc cô chaát coù kích thöôùc lôùn), do ñoù hoaït löïc cuûa enzyme coá ñònh giaûm. Nhìn chung enzyme urease coá ñònh cuõng nhö caùc loaïi enzyme coá ñònh khaùc vaãn giöõ ñöôïc tính ñaëc hieäu cuûa mình. Theâm vaøo ñoù, nhôø lieân keát vôùi chaát mang maø chuùng coù ñoä beàn vöõng lôùn ñoái vôùi caùc taùc ñoäng khaùc nhau. Nhö vaäy, ñöùng treân quan ñieåm thöïc teá, söï giaûm hoaït ñoä hoaøn toaøn coù theå ñöôïc buø laïi baèng tính chaát naøy [4]. 1.3.3.2 Tính chaát ñoäng hoïc cuûa enzyme urease coá ñònh Keát quaû cuûa haàu heát caùc nghieân cöùu ñeàu cho raèng urease coá ñònh cuõng tuaân theo ñònh luaän Michaelis – Menten [4]. Tuy nhieân, caùc thoâng soá ñoäng hoïc cuûa urease coá ñònh nhö KM, Vmax coù theå bò bieán ñoåi. Cuõng theo keát quaû cuûa caùc nghieân cöùu naøy thì ñoái vôùi urease coá ñònh, haèng soá KM thöôøng coù khuynh höôùng taêng coøn Vmax laïi coù khuynh höôùng giaûm so vôùi urease töï do. Krajewska ñaõ coù nhieàu coâng trình nghieân cöùu coá ñònh urease treân chaát mang laø chitosan. Naêm 1990, nghieân cöùu coá ñònh urease leân chitosan cuûa taùc giaû cuøng caùc coäng söï cho thaáy: Km cuûa enzyme coá ñònh laø 26.4 mmol/lit so vôùi enzyme töï do laø 5.04 mmol/lit, trong khi ñoù, Vmax cuûa enzyme coá ñònh laïi giaûm khoaûng 1.5 laàn so vôùi enzyme töï do. Moät nghieân cöùu khaùc cuûa taùc giaû vaøo naêm 2005 cuõng cho keát quaû Km cuûa enzyme coá ñònh taêng so vôùi enzyme töï do [17]. Nghieân cöùu cuûa Hatayama vaø coäng söï (1995) coá ñònh urease baèng phöông phaùp nhoát trong heä sôïi toång hôïp töø cellulose acetate vaø TiO2 cuõng cho thaáy Km cuûa urease coá ñònh coù giaù trò laø 8.10-1mol/lit, cao hôn nhieàu so vôùi Km cuûa urease töï do (coù giaù trò 9,4.10-4 mol/lit), trong khi ñoù, Vmax cuûa urease coá ñònh laø 7,2 .10-5 mol/phuùt/g, thaáp hôn urease töï do (2,7.10-3 mol/phuùt/g) [40]. Nghieân cöùu cheá taïo biosensor söû duïng urease coá ñònh baèng phöông phaùp sol – gel vaø phöông phaùp nhoát urease trong gel nhôø albumine huyeát thanh boø vaø glutaraldehyde cuûa Lee vaø coäng söï (1999) cho keát quaû laø haèng soá Michealis – Menten Km cuûa urease coá ñònh laàn löôït laø 4.95 vaø 6.5 mM cao hôn so vôùi urease töï do laø 1.69 mM [90]. Nghieân cöùu coá ñònh urease treân caùc chaát mang khaùc nhau nhö hoãn hôïp chitosan – alginate vaø hoãn hôïp poly(acrylamide-co-acrylic acid)/k-carrageenan cuûa Kara vaø coäng söï (2006) cho thaáy: Km cuûa enzyme coá ñònh lôùn hôn enzyme töï do (4.3 mmol vaø 3.30 mmol cuûa enzyme coá ñònh so vôùi 3.03 mmol cuûa enzyme töï do), trong khi ñoù Vmax cuûa enzyme töï do laø 0.0182 mM/phuùt lôùn hôn enzyme coá ñònh laàn löôït laø 0.0104 vaø 0.0099 mM/phuùt [31]. Nguyeân nhaân cuûa söï thay ñoåi caùc thoâng soá ñoäng hoïc cuûa urease coá ñònh coù theå laø do: [4] Söï khaùc bieät veà hieän töôïng phaân boá chaát hoøa tan trong moâi tröôøng coù enzyme coá ñònh vôùi söï phaân boá chaát hoøa tan trong moâi tröôøng coù enzyme töï do. Hieän töôïng naøy xaûy ra khi söû duïng caùc chaát mang coù tích ñieän ñeå coá ñònh enzyme. Söï coù maët cuûa caùc chaát mang coù ñieän tích seõ gaây ra hieän töôïng taäp trung cô chaát taïi beà maët chaát mang neáu cô chaát tích ñieän ngöôïc daáu vôùi chaát mang vaø ngöôïc laïi. Keát quaû cuûa söï töông taùc naøy daãn ñeán söï phaân boá noàng ñoä chaát hoøa tan ôû moâi tröôøng gaàn enzyme khaùc vôùi noàng ñoä chaát hoøa tan ôû moâi tröôøng trong dung dòch. Neáu cô chaát vaø chaát mang tích ñieän traùi daáu, cô chaát seõ taäp trung nhieàu treân beà maët chaát mang, keát quaû daãn ñeán aùi löïc bieåu kieán cuûa enzyme vaø cô chaát seõ taêng vaø ngöôïc laïi. Nhöõng thay ñoåi veà caáu truùc khoâng gian cuûa enzyme khi coù maët chaát mang. Khi enzyme gaén leân chaát mang seõ gaây ra nhöõng bieán ñoåi hình theå cuûa enzyme cuõng nhö seõ taïo ra söï caûn trôû khoâng gian giöõa enzyme vaø cô chaát do coù maët chaát mang, laøm giaûm khaû naêng tieáp xuùc giöõa enzyme vaø cô chaát, Km seõ taêng leân. Nhöõng haïn cheá veà maët khueách taùn khi coù maët chaát mang, ñaëc bieät laø trong tröôøng hôïp chaát mang daïng khuoân gel hoaëc maøng bao vi theå. Vaän toác khueách taùn cô chaát vaø caùc chaát hoøa tan khaùc phuï thuoäc vaøo kích thöôùc loã mao quaûn vaø kích thöôùc phaân töû cuûa cô chaát. Tuy nhieân, ñeå laøm taêng vaän toác khueách taùn, chuùng ta coù theå gia taêng söï khuaáy ñaûo moâi tröôøng hoaëc giaûm kích thöôùc haït gel [4]. 1.3.3.3 Aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán enzyme urease coá ñònh Cuõng nhö enzyme töï do, nhieät ñoä laø moät yeáu toá aûnh höôûng raát lôùn ñeán hoaït tính cuõng nhö caùc tính chaát khaùc cuûa enzyme urease coá ñònh. Nhieàu nghieân cöùu veà enzyme urease coá ñònh ñaõ keát luaän raèng nhôø lieân keát vôùi chaát mang maø urease coá ñònh coù tính beàn nhieät toát hôn so vôùi enzyme töï do. Beân caïnh ñoù, nhieät ñoä toái öu cuûa enzyme coá ñònh cuõng coù xu höôùng chuyeån dòch leân nhöõng nhieät ñoä cao hôn tuøy vaøo loaïi enzyme urease vaø phöông phaùp coá ñònh [4]. Nghieân cöùu cuûa Rao vaø coäng söï veà coá ñònh urease ñaäu röïa leân maøng polymer töø gelatin vaø poly(HEMA) (1995) cho thaáy nhieät ñoä toái öu cuûa urease coá ñònh dòch chuyeån töø 60oC leân 70oC, trong khi ñoù ñoä beàn nhieät cuûa urease coá ñònh taïi caùc nhieät ñoä khaùc nhau thì cao hôn so vôùi urease töï do trong cuøng ñieàu kieän [60]. (a) (b) Hình 1.5: (a) Nhieät ñoä toái öu cuûa enzyme urease töï do vaø coá ñònh (b) Ñoä beàn nhieät cuûa urease töï do vaø coá ñònh ○ Urease töï do ● Urease coá ñònh Nghieân cöùu cuûa Chen vaø Chiu veà coá ñònh urease töø ñaäu röïa treân beà maët cuûa caùc haït chitosan xoáp (1999) cho keát quaû taïi nhieät ñoä 70oC trong ñeäm pH 7, enzyme coá ñònh beàn hôn so vôùi enzyme töï do, cuï theå laø enzyme töï do bò maát ñi moät nöûa hoaït tính ban ñaàu sau 70 phuùt, trong khi ñoù, caàn ñeán 175 phuùt thì urease coá ñònh môùi bò maát ñi moät nöûa hoaït tính ban ñaàu. Nghieân cöùu cuõng cho thaáy Topt cuûa urease coá ñònh taêng töø 60oC leân 70oC [48]. Hình 1.6: Ñoä beàn nhieät cuûa enzyme urease töï do vaø coá ñònh taïi nhieät ñoä 70oC trong ñeäm pH 7. Hình 1.7: Nhieät ñoä toái öu cuûa enzyme ureae töï do vaø coá ñònh trong ñeäm pH 6.5 1.3.3.4 Aûnh höôûng cuûa pH ñeán enzyme urease coá ñònh pH toái öu cuûa urease coá ñònh, cuõng nhö nhieàu loaïi enzyme coá ñònh khaùc, coù theå thay ñoåi so vôùi enzyme töï do. pH toái öu naøy coù theå dòch chuyeån veà phía kieàm hay veà phía acid sau khi coá ñònh [4]. Nghieân cöùu cuûa Turmanova vaø coäng söï veà vieäc coá ñònh urease leân maøng trao ñoåi ion (2005) vôùi maøng laø polymer cuûa acid acrylic vaø lôùp phim polyethene moûng cho thaáy pH toái öu cuûa urease töï do laø 5.8, trong khi ñoù, pH toái öu cuûa enzyme coá ñònh laø 6 [75]. Hình 1.8: Aûnh höôûng cuûa pH ñeán enzyme coá ñònh treân maøng trao ñoåi ion Nghieân cöùu coá ñònh urease ñaäu röïa treân caùc chaát mang khaùc nhau nhö hoãn hôïp chitosan – alginate vaø hoãn hôïp poly(acrylamide-co-acrylic acid)/k-carrageenan cuûa Kara vaø coäng söï (2006) cho thaáy pH toái öu cuûa enzyme sau coá ñònh dòch chuyeån töø 7.5 leân 8. Theâm vaøo ñoù, hoaït tính cuûa urease coá ñònh trong ñieàu kieän pH thaáp cuõng cao hôn so vôùi urease töï do [34]. Hình 1.9: Aûnh höôûng cuûa pH ñeán enzyme urease coá ñònh. Tuy nhieân, cuõng coù nhieàu tröôøng hôïp maø pH toái öu cuûa enzyme coá ñònh khoâng coù söï khaùc bieät so vôùi enzyme töï do, chæ coù moät soá khaùc bieät laø ñoä beàn cuûa enzyme coá ñònh trong moâi tröôøng acid hoaëc base toát hôn so vôùi enzyme töï do. Nghieân cöùu cuûa Chen vaø Chiu veà coá ñònh urease treân beà maët cuûa caùc haït chitosan xoáp (1999) cho thaáy pH toái öu cuûa enzyme coá ñònh laø 7.5 vaø khoâng coù söï dòch chuyeån so vôùi enzyme töï do, nhöng hoaït tính cuûa urease coá ñònh taïi caùc pH acid vaø base laïi cao hôn so vôùi urease töï do [48]. Nguyeân nhaân cuûa söï chuyeån dòch pHopt cuûa enzyme sau coá ñònh coù theå laø do: [4] Aûnh höôûng cuûa tröôøng tónh ñieän cuûa chaát mang. Söï töông taùc giöõa caùc nhoùm chöùc cuûa chaát mang vôùi caùc nhoùm chöùc cuûa enzyme. 1.3.3.5 Aûnh höôûng cuûa thôøi gian baûo quaûn ñeán hoaït tính cuûa urease coá ñònh Enzyme urease noùi rieâng vaø caùc enzyme coá ñònh noùi chung nhôø söï baûo veä cuûa chaát mang choáng laïi caùc taùc ñoäng baát lôïi beân ngoaøi neân coù khaû naêng baûo quaûn toát hôn so vôùi caùc enzyme töï do vaø coù theå ñöôïc taùi söû duïng nhieàu laàn. Haàu heát caùc nghieân cöùu veà enzyme urease coá ñònh ñeàu cho thaáy keát quaû nhö treân [4]. Nghieân cöùu coá ñònh urease nhôø maøng bao phospholipid lieân keát vôùi silica cuûa Kallury vaø coäng söï (1993) cho thaáy sau 42 ngaøy trong ñieàu kieän baûo quaûn khoâ ôû nhieät ñoä phoøng, hoaït tính cuûa urease coá ñònh haàu nhö khoâng thay ñoåi so vôùi ngay sau khi coá ñònh. Nghieân cöùu coá ñònh urease leân nylon vaø maøng Amberlite MB-1 cuûa Anita vaø coäng söï (1997) cuõng cho keát quaû khaû naêng baûo quaûn cuûa enzyme coá ñònh toát hôn so vôùi enzyme töï do: ñoái vôùi maøng nylon, sau 60 ngaøy ôû ñieàu kieän 4oC vaø trong ñeäm phosphate pH 6, hoaït tính urease coá ñònh coøn laïi ñeán 76% hoaït tính ban ñaàu. Coøn ñoái vôùi maøng Amberlite MB-1, con soá ñoù laø 65%. [9,10] Nghieân cöùu cheá taïo biosensor duøng urease coá ñònh trong gel albumin huyeát thanh boø cuûa Milardovic vaø coäng söï (1999) cho thaáy trong ñieàu kieän baûo quaûn ôû 6oC, ñeäm Tris – HCl pH 7.4, sau 45 ngaøy hoaït tính cuûa urease coá ñònh chæ maát ñi 20% so vôùi hoaït tính ban ñaàu [80]. Nghieân cöùu cuûa Teke vaø coäng söï (2007) veà cheá taïo ñieän cöïc duøng urease coá ñònh treân gelatin cho thaáy, hoaït tính cuûa urease haàu nhö khoâng thay ñoåi sau 14 laàn söû duïng ñieän cöïc ñeå phaân tích urea, sau laàn thöù 15 thì hoaït tính naøy cuõng chæ giaûm 2% [56]. CHÖÔNG 2: NGUYEÂN LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU 2.1 NGUYEÂN LIEÄU 2.1.1 Enzyme urease (EC 3.5.1.5) Cheá phaåm enzyme urease (carbamine amideohydrolase, EC 3.5.1.5) thu nhaän töø ñaäu röïa do haõng Merck (Ñöùc) cung caáp vôùi caùc tính chaát nhö sau: Hoïat tính xuùc taùc: 5 U/mg, trong ñoù, 1U ñöôïc ñònh nghóa laø löôïng enzyme urease coù khaû naêng xuùc taùc ñeå chuyeån hoùa urea taïo thaønh 1 μmol NH3 sau 1 phuùt ôû ñieàu kieän tieâu chuaån. Tính chaát hoùa lyù: Daïng boät khoâ, maøu töø traéng ñeán hôi vaøng, khoâng muøi. Ít tan trong nöôùc (20oC). pH cuûa dung dòch noàng ñoä 5g/l ôû 20oC: 6 – 7. Khoái löôïng rieâng: 410 kg/m3. 2.1.2 Vaät lieäu coá ñònh 2.1.2.1 Chitosan Hình 2.1: Caáu taïo cuûa chitosan Nguoàn goác: Ñaïi hoïc Thuûy saûn Nha Trang. Thoâng soá hoùa lyù: Ñoä aåm: 15.92%. Ñoä tro: 2.0675% (theo khoái löôïng chaát khoâ cuûa nguyeân lieäu). Ñoä nhôùt dung dòch 1%: 50.33 cp. Chæ soá deacetyl hoùa (chæ soá DD): 75%. Phaân töû löôïng trung bình: 5.187x104 ñvC. 2.1.2.2 Gelatin Trong nghieân cöùu naøy, chuùng toâi söû duïng gelatin daïng boät khoâ cuûa haõng Merck (Ñöùc) vôùi caùc chæ tieâu chaát löôïng ñöôïc trình baøy trong baûng 2.1. Baûng 2.1: Chæ tieâu chaát löôïng cuûa gelatin (Meck) Thaønh phaàn Giaù trò Ñoä aåm, % 12,2 Haøm löôïng tro, % 2,0 Haøm löôïng SO2, % 0,004 Haøm löôïng Arsenic, % 0,00006 Haøm löôïng chì, % 0,001 Haøm löôïng H2O2, ppm 0,01 pH (1% gelatin :nöôùc) 3,8-7,6 E. coli, teá baøo/10 gram 0 Salmonella, teá baøo/10 gram 0 2.1.2.3 Chaát taïo lieân keát [94] Muïc ñích cuûa vieäc söû duïng chaát taïo lieân keát trong coá ñònh enzyme urease laø ñeå hình thaønh neân caùc caàu noái giöõa phaân töû enzyme vaø chaát mang nhôø caùc lieân keát coäng hoùa trò. Hình 2.2: Coâng thöùc caáu taïo cuûa glutaraldehyde Glutaraldehyde coù 2 nhoùm chöùc aldehyde ôû 2 ñaàu. Hai nhoùm naøy seõ taïo lieân keát vôùi nhoùm amin cuûa chaát mang vaø cuûa enzyme, töø ñoù giöõ enzyme coá ñònh treân chaát mang. Moät soá tính chaát hoùa lyù cuûa glutaraldehyde ñöôïc trình baøy cuï theå trong baûng 2.2. Baûng 2.2: Moät soá tính chaát hoùa lyù cuûa glutaraldehyde Coâng thöùc C5H8O2 Phaân töû khoái (ñvC) 100.12 Tyû troïng (g/ml) 1.06 Ñieåm noùng chaûy (oC) -14 Ñieåm soâi (oC) 187 Trong nghieân cöùu naøy, chuùng toâi duøng glutaraldehyde noàng ñoä ban ñaàu 25% do haõng Merck cung caáp. 2.1.3 Hoùa chaát Trong nghieân cöùu naøy, chuùng toâi coøn söû duïng moät soá hoùa chaát khaùc nhö urea, NH4Cl, dung dòch HCl, NaOH, acid acetic… cuûa haõng Hangzhou King Techina (Trung Quoác) vaø thuoác thöû Nessler, ñeäm Tris, NiSO4 do haõng Merck (Ñöùc) cung caáp. 2.2 PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU 2.2.1 Muïc ñích vaø noäi dung nghieân cöùu Trong luaän vaên naøy, chuùng toâi tieán haønh nghieân cöùu moät soá phöông phaùp coá ñònh enzyme urease treân caùc loaïi chaát mang khaùc nhau nhö chitosan, gelatin, loøng traéng tröùng ñeå tìm ra phöông phaùp thích hôïp nhaát vaø khaûo saùt moät soá yeáu toá aûnh höôûng ñeán hieäu quaû cuûa phöông phaùp coá ñònh ñöôïc choïn. Beân caïnh ñoù, chuùng toâi cuõng khaûo saùt caùc tính chaát vaø xaùc ñònh caùc thoâng soá hoaït ñoäng cuûa enzyme urease coá ñònh. Noäi dung nghieân cöùu cuûa chuùng toâi ñöôïc trình baøy cuï theå trong hình 2.3. Nghieân cöùu choïn chaát mang vaø phöông phaùp coá ñònh enzyme urease leân chaát mang Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán phöông phaùp coá ñònh enzyme urease leân maøng chitosan baèng lieân keát coäng hoùa trò Khaûo saùt caùc tính chaát cuûa urease coá ñònh Lieân keát coäng hoùa trò Goùi trong khuoân gel Chitosan Gelatin Loøng traéng tröùng Tính chaát ñoäng hoïc AÛnh höôûng cuûa pH AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä Khaû naêng taùi söû duïng cuûa enzyme coá ñònh Ñoä beàn baûo quaûn Gelatin Ñoä beàn beàn nhieät Hình 2.3: Sô ñoà nghieân cöùu 2.2.2 Khaûo saùt xaùc ñònh phöông phaùp coá ñònh enzyme urease Trong thí nghieäm naøy, chuùng toâi seõ tieán haønh coá ñònh enzyme urease theo 4 phöông phaùp: Phöông phaùp nhoát enzyme urease trong gel gelatin. Phöông phaùp nhoát enzyme urease trong gel loøng traéng tröùng (albumin). Phöông phaùp gaén enzyme leân chaát mang gelatin baèng lieân keát coäng hoùa trò. Phöông phaùp gaén enzyme leân chaát mang chitosan baèng lieân keát coäng hoùa trò. Sau ñoù döïa vaøo hoaït tính cuûa enzyme urease sau coá ñònh treân chaát mang, chuùng toâi seõ xaùc ñònh ñöôïc phöông phaùp coá ñònh enzyme urease toát nhaát trong 4 phöông phaùp. 2.2.2.1 Phöông phaùp coá ñònh enzyme urease trong gel gelatin theo phöông phaùp nhoát Pha dung dòch gelatin trong ñeäm phosphate noàng ñoä 60 mg/ml ñeå trong beå ñieàu nhieät ôû 60oC cho tan ñeàu. Sau ñoù, khuaáy dung dòch gelatin treân maùy khuaáy töø, theâm 10 µl dung dòch glutaraldehyde troän ñeàu. Boå sung enzyme urease vaøo dung dòch gelatin ôû treân vôùi noàng ñoä 15 mg/ml. Taïo maøng treân oáng thuûy tinh baèng caùch ruùt 30 μl dung dòch enzyme – gelatin taïo maøng treân oáng nghieäm vôùi chieàu cao 10 mm, ñeå khoâ ôû nhieät ñoä phoøng trong voøng 30 phuùt, sau ñoù nhuùng maøng vaøo dung dòch glutaraldehyde 2.5%, laáy ra ñeå khoâ vaø röûa laïi baèng ñeäm ñeå loaïi glutaraldehyde khoâng lieân keát, röûa laïi maøng baèng nöôùc caát roài baûo quaûn trong ñeäm phosphate ôû 4oC (Hình 2.4). Hình 2.4: Sô ñoà phöông phaùp taïo enzyme coá ñònh trong gel gelatin baèng phöông phaùp nhoát 2.2.2.2 Phöông phaùp coá ñònh enzyme urease trong loøng traéng tröùng baèng phöông phaùp nhoát. Pha dung dòch albumin trong ñeäm phosphate noàng ñoä 0,1 mg/ml. Sau ñoù, khuaáy dung dòch albumin treân maùy khuaáy töø. Boå sung enzyme urease vaøo dung dòch albumin ôû treân vôùi noàng ñoä 10 mg/ml. Taïo maøng treân oáng thuûy tinh baèng caùch ruùt 30 μl dung dòch enzyme – albumin taïo maøng treân oáng nghieäm vôùi chieàu cao 10 mm, ñeå khoâ ôû nhieät ñoä phoøng trong voøng 30 phuùt, laáy ra ñeå khoâ roài baûo quaûn trong ñeäm phosphate ôû 4oC. 2.2.2.3 Phöông phaùp gaén enzyme leân chaát mang chitosan baèng lieân keát coäng hoùa trò 2.2.2.3.1 Chuaån bò maøng chitosan Pha dung dòch chitosan noàng ñoä 1% trong dung dòch acid acetic 1%. Ruùt 100 µl dung dòch chitosan taïo maøng treân oáng thuûy tinh vôùi chieàu cao maøng laø 10 mm. Hong khoâ maøng ôû 60oC roài ñeå maøng khoâ trong 1 ñeâm. Trung hoøa maøng baèng dung dòch NaOH 1% trong voøng 30 phuùt roài röûa saïch baèng nöôùc caát (coù theå ngaâm maøng trong nöôùc caát 30 phuùt). Ngaâm maøng trong dung dòch glutaraldehyde trong thôøi gian 60 – 90 phuùt. Sau ñoù röûa vaø ngaâm laïi trong nöôùc caát ñeå loaïi boû caùc phaân töû glutaraldehyde khoâng lieân keát. Coá ñònh Pha dung dòch enzyme noàng ñoä 3 mg/ml trong ñeäm phosphate pH 5.6 coù boå sung EDTA noàng ñoä 10mM. Ngaâm maøng trong dung dòch enzyme qua 24 giôø. Sau 24 giôø, laáy maøng ra ñeå raùo roài röûa laïi baèng nöôùc caát ñeå loaïi caùc phaân töû enzyme töï do. Röûa maøng laàn 2 baèng ñeäm phosphate. Baûo quaûn trong ñeäm phosphate pH 7 ôû 4 – 5oC. 2.2.2.4 Phöông phaùp gaén enzyme leân chaát mang gelatin baèng lieân keát coäng hoùa trò 2.2.2.4.1 Taïo maøng Chuaån bò dung dòch gelatin noàng ñoä 60mg/ml trong ñeäm phosphate. Ruùt 30 µl dung dòch gelatin ñeå taïo maøng treân oáng thuûy tinh vôùi chieàu cao maøng laø 10 mm. Hong khoâ maøng ôû 60oC, sau ñoù ñeå nguoäi vaø nhuùng vaøo dung dòch glutaraldehyde 0.01% trong voøng 30 phuùt. Röûa maøng baèng nöôùc caát ñeå loaïi caùc phaân töû glutaraldehyde töï do. Coá ñònh Tieán haønh töông töï nhö vôùi maøng chitosan. Phöông phaùp coá ñònh enzyme urease baèng caùch taïo lieân keát ñoàng hoùa trò ñöôïc trình baøy toùm taét trong hình 2.5. Hình 2.5: Sô ñoà phöông phaùp coá ñònh enzyme urease baèng lieân keát ñoàng hoùa trò. 2.2.3 Khaûo saùt caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình coá ñònh enzyme urease leân maøng chitosan baèng lieân keát coäng hoùa trò Sau khi ñaõ choïn chitosan laøm chaát mang ñeå coá ñònh enzyme urease, trong phaàn nghieân cöùu naøy, chuùng toâi seõ khaûo saùt caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình coá ñònh enzyme urease treân maøng chitosan. 2.2.3.1 Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa ñoä daøy maøng Do ñieàu kieän khoâng cho pheùp neân chuùng toâi vaãn chöa xaùc ñònh ñöôïc tröïc tieáp ñoä daøy cuûa maøng. Trong nghieân cöùu naøy, chuùng toâi chæ coù theå tieán haønh khaûo saùt aûnh höôûng cuûa ñoä daøy maøng chitosan ñeán hoaït tính cuûa enzyme urease coá ñònh moät caùch giaùn tieáp thoâng qua theå tích ruùt dung dòch chitosan ñeå taïo maøng. Trình töï thí nghieäm nhö sau: Taïo maøng vôùi caùc theå tích dung dòch chitosan khaùc nhau nhö: 30µL, 50µL, 100µL vaø150µL. Caùc böôùc coá ñònh enzyme sau ñoù ñöôïc tieán haønh nhö ñaõ trình baøy ôû muïc (2.2.2.2). Tieáp theo, chuùng toâi tieán haønh xaùc ñònh hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh öùng vôùi töøng noàng ñoä dung dòch glutaraldehyde khaùc nhau. 2.2.3.2 Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa noàng ñoä dung dòch glutaraldehyde. Trong thí nghieäm naøy, chuùng toâi seõ xem xeùt aûnh höôûng cuûa noàng ñoä dung dòch glutaraldehyde duøng ñeå ngaâm oáng thuûy tinh tröôùc khi coá ñònh enzyme. Trình töï thí nghieäm nhö sau: Sau khi taïo maøng chitosan, oáng thuûy tinh seõ ñöôïc ngaâm vaøo caùc dung dòch glutaraldehyde coù noàng ñoä 0.005%, 0.01%, 0.05% vaø 0.1% trong thôøi gian 60 phuùt. Caùc böôùc coá ñònh enzyme sau ñoù ñöôïc tieán haønh nhö ñaõ trình baøy taïi muïc (2.2.2.2). Tieáp theo, chuùng toâi tieán haønh xaùc ñònh hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh öùng vôùi töøng noàng ñoä dung dòch glutaraldehyde khaùc nhau. 2.2.3.3 Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa thôøi gian ngaâm maøng trong dung dòch glutaraldehyde. Muïc ñích cuûa chuùng toâi trong thí nghieäm naøy laø khaûo saùt aûnh höôûng cuûa thôøi gian ngaâm oáng thuûy tinh trong dung dòch glutaraldehyde ñeán hieäu quaû cuûa quaù trình coá ñònh enzyme urease leân maøng chitosan. Thí nghieäm ñöôïc tieán haønh nhö sau: OÁng thuûy tinh sau khi ñöôïc taïo maøng seõ ñöôïc ngaâm vaøo dung dòch glutaraldehyde 0.01% trong caùc khoaûng thôøi gian 30 phuùt, 60 phuùt, 90 phuùt vaø 120 phuùt. Caùc böôùc coá ñònh sau ñoù cuõng ñöôïc tieán haønh nhö ñaõ trình baøy ôû muïc (2.2.2.2). Tieán haønh xaùc ñònh hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh öùng vôùi töøng thôøi gian ngaâm dung dòch glutaraldehyde khaùc nhau ñeå tìm ra thôøi gian ngaâm toát nhaát. 2.2.3.4 Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa pH dung dòch enzyme urease duøng ñeå coá ñònh Theo caùc nghieân cöùu ñaõ tieán haønh tröôùc ñoù thì pH cuûa dung dòch enzyme coá ñònh seõ aûnh höôûng ñeán tính chaát cuûa glutaraldehyde, töø ñoù coù theå laøm taêng hoaëc giaûm khaû naêng taïo lieân keát ñoàng hoùa trò giöõa glutaraldehyde vaø phaân töû enzyme. Trong thí nghieäm naøy, chuùng toâi seõ tieán haønh khaûo saùt aûnh höôûng cuûa pH dung dòch enzyme coá ñònh leân hieåu quaû cuûa phöông phaùp coá ñònh. Thí nghieäm ñöôïc tieán haønh nhö sau: Caùc böôùc taïo maøng chitosan cho oáng thuûy tinh ñöôïc tieán haønh nhö muïc (2.2.2.2) ñaõ trình baøy. Tieán haønh pha hai loaïi dung dòch urease: loaïi thöù nhaát ñöôïc pha trong ñeäm phosphate 1/15 M, EDTA 10 mM coù pH 7.4 laø pH toái thích cuûa enzyme urease töï do. Loaïi thöù hai ñöôïc pha trong ñeäm phosphate noàng ñoä nhö treân nhöng vôùi pH laø 5.6 vaø pH 5.2. Caùc böôùc coá ñònh cuõng ñöôïc tieán haønh nhö ñaõ trình baøy ôû muïc (2.2.3.2). Tieán haønh xaùc ñònh hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh öùng vôùi töøng pH dung dòch enzyme coá ñònh khaùc nhau ñeå tìm ra pH toát hôn. 2.2.3.5 Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa thôøi gian coá ñònh Hieäu quaû cuûa phöông phaùp coá ñònh phuï thuoäc vaøo löôïng enzyme taïo ñöôïc lieân keát ñoàng hoùa trò thoâng qua glutaraldehyde vôùi chaát mang vaø löôïng enzyme lieân keát naøy phuï thuoäc vaøo thôøi gian nhuùng oáng thuûy tinh vaøo dung dòch enzyme urease. Trong thí nghieäm naøy, chuùng toâi khaûo saùt aûnh höôûng cuûa thôøi gian ngaâm oáng thuûy tinh trong dung dòch enzyme ñeán hieäu quaû cuûa phöông phaùp coá ñònh. Chuùng toâi tieán haønh thí nghieäm nhö sau: Vieäc taïo maøng chitosan treân oáng thuûy tinh ñöôïc tieán haønh theo caùc böôùc nhö muïc (2.2.2.2). Ngaâm oáng thuûy tinh trong dung dòch enzyme noàng ñoä 3 mg/ml pha trong ñeäm. Chuùng toâi laáy caùc maãu oáng thuûy tinh ra khoûi dung dòch enzyme coá ñònh sau caùc khoaûng thôøi gian 6 giôø, 18 giôø, 24 giôø vaø 30 giôø. Caùc böôùc xöû lyù sau ñöôïc tieán haønh nhö ñaõ trình baøy trong muïc (2.2.3.2). Tieán haønh xaùc ñònh hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh öùng vôùi töøng thôøi gian coá ñònh khaùc nhau ñeå tìm ra thôøi gian thích hôïp. 2.2.4. Xaùc ñònh hieäu suaát coá ñònh enzyme urease coá ñònh leân chaát mang chitosan baèng lieân keát coäng hoùa trò Chuùng toâi tính hieäu suaát coá ñònh urease theo trình töï sau: Xaùc ñònh hoaït tính cuûa urease töï do (U/mgboät). Xaùc ñònh hoaït tính cuûa urease coá ñònh (U/mgboät). Xaùc ñònh heä soá chuyeån ñoåi hoaït tính: (2.1) Tính haøm löôïng protein coù trong dung dòch enzyme ban ñaàu P2 (µgprotein/mgboät). Tính haøm löôïng protein coù trong dung dòch enzyme coøn laïi sau coá ñònh P1 (µgprotein/mgboät) . Xaùc ñònh haøm löôïng enzyme ñaõ coá ñònh treân maøng P (µgprotein/mgboät): P= P2 - P1 (2.2) Hieäu suaát coá ñònh: (2.3) 2.2.5 Khaûo saùt tính chaát cuûa enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan baèng lieân keát coäng hoùa trò 2.2.5.1 Khaûo saùt tính chaát ñoäng hoïc cuûa enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan baèng lieân keát coäng hoùa trò. Trong nghieân cöùu naøy, chuùng toâi tieán haønh khaûo saùt aûnh höôûng cuûa noàng ñoä cô chaát ñeán hoaït tính cuûa enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan. Ñeå khaûo saùt aûnh höôûng cuûa noàng ñoä cô chaát, chuùng toâi coá ñònh caùc yeáu toá nhö: noàng ñoä enzyme, nhieät ñoä, pH, thôøi gian phaûn öùng… vaø thay ñoåi noàng ñoä cô chaát urea trong khoaûng 0-4.5% roài so saùnh hoaït tính cuûa urease ôû nhöõng noàng ñoä ñoù. Töø keát quaû thöïc nghieäm thu ñöôïc, chuùng toâi tieán haønh tính toaùn xaùc ñònh giaù trò caùc thoâng soá ñoäng hoïc cuûa phaûn öùng enzyme laø Km vaø Vmax. Tieán haønh töông töï vôùi enzyme urease töï do ñeå kieåm chöùng. Xaùc ñònh hoaït tính cuûa enzyme töï do vaø coá ñònh öùng vôùi töøng noàng ñoä urea khaùc nhau. Veõ ñoà thò Michaelis Menten (toác ñoä thuûy phaân urea V theo noàng ñoä cô chaát [S]), ñoà thò Lineweaver-Burk (1/V theo 1/[S]) ñeå xaùc ñònh Vmax, Km vaø noàng ñoä cô chaát [S] maø taïi ñoù hoaït tính enzyme urease laø cao nhaát. 2.2.5.2 Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan baèng lieân keát coäng hoùa trò. Trong thí nghieäm naøy, chuùng toâi tieán haønh khaûo saùt aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh cuõng nhö ñoä beàn nhieät cuûa noù. Chuùng toâi cuõng song song khaûo saùt enzyme coá ñònh vaø enzyme töï do ñeå coù söï so saùnh. Chuùng toâi coá ñònh caùc yeáu toá nhö noàng ñoä enzyme, noàng ñoä urea, pH dung dòch phaûn öùng, thôøi gian phaûn öùng, cho nhieät ñoä dung dòch phaûn öùng thay ñoåi töø 30 oC ñeán 80oC vaø xaùc ñònh hoaït tính enzyme urease coá ñònh vaø töï do öùng vôùi moãi nhieät ñoä. 2.2.5.3 Khaûo saùt ñoä beàn nhieät cuûa enzyme coá ñònh. Vôùi thí nghieäm naøy, chuùng toâi giöõ enzyme urease coá ñònh vaø töï do ôû nhieät ñoä 55oC vaø laáy maãu enzyme sau moãi 30 phuùt ñeå xaùc ñònh hoaït tính vaø ñaùnh giaù söï giaûm hoaït tính cuûa enzyme urease coá ñònh vaø enzyme urease töï do theo thôøi gian. Söï voâ hoaït enzyme döôùi taùc duïng cuûa nhieät ñoä ñöôïc bieåu dieãn theo phöông trình (3.4) [4,15]. [A] = [Ao] .e-kt (2.4) k: Haèng soá toác ñoä voâ hoaït enzyme (phuùt-1). Ao: Hoaït ñoä rieâng cuûa enzyme taïi thôøi ñieåm ban ñaàu (U/mg protein enzyme). A: Hoaït ñoä rieâng coøn laïi cuûa enzyme sau thôøi gian gia nhieät t (U/mg protein enzyme). Laáy logarit phöông trình (3.7) ta ñöôïc phöông trình: ln[A] = -kt + ln[Ao] (2.5) Trong thöïc nghieäm, ñeå ñôn giaûn, ngöôøi ta coù theå thay giaù trò hoaït ñoä rieâng cuûa enzyme A vaø Ao baèng hoaït tính cuûa enzyme urease (tính theo % so vôùi hoaït tính ban ñaàu) maø khoâng laøm thay ñoåi ñaùng keå keát quaû thí nghieäm. 2.2.5.4 Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa pH ñeán urease coá ñònh treân maøng chitosan baèng lieân keát coäng hoùa trò. pH coù aûnh höôûng raát lôùn ñeán hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh. Vì vaäy, trong thí nghieäm naøy, muïc ñích chuùng toâi laø khaûo saùt aûnh höôûng cuûa pH vaø tìm ra pH toái öu cho hoaït ñoäng cuûa enzyme coá ñònh. Chuùng toâi tieán haønh thí nghieäm nhö sau: Coá ñònh caùc yeáu toá nhö noàng ñoä enzyme coá ñònh, nhieät ñoä, thôøi gian phaûn öùng, noàng ñoä cô chaát. Thay ñoåi pH cuûa dung dòch phaûn öùng trong khoaûng töø 5 ñeán 8 roài xaùc ñònh hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh vaø enzyme töï do öùng vôùi moãi pH khaùc nhau vaø suy ra pH toái thích. 2.2.5.5 Khaûo saùt khaû naêng taùi söû duïng enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan baèng lieân keát coäng hoùa trò. Thí nghieäm khaûo saùt khaû naêng taùi söû duïng cuûa enzyme urease coá ñònh ñöôïc tieán haønh nhö sau: Xaùc ñònh hoaït tính cuûa enzyme urease coá ñònh treân oáng thuûy tinh. Sau ñoù röûa oáng thuûy tinh baèng nöôùc caát ñeå loaïi cô chaát vaø saûn phaåm coøn baùm treân ñieän cöïc. Ngaâm oáng thuûy tinh chöùa enzyme coá ñònh trong ñeäm phosphate 1/15 M pH 7, 10 mM EDTA trong voøng 15 phuùt. Ngaâm oáng thuûy tinh chöùa enzyme coá ñònh trong phosphate 1/15 M pH 7, 1 mM EDTA trong voøng 30 – 60 phuùt. Baûo quaûn oáng thuûy tinh chöùa enzyme coá ñònh trong ñeäm phosphate ôû 4oC. Laëp laïi vieäc xaùc ñònh hoaït tính vaø röûa oáng thuûy tinh chöùa enzyme coá ñònh cho ñeán khi hoaït tính enzyme giaûn hôn 50% so vôùi ban ñaàu. Suy ra soá laàn taùi söû duïng cuûa enzyme coá ñònh. 2.2.5.6 Khaûo saùt ñoä beàn baûo quaûn cuûa enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan baèng lieân keát coäng hoùa trò. Vôùi caùc cheá ñoä baûo quaûn khaùc nhau thì hoaït tính coøn laïi cuûa enzyme coá ñònh cuõng nhö khaû naêng taùi söû duïng chuùng cuõng bò aûnh höôûng ñaùng keå. Trong thí nghieäm naøy, chuùng toâi tieán haønh khaûo saùt caùc cheá ñoä baûo quaûn khaùc nhau nhaèm tìm ra cheá ñoä baøo quaûn thích hôïp nhaát vôùi enzyme urease coá ñònh. Thí nghieäm ñöôïc tieán haønh nhö sau: Baûo quaûn oáng thuûy tinh chöùa enzyme coá ñònh ôû 4 cheá ñoä: trong dung dòch ñeäm phosphate 1/15 M. pH 7, 1mM EDTA, trong ñeäm phosphate 1/15 M, pH 7 nhöng khoâng coù EDTA, trong dung dòch chöùa muoái NiSO4 vaø ñeå khoâ. Taát caùc caùc cheá ñoä baûo quaûn ñeàu ñöôïc tieán haønh ôû 4oC. Chuùng toâi cuõng tieán haønh baûo quaûn moät dung dòch enzyme urease töï do trong dung dòch ñeäm phosphate ñeå so saùnh. Sau caùc khoaûng thôøi gian nhaát ñònh (1 tuaàn), chuùng toâi laáy maãu enzyme coá ñònh vaø khaûo saùt hoaït tính cuûa chuùng ñeå kieåm tra ñoä giaûm hoaït tính so vôùi ban ñaàu, töø ñoù ñöa ra phöông phaùp baûo quaûn thích hôïp. 2.2.6 Caùc phöông phaùp phaân tích 2.2.6.1 Phöông phaùp xaùc ñònh hoaït tính enzyme urease töï do Trong nghieân cöùu naøy, chuùng toâi tieán haønh xaùc ñònh hoaït tính enzyme urease baèng phöông phaùp Nessler. Duøng phaûn öùng maøu vôùi thuoác thöû Nessler đeå đònh löôïng ammonia đöôïc taïo thaønh trong phaûn öùng thuûy phaân urea bôûi urease. NH3 taïo thaønh seõ phaûn öùng vôùi thuoác thöû Nessler taïo phöùc maøu vaøng. Phöùc naøy coù ñoä haáp thu cöïc ñaïi ôû böôùc soùng 490 nm vaø cöôøng đoä maøu thay đoåi tuøy theo löôïng NH3 taïo ra. K2HgI4 + 3 KOH + NH3 à OHg2NH2I + 7 KI + 3 H2O Hoùa chaát Thuoác thöû Nessler. Dung dòch NH4Cl chuaån chöùa 10mg NH3/ml Enzyme urease, urea, ñeäm phosphate 1/15 M pH 7, HCl 1N, nöôùc caát. Tieán haønh a) Döïng ñöôøng chuaån NH3 Chuaån bò dung dòch goác NH4Cl chöùa 10mg NH3/ml: caân 0,3089g NH4Cl, ñònh möùc leân 100ml, ruùt 1ml dung dòch tieáp tuïc ñònh möùc 100ml. Laáy 9 oáng nghieäm, ñaùnh soá thöù töï töø 0 ñeán 9. Cho vaøo moãi oáng ngheäm caùc dung dòch theo trình töï sau: Baûng 2.3: Daõy oáng nghieäm trong phöông phaùp xaùc ñònh hoaït tính enzyme urease töï do OÁng nghieäm 0 1 2 3 4 5 6 7 8 NH4Cl (ml) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 Löôïng NH3 (mg) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Nöôùc caát (ml) 5.5 5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 Nessler (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Ñeå maãu oån ñònh maøu trong 15 phuùt, sau ñoù laéc ñeàu vaø ño maät ñoä quang ôû böôùc soùng 490nm. Veõ ñöôøng chuaån NH3 vôùi truïc tung laø maät ñoä quang (A), truïc hoaønh laø haøm löôïng NH3. b) Xaùc ñònh hoaït tính Pheùp thöû ñöôïc tieán haønh 3 laàn treân 3 oáng nghieäm. Chuaån bò dung dòch urea: Pha dung dòch urea 2%: caân 2g urea, ñònh möùc 100ml baèng ñeäm phosphate 1/15 M, pH 7. Laáy 1 oáng nghieäm saïch vaø khoâ, cho vaøo: 0,4ml nöôùc caát + 0,5ml dung dòch urea 2% ôû treân. Giöõ oáng nghieäm trong beå ñieàu nhieät ñeán khi ñaït 30oC. Song song vôùi böôùc tieán haønh treân, ta chuaån bò dung dòch urease: caân 15mg enzyme daïng boät hoaøn tan trong 5ml ñeäm phosphate. Khi oáng nghieäm ñaõ ñaït 30oC, boå sung 0,1ml dung dòch urease, laéc ñeàu, ñeå phaûn öùng ôû 30oC trong voøng 15 phuùt. Theâm vaøo oáng nghieäm 0,5ml HCl 1N ñeå khöû hoaït tính urease vaø laøm ngöøng phaûn öùng. Laøm ñoàng thôøi moät maãu traéng: thay dung dòch urea 2% baèng nöôùc caát hay khöû hoaït tính urease baèng 0,5ml HCl 1N tröôùc khi cho urea vaøo. Xaùc ñònh löôïng NH3 taïo thaønh: laáy 0,5ml dung dòch sau phaûn öùng, boå sung theâm 5 ml nöôùc caát vaø 0,5ml thuoác thöû Nessler, laéc ñeàu, ñeå oån ñònh maøu trong 15 phuùt. Ño maät ñoä quang cuûa maãu thöû vaø maãu traéng ôû böôùc soùng 490nm. Tính: OD = ODmt - ODmtr Döïa vaøo ñöôøng chuaån NH3, suy ra haøm löôïng NH3 taïo thaønh. c) Coâng thöùc tính hoaït tính Hoaït tính urease: A = (UI/mg boät) (2.6) Toång hoaït tính: At = A * m (UI) (2.7) Hoaït tính rieâng: Ap = At / (löôïng protein cuûa cheá phaåm) (UI/mg protein) (2.8) y: haøm löôïng NH3 taïo thaønh (mg) a, b: caùc heä soá cuûa phöông trình ñöôøng chuaån NH3 m: khoái löôïng enzyme urease söû duïng (mg). F: theå tích dung dòch coù ñöôïc sau khi pha dung dòch enzyme (ml). 2.2.6.2 Phöông phaùp xaùc ñònh hoaït tính enzyme urease coá ñònh treân oáng thuûy tinh. ÔÛ ñaây, chuùng toâi cuõng choïn phöông phaùp Nessler ñeå xaùc ñònh hoaït tính enzyme urease coá ñònh vôùi caùc böôùc tieán haønh nhö sau: Chuaån bò dung dòch urea: 0.5 ml dung dòch urea 2% + 0.5 ml nöôùc caát. Nhuùng oáng thuûy tinh ñaõ coù enzyme coá ñònh vaøo dung dòch urea noùi treân. Cho phaûn öùng xaûy ra trong voøng 10 phuùt. Sau 10 phuùt, laáy oáng thuûy tinh ñaõ coù enzyme coá ñònh ra. Ruùt 0.2 ml dung dòch sau phaûn öùng cho vaøo 5.3 ml nöôùc caát, boå sung theâm 0.5 ml thuoác thöû Nessler, laéc ñeàu vaø ñeå 15 phuùt cho oån ñònh maøu roài ño ñoä haáp thu ôû böôùc soùng 490 nm. Duøng ñöôøng chuaån NH3 ñeå suy ra hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh. Maãu traéng: thay dung dòch urea 2% baèng nöôùc caát vaø khoâng nhuùng oáng thuûy tinh ñaõ coù enzyme coá ñònh vaøo. CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN 3.1 Khaûo saùt caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình coá ñònh enzyme urease leân chaát mang chitosan baèng lieân keát coäng hoùa trò. 3.1.1 Khaûo saùt xaùc ñònh phöông phaùp coá ñònh enzyme urease leân oáng thuûy tinh. Trong nghieân cöùu naøy, chuùng toâi khaûo saùt 4 phöông phaùp khaùc nhau ñeå coá ñònh enzyme urease leân beà maët thuûy tinh: Phöông phaùp nhoát enzyme urease trong gel gelatin. Phöông phaùp nhoát enzyme urease trong gel loøng traéng tröùng (albumin). Phöông phaùp gaén enzyme leân chaát mang gelatin baèng lieân keát coäng hoùa trò. Phöông phaùp gaén enzyme leân chaát mang chitosan baèng lieân keát coäng hoùa trò. Hình 3.1: Khaûo saùt caùc loaïi maøng Keát quaû thí nghieäm trong hình 3.1 cho thaáy hoaït tính cuûa enzyme ñöôïc coá ñònh theo phöông phaùp gaén enzyme leân chaát mang cao hôn haún so vôùi phöông phaùp nhoát enzyme trong khuoân gel. Ñoái vôùi phöông phaùp nhoát enzyme trong khuoân gel, maëc duø hieäu suaát coá ñònh raát cao, nhöng hoaït tính enzyme coá ñònh theo phöông phaùp naøy thaáp hôn laø do söï coù maët cuûa chaát mang haïn cheá khaû naêng tieáp xuùc giöõa enzyme vôùi cô chaát. Maët khaùc, söï coù maët cuûa chaát mang laøm caûn trôû söï khueách taùn cô chaát vaø saûn phaåm vaøo vaø ra khuoân gel. Do ñoù aûnh höôûng ñeán hoaït tính cuûa enzyme urease coá ñònh. Ngöôïc laïi, vôùi phöông phaùp gaén enzyme leân beà maët chaát mang thì khaû naêng tieáp xuùc giöõa enzyme vaø cô chaát toát hôn raát nhieàu so vôùi phöông phaùp nhoát enzyme trong gel. Chính vì vaäy phöông phaùp gaén enzyme leân maøng laø toát nhaát. Khi duøng phöông phaùp gaén enzyme leân maøng, chuùng toâi söû duïng hai loaïi chaát mang laø gelatin vaø chitosan. Keát quaû töø ñoà thò 3.1 cuõng cho thaáy hoaït tính cuûa enzyme ñöôïc coá ñònh leân maøng chitosan toát hôn vaø cao gaáp 3 laàn hoaït tính cuûa enzyme ñöôïc coá ñònh leân maøng gelatin. Ñieàu naøy ñöôïc lyù giaûi nhö sau Glutaraldehyde (GA) ñöôïc söû duïng laøm caàu noái giöõa chaát mang vaø enzyme. Baûn chaát cuûa lieân keát naøy laø lieân keát giöõa nhoùm –CHO cuûa GA vaø nhoùm –NH2 cuûa enzyme. Nhö ta ñaõ bieát, chitosan coù baûn chaát laø moät polysaccharid coù caùc nhoùm –NH2 neân khi nhuùng maøng chitosan vaøo dung dòch GA, cuõng seõ xaûy ra lieân keát coäng hoùa trò giöõa nhoùm –NH2 cuûa chitosan vaø moät nhoùm –CHO cuûa GA. Töø ñoù hình thaønh neân lieân keát coäng hoùa trò töông ñoái chaët cheõ giöõa chaát mang vaø enzyme thoâng qua caàu noái laø GA. Ngöôïc laïi, gelatin coù baûn chaát laø moät protein neân lieân keát trong phaân töû gelatin laø lieân keát peptide (nhieàu nhoùm glycine, proline vaø 4-hydroxyproline). Vì vaäy soá löôïng nhoùm –NH2 töï do khoâng nhieàu, daãn ñeán khaû naêng taïo lieân keát vôùi GA khoâng cao. Chính vì vaäy, khaû naêng coá ñònh enzyme treân maøng gelatin seõ khoâng toát baèng coá ñònh enzyme treân maøng chitosan. 3.1.2 Aûnh höôûng cuûa ñoä daøy maøng chitosan Trong nghieân cöùu naøy, chuùng toâi chæ coù theå thöïc hieän khaûo saùt aûnh höôûng cuûa ñoä daøy maøng chitosan ñeán quaù trình coá ñònh enzyme urease moät caùch giaùn tieáp thoâng qua theå tích ruùt dung dòch chitosan ñeå taïo maøng. Keát quaû thí nghieäm trong hình 3.2 cho thaáy khi taêng beà daøy maøng, hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh treân oáng thuûy tinh taêng vaø ñaït toái ña khi theå tích dung dòch chitosan duøng ñeå taïo maøng laø 100 µL. Neáu tieáp tuïc taêng beà daøy maøng thì hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh laïi giaûm. Nguyeân nhaân cuûa hieän töôïng treân coù theå ñöôïc giaûi thích laø khi taêng beà daøy maøng, soá nhoùm lieân keát giöõa GA vaø maøng seõ taêng, daãn ñeán khaû naêng lieân keát vôùi enzyme cuõng taêng. Tuy nhieân, neáu taêng theå tích ruùt dung dòch chitosan vöôït qua 100 µL, hoaït tính cuûa enzyem coá ñònh khoâng nhöõng khoâng taêng maø coøn giaûm. Ñieàu naøy coù theå ñöôïc giaûi thích laø khi caøng taêng ñoä daøy maøng, soá nhoùm –NH2 treân maøng chitosan seõ caøng taêng. Soá löôïng lieân keát cuûa 2 nhoùm –NH2 treân maøng vaø 2 nhoùm –CHO cuûa GA seõ caøng taêng (GA chæ coù 2 nhoùm –CHO), laøm cho löôïng GA duøng ñeå lieân keát vôùi enzyme seõ giaûm, daãn ñeán löôïng enzyme lieân keát treân maøng khoâng nhieàu, hoaït tính enzyme coá ñònh cuõng giaûm theo. Maët khaùc, hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh giaûm cuõng coù theå laø do lieân keát ngang giöõa GA vaø maøng quaù nhieàu, phaù vôõ caáu truùc cuûa maøng, luùc ñoù maøng seõ raát gioøn, deã vôõ [17]. Hình 3.2: Khaûo saùt theå tích ruùt chitosan ñeå taïo maøng Keát quaû nghieân cöùu coá ñònh urease treân maøng chitosan cuûa Krajewska vaø coäng söï (1990) keát luaän raèng ñoä daøy maøng tính toaùn ñöôïc laø 0,08-0,09mm [17]. 3.1.3 Aûnh höôûng cuûa noàng ñoä glutaraldehyde. Nhö chuùng toâi ñaõ ñeà caäp ôû treân, lieân keát giöõa chaát mang vaø enzyme thoâng qua caàu noái laø GA. Vì vaäy, trong thí nghieäm naøy chuùng toâi khaûo saùt aûnh höôûng cuûa noàng ñoä GA ñeán khaû naêng coá ñònh enzyme urease leân maøng chitosan. Hình 3.3: Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa noàng doä GA Keát quaû thí nghieäm trong hình 3.3 cho thaáy khi taêng noàng ñoä GA, hoaït tính enzyme urease coá ñònh taêng vaø ñaït cöïc ñaïi taïi noàng ñoä 0.01%. Sau ñoù neáu noàng ñoä GA tieáp tuïc taêng, hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh seõ giaûm. Ñieàu naøy coù theå ñöôïc giaûi thích nhö sau: Do GA laø taùc nhaân gaén keát enzyme leân chaát mang neân khi noàng ñoä GA taêng, soá löôïng enzyme lieân keát vôùi chaát mang cuõng taêng, daãn ñeán hoaït tính enzyme coá ñònh taêng. ÔÛ noàng ñoä GA thaáp (nhoû hôn 0.01%), lieân keát coäng hoùa trò ñaõ ñöôïc hình thaønh nhöng chöa nhieàu. Do ñoù, löôïng enzyme coá ñònh leân maøng chöa cao, hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh coù taêng nhöng chöa ñaït cöïc ñaïi. Khi noàng ñoä GA quaù cao (lôùn hôn 0.01%), hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh giaûm laø do lieân keát ngang giöõa GA vaø maøng quaù chaët, phaù vôõ caáu truùc cuûa maøng, luùc ñoù maøng seõ raát gioøn, deã vôõ [17]. Maët khaùc, soá löôïng lieân keát cuûa 2 nhoùm –NH2 treân maøng vaø 2 nhoùm –CHO cuûa GA cuõng taêng, laøm cho löôïng GA duøng ñeå lieân keát vôùi enzyme seõ giaûm. Ñieàu naøy ñoàng nghóa vôùi vieäc khaû naêng gaén keát enzyme leân maøng laø khoâng toát. Keát quaû nghieân cöùu cuûa chuùng toâi cuõng phuø hôïp vôùi nghieân cöùu coá ñònh urease treân maøng chitosan cuûa Krajewska vaø coäng söï (1990). Keát quaû nghieân cöùu treân cuõng cho thaáy noàng ñoä GA toái öu cho vieäc coá ñònh enzyme urease leân maøng chitosan laø 0.01% [17]. 3.1.4 AÛnh höôûng cuûa thôøi gian ngaâm maøng trong dung dòch glutaraldehyde. Trong nghieân cöùu naøy, chuùng toâi ñaõ tieán haønh khaûo saùt aûnh höôûng cuûa thôøi gian ngaâm maøng trong dung dòch GA ñeán hieäu quaû cuûa quaù trình coá ñònh enzyme urease leân chaát mang chitosan vôùi caùc giaù trò laø 0.5 giôø, 1 giôø, 1.5 giôø vaø 2 giôø. Keát quaû thí nghieäm trong hình 3.4 cho thaáy khi taêng thôøi gian ngaâm maøng chitosan trong dung dòch GA, hoaït tính cuûa enzyme urease taêng daàn vaø ñaït cöïc ñaïi khi thôøi gian ngaâm laø 1.5 giôø. Tieáp theo, neáu tieáp tuïc taêng thôøi gian ngaâm maøng trong GA, hoaït tính enzyme laïi giaûm. Nguyeân nhaân cuûa hieän töôïng treân coù theå ñöôïc giaûi thích laø neáu thôøi gian ngaâm trong dung dòch GA caøng ngaén, soá löôïng lieân keát taïo thaønh giöõa GA vaø nhoùm –NH2 treân maøng chitosan caøng ít, daãn ñeán khaû naêng taïo lieân keát vôùi enzyme khoâng cao, laøm hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh seõ thaáp. Ngöôïc laïi, neáu ngaâm maøng trong thôøi gian quaù daøi, seõ daãn ñeán hieän töôïng taïo lieân keát ngang giöõa GA vaø maøng quaù chaët, laøm maøng gioøn, deã vôõ, hieäu suaát coá ñònh cuõng khoâng cao [17]. Nghieân cöùu cuûa Krajewska vaø coäng söï (1990) khi coá ñònh enzyme urease leân maøng chitosan cuõng cho keát quaû töông töï cuûa chuùng toâi. Keát quaû nghieân cöùu cho thaáy thôøi gian toái thích ngaâm maøng trong dung dòch GA laø 1,5 giôø [17]. Hình 3.4: Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa thôøi gian ngaâm maøng trong dung dòch GA 3.1.5 AÛnh höôûng cuûa pH cuûa dung dòch enzyme urease Nhieàu keát quaû nghieân cöùu cho thaáy pH cuûa dung dòch enzyme urease duøng ñeå coá ñònh coù aûnh höôûng raát lôùn ñeán khaû naêng gaén keát enzyme treân maøng chitosan [4]. Hình 3.5: AÛnh höôûng cuûa pH cuûa dung dòch enzyme urease ñeán hoaït tính cuûa enzyme urease coá ñònh. Chính vì vaäy, muïc ñích cuûa nghieân cöùu naøy laø khaûo saùt aûnh höôûng cuûa pH ñeán quaù trình coá ñònh enzyme urease leân maøng chitosan, xaùc ñònh pH toát nhaát ñeå coá ñònh enzyme. Töø ñoù, chuùng toâi ñaõ choïn ba dung dòch enzyme coù pH khaùc nhau ñeå khaûo saùt: pH=5,2; pH=5,6 vaø pH=7,4. Keát quaû nghieân cöùu cho thaáy ôû dung dòch enzyme coù pH=5.6, hoaït tính cuûa enzyme urease coá ñònh cao hôn haún so vôùi nhöõng maøng ñöôïc xöû lyù ôû dung dòch enzyme coù pH=5,2 vaø pH=7,4. Enzyme urease ñöôïc coá ñònh trong dung dòch enzyme coù pH=5.2 coù hoaït tính raát thaáp. Nhö chuùng ta ñaõ bieát, phaûn öùng taïo lieân keát giöõa maøng chitosan vaø urease xaûy ra theo cô cheá nhö sau: Ch-NH2 + OHC-(CH2)3-CHO è Ch-N=CH-(CH2)3-CHO + H2O (a) Chitosan Glutaraldehyde Ch-N=CH-(CH2)3-CHO + H2N-E è Ch-N=CH-(CH2)3 –CH=N-E + H2O (b) Chitosan ñaõ xöû lyù baèng GA Enzyme Trong ñoù phaûn öùng (a) khoâng phuï thuoäc vaøo pH. Ngöôïc laïi phaûn öùng (b) laïi phuï thuoäc raát nhieàu vaøo pH. Hoaït tính enzyme coá ñònh seõ lôùn nhaát neáu maøng ñöôïc ngaâm vaøo dung dòch enzyme coù pH thaáp hôn. Ñieàu ñoù laø vì pH acid seõ taïo thuaän lôïi cho phaûn öùng giöõa nhoùm amino vaø nhoùm aldehyde, ñoàng thôøi ôû pH acid naøy, chitosan toàn taïi ôû daïng gel, giuùp cho nhieàu phaân töû urease lieân keát vaøo maøng thoâng qua con ñöôøng haáp thuï hay nhoát gel [17]. Tuy nhieân, neáu pH quaù thaáp, haàu heát caùc nhoùm amino ñeàu tích ñieän döông. Ñieàu naøy gaây khoù khaên cho phaûn öùng giöõa nhoùm amino cuûa enzyme vaø nhoùm aldehyde cuûa GA, khi ñoù hieäu suaát coá ñònh khoâng cao daãn ñeán hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh cuõng thaáp. Maët khaùc, Sumner vaø Hand ñaõ xaùc ñònh ñieåm ñaúng ñieän cuûa urease naèm trong khoaûng pH=5.0-5.1. Taïi ñieåm ñaúng ñieän, ñoä hoøa tan cuûa urease cöïc nhoû [77]. Do ñoù, hieäu suaát coá ñònh enzyme cuõng thaáp neân hoaït tính enzyme coá ñònh cuõng khoâng cao. Keát quaû thí nghieäm cuûa chuùng toâi cuõng töông töï vôùi nhöõng nghieân cöùu cuûa nhieàu taùc giaû khi nghieân cöùu veà quaù trình coá ñònh urease: Krajewska vaø coäng söï (1990) nghieân cöùu veà enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan, dung dòch enzyme coù pH =5.3 seõ laø toái öu cho vieäc coá ñònh enzyme [17]. Anita vaø coäng söï (1997) cho raèng dung dòch enzyme urease coù pH =6.0 laø toát nhaát khi coá ñònh enzyme urease treân nylon [10]. 3.1.6 Aûnh höôûng cuûa thôøi gian ngaâm Hieäu quaû cuûa phöông phaùp coá ñònh phuï thuoäc vaøo löôïng enzyme taïo ñöôïc lieân keát ñoàng hoùa trò thoâng qua glutaraldehyde vôùi chaát mang vaø löôïng enzyme lieân keát naøy phuï thuoäc vaøo thôøi gian nhuùng oáng thuûy tinh vaøo dung dòch enzyme urease. Keát quaû thí nghieäm trong hình 3.6 cho thaáy neáu taêng thôøi gian ngaâm maøng trong dung dòch enzyme, hoaït tính cuûa enzyme caøng taêng vaø ñaït toát nhaát ôû 24 giôø. Neáu tieáp tuïc taêng thôøi gian ngaâm, hoaït tính cuûa enzyme vaãn khoâng taêng. Veà nguyeân taéc, neáu thôøi gian ngaâm maøng trong dung dòch enzyme caøng laâu thì soá lieân keát giöõa enzyme vaø maøng ñöôïc hình thaønh caøng nhieàu. Ñeán moät luùc naøo ñoù, maøng seõ baõo hoøa enzyme, hoaït tính khoâng taêng nöõa. Ñieàu naøy coù theå giaûi thích nhö sau: Sau khi ñaõ lieân keát vôùi maøng, soá nhoùm -CHO coøn laïi cuûa glutaraldehyde seõ lieân keát vôùi nhöõng nhoùm –NH2 cuûa enzyme. Sau moät khoaûng thôøi gian ngaâm maøng trong dung dòch enzyme, soá nhoùm -CHO cuûa glutaraldehyde seõ khoâng coøn töï do nöõa. Chính vì vaäy neáu thôøi gian ngaâm caøng daøi, cuõng khoâng theå taïo theâm lieân keát giöõa enzyme vaø maøng. Hình 3.6 : Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa thôøi gian coá ñònh urease 3.2 Xaùc ñònh hieäu suaát coá ñònh urease treân maøng chitosan baèng lieân keát coäng hoùa trò. Khi coá ñònh enzyme treân moät chaát mang xaùc ñònh, seõ coù moät phaàn nhoû enzyme khoâng coá ñònh ñöôïc leân chaát mang trong quaù trình coá ñònh. Hoaït tính cuûa urease ñöôïc coá ñònh treân chaát mang caøng lôùn thì hieäu quaû coá ñònh cuûa phöông phaùp ñoù seõ caøng cao vaø trieån voïng öùng duïng cuûa phöông phaùp ñoù seõ caøng khaû quan. Chuùng toâi xaùc ñònh hieäu suaát coá ñònh urease döïa treân tæ soá hoaït tính cuûa urease coá ñònh treân maøng vaø hoaït tính cuûa urease töï do ban ñaàu tröôùc khi coá ñònh. Khi coá ñònh enzyme urease treân maøng chitosan baèng lieân keát coäng hoùa trò, hieäu suaát coá ñònh enzyme laø 56,48%. Khi so saùnh hieäu suaát coá ñònh enzyme urease treân maøng chitosan vôùi hieäu suaát coá ñònh enzyme urease treân nhieàu loaïi chaát mang khaùc nhö nylon (hieäu suaát coá ñònh laø 12.11% (Anita vaø coäng söï,1997)) [10] thì hieäu suaát coá ñònh enzyme treân maøng chitosan laø khaù cao. 3.3 Khaûo saùt tính chaát cuûa enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan baèng lieân keát coäng hoùa trò 3.3.1 Khaûo saùt tính chaát ñoäng hoïc cuûa enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan baèng lieân keát coäng hoùa trò Veà maët lyù thuyeát, theo phöông trình ñoäng hoïc Michaelis-Menten, trong moät giôùi haïn noàng ñoä xaùc ñònh, khi taêng noàng ñoä cô chaát thì vaän toác phaûn öùng enzyme seõ taêng, vöôït qua giôùi haïn noàng ñoä ñoù vaän toác phaûn öùng enzyme taêng theâm khoâng ñaùng keå. Hình 3.7: Ñoà thò bieåu dieãn söï bieán ñoåi vaän toác thuûy phaân cuûa urease coá ñònh vaø urease töï do khi thay ñoåi noàng ñoä cô chaát urea Keát quaû thí nghieäm cho thaáy khi taêng noàng ñoä cô chaát trong dung dòch thì vaän toác phaûn öùng thuûy phaân urea baèng enzyme urease coá ñònh vaø enzyme urease töï do ñeàu taêng. Vaän toác phaûn öùng thuûy phaân urea bôûi enzyme urease coá ñònh ñaït giaù trò cöïc ñaïi taïi noàng ñoä urea laø 2.5% (töông ñöông vôùi noàng ñoä urea laø 2.5g/100ml nöôùc). Vaän toác phaûn öùng thuûy phaân bôûi enzyme töï do ñaït cöïc ñaïi taïi noàng ñoä urea laø 2% (töông ñöông vôùi noàng ñoä urea laø 2g/100ml nöôùc). Khi noàng ñoä urea trong dung dòch phaûn öùng lôùn hôn nhöõng giaù trò treân, vaän toác phaûn öùng baét ñaàu giaûm. Hieän töôïng vaän toác phaûn öùng enzyme giaûm khi noàng ñoä cô chaát quaù cao ñöôïc giaûi thích do khi thöøa cô chaát, caùc phaân töû cô chaát coù theå keát hôïp vôùi phöùc enzyme-cô chaát, taïo phöùc chaát khoâng hoaït ñoäng, laøm giaûm hoaït tính cuûa enzyme [15]. Hình 3.8: Ñoà thò bieåu dieãn moái quan heä giöõa 1/V vaø 1/[S] cuûa urease coá ñònh vaø urease töï do. Baûng 3.1: Caùc thoâng soá ñoäng hoïc cuûa urease coá ñònh vaø urease töï do: Urease Vmax (µmol/mg.phuùt) Km (mmol) Coá ñònh 0.446 263.6 Töï do 1.009 88.2 Töø keát quaû thöïc nghieäm thu ñöôïc, chuùng toâi tieán haønh tính toaùn xaùc ñònh giaù trò caùc thoâng soá ñoäng hoïc cuûa phaûn öùng enzyme nhö Km vaø Vmax. Keát quaû thí nghieäm trong baûng 3.1 cho thaáy Km cuûa urease coá ñònh lôùn hôn gaáp 3 laàn so vôùi Km cuûa urease töï do nghóa laø urease töï do coù aùi löïc vôùi cô chaát cao hôn urease coá ñònh. Ñoàng thôøi trong tröôøng hôïp thuûy phaân ure baèng enzyme coá ñònh, vaän toác phaûn öùng ñaït giaù trò cöïc ñaïi thaáp hôn hai laàn so vôùi trong tröôøng hôïp söû duïng enzyme töï do. Nguyeân nhaân cuûa hieän töôïng naøy coù theå laø: Enzyme urease bò thay ñoåi caáu truùc phaân töû khi coá ñònh vaøo maøng, vì vaäy khaû naêng phaân töû cô chaát tieáp caän vôùi trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme coá ñònh gaëp nhieàu khoù khaên daãn ñeán aùi löïc giöõa cô chaát vaø enzyme giaûm, nghóa laø Km taêng [17]. Do enzyme laø moät protein, coù chöùa nhöõng goác öa nöôùc, keát hôïp vôùi caùc phaân töû nöôùc taïo ra nhöõng lôùp hydrat bao xung quanh nhöõng phaân töû enzyme coá ñònh, daãn ñeán keát quaû laø seõ gaây caûn trôû cho söï tieáp xuùc giöõa enzyme vaø cô chaát. Khi ñoù Km cuõng seõ taêng [17]. Khi enzyme urease bò coá ñònh leân chaát mang, caùc phaân töû cô chaát phaûi maát moät khoaûng thôøi gian ñeå di chuyeån töø moâi tröôøng beân ngoaøi vaøo beân trong maøng ñeå tieáp xuùc vôùi enzyme. Trong khi ñoù, neáu söû duïng enzyme urease töï do ñeå thuûy phaân, caùc phaân töû enzyme ñöôïc phaân boá ñeàu trong dung dòch vaø khaû naêng tieáp xuùc tröïc tieáp vôùi cô chaát cao hôn so vôùi enzyme coá ñònh. Chính vì vaäy maø vaän toác cöïc ñaïi cuûa phaûn öùng thuûy phaân ure trong tröôøng hôïp söû duïng enzyme coá ñònh thaáp hôn trong tröôøng hôïp söû duïng enzyme töï do. Keát quaû thí nghieäm cuûa chuùng toâi töông töï nhö keát quaû nghieân cöùu cuûa nhieàu taùc giaû khaùc nhö: Krajewska vaø coäng söï (1990) nghieân cöùu coá ñònh urease treân chitosan cho thaáy: Km cuûa urease coá ñònh vaø urease töï do laàn löôït laø: 26.4 vaø 5.04 mmol/l, Vmax cuûa urease coá ñònh nhoû hôn 1.5 laàn so vôùi urease töï do [17]. Nghieân cöùu cuûa Hatayama vaø coäng söï (1995) coá ñònh urease baèng phöông phaùp nhoát trong heä sôïi toång hôïp töø cellulose acetate vaø TiO2 cuõng cho thaáy Km cuûa urease coá ñònh coù giaù trò laø 8.10-1mol/lit, cao hôn nhieàu so vôùi Km cuûa urease töï do (coù giaù trò 9,4.10-4 mol/lit), trong khi ñoù, Vmax cuûa urease coá ñònh laø 7,2 .10-5 mol/phuùt/g, thaáp hôn urease töï do (2,7.10-3 mol/phuùt/g) [40]. Nghieân cöùu coá ñònh urease treân caùc chaát mang khaùc nhau nhö hoãn hôïp chitosan – alginate vaø hoãn hôïp poly(acrylamide-co-acrylic acid)/k-carrageenan cuûa Kara vaø coäng söï (2006) cho thaáy: Km cuûa enzyme coá ñònh lôùn hôn enzyme töï do (4.3 mmol vaø 3.30 mmol cuûa enzyme coá ñònh so vôùi 3.03 mmol cuûa enzyme töï do), trong khi ñoù Vmax cuûa enzyme töï do laø 0.0182 mM/phuùt lôùn hôn enzyme coá ñònh laàn löôït laø 0.0104 vaø 0.0099 mM/phuùt [34 ]. 3.3.2 Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan baèng lieân keát coäng hoùa trò Cuõng nhö enzyme töï do, nhieät ñoä laø moät yeáu toá aûnh höôûng raát lôùn ñeán hoaït tính cuûa enzyme urease coá ñònh. Nhôø lieân keát vôùi chaát mang maø urease coá ñònh coù khaû naêng chòu ñöôïc nhieät ñoä cao toát hôn so vôùi urease töï do. Keát quaû thí nghieäm trong hình 3.10 cho thaáy khi taêng nhieät ñoä, hoaït tính cuûa enzyme urease coá ñònh taêng vaø ñaït cöïc ñaïi taïi 650C. Trong khi ñoù, hoaït tính cuûa enzyme urease töï do ñaït cöïc ñaïi khi nhieät ñoä laø 600C. Nhö vaäy, nhieät ñoä toái thích cuûa enzyme urease coá ñònh cao hôn nhieät ñoä toái thích cuûa enzyme urease töï do. Neáu tieáp tuïc taêng nhieät ñoä, hoaït tính cuûa enzyme seõ giaûm. Hình 3.9 : Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán enzyme coá ñònh vaø enzyme töï do. Nguyeân nhaân cuûa hieän töôïng treân coù theå ñöôïc giaûi thích nhö sau: Ñoái vôùi urease töï do hay urease coá ñònh, khi nhieät ñoä taêng, caùc phaân töû urease vaø cô chaát nhaän ñöôïc naêng löôïng hoaït hoùa cao hôn, do ñoù seõ chuyeån ñoäng nhieàu hôn, khaû naêng tieáp xuùc vôùi nhau toát hôn. Keát quaû laø khaû naêng phaûn öùng cuûa urease seõ cao, hieäu suaát thuûy phaân urea cuõng toát. Tuy nhieân, ñeán moät nhieät ñoä naøo ñoù, enzyme seõ bò bieán tính bôûi taùc duïng cuûa nhieät ñoä neân hoaït tính cuûa enzyme seõ giaûm. Noùi caùch khaùc, khi nhieät ñoä quaù cao, hoaït tính enzyme seõ khoâng taêng nöõa maø baét ñaàu giaûm. Hieän töôïng enzyme bò voâ hoaït bôûi nhieät ñoä cao ñöôïc giaûi thích laø khi taêng nhieät ñoä, caùc nguyeân töû trong phaân töû enzyme tích luõy naêng löôïng vaø baét ñaàu coù xu höôùng chuyeån ñoäng nhanh hôn. Ñeán moät luùc naøo ñoù khi caùc nguyeân töû naøy tích luõy ñuû naêng löôïng, chuùng seõ taùch rôøi ra khoûi phaân töû enzyme, laøm thay ñoåi caáu truùc phaân töû enzyme, laøm cho enzyme maát hoaït tính [15]. Hôn nöõa, ñoái vôùi enzyme töï do, döôùi taùc ñoäng cuûa nhieät ñoä cao, caùc phaân töû enzyme trong dung dòch chuyeån ñoäng nhieät hoãn loaïn, laøm taêng söï va chaïm cuûa caùc phaân töû enzyme vôùi nhau, laøm cho caùc nguyeân töû “hoaït ñoäng” trong phaân töû enzyme caøng deã bò taùch rôøi, hoaït tính cuûa enzyme seõ giaûm nhanh hôn [15]. Nhieät ñoä toái thích cuûa urease coá ñònh cao hôn nhieät ñoä toái thích cuûa urease töï do laø do urease coá ñònh ñöôïc giöõ chaët bôûi maøng neân urease coá ñònh caàn coù naêng löôïng hoaït hoùa cao hôn urease töï do ñeå thöïc hieän phaûn öùng thuûy phaân ure. Ñeå urease coá ñònh ñaït ñöôïc naêng löôïng hoaït hoùa lôùn hôn, caàn phaûi taêng nhieät ñoä cao hôn. [17]. Noùi caùch khaùc nhieät ñoä toái thích cuûa urease coá ñònh cao hôn nhieät ñoä toái thích cuûa urease töï do. Beân caïnh ñoù, vì urease ñöôïc coá ñònh neân urease ñaõ ñöôïc maøng baûo veä, khaû naêng bò bieán tính bôûi nhieät laø khoâng cao neân hieäu suaát thuûy phaân ure seõ toát hôn so vôùi tröôøng hôïp cuûa urease töï do. Khi so saùnh nhieät ñoä toái thích cuûa hai loaïi enzyme urease naøy, keát quaû nghieân cöùu cuûa chuùng toâi cuõng phuø hôïp vôùi caùc nghieân cöùu cuûa nhieàu taùc giaû khaùc nhö: Krajewska vaø coäng söï (1990) nghieân cöùu coá ñònh urease leân maøng chitosan thaáy raèng naêng löôïng hoaït hoùa cuûa urease töï do vaø urease coá ñònh laàn löôït laø 5.71 vaø 7.37 kcal/mol, nhieät ñoä toái thích cuûa urease töï do vaø urease coá ñònh laàn löôït laø 650C vaø 750C [17 ]. Kara vaø coäng söï (2006) nghieân cöùu coá ñònh urease treân caùc chaát mang khaùc nhau nhö hoãn hôïp chitosan – alginate vaø hoãn hôïp poly(acrylamide-co-acrylic acid)/k-carrageenan cuõng keát luaän raèng nhieät ñoä toái thích cuûa urease töï do vaø urease coá ñònh laàn löôït laø 550C vaø 600C [ 34]. Neáu taêng nhieät ñoä vöôït qua nhieät ñoä toái thích cuûa urease coá ñònh, hoaït tính cuûa urease seõ giaûm ñaùng keå, luùc naøy enzyme ñaõ bò bieán tính bôùi nhieät. 3.3.3 Khaûo saùt ñoä beàn nhieät cuûa enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán hoaït tính cuûa enzyme coù theå theo 2 höôùng: hoaït hoùa vaø voâ hoaït enzyme. Khi taêng nhieät ñoä trong moät giôùi haïn nhaát ñònh, vaän toác phaûn öùng taêng theo hay noùi caùch khaùc laø taêng nhieät ñoä coù theå laøm taêng hoaït tính enzyme. Tuy nhieân, nhieät ñoä cao cuõng laøm hoaït tính enzyme giaûm ñi nhanh choùng. Trong nghieân cöùu naøy, chuùng toâi tieán haønh khaûo saùt khaû naêng beàn vôùi nhieät cuûa enzyme ôû nhieät ñoä laø 550C. Keát quaû thí nghieäm cho thaáy ñoái vôùi enzyme coá ñònh, sau 180 phuùt hoaït tính cuûa enzyme urease coá ñònh coøn 80% so vôùi giaù trò hoaït tính ban ñaàu. Trong khi ñoù, ôû enzyme urease töï do hoaït tính chæ coøn laïi 60%. Hình 3.10: Khaûo saùt ñoä beàn nhieät cuûa enzyme coá ñònh vaø enzyme töï do ôû 550C. Nhö vaäy keát quaû thí nghieäm cho thaáy khi coá ñònh enzyme urease treân maøng chitosan, ñoä beàn nhieät cuûa enzyme coá ñònh cao hôn haún so vôùi enzyme töï do. Urease ñöôïc coá ñònh neân urease ñaõ ñöôïc maøng baûo veä, khaû naêng bò bieán tính bôûi nhieät laø khoâng cao neân möùc ñoä giaûm hoaït tính seõ thaáp hôn so vôùi urease töï do [10]. Beân caïnh ñoù, chuùng toâi cuõng tieán haønh xaùc ñònh haèng soá toác ñoä voâ hoaït enzyme vaø thôøi gian baùn huûy t1/2. Keát quaû tính toaùn töø baûng 3.2 cho thaáy haèng soá toác ñoä voâ hoaït enzyme k cuûa enzyme urease coá ñònh laø 3.10-4 (phuùt)-1 vaø nhoû hôn 3 laàn so vôùi haèng soá toác ñoä voâ hoaït enzyme k cuûa enzyme urease töï do laø 9.10-4 (phuùt)-1. Thôøi gian “baùn huûy” t1/2 cuûa enzyme urease coá ñònh vaø enzyme urease töï do laàn löôït laø 2311 phuùt (38.5 giôø) vaø 771 phuùt (12.9 giôø). Ñieàu ñoù cho thaáy ñoä beàn nhieät cuûa enzyme urease coá ñònh cao hôn haún so vôùi enzyme urease töï do. Baûng 3.2: Keát quaû haèng soá toác ñoä voâ hoaït enzyme k vaø thôøi gian “baùn huûy” t1/2 cuûa enzyme urease coá ñònh vaø enzyme urease töï do ôû 550C. T1/2 (phuùt) K (phuùt)-1 Urease coá ñònh 2311 3.10-4 Urease töï do 771 9.10-4 Nghieân cöùu cuûa chuùng toâi cho keát quaû töông töï keát quaû cuûa caùc taùc giaû khaùc khi khaûo saùt ñoä beàn nhieät cuûa enzyme urease coá ñònh treân caùc chaát mang khaùc: Taùc giaû Krajewska vaø coäng söï (1990), nghieân cöùu coá ñònh urease treân maøng chitosan keát luaän raèng thôøi gian baùn huûy hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh vaø enzyme töï do laàn löôït laø 250phuùt vaø 120phuùt [17]. Chen vaø Chiu (1999) nghieân cöùu coá ñònh enzyme urease treân haït chitosan vaø keát luaän raèng thôøi gian baùn huûy hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh vaø enzyme töï do laàn löôït laø 175phuùt vaø 70phuùt [48]. 3.3.4 Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa pH ñeán enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan baèng lieân keát coäng hoùa trò Trong nghieân cöùu naøy, chuùng toâi thöïc hieän thí nghieäm xaùc ñònh pH toái thích cho enzyme urease coá ñònh. Ñoàng thôøi cuõng tieán haønh maãu ñoái chöùng laø enzyme töï do. Hình 3.11 : Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa pH ñeán enzyme coá ñònh vaø enzyme töï do Keát quaû thí nghieäm trong hình 3.9 cho thaáy pH toái thích cuûa enzyme coá ñònh laø pH 6.0, pH toái thích cuûa enzyme töï do laø pH 7.5. pH toái thích cuûa enzyme coá ñònh nhoû hôn pH toái thích cuûa enzyme töï do. Nguyeân nhaân cuûa hieän töôïng treân coù theå giaûi thích nhö sau. Trong cuøng moät dung dòch ñeäm phosphate, seõ coù hai pH aûnh höôûng ñeán hoaït tính cuûa urease coá ñònh. Ñoù laø pH ôû vuøng trung gian giöõa maøng chitosan vaø enzyme coá ñònh vaø pH cuûa dung dòch ñeäm phosphate. Chitosan laø moät polycation (pKa 6.5), mang ñieän tích döông, vì vaäy seõ coù nhieàu ion OH- xung quanh noù. Ñieàu naøy cho thaáy ôû vuøng trung gian giöõa maøng chitosan vaø enzyme coá ñònh seõ coù ít ion H+ hôn so vôùi trong dung dòch ñeäm phosphate, nghóa laø pH ôû vuøng naøy seõ cao hôn so vôùi trong dung dòch ñeäm phosphate [18,19]. Do ñoù, trong hai dung dòch ñeäm phosphate coù cuøng pH, hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh seõ ñöôïc ño ôû pH thaáp hôn so vôùi enzyme töï do. Ñeå enzyme ñaït ñöôïc hoaït tính cao nhaát trong dung dòch ñeäm phosphate, pH toái thích cuûa enzyme urease coá ñònh seõ thaáp hôn pH toái thích cuûa enzyme urease töï do. Keát quaû nghieân cöùu cuûa Anita cuøng coäng söï (1997) cuõng phuø hôïp vôùi nhöõng thí nghieäm cuûa chuùng toâi, pH toái thích cuûa enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan cuõng laø 6.0 [10]. 3.3.5 Khaûo saùt khaû naêng taùi söû duïng cuûa ñeán enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan baèng lieân keát coäng hoùa trò Keát quaû thí nghieäm treân hình 3.18 cho thaáy, sau 5 laàn söû duïng, hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh thay ñoåi khoâng ñaùng keå. Sau ñoù neâu tieáp thuïc söû duïng hoaït tính enzyme coá ñònh giaûm ñaùng keå. Sau khi söû duïng laàn thöù 6 vaø laàn thöù 7, hoaït tính enzyme coá ñònh coøn laïi laàn löôït laø 80% vaø 25% so vôùi ban ñaàu. Hình 3.12: Khaûo saùt khaû naêng taùi söû duïng cuûa maøng. Nguyeân nhaân coù theå ñöôïc giaûi thích nhö sau: Trong phaûn öùng coù xuùc taùc enzyme, nhôø söï taïo thaønh phöùc hôïp trung gian enzyme - cô chaát maø cô chaát ñöôïc hoaït hoùa. Khi cô chaát keát hôïp vôùi enzyme, do keát quaû cuûa söï cöïc hoùa, söï dòch chuyeån cuûa caùc electron vaø söï bieán daïng cuûa caùc lieân keát tham gia tröïc tieáp vaøo phaûn öùng daãn ñeán laøm thay ñoåi ñoäng naêng cuõng nhö theá naêng cuûa phaân töû cô chaát, keát quaû laøm cho phaân töû cô chaát trôû neân hoaït ñoäng hôn, nhôø ñoù tham gia phaûn öùng deã daøng hôn. Ñieàu ñoù nghóa laø khi coù söï keát hôïp giöõa enzyme – cô chaát, ñaõ hình thaønh caùc lieân keát trong quaù trình phaûn öùng nhö töông taùc tónh ñieän, lieân keát hydro, lieân keát Van der Waals [6]. Beân caïnh ñoù, tröôùc khi bieán ñoåi phöùc naøy thaønh saûn phaåm, ñaõ xaûy ra söï bieán ñoåi cô chaát daãn ñeán söï keùo caêng vaø phaù vôõ caùc lieân keát ñoàng hoùa trò tham gia phaûn öùng laøm aûnh höôûng maïnh ñeán caáu truùc phaân töû enzyme [4]. Nhö vaäy, sau nhieàu laàn söû duïng, caáu truùc cuûa enzyme coá ñònh seõ bò thay ñoåi, hoaït tính cuûa enzyme seõ giaûm. Keát quaû thí nghieäm cuûa chuùng toâi cuõng töông töï vôùi caùc nghieân cöùu cuûa nhieàu taùc giaû khaùc nhö: Krajewska vaø coäng söï (1990) nghieân cöùu coá ñònh urease treân chitosan, khaû naêng taùi söû duïng cuûa urease coá ñònh laø 9 laàn [17]. Keát quaû nghieân cöùu cuûa Anita vaø coäng söï (1997) veà urease coá ñònh treân nylon coù khaû naêng taùi söû suïng laø 5 laàn [10]. 3.3.6 Khaûo saùt ñoä beàn baûo quaûn ñeán enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan baèng lieân keát coäng hoùa trò Trong nghieân cöùu naøy, chuùng toâi tieán haønh khaûo saùt ñoä beàn baûo quaûn cuûa enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan trong nhieàu loaïi dung dòch baûo quaûn khaùc nhau nhö dung dòch ñeäm photphat coù boå sung EDTA 1mM, dung dòch ñeäm photphat khoâng boå sung EDTA, dung dòch muoái NiSO4 vaø oáng thuûy tinh coù chöùa enzyme coá ñònh ñeå khoâ. Maãu ñoái chöùng laø dung dòch enzyme töï do. Hình 3.13: Ñoä beàn baûo quaûn cuûa enzyme urease coá ñònh vaø urease töï do . Keát quaû thí nghieäm trong hình 3.17 cho thaáy sau 3 tuaàn baûo quaûn, möùc ñoä giaûm hoaït tính cuûa dung dòch khoâng boå sung EDTA thaáp nhaát, möùc ñoä giaûm nhieàu nhaát laø dung dòch NiSO4. Dung dòch coù boå sung EDTA maëc duø khoâng toát nhö dung dòch khoâng boå sung EDTA, nhöng coù khaû naêng baûo quaûn toát hôn so vôùi dung dòch enzyme töï do vaø oáng thuûy tinh coù chöùa enzyme coá ñònh ñeå khoâ. Nguyeân nhaân cuûa hieän töôïng naøy coù theå ñöôïc giaûi thích laø: Neáu baûo quaûn enzyme coá ñònh trong moâi tröôøng coù EDTA 1mM, ñieàu naøy cuõng toát. Vì khi ñoù, EDTA seõ “baét” nhöõng ion kim loaïi baèng caùch ion kim loaïi seõ keát hôïp vôùi hai nhoùm –COOH coøn laïi cuûa EDTA, töø ñoù seõ haïn cheá ñöôïc khaû naêng öùc cheá cuûa ion kim loaïi cho söï hoaït ñoäng cuûa enzyme. Coâng thöùc caáu taïo cuûa EDTA-Na2.2H2O Thöïc teá moät ñieàu raèng nöôùc caát chöa hoaøn toaøn loaïi boû ñöôïc taát caû caùc ion kim loaïi. Do ñoù ñeå ñaûm baûo ñoä tin caäy trong taát caû caùc khaûo saùt, chuùng toâi ñaõ baûo quaûn enzyme coá ñònh trong dung dòch coù chöùa EDTA 1mM. Rieâng ñoái vôùi vieäc baûo quaûn trong moâi tröôøng coù Ni2+, ôû ñaây khoâng phaûi dung dòch ñeäm phosphate, vì neáu laø dung dòch phosphate, Ni2+ seõ phaûn öùng vôùi caùc ion phosphate taïo keát tuûa, laøm aûnh höôûng ñaùng keå ñeán keát quaû cuûa thí nghieäm. Moâi tröôøng chæ laø nöôùc caát coù boå sung NiSO4. Neáu noàng ñoä Ni2+ thaáp, ñieàu naøy seõ hoã trôï cho söï hoaït hoùa trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme cuõng laø Ni2+. Theá nhöng baûo quaûn urease coá ñònh trong moâi tröôøng coù noàng ñoä Ni2+ 1mM, seõ coù taùc duïng gaây öùc cheá enzyme. Keát quaû thí nghieäm cuûa chuùng toâi ñaõ chöùng minh ñieàu naøy laø coù cô sôû. Sau 3 tuaàn baûo quaûn, hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh gaàn nhö laø maát hoaøn toaøn. Qua ñoà thò, ñoä beàn baûo quaûn cuûa enzyme cuõng ñaõ thay ñoåi. Sau 15 ngaøy, enzyme töï do ñaõ maát ñi 50% hoaït tính. Trong khi ñoù, enzyme coá ñònh ñöôïc baûo quaûn trong moâi tröôøng ñeäm coù hoaëc khoâng coù EDTA, chæ maát maát khoaûng 30-35% hoaït tính. Ñieàu naøy coù theå giaûi thích nhö sau: Trong quaù trình baûo quaûn enzyme, hoaït tính cuûa enzyme urease töï do vaø coá ñònh ñeàu giaûm daàn theo thôøi gian. Tuy nhieân, vieäc coá ñònh enzyme coù theå giuùp duy trì hoaït tính cuûa enzyme trong thôøi gian daøi hôn. Hieän töôïng giaûm daàn hoaït tính cuûa enzyme urease töï do theo thôøi gian laø do khi toàn taïi trong moâi tröôøng dung dòch, caùc phaân töû enzyme coù theå töông taùc vôùi nhau, phaù vôõ lieân keát yeáu giöõa caùc tieåu ñôn vò hình thaønh neân caáu truùc baäc 4 cuûa phaân töû protein, laøm cho caáu truùc baäc 4 cuûa phaân töû urease bò phaù huûy, enzyme bò voâ hoaït. Khi enzyme ñöôïc coá ñònh treân maøng chitosan, söï coù maët cuûa chaát mang ñaõ giuùp haïn cheá söï töông taùc giöõa caùc phaân töû enzyme vôùi nhau, do ñoù hoaït tính cuûa enzyme giöõ ñöôïc trong thôøi gian daøi hôn. Baûng 3.3: Keát quaû haèng soá toác ñoä voâ hoaït enzyme k vaø thôøi gian “baùn huûy” t1/2 cuûa enzyme urease coá ñònh trong caùc dung dòch baûo quaûn vaø enzyme urease töï do Dung dòch Khoâng EDTA Coù EDTA OÁng thuûy tinh chöùa enzyme coá ñònh ñeå khoâ NiSO4 Enzyme töï do t1/2 (ngaøy) 25.4 26.5 24.1 10.7 23.1 k (ngaøy)-1 2,73.10-2 2,62.10-2 2,88.10-2 6,49.10-2 3.10-2 Keát quaû tính toaùn töø ñoà thò cho thaáy haèng soá toác ñoä voâ hoaït enzyme k cuûa enzyme urease coá ñònh trong caùc dung dòch baûo quaûn (khoâng EDTA vaø coù EDTA), cuûa oáng thuûy tinh chöùa enzyme coá ñònh ñeå khoâ vaø enzyme töï do laø gaàn nhö nhau. Chæ coù tröôøng hôïp baûo quaûn enzyme coá ñònh trong dung dòch NiSO4 haèng soá toác ñoä voâ hoaït enzyme k raát cao, nghóa laø hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh seõ giaûm nhanh choùng. Ñieàu naøy hoaøn toaøn phuø hôïp vôùi nhöõng phaân tích cuûa chuùng toâi ôû treân. Keát quaû nghieân cöùu cuûa chuùng toâi töông töï vôùi nhöõng keát luaän cuûa taùc giaû Krajewska vaø coäng söï (1990) khi nghieân cöùu coá ñònh enzyme urease treân chitosan, cho raèng neân baûo quaûn enzyme urease coá ñònh trong dung dòch ñeäm phosphate coù boå sung EDTA 1mM [17]. CHÖÔNG 4: KEÁT LUAÄN VAØ KIEÁN NGHÒ 4.1. Keát luaän Qua quaù trình nghieân cöùu, chuùng toâi thaáy raèng enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan coù moät soá tính chaát nhö sau: Km vaø Vmax cuûa enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan coù giaù trò laàn löôït laø 263.69mmol vaø 0.446 µmol/mg.phuùt. Km vaø Vmax cuûa enzyme urease töï do coù giaù trò laàn löôït laø 88.2 mmol vaø 1,009 µmol/mg.phuùt. Enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan coù hoaït tính thaáp hôn enzyme urease töï do. Tuy nhieân, enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan coù nhieàu öu ñieåm hôn enzyme urease töï do nhö: enzyme urease coá ñònh coù ñoä beàn nhieät cao hôn enzyme töï do, enzyme urease coá ñònh coù theå duy trì hoaït tính cuûa noù trong moät thôøi gian daøi hôn khi baûo quaûn trong nhöõng ñieàu kieän khaùc nhau, enzyme urease coá ñònh coù theå taùi söû duïng nhieàu laàn trong moät thôøi gian daøi. Keát quaû nghieân cöùu cuûa chuùng toâi cho thaáy vieäc öùng duïng enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan vaøo vieäc coá ñònh enzyme urease leân ñieän cöïc laø raát thuaän lôïi. 4.2. Kieán nghò Do haïn cheá veà maët thôøi gian neân trong phaàn nghieân cöùu cuûa chuùng toâi chöa khaûo saùt ñöôïc moät soá vaán ñeá lieân quan ñeán quaù trình coá ñònh enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan. Töø ñoù chuùng toâi ñöa ra moät soá kieán nghò sau: Nghieân cöùu caùc phöông phaùp laøm taêng hieäu suaát coá ñònh enzyme urease treân maøng chitosan. Khaûo saùt noàng ñoä urease toái thích cho coâng taùc coá ñònh. Nghieân cöùu vaø tieán haønh saûn xuaát ñieän cöïc sinh hoïc cuûa enzyme urease ôû qui moâ coâng nghieäp. Nghieân cöùu coá ñònh enzyme urease treân nhieàu loaïi chaát mang khaùc. ÖÙng duïng thöïc teá urease coá ñònh vaøo y hoïc, coâng ngheä sinh hoïc vaø sinh hoaït ñôøi soáng. TAØI LIEÄU THAM KHAÛO Nguyeãn Höõu Chaán. (1983). Enzyme vaø xuùc taùc sinh hoïc. NXB Y hoïc, Haø Noäi. Nguyeãn Thò Tuùy Ñoan. (2005). Nghieân cöùu thu nhaän urease töø ñaäu naønh. Luaän vaên ñaïi hoïc, Ñaïi hoïc baùch Khoa TP.HCM. Nguyeãn Thò Vieät Höông. (1999). Taùch chieát urease töø ñaäu naønh vaø öùng duïng ñeå xaùc ñònh urease trong beänh phaåm. Luaän vaên thaïc só ÑHKHTN TpHCM. Nguyeãn Ñöùc Löôïng. (2004). Coâng ngheä enzyme. NXB Ñaïi hoïc Quoác gia TP.HCM. Nguyeãn Tieán Thaéng. (1998). Giaùo trình sinh hoùa hieän ñaïi. NXB Giaùo duïc, Haø Noäi. Leâ Ngoïc Tuù. (2002). Hoùa Sinh Coâng Nghieäp. NXB Khoa hoïc vaø Kyõ thuaät, Haø Noäi. Nguyeãn Thò Caåm Vi. (2006). Nghieân cöùu thu nhaän, tinh saïch urease töø ñaäu naønh vaø xaùc ñònh caùc thoâng soá ñoäng hoïc cuûa enzyme urease. Luaän vaên thaïc só, Ñaïi hoïc baùch Khoa TP.HCM. A.A.Sedov, A.D.Virnik. (1977). Cellulose acetate fibre containing immobilized urease. J.Biol.Chem,4, 39-40. A.Anita, Sastry C.A. vaø Hashim M.A.. (1997). Immobilization of urease using Amberlite MB-1. Bioprocess Engineering, 17, 355-359. A.Anita, C.A.Sastry & M.A.Hashim. (1997). Urease immobilized on nylon: Preparation and properties. Biocatalysis and Biotransformation, 17, 141-145. A.A.Shul’ga, A.P.Soldatkin & A.V.El’skaya. (1994). Thin-film conductometric biosensors for glucose and urea determination. Biosensors & bioelectronics, 9, 217-223. A.P.Piedade, J.T.Guthrie and A.Kazlauciunas. (1995). Characterization of cellulose derivatives-relevance to sensor development. Cellulose , 2, 243-263. A.P.Soldatkin, V.Volotovsky, C.Martelet. (2000). Improvement of urease based biosensor characteristics using additional layers of charged polymers. Analytica Chimica Acta., 403, pp. 25-29. Aristippos Gennadios. et al. (2000). Protein-based films and coatings. International Book. Bailey James E., Ollis David F. (1986). Biochemical engineering fundamentals 2nd Edition, McGraw-Hill Book Company, United States of America, pp. 86-226. Baolong Liu, Renqi Hu. (1997). Studies on a potentiometric urea biosensor based on an ammonia electrode and urease, immobilized on aluminum oxide matrix. Analytica Chimica Acta., 341, pp. 161-169. Barbara Krajewska, Maciej Leszko & Wieslawa Zaborska. (1990). Urease immobilized on chitosan membrane: Preparation and properties. J.Chem.Tech.Biotechnol., 48, 337-350. Barbara Krajewska & Zofia Piwowarska. (2005). Free vs chitosan-immobilized urease: Microenvironmental effects on enzyme inhibitions. Biocatalysis and Biotransformation, 23, 225-232. Barbara Krajewska. (2000). Chitosan membrane-immobilized urease. Kinetic behavior in phosphate buffer in the pH range 5.76-8.19. Journal of Bioactive and compatible polymers, 15, 155-170. Barna Kovacs, Geza Nagy, Roland Dombi. (2003). Optical biosensor for urea with improved response time. Biosensors & Bioelectronics , 18, 111-118. Boris Lakard, Guillaume Herlem, Sophie Lakard. (2003). Urea potentiometric biosensor based on modified electrodes with urease immobilized on polyethylenimine films. Biosensors and Bioelectronics, 19, 1641-1648. B.D.Mac Craith et al. (1997). Optical chemical sensors based on sol-gel materials: Recent advances and critical issues. Journal of Sol-Gel Science and Technology, 8, 1053-1061. Catarina M.Silva et al. (2006). Microencapsulation of Hemoglobin in chitosan-coated alginate microspheres prepared by emulsifi cation/internal gelation. The AAPS Journal ,7 (4) Article 88, pp.903-914. Chirictian Eppelsheim, Ralph Aubeck. (1995). Comparison of potentiometric enzyme sensors for urea and penicilline-G: differential thick-film sensors versus classical electrodes. Journal of Membrane Science, 100, 131-137. Christine Stamm, Kurt Seiler and Wilhelm Simon. (1993). Enzymatic biosensor for urea based on an ammonium ion-selective bulk optode membrane. Analytica Chimica Acta., 282, 229-237. Claudio Airoldi, Oyrton A.C.Monteiro Junior. (2003). Copper adsorption and enzyme immobilization on organosilane-glutaraldehyde hybrids as support. Polymer bulletin, 50, 61-68 . Cristian Follmer, Rafael Real Guarra, German E.Wasserman. (2004). Jackbean, soybean and Bacillus pasteurii ureases, J.Biochem., 271, 1357-1363 C.M.Lai and M.A.Tabatabai. (1992). Kinetic parameters of immobilized urease. Soil Biol. Biochem., 24, 225-228. Deborah D.McCoy, Robert P.Hausinger. (1991). Characterization of urease from Sporosarcina ureae. Arch Microbiol., 157, 411-416. Dezhong Liu et al. (1996). Study on the urease activity in different plant see