Luận văn Thu nhận Enzym Papain để ứng dụng vào phản ứng thủy phân Protein trong bánh dầu đậu phộng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM THU NHẬN ENZYM PAPAIN ĐỂ ỨNG DỤNG VÀO PHẢN ỨNG THỦY PHÂN PROTEIN TRONG BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG CHUYÊN NGÀNH: HĨA HỮU CƠ MÃ SỐ: 604427 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS. TRẦN KIM QUI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2009 LỜI CẢM ƠN  Để hồn thành chƣơng trình cao học và luận văn này, em đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn, giúp đỡ và gĩp ý nhiệt tình của quý thầy cơ khoa Hĩa trƣờng Đại Học Khoa Học Tự Nhiên. Trƣớc hết, em xin chân thành cảm ơn đến quý thầy cơ khoa Hĩa trƣờng Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TpHCM, đặc biệt là những thầy cơ đã tận tình dạy bảo cho em trong suốt thời gian học tập tại trƣờng. Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến GS.TS. Trần Kim Qui, TS. Lê Việt Tiến đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hƣớng dẫn nghiên cứu và giúp em hồn thành luận văn này. Nhân đây, em cũng xin chân thành cảm ơn các anh chị nghiên cứu sinh đã động viên và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình hồn thành luận văn. Em xin chân thành cảm ơn anh Hồ Anh Vũ, anh luơn động viên và đồng hành cùng em trong suốt thời gian học tập cũng nhƣ thời gian em thực hiện luận văn này. Cuối cùng con xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành đến gia đình đã cho con cĩ đƣợc thành quả nhƣ ngày hơm nay. Mặc dù đã cĩ nhiều cố gắng để hồn thiện luận văn bằng tất cả sự nhiệt tình và năng lực của mình, tuy nhiên khơng thể tránh khỏi những thiếu sĩt, rất mong nhận đƣợc những ý kiến đĩng gĩp quý báu của quý thầy cơ và các bạn. Tp.HCM – Ngày 12 tháng 09 năm 2009 MỤC LỤC MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 Chương 1 TỔNG QUAN ................................................................................... 2 1.1 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN ...................................................... 2 1.1.1 Cysteine protease ................................................................................. 2 1.1.2 Papain .................................................................................................... 2 1.1.2.1 Nguồn gốc ....................................................................................... 2 1.1.2.1.1. Giới thiệu về cây đu đủ. .......................................................... 3 1.1.2.1.2. Phân bố sinh thái của cây đu đủ. ............................................ 4 1.1.2.1.3. Hoạt tính sinh học và cơng dụng của một số chất cĩ trong cây đu đủ ................................................................................................. 4 1.1.2.2 Tính chất của papain ..................................................................... 5 1.1.2.2.1 Tính chất vật lý ......................................................................... 5 1.1.2.2.2 Tính chất hĩa học ..................................................................... 5 a) Cấu tạo hĩa học ........................................................................... 5 b) Cấu trúc khơng gian ..................................................................... 6 c) Cấu trúc tâm hoạt động của papain ............................................. 7 d) Phản ứng của papain ................................................................... 7 e. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain ................ 9 1.1.2.3 Ứng dụng của enzyme papain ................................................. 10 1.1.2.3.1 Trong y học: ....................................................................... 10 1.1.2.3.2 Trong cơng nghiệp thực phẩm: .......................................... 10 1.1.2.3.3 Trong các ngành cơng nghiệp khác: .................................. 10 1.2 THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG ................ 10 1.3 PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG ........................... 12 1.3.1 Khái niệm phản ứng thủy phân ............................................................ 12 1.3.2 Quy trình thực hiện phản ứng thủy phân ............................................ 13 1.3.3 Các thay đổi hĩa sinh trong quá trình thủy phân: ............................. 14 1.3.4 Tính chất của sản phẩm sau thủy phân ............................................... 14 1.3.5 Ƣu và nhƣợc điểm của phản ứng thủy phân: ...................................... 15 1.3.5.1 Ƣu điểm: ........................................................................................... 15 1.3.5.2 Nhƣợc điểm: ..................................................................................... 15 1.4 ỨNG DỤNG ENZYME PAPAIN LÀM XÚC TÁC CHO PHẢN ỨNG THỦY PHÂN PROTEIN TRONG BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG .................... 15 Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ........................................................ 17 2.1. HĨA CHẤT VÀ THIẾT BỊ ........................................................................ 17 2.1.1. Hĩa chất ................................................................................................. 17 2.1.2. Thiết bị ................................................................................................... 18 2.2 PHƢƠNG PHÁP THỰC HIỆN ................................................................... 18 2.2.1 Phƣơng pháp trích nhựa đu đủ từ trái................................................. 18 2.2.2 Phƣơng pháp thu nhận papain tinh khiết ............................................ 19 2.2.2.1 Loại bỏ các chất khơng tan ở pH 9. ................................................ 20 2.2.2.2 Quá trình phân đoạn bằng amonium sulfate ................................. 20 2.2.2.3 Quá trình phân đoạn bằng NaCl ..................................................... 20 2.2.2.4 Kết tinh .............................................................................................. 20 2.2.2.5 Tái kết tinh ........................................................................................ 21 2.2.2.6 Đơng khơ chân khơng. ..................................................................... 21 2.2.3 Xác định lƣợng protein theo phƣơng pháp Lowry ............................. 22 2.2.4 Xác định hoạt tính protein theo phƣơng pháp Anson ........................ 23 2.2.5 Xác định đạm tổng số theo phƣơng pháp Kjeldahl ............................ 24 2.2.5.1 Nguyên tắc: ...................................................................................... 24 2.2.5.2 Cách tính: ......................................................................................... 24 2.2.6 Phƣơng pháp xác định đạm formol (phƣơng pháp Sorensen) .......... 25 2.2.6.1 Nguyên tắc........................................................................................ 25 2.2.6.2 Tiến hành ......................................................................................... 25 2.2.6.3 Cách tính .......................................................................................... 26 2.2.7 Xác định đạm amoniac .......................................................................... 26 2.2.7.1 Nguyên tắc........................................................................................ 26 2.2.7.2 Tiến hành ......................................................................................... 27 2.2.7.3 Cách tính .......................................................................................... 27 2.2.8 Phƣơng pháp chung tiến hành phản ứng thủy phân bánh dầu đậu phộng với xúc tác papain thơ. ........................................................................ 27 2.2.8.1 Phƣơng pháp loại béo: .................................................................... 27 2.2.8.2 Phƣơng pháp thực hiện phản ứng ................................................. 27 2.2.8.3 Hiệu suất thủy phân ........................................................................ 28 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 30 3.1 KHẢO SÁT LƢỢNG NHỰA Ở QUẢ ĐU ĐỦ ........................................... 30 3.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SƠ CHẾ NHỰA TƢƠI ..................................... 30 3.3 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN THU NHẬN PAPAIN TỪ NHỰA KHƠ ....... 31 3.4 PHƢƠNG PHÁP LOWRY XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG PROTEIN ....... 33 3.5 PHƢƠNG PHÁP ANSON XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PROTEASE ........ 34 3.6 KHẢO SÁT LƢỢNG ENZYME THU ĐƢỢC SAU CÁC GIAI ĐOẠN TINH CHẾ. .......................................................................................................... 35 3.7 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CỦA ENZYME SAU CÁC GIAI ĐOẠN TINH CHẾ ........................................................................................................... 37 3.8 KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI LƢỢNG PROTEIN TRONG CÁC CHẾ PHẨM PROTEASE THU ĐƢỢC THEO THỜI GIAN .................................. 39 3.9 KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI HOẠT TÍNH CỦA CÁC CHẾ PHẨM THEO THỜI GIAN. ........................................................................................... 41 3.10 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME PAPAIN. ............................................................................................ 44 3.10.1. Khảo sát ảnh hƣởng của pH ............................................................... 44 3.10.2 Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ ....................................................... 45 3.11 KHẢO SÁT HÀM LƢỢNG ĐẠM FORMOL VÀ AMONIAC THEO THỜI GIAN TRONG PHẢN ỨNG THỦY PHÂN. ......................................... 46 3.12 KHẢO SÁT PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG VỚI XÚC TÁC PAPAIN THƠ. ......................................................................... 49 3.12.1. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.25% so với cơ chất theo thời gian............................................................................ 50 3.12.2. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.50% so với cơ chất theo thời gian............................................................................ 57 3.12.3. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.75% so với cơ chất .................................................................................................... 65 3.12.4. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 1.00% so với cơ chất .................................................................................................... 72 KẾT LUẬN .............................................................................................................. 80 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 81 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tính chất vật lý của papain .......................................................................... 5 Bảng 1.2 Thành phần hĩa học của hạt đậu phộng .................................................... 10 Bảng 1.3. Thành phần acid béo trong bánh dầu đậu phộng ...................................... 11 Bảng 1.4 Thành phần hĩa học của bã đậu phộng đã loại béo ................................... 11 Bảng 1.5. Thành phần amino acid trong đậu phộng ................................................. 11 Bảng 3.1. Hàm lượng phần trăm của nhựa đu đủ trong các loại quả khác nhau. ..... 30 Bảng 3.2. Các phương pháp làm khơ nhựa đu đủ ..................................................... 30 Bảng 3.3. Mật độ quang của albumin ở bước sĩng 750nm ...................................... 33 Bảng 3.4. Mật độ quang của tyrosin ở bước sĩng 720nm ........................................ 34 Bảng 3.5. Lượng protein thu được ở các phân đoạn tinh chế khác nhau. ................. 36 Bảng 3.6. Hoạt tính protease của enzyme sau các giai đoạn tinh chế ....................... 38 Bảng 3.7. Hàm lượng protein của các chế phẩm theo thời gian .............................. 40 Bảng 3.8. Hoạt tính protein của các chế phẩm theo thời gian .................................. 42 Bảng 3.9. Hoạt tính của protein P(UI) biến đổi theo pH ......................................... 44 Bảng 3.10. Hoạt tính của protein P(UI) trong nhựa khơ biến đổi theo nhiệt độ ...... 45 Bảng 3.11: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 0.25% so với cơ chất. ........................................................................................................... 47 Bảng 3.12: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 0.50% so với cơ chất. ........................................................................................................... 47 Bảng 3.13: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 1.00% so với cơ chất. ........................................................................................................... 47 Bảng 3.14: Biến thiên hàm lượng đạm amoniac ở các nồng độ enzyme khác nhau 48 Bảng 3.15. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% ..... 51 Bảng 3.16. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% ..... 51 Bảng 3.17. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% ..... 52 Bảng 3.18. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% ..... 53 Bảng 3.19. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% ..... 53 Bảng 3.20. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% ..... 54 3.11 KHẢO SÁT HÀM LƢỢNG ĐẠM FORMOL VÀ AMONIAC THEO THỜI GIAN TRONG PHẢN ỨNG THỦY PHÂN. ......................................... 46 3.12 KHẢO SÁT PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG VỚI XÚC TÁC PAPAIN THƠ. ......................................................................... 49 3.12.1. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.25% so với cơ chất theo thời gian............................................................................ 50 3.12.2. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.50% so với cơ chất theo thời gian............................................................................ 57 3.12.3. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.75% so với cơ chất .................................................................................................... 65 3.12.4. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 1.00% so với cơ chất .................................................................................................... 72 KẾT LUẬN .............................................................................................................. 80 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 81 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tính chất vật lý của papain .......................................................................... 5 Bảng 1.2 Thành phần hĩa học của hạt đậu phộng .................................................... 10 Bảng 1.3. Thành phần acid béo trong bánh dầu đậu phộng ...................................... 11 Bảng 1.4 Thành phần hĩa học của bã đậu phộng đã loại béo ................................... 11 Bảng 1.5. Thành phần amino acid trong đậu phộng ................................................. 11 Bảng 3.1. Hàm lượng phần trăm của nhựa đu đủ trong các loại quả khác nhau. ..... 30 Bảng 3.2. Các phương pháp làm khơ nhựa đu đủ ..................................................... 30 Bảng 3.3. Mật độ quang của albumin ở bước sĩng 750nm ...................................... 33 Bảng 3.4. Mật độ quang của tyrosin ở bước sĩng 720nm ........................................ 34 Bảng 3.5. Lượng protein thu được ở các phân đoạn tinh chế khác nhau. ................. 36 Bảng 3.6. Hoạt tính protease của enzyme sau các giai đoạn tinh chế ....................... 38 Bảng 3.7. Hàm lượng protein của các chế phẩm theo thời gian .............................. 40 Bảng 3.8. Hoạt tính protein của các chế phẩm theo thời gian .................................. 42 Bảng 3.9. Hoạt tính của protein P(UI) biến đổi theo pH ......................................... 44 Bảng 3.10. Hoạt tính của protein P(UI) trong nhựa khơ biến đổi theo nhiệt độ ...... 45 Bảng 3.11: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 0.25% so với cơ chất. ........................................................................................................... 47 Bảng 3.12: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 0.50% so với cơ chất. ........................................................................................................... 47 Bảng 3.13: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 1.00% so với cơ chất. ........................................................................................................... 47 Bảng 3.14: Biến thiên hàm lượng đạm amoniac ở các nồng độ enzyme khác nhau 48 Bảng 3.15. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% ..... 51 Bảng 3.16. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% ..... 51 Bảng 3.17. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% ..... 52 Bảng 3.18. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% ..... 53 Bảng 3.19. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% ..... 53 Bảng 3.20. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% ..... 54 Bảng 3.21. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% ..... 55 Bảng 3.22. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% ..... 56 Bảng 3.23. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% ..... 56 Bảng 3.24. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% ..... 58 Bảng 3.25. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% ..... 59 Bảng 3.26. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% ..... 59 Bảng 3.27. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% ..... 60 Bảng 3.28. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% ..... 61 Bảng 3.29. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% ..... 61 Bảng 3.30. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% ..... 62 Bảng 3.31. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% ..... 63 Bảng 3.32. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% ..... 63 Bảng 3.33. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% ..... 65 Bảng 3.34. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% ..... 66 Bảng 3.35. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% ..... 66 Bảng 3.36. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% ..... 68 Bảng 3.37. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% ..... 68 Bảng 3.38. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% ..... 69 Bảng 3.39. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% ..... 70 Bảng 3.40. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% ..... 70 Bảng 3.41. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% ..... 71 Bảng 3.42. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% ..... 72 Bảng 3.43. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% ..... 73 Bảng 3.44. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% ..... 74 Bảng 3.45. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% ..... 75 Bảng 3.46. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% ..... 75 Bảng 3.47. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% ..... 76 Bảng 3.48. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% ..... 77 Bảng 3.49. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% ..... 77 Bảng 3.50. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% ..... 78 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 2.1. Các loại hoa và trái của cây đu đủ. ............................................................. 3 Hình 1.2 Cấu trúc bậc 3 của papain ............................................................................ 6 Hình 1.3 Cấu trúc tâm hoạt động của papain .............................................................. 7 Hình 1.4. Phản ứng hĩa học của papain ...................................................................... 8 Hình 1.8. Sơ đồ phản ứng thủy phân......................................................................... 13 Hình 2.1 Cách lấy nhựa đu đủ ................................................................................... 19 Hình 2.2 Sơ đồ thu nhận papain từ nhựa đu đủ đơng khơ......................................... 21 Hình 3.1a. Điện di đồ của nhựa khơ ở trái non sơ chế bằng dung mơi etanol ......... 31 Hình 3.1 b. Điện di đồ của chế phẩm Merk và papain tinh chế từ nhựa đu đủ đơng khơ. ............................................................................................................................ 32 Hình 3.2. Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ albumin. ..................................................................................................................... 33 Hình 3.3. Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ tyrosin. ....................................................................................................................... 34 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự biến thiên lượng protein sau mỗi giai đoạn tinh chế. . 36 Hình 3.5. Sự biến thiên hoạt tính của protein sau các giai đoạn tinh chế. ................ 39 Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lượng protein theo thời gian ............. 40 Hình 3.7. Sự biến đổi hoạt tính của các chế phẩm theo thời gian ............................. 42 Hình 3.8 Hoạt tính của protein P(UI/ml) trong nhựa khơ biến đổi theo pH ............. 44 Hình 3.9:Hoạt tính của protein trong nhựa khơ theo nhiệt độ .................................. 46 Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian phản ứng. ................................................................................................................... 48 Hình 3.11. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 6.0 và hàm lượng xúc tác là 0.25%. ............................................................................................. 52 Hình 3.12. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 7.0 và hàm lượng xúc tác là 0.25%. ............................................................................................. 55 Hình 3.13. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 8.0 và hàm lượng xúc tác là 0.25%. ............................................................................................. 57 Hình 3.14. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 6.0 và hàm lượng xúc tác là 0.50%. ............................................................................................. 60 Hình 3.15. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 7.0 và hàm lượng xúc tác là 0.50%. ............................................................................................. 62 Hình 3.16. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 8.0 và hàm lượng xúc tác là 0.50%. ............................................................................................. 64 Hình 3.17. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 6.0 và hàm lượng xúc tác là 0.75%. ............................................................................................. 67 Tại pH 7.0, hiệu suất phản ứng ở mỗi nhiệt độ khác nhau được trình bày trong bảng 3.36 – 3.38. ................................................................................................................ 67 Hình 3.18. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 7.0 và hàm lượng xúc tác là 0.75%. ............................................................................................. 69 Hình 3.19. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 8.0 và hàm lượng xúc tác là 0.75%. ............................................................................................. 71 Hình 3.20. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 6.0 và hàm lượng xúc tác là 1.00%. ............................................................................................. 74 Hình 3.21. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 7.0 và hàm lượng xúc tác là 1.00%. ............................................................................................. 76 Hình 3.22. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 8.0 và hàm lượng xúc tác là 1.00%. ............................................................................................. 78 Hình 3.23 Kết quả điện di của dung dịch sau phản ứng ở các hàm lượng xúc tác khác nhau................................................................................................................... 79 1 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM MỞ ĐẦU Hiện nay vấn đề vệ sinh an tồn thực phẩm và ơ nhiễm mơi trường đang là vấn đề được quan tâm hàng đầu. Trong quá trình sản xuất nước chấm cĩ hàm lượng đạm cao, người ta thường dùng các phương pháp thủy phân protein tạo thành các dung dịch amino acid. Cĩ 3 phương pháp tiến hành phản ứng thủy phân protein: Phương pháp hĩa học: thủy phân protein với xúc tác acid, thời gian tiến hành phản ứng là 24 giờ. Nhược điểm của phương pháp này là tạo thành sản phẩm phụ 3- MCPD, một chất độc gây ung thư. Phương pháp dùng men vi sinh: sử dụng chủng nấm Aspergillus oryzae để xúc tác phản ứng thủy phân protein. Nhược điểm của phương pháp này là thời gian thực hiện phản ứng khá dài khoảng từ 6 – 8 tháng. Phương pháp hĩa sinh: sử dụng xúc tác là các enzyme protease cĩ nguồn gốc động thực vật làm xúc tác. Phương pháp này cĩ thời gian phản ứng ngắn và khơng tạo sản phẩm phụ cĩ khả năng gây ung thư. Các phản ứng sử dụng xúc tác enzyme được ứng dụng rất rộng rãi trong lĩnh vực này vì chúng khơng những cho hiệu suất cao mà thời gian thực hiện phản ứng cũng ngắn hơn so với phản ứng được tiến hành theo phương pháp cổ điển. Hơn nữa các enzyme thường được phân bố rất rộng rãi trong tất cả các mơ, cơ quan động vật và thực vật, tế bào vi sinh vật nên tương đối dễ tìm. Trong phạm vi luận văn này chúng tơi sẽ tiến hành thu nhận enzyme papain cĩ trong nhựa đu đủ và ứng dụng tính chất thủy phân protein của enzyme papain để làm xúc tác cho phản ứng thủy phân protein trong bánh dầu đậu phộng đã được ép lấy dầu. Chúng tơi chọn enzyme papain vì đây là enzyme cĩ hoạt tính protease cao, hiện diện nhiều trong nhựa trái đu đủ, một loại cây được trồng rất phổ biến ở nước ta. 2 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN 1.1.1 Cysteine protease [8, 9, 19, 34, 43] Cysteine proteases (EC.3.4.22) là nhĩm các protein cĩ trọng lượng phân tử trong khoảng 21-30 kDa, các protein này cĩ khả năng xúc tác để thủy phân các loại liên kết: peptide, amide, ester thiol. Đây cũng là những enzyme cĩ nhĩm –SH trong tâm hoạt động. Người ta đã tìm thấy hơn 20 họ cysteine proteases (Barrett, 1994) và nhiều enzyme trong số này (papain, bromelain, ficain, animal cathepsins) được ứng dụng rộng rãi trong cơng nghiệp. Cĩ hai loại cysteine proteases là exopeptidase (cathepsin X, carboxypeptidase B) và endopeptidases (bromelain, ficain, cathepsin...). Exopeptidase thủy phân liên kết peptide ở đầu N hoặc đầu C tự do trong khi đĩ endopeptidase cắt đứt các liên kết peptide ở giữa chuỗi polypeptide. 1.1.2 Papain 1.1.2.1 Nguồn gốc[2,17, 19, 32 ] Papain (EC 3.4.22.3) là cysteine protease được biết đến nhiều nhất và được phân lập lần đầu tiên vào năm 1879 từ nhựa trái đu đủ (Carica papaya). Đây cũng là enzyme đầu tiên được xác định cấu trúc tinh thể (Drenth et al., 1968; Kamphuis et al., 1894). Trong nhựa đu đủ ngồi enzyme papain cịn cĩ các loại protease khác như chymopapain, caricain, glycyl endopeptidase và một số enzyme khác (Baines and Brock-lehurst, 1979). Nhựa đu đủ cĩ hàm lượng và hoạt tính papain cao nhất tập trung ở vùng cĩ nắng nĩng và độ ẩm ổn định quanh năm. 3 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 1.1.2.1.1. Giới thiệu về cây đu đủ.[7, 8, 41] A: hoa cái B: hoa lưỡng tính C: hoa đực D: trái của cây cái E: trái lưỡng tính F: cây đực Hình 2.1. Các loại hoa và trái của cây đu đủ. Tên khoa học: Carica papaya L., thuộc họ đu đủ - Caricaceae Cây đu đủ cịn được gọi thù đủ ở Huế, phiên mộc, cà lào, phiên qua, phan qua thụ, lơ hong phlê (Campuchia), mắc hung (Lào), má hống (Thái). Đu đủ thường là cây đồng chu, nhưng đu đủ cĩ thể xếp thành 3 loại trên phương diện giới tính: cây đực, cây lưỡng tính và cây cái. Vài cây đu đủ cũng cĩ thể trổ cả ba loại hoa nĩi trên. Ngồi ra cũng cĩ cây ra hoa khơng hẳn hồn tồn đực, cái hay lưỡng tính mà lại pha lẫn nhiều ít đặc tính của ba loại hoa. Khuynh hướng thay đổi giới tính phần lớn do thời tiết gây ra tỉ như khơ hạn và thay đổi nhiệt độ. 4 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 1.1.2.1.2. Phân bố sinh thái của cây đu đủ.[7, 26, 33] Chi Carica L. cĩ nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Mỹ. Ở vùng núi cao (1500-3000m), từ Panama đến Bolivia, cây đu đủ trồng hiện nay rất cĩ thể là giống lai tự nhiên của lồi C. peltata Hook & Ann. Vào khoảng thế kỷ 16, người Tây Ban Nha đã đưa đu đủ vào trồng ở vùng Caribê và một số nước Đơng Nam Á. Từ các địa điểm này, cây tiếp tục được trồng rộng rãi ở Ấn Độ, Srilanca, châu Đại Dương và châu Phi. 1.1.2.1.3. Hoạt tính sinh học và cơng dụng của một số chất cĩ trong cây đu đủ [8,41, 45] 1. Nhựa đu đủ cĩ thể gây viêm da. 2. Ở Trung Mỹ, trong dân gian, người ta sử dụng đu đủ để điều trị bệnh lỵ amip (Entamoeba histolytica), một loại ký sinh trùng gây tiêu chảy dạng lỵ và biến chứng áp- xe gan. 3. Ở Samoa, người dân dùng phần dưới vỏ thân cây đu đủ để chữa chứng nhức răng. 4. Nhựa đu đủ cĩ chứa papain, là một trong hai loại men tiêu hủy protein (proteolytic enzymes) cĩ tác dụng làm mềm thịt bắp. Chính do tác dụng này, khi dùng đu đủ hầm chung với thịt, thịt sẽ mềm hơn. Người dân vùng Ca-ri-bê, Trung Mỹ cho biết họ cĩ thể dùng khẩu phần với số lượng lớn thịt cá nhưng vẫn khơng hề gì nếu ăn đu đủ xanh sau đĩ. 5. Phần cơm đu đủ là thành phần chính của các loại mỹ phẩm như kem nền (mặt), kem đánh răng, xà bơng gội đầu. 6. Các ứng dụng quan trọng trong y học của nhựa đu đủ là chiết xuất papain để dùng trong phẫu thuật cột sống (là một loại "dao phẫu thuật tự nhiên" để mở đĩa đệm). Nghiên cứu cho thấy chiết xuất papain cĩ hoạt tính kháng sinh (antibiotic activity) với tác dụng chống vi khuẩn gram dương (gram-positive bacteria). Nĩ cịn được dùng để điều trị lở loét, làm tiêu giả mạc trong bệnh bạch hầu, chống kết dính sau phẫu thuật, làm thuốc giúp tiêu hĩa. Trong cơng nghiệp, papain được dùng để 5 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM tinh chế bia; xử lý len và lụa trước khi nhuộm; là phụ gia trong cơng nghệ chế biến cao su; khi tinh chế dầu gan cá tuna, người ta tiêm papain vào gan trước khi chiết xuất, làm cho thành phẩm giàu Vitamin A và D hơn. Khoảng 1,500 quả đu đủ xanh cỡ vừa cho được khoảng 650g papain. 1.1.2.2 Tính chất của papain[8] 1.1.2.2.1 Tính chất vật lý Bảng 1.1 Tính chất vật lý của papain Tính chất vật lý Giá trị Điểm đẳng điện pI = 8.75 Hằng số sa lắng S20 2.42 ± 0.04 Hằng số phân tán D20 (10 -7 giây.cm 2 ) 10.27 ± 0.13 Phân tử lượng 20,700 Độ triền quang [] D 20 -66.7 o Độ xoắn 17% Vịng hiệu ứng cotton 290nm Thể tích riêng phần V(mL/g) 0.724 Trị số ma sát f/fo 1.16 Bột màu vàng hay màu nâu nhạt, tùy thuộc phương pháp sấy, khơng tan trong hầu hết các chất hữu cơ nhưng tan một phần trong H2O hay glycerine. Bền nhiệt. 1.1.2.2.2 Tính chất hĩa học[8, 34] a) Cấu tạo hĩa học Theo kết quả phân tích bằng tia X, phân tử papain được cấu tạo bởi 212 acid amin trong đĩ khơng cĩ chứa methionine. Phân tử lượng khoảng 23,350 Da, phân tử là một mạch polypeptide với đầu N là isoleucine, đầu C là asparagine, cĩ 6 gốc cysteine tạo thành 3 cầu disulfur ở các vị trí 22-63, 56-95, 153-200 khơng cĩ chức năng sinh học, chỉ làm tăng tính bền vững của cấu trúc và một nhĩm –SH tự do ở vị trí 25. 6 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM b) Cấu trúc khơng gian Phân tử papain cĩ dạng hình cầu với kích thước 36x48x36Ao và mạch chính bị gấp thành hai phần riêng biệt bởi một khe. Trung tâm hoạt động nằm tại bề mặt của khe này, nhĩm -SH hoạt động của cysteine 25 nằm bên trái khe và nhĩm histidine 159 nằm bên phải khe. Phần xoắn  chiếm 20% tồn bộ các amino acid cĩ trong phân tử. Hình 1.2 Cấu trúc bậc 3 của papain Hoạt tính của papain dựa trên hai tâm hoạt động là Cys25 và His159. Khoảng pH hoạt động của papain khá rộng (3.5 – 8.0) tùy thuộc vào cơ chất. Khi cơ chất là casein thì hoạt tính tối ưu của papain trong vùng pH từ 5.7 – 7.0 và nhiệt độ thích hợp là 50 – 57OC. 7 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM c) Cấu trúc tâm hoạt động của papain Tâm hoạt động của papain gồm cĩ nhĩm –SH của cysteine 25 và nitrogen bậc 3 của histidine 159. Bên cạnh đĩ nhĩm imidazole của His 159 cũng liên kết với Asp 175 bởi liên kết hydrogen. Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các amino acid là: Lys-Asp-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys. Theo các nghiên cứu của Lowe, chuỗi polypeptide trong trung tâm hoạt động của papain gần giống như của ficin hay trypsin, mặc dù chúng cĩ nguồn gốc khác nhau. Ficin: Arg-Glu-Glu-Gly-Glu-Cys-Gly-Ser-Cys. Trypsin: Lys-Asp-Ser-Cys-Glu-Gly-Gly-Asp-Ser. Hình 1.3 Cấu trúc tâm hoạt động của papain d) Phản ứng của papain [21, 22, 23, 35] Papain thủy phân protein thành các polypeptide và các acid amin, nĩ đĩng vai trị vừa như endopeptidase vừa như exopeptidase. 8 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM S NH HN R' NH C O R Cys 25 S NH N Cys 25 C R O R' NH2 His159 His159 S NH HN Cys 25 His159 RCO-NHR' S NH N Cys 25 C R O His159 O H H S NH HN OH C O R Cys 25 His159 Thủy phân RCOOH S - acyl hóa H2O R'NH2 Đề acyl hóa Liên kết với chất nền Papain + R- SHS-S-CH3 Papain SH + R-S-S-CH3 C O HNHC (CH2)3 NH C C O NO2 NH2 + NH2 Cl Papain SH C O HNHC (CH2)3 NH C C O NH2 + NH2 OH3 + NH2 NO2 Cl Không hoạt động Hoạt động Không màu Có màu Hình 1.4. Phản ứng hĩa học của papain 9 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM e. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain[8, 6, 38]  Nhiệt độ: Papain là enzyme chịu được nhiệt độ tương đối cao. Ở dạng nhựa khơ papain khơng bị biến tính trong 3 giờ ở 100oC. Cịn ở dạng dung dịch papain bị mất hoạt tính sau 30 phút ở 82.5oC và nếu nhiệt độ tăng cao hơn (>100oC) thì nĩ sẽ bị mất hồn tồn hoạt tính kể cả khi thêm lượng lớn chất hoạt hĩa vào dung dịch. Điều này là do ở dạng dung dịch khi tăng lên đến nhiệt độ lớn hơn 100oC thì cấu trúc tâm hoạt động của papain bị phá hủy hồn tồn. Điều đáng lưu ý là sau khi đã được tinh sạch và ở trạng thái tinh thể thì papain cĩ độ bền nhiệt thấp hơn papain ở trong nhựa, do trong nhựa cịn chứa các protein khác cĩ tác dụng bảo vệ papain. Papain trong dung dịch NaCl giữ ở 4oC bền trong nhiều tháng. Trong dung dịch dẫn xuất thủy ngân, papain cũng khơng mất hoạt tính trong nhiều tháng. Trong khi đĩ hầu hết các enzyme mất hoạt tính mỗi ngày 1-2% do sự phân hủy hoặc oxy hĩa. Khi thủy phân các protein khác nhau, thì tùy thuộc vào cơ chất mà nhiệt độ thích hợp cho papain cũng khác nhau chẳng hạn đối với cơ chất là casein thì nhiệt độ tối ưu cho phản ứng là 37oC. Papain dạng ổn định ở trạng thái khơ cĩ thể chịu nhiệt độ sấy ở 115oC trong thời gian 2 giờ mà hoạt tính vẫn duy trì được 90%.  pH: Papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4.5-8.5 nhưng lại dễ biến tính trong mơi trường acid cĩ pH < 4.5 hoặc trong mơi trường kiềm mạnh cĩ pH > 12. Khi phản ứng với cơ chất thì tùy thuộc vào bản chất của cơ chất mà pH tối ưu sẽ khác nhau. Chẳng hạn, papain phản ứng với casein ở pH tối ưu là 7-7.5. Papain dạng ổn định tức là dạng mà cấu trúc khơng gian của enzyme được ổn định, cĩ thể chịu được các pH = 1.5 và pH = 8.5 trong 90 phút.  Dung mơi: Papain khơng thay đổi độ quay quang học trong dung mơi là methanol 70% và khơng thay đổi độ nhớt trong dung mơi methanol 50%. Trong dung dịch dimethylsulfoxide chứa 20% dung mơi hữu cơ và urea 8M khơng làm giảm hoạt tính cũng như thay đổi cấu hình của papain. Các chất gây biến tính mạnh 10 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM như TCA 10%, guanidine hydrochloride 6M làm biến đổi bất thuận nghịch về độ quay quang học và hoạt tính của papain. 1.1.2.3 Ứng dụng của enzyme papain[7, 8, 25, 29, 46] 1.1.2.3.1 Trong y học: Papain được dùng làm thuốc chống giun sán, ăn khơng tiêu, chống biếng ăn,… papain cịn dùng làm thuốc rửa ráy tai, dùng trong phẫu thuật. Papain cĩ tác dụng lên hệ mạch dùng trị bệnh bạch cầu, viêm họng… 1.1.2.3.2 Trong cơng nghiệp thực phẩm: Papain được dùng để làm mềm thịt, dùng để thủy phân gan cá ngừ làm thuốc bổ. Papain cịn được dùng trong sản xuất bia vì nĩ giúp tiêu hĩa các protein cịn hịa tan trong bia. 1.1.2.3.3 Trong các ngành cơng nghiệp khác: Papain được dùng làm mềm da trong ngành cơng nghiệp thuộc da, dùng tẩy các vết máu trên quần áo. Trong cơng nghiệp mỹ phẩm, papain được dùng để tẩy các vết nám, tàn nhang trên da. 1.2 THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG Đậu phộng cĩ hàm lượng lipid cao nên thường được dùng để ép dầu. Đậu phộng sau khi ép lấy dầu được gọi là bánh dầu phộng. Theo tài liệu cơng bố, trung bình trong hạt đậu phộng cĩ thành phần như bảng 1.2: Bảng 1.2 Thành phần hĩa học của hạt đậu phộng Thành phần Hàm lượng (%) Protein 20 – 34 Lipid 40 – 60 Hydrat carbon 6.0 – 22 Xenlulo 2.0 – 4.5 Tro 1.8 – 4.6 Trong protein của đậu phộng thì glubumin cĩ hàm lượng cao nhất chiếm khoảng 97%, ngồi ra cịn cĩ một số hàm lượng khơng đáng kể albumin, prolamin, glutein. 11 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Trong lipid của đậu phộng cĩ hai loại acid béo no và khơng no với hàm lượng tính theo phần trăm như bảng 1.3: Bảng 1.3. Thành phần acid béo trong bánh dầu đậu phộng Tên acid béo Khơng no (%) No (%) Oleic 50 – 70 6 - 11 Linoleic 13 – 26 2 – 6 Linolenoic 13 – 26 5 – 7 Bánh đậu phộng đã tách dầu cĩ thành phần theo bảng 1.4: Bảng 1.4 Thành phần hĩa học của bã đậu phộng đã loại béo Thành phần Hàm lượng (%) Protein 48 Acid amin 12.7 Hydrat carbon 26.5 Lipid 8.0 Tro 4.8 Hàm lượng acid amin bao gồm các acid amin cơ bản theo bảng 1.5 : Bảng 1.5. Thành phần acid amin trong đậu phộng Tên cấu tử Hàm lượng (%) Tryptophan 0.5 Leucin 3.5 Isoleucin 1.5 Valin 1.65 Threonin 0.75 Lysin 1.5 Methionin 0.6 Phenylalanin 2.7 12 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 1.3 PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG 1.3.1 Khái niệm phản ứng thủy phân[13, 14, 15] Phản ứng thủy phân là phản ứng phân hủy các chất cĩ sự tham gia của nước. Phản ứng thủy phân là phản ứng quan trọng trong các ngành cơng nghiệp, đặc biệt là trong cơng nghiệp thực phẩm. Người ta ứng dụng phản ứng thủy phân trong cơng nghiệp thực phẩm để sản xuất ra hàng loạt sản phẩm mới khác xa với tính chất của nguyên liệu ban đầu về tính cảm quan, về tính dinh dưỡng của sản phẩm. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp phản ứng thủy phân cĩ hại cho các sản phẩm thực phẩm trong quá trình bảo quản. Phương trình tổng quát của phản ứng thủy phân R1R2 + H2O Enzym (H+, HO-) R1OH + R2H Các tác nhân làm xúc tác cho phản ứng thủy phân thường là các acid, base hay các enzyme hydrolase trong đĩ đặc biệt được ứng dụng rộng rãi là các enzyme cĩ nguồn gốc vi sinh vật và thực vật. Trong phản ứng thủy phân cĩ sự tham gia của một lượng nước rất lớn do đĩ tốc độ của phản ứng thủy phân chỉ tùy thuộc vào nồng độ của cơ chất. Như vậy, phản ứng thủy phân xúc tác bởi enzyme là phản ứng đơn phân cĩ thứ bậc 1. 13 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 1.3.2 Quy trình thực hiện phản ứng thủy phân e e Hình 1.8. Sơ đồ phản ứng thủy phân Quá trình chuyển từ protein bánh đậu phộng thành acid amin là một quá trình khá phức tạp. Dưới điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân, enzyme sẽ tham gia phản ứng theo sơ đồ sau: E + S ---> ES --> S + P Người ta cho rằng ban đầu enzyme sẽ liên kết với cơ chất (bánh dầu đậu phộng), sau đĩ mới diễn ra sự thủy giải và tạo ra các sản phẩm là các acid amin và các đoạn peptid ngắn. 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Ở đây E là enzyme papain và S là protein đậu phộng, ES là phức hợp trung gian giữa enzyme và cơ chất, P là sản phẩm (chủ yếu là các acid amin và các peptid cấp thấp). Sự tạo thành và chuyển biến của hợp chất trung gian ES xảy ra qua 3 bước: Bước 1: Enzyme kết hợp với protein tạo thành phức enzyme – protein (ES). Bước 2: Cĩ sự thay đổi mật độ điện tử và sự biến dạng hình học của các mối liên kết đồng hĩa trị trong phân tử cơ chất S cũng như trung tâm hoạt động của E. Bước 3: Giai đoạn tạo thành acid amin hay peptid cấp thấp và giải phĩng enzyme. 1.3.3 Các thay đổi hĩa sinh trong quá trình thủy phân: Những nghiên cứu về sự liên kết enzyme và cơ chất đề ra giả thuyết: phần lớn các enzyme trở nên hấp thụ với bề mặt ngồi của protein đậu phộng theo một tiến trình tương đối nhanh, sau đĩ sự khuếch tán những phân tử enzyme vào trong những thành phần này xảy ra chậm hơn. Sự thủy phân những nối peptid của protein đậu phộng cĩ thể chia làm hai pha: Pha nhanh (pha động): xảy ra ở giai đoạn đầu. Trong suốt pha này, một số lớp peptid bị phá hủy trong một đơn vị thời gian và một phần chất hịa tan được phĩng thích vào trong dung dịch. Pha chậm (pha tĩnh): tốc độ thủy phân càng về sau càng giảm, tiến trình hầu như ít cĩ sự thay đổi cho đến khi phản ứng thủy phân kết thúc. 1.3.4 Tính chất của sản phẩm sau thủy phân[16] Tính chất quan trọng nhất của sản phẩm là tính dinh dưỡng. Chiều dài chuỗi peptid của sản phẩm thủy phân cĩ tầm quan trọng đặc biệt. Khả năng hịa tan, khả năng nhũ tương, vị đắng …đều phụ thuộc ít nhiều vào kích thước và trọng lượng phân tử của các loại proteint cĩ trong sản phẩm. Tất cả các sản phẩm thủy phân đều cĩ vị đắng ở những mức độ khác nhau làm hạn chế rất nhiều tính cảm quan của sản phẩm. Vị đắng là nhược điểm chung của các sản phẩm thủy phân với xúc tác enzyme và được cho là cĩ liên quan đến những peptid cĩ trọng lượng phân tử thấp (khoảng 6,000 Da). Ta khơng thể khử được vị đắng nhưng cĩ thể giảm bớt được 15 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM bằng cách kiểm sốt mức độ thủy phân để cho những peptid cĩ phân tử lượng lớn chiếm ưu thế. Việc sử dụng enzyme làm xúc tác cĩ nhược điểm là thủy phân khơng triệt để, sau thủy phân cịn khoảng 20% nitơ tổng số vẫn khơng tan, do đĩ người ta thường phối hợp thủy phân bằng hĩa chất để nâng cao hiệu suất thủy phân. 1.3.5 Ƣu và nhƣợc điểm của phản ứng thủy phân: 1.3.5.1 Ƣu điểm: Do enzyme hydrolase cĩ tính đặc hiệu cao nên ít hoặc hầu như khơng tạo thành sản phẩm phụ. Dịch thủy phân thu được cĩ độ thuần khiết cao. Sử dụng enzyme xúc tác phản ứng cĩ thể định hướng được phản ứng xảy ra và sản phẩm tạo thành. Cĩ thể điều chỉnh được phản ứng nhằm tạo ra sản phẩm mong muốn. Hiệu suất thủy phân của enzyme khá cao, chỉ cần một lượng nhỏ enzyme cũng cĩ thể thủy phân được một lượng rất lớn cơ chất. Trong phản ứng xúc tác bởi enzyme thì yêu cầu về độ thuần khiết của cơ chất khơng cao. Khơng như một số phản ứng hĩa học khác, phản ứng thủy phân với xúc tác enzyme xảy ra ở những điều kiện ít khắc nghiệt hơn. Phản ứng thủy phân bằng enzyme cĩ biệt tính chọn lọc lập thể cao. 1.3.5.2 Nhƣợc điểm: Thời gian thủy phân với xúc tác enzyme thường kéo dài hơn so với thủy phân với xúc tác acid. Dịch sau thủy phân thường khĩ lọc. 1.4 ỨNG DỤNG ENZYME PAPAIN LÀM XÚC TÁC CHO PHẢN ỨNG THỦY PHÂN PROTEIN TRONG BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG Trong luận văn này, chúng tơi điều chế enzyme papain để thủy phân protein trong bánh dầu đậu phộng với các nội dung sau: 1. Thu nhận enzyme papain từ nhựa trái đu đủ  Khảo sát các điều kiện thu nhận enzyme papain 16 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM  Định lượng và hoạt tính của enzyme papain sau mỗi giai đoạn tinh chế.  Khảo sát sự biến đổi lượng và hoạt tính enzyme papain theo thời gian.  Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme papain. 2. Khảo sát phản ứng thủy phân bánh dầu đậu phộng  Xác định hàm lượng đạm formol và đạm amoniac theo thời gian phản ứng  Khảo sát sự thay đổi hàm lượng xúc tác, pH và nhiệt độ ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng thủy phân. 17 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. HĨA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 2.1.1. Hĩa chất Thuốc thử Folin – Merck, Đức. Tyrosin – Merck, Đức. Casein – Merck, Đức. Albumin – Merck, Đức. Dung dịch Citrat Natri 1%: cân chính xác 1g Citrat Natri pha với nước cất thành 100ml. Dung dịch Na2HPO4 1/15M: cân chính xác 5.9690g Na2HPO4.12H2O hịa tan trong nước cất và định mức cho đủ 250ml. Dung dịch KH2PO4 1/15M: cân chính xác 0.9072g KH2PO4 hịa tan trong nước cất và định mức lại cho đủ 100ml. Dung dịch đệm Sorosen 1/15M, pH 7.6: trộn chung 177ml dung dịch Na2HPO4 1/15M và 23ml dung dịch KH2PO4 1/15M. Dung dịch casein 1%: đun sơi cách thủy 1g casein trong dung dịch đệm Sorensen cho đến khi tan hồn tồn rồi định mức lại cho đủ 100ml. Dung dịch TCA 5%: hịa tan 5g TCA trong nước cho đủ 100ml. Dung dịch NaOH 0.5N: hịa tan 10g NaOH trong nước cho đủ 500ml. Dung dịch HCl 0.2N: trộn 4.25ml HCl đậm đặc với nước cho đủ 250ml. Dung dịch Tyrosin 20 mM/l: khuấy nghiền 1.8119 Tyrosin trong dung dịch HCl 0.2N vừa đủ 500ml. Dung dịch Tyrosin chuẩn 1mM/l trong dung dịch HCl 0.2N: pha lỗng 5ml dung dịch Tyrosin 20mM/l trong dung dịch HCl 0.2N thành 100ml. Nhựa đu đủ lấy mẫu tại thị trấn Xuyên Mộc - tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu. 18 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Bánh dầu đậu phộng lấy mẫu tại chợ Lái Thiêu. 2.1.2. Thiết bị Máy quang phổ UV Aglient 8453. Máy đơng khơ chân khơng Christ, Alpha 1- 2 Ldplus Cùng các thiết bị khác của phịng thí nghiệm : máy ly tâm, máy khuấy từ gia nhiệt... 2.2 PHƢƠNG PHÁP THỰC HIỆN 2.2.1 Phƣơng pháp trích nhựa đu đủ từ trái[3, 8, 11, 16, 10, 20] Quả: lấy ở những quả đang cịn xanh, vỏ quả mịn, cĩ trọng lượng từ 0.3-1 kg là tốt nhất. Quả non quá cho ít nhựa, quả quá già hoặc quả to vừa cho nhựa ít, vừa khơng sánh sệt, hoạt tính enzyme khơng cao. Quả cĩ vỏ sần sùi, chia thùy cũng cho ít nhựa. Để thu enzyme cĩ hoạt tính cao nhất, nên lấy nhựa ở quả đang độ 10 tuần tuổi. Thời gian lấy nhựa: sáng sớm, kết thúc vào giữa buổi sáng (giai đoạn cĩ độ ẩm khơng khí cao). Khi độ ẩm khơng khí thấp, dịng nhựa chảy chậm và đặc rất khĩ thu nhận. Mùa khơ: nhựa ít, đặc, nồng độ protein cao Mùa mưa: nhựa nhiều, lỗng, nồng độ protein thấp Tiến hành Nhựa đu đủ lấy ở quả xanh cịn ở trên cây Dùng dao inox cĩ đầu nhọn rạch vài đường dọc theo quả ở chỗ đường kính quả to nhất, các lát khía cách nhau 3-5cm (khơng rạch sâu quá 2cm, nếu khơng dịch nước và tinh bột từ quả sẽ trộn lẫn vào nhựa và làm giảm chất lượng nhựa thu được). Hứng lấy nhựa chảy ra bằng lọ thủy tinh màu miệng rộng trong 4 – 6 phút, sau khi lấy nhựa xong đậy nắp kín và bảo quản lạnh, giữ trong tối nhằm tránh khơng cho nhựa tiếp xúc lâu với khơng khí và để bảo đảm hoạt tính của papain cĩ trong nhựa. 19 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Khi lấy nhựa cần lau sạch trái nhằm tránh khơng cho chất bẩn hoặc cơn trùng lẫn vào. Khơng nên trộn nhựa khơ với nhựa tươi vì nĩ làm giảm chất lượng nhựa. Hình 2.1 Cách lấy nhựa đu đủ Quả cĩ thể được rút nhựa trong suốt khoảng thời gian từ 4 – 7 ngày. Lần đầu tiên cĩ thể chỉ cần một rạch là đủ, ở những lần thu nhựa sau, rạch 2 – 3 đường giữa những đường rạch trước đĩ. Khi tiến hành các thao tác với nhựa tươi, tránh khơng cho nhựa tiếp xúc vào da vì dễ gây bỏng. Đồng thời cũng khơng nên để nhựa tiếp xúc với các dụng cụ làm từ kim loại nặng như sắt, đồng, …để tránh làm biến màu và giảm hoạt tính enzyme. Lọ, dao, muỗng,… phải được làm bằng nhựa hoặc thép khơng rỉ. Nhựa tươi khơng bền vì thế nên đơng khơ chân khơng ngay sau khi thu nhận, nhựa đơng khơ được bảo quản trong tủ lạnh để tiến hành các nghiên cứu. 2.2.2 Phƣơng pháp thu nhận papain tinh khiết[8, 18, 23, 28, 40, 42, 44] Trong thành phần của nhựa đu đủ tươi ngồi enzyme papain, chymopapain cịn cĩ một số loại enzyme, protein, chất nhựa, chất cao su, chất béo,… và các tạp chất khác. Để cĩ được quy trình tách và làm sạch papain từ nhựa đu đủ cĩ hiệu quả thì phải cĩ quy trình hịa tan nhựa đu đủ, mục đích là để loại bỏ các chất cặn, nhựa, tạp lớn. 20 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Trộn 180g nhựa đu đủ khơ với 100g celite và 150g cát sạch, nghiền kỹ trong cối ở nhiệt độ phịng với 200-300ml dung dịch cysteine 0.04M (hịa tan 6.3g cysteine hydrochloride trong 1000ml dung dịch NaOH 0.054M, kiềm được sử dụng để đưa pH dịch chiết tới 5.7). Khi dịch nhựa tạo thành thể huyền phù, gạn bỏ lớp nổi ở trên. Quá trình nghiền và trích được lặp lại với 300ml dung dịch cysteine. Sau đĩ rửa cối với dung dịch cysteine để điều chỉnh thể tích lên 1000ml. Dịch huyền phù sau cùng được lọc lạnh (cĩ thể hút nhẹ) trên giấy lọc Whatman số 1. Thời gian lọc phụ thuộc vào nhựa khơ được sử dụng và quá trình này cĩ thể rất chậm. Nước lọc cĩ màu trắng sữa hoặc vàng xanh, pH gần 5.7. Các bước cịn lại của quá trình tinh sạch enzyme được tiến hành trong điều kiện lạnh.[25, 27, 28] 2.2.2.1 Loại bỏ các chất khơng tan ở pH 9. Dịch chiết thu được ở trên được điều chỉnh lên pH 9 bằng cách thêm từ từ và khuấy đều một lượng khoảng 110ml dung dịch NaOH 1M. Tủa xám tạo thành cĩ thể được loại ra bằng lọc hoặc ly tâm ở 4000rpm trong 30 phút. Dịch trích ở giai đoạn này phải trong do các tủa gây biến tính protein đã được loại bỏ. 2.2.2.2 Quá trình phân đoạn bằng amonium sulfate Cho amonium sulfate vào dịch enzyme đến 40% độ bão hịa, sau 1-2 giờ, ly tâm ở 4000rpm. Thu nhận tủa, bỏ dịch lỏng hoặc cĩ thể giữ lại để lấy chymopapain. Tủa được rửa một lần với 400-500ml dung dịch amonium sulfate 40% độ bão hịa. 2.2.2.3 Quá trình phân đoạn bằng NaCl Hịa tan tủa trong 600ml dung dịch cysteine 0.02M (pH 7-7.5), tủa papain tạo thành khi thêm từ từ 60g NaCl rắn. Sau một giờ, ly tâm ở 4000rpm trong 40 phút để thu tủa, bỏ dịch lỏng. 2.2.2.4 Kết tinh Tủa được tạo thành dịch huyền phù với 400ml dung dịch cysteine 0.002M ở pH 6.5 và điều kiện nhiệt độ phịng. pH của dung dịch huyền phù được điều chỉnh lại đến 6.5 sau khi cho protein vào. Giữ ở nhiệt độ phịng trong 30 phút để tinh thể tạo thành, sau đĩ duy trì ở 4oC qua đêm, sau đĩ ly tâm lạnh ở 4000rpm trong 1 giờ để thu nhận tinh thể. 21 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 2.2.2.5 Tái kết tinh Hịa tan tinh thể thu được ở giai đoạn kết tinh trong nước cất (tạo dung dịch cĩ nồng độ protein khoảng 1%) ở nhiệt độ phịng. Sau đĩ cho vào từ từ (đồng thời khuấy đều) dung dịch NaCl bão hịa (10ml/300ml dung dịch protein). Khi 75% thể tích dung dịch NaCl đã cho vào, papain bắt đầu kết tinh ở nhiệt độ phịng. Dịch huyền phù được giữ ở 4oC qua đêm, sau đĩ ly tâm thu tủa. Hoạt độ riêng của enzyme cĩ thể tăng nhẹ nếu tiến hành tái kết tinh thêm một lần nữa như trên. 2.2.2.6 Đơng khơ chân khơng. Tủa protein thu được đem đơng khơ chân khơng để loại bỏ nước. Protein sau khi đơng khơ chân khơng được bảo quản trong tủ lạnh để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. Qui trình thu nhận papain tinh khiết cĩ thể được tĩm tắt lại theo sơ đồ 2.2 Hình 2.2 Sơ đồ thu nhận papain từ nhựa đu đủ đơng khơ 22 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 2.2.3 Xác định lƣợng protein theo phƣơng pháp Lowry[1, 4, 12, 36] Nguyên tắc Hầu hết các protein đều cĩ chứa tyrosin và tryptophan. Hàm lượng của những acid amin này tùy thuộc vào loại protein. Vì vậy, những protein cùng loại với nhau cĩ hàm lượng các acid amin này giống nhau. Khi cho protein tác dụng với thuốc thử Folin sẽ tạo thành một phức chất cĩ màu. Cường độ màu của phức này tỉ lệ với hàm lượng tyrosin và tryptophan (cũng là hàm lượng protein). Vì thế ta cĩ thể dùng phương pháp so màu để xác định hàm lượng protein. Hĩa chất Dung dịch A: cân 2g Na2CO3 hịa tan trong NaOH N/10 thành 100ml. Dung dịch B: cân 0.5g CuSO4.5H2O hịa tan trong Citrat Natri 1% tạo thành 100ml. Dung dịch C (chỉ pha để dùng trong ngày): là hỗn hợp của hai dung dịch A và B được pha theo tỷ lệ 49:1. Dung dịch Albumin 0.1%: cân chính xác đến 4 chữ số khoảng 0.1g albumin pha với nước cất thành 100ml. Dựng đƣờng chuẩn Ta thực hiện đường chuẩn với một loại protein tinh khiết cĩ sẵn, thường là albumin của bị đã đơng khơ. Tiến hành pha albumin cĩ nồng độ khác nhau vào các ống nghiệm được đánh số từ 0 đến 5 như bảng bên dưới. Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5 Nồng độ protein mg/ml 0 50 100 150 200 250 Dung dịch albumin 0.1% (ml) 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Nước cất (ml) 10 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 Hút 0.4ml dung dịch protein cĩ nồng độ khác nhau từ các ống nghiệm vừa pha ở trên theo thứ tự từ 1 đến 6 vào 6 ống nghiệm sạch khác. Thêm vào đĩ 2ml dung dịch C. Lắc đều và để yên ở nhiệt độ phịng trong 5 phút. Sau đĩ thêm vào 0,2ml thuốc thử Folin, lắc đều trong 5 – 10 phút, thêm nước cất cho đủ 5ml. Đem 23 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM đo mật độ quang (OD) ở bước sĩng 750nm. Sau đĩ vẽ đường chuẩn biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang (OD) theo nồng độ albumin chuẩn (mg/ml). Xác định hàm lƣợng protein cĩ trong mẫu: Hút 0.4ml dung dịch protein cần xác định hàm lượng cho vào một ống nghiệm sạch và đã được sấy khơ. Thêm vào đĩ 2ml dung dịch C. Lắc đều và để yên ở nhiệt độ phịng trong 5 phút. Sau đĩ, thêm vào 0.2ml thuốc thử Folin, lắc đều trong 5 – 10 phút, thêm nước cất vào cho đủ 5ml. Đem đo mật độ quang (OD) ở bước sĩng 750nm. Dựa vào đường chuẩn để ngoại suy ra hàm lượng protein cĩ trong mẫu nghiên cứu. 2.2.4 Xác định hoạt tính protein theo phƣơng pháp Anson[1, 4] Nguyên tắc Casein bị phân giải trong mơi trường kiềm dưới tác dụng của protease tạo thành sản phẩm là các đoạn peptid ngắn hịa tan trong tricloroacetic acid (TCA), xác định tyrosin và tryptophan hịa tan bởi thuốc thử Folin. Dựng đƣờng chuẩn Tyrosin Dung dịch hĩa chất Ống nghiệm Dung dịch Tyrosin chuẩn (ml) 1 2 3 4 5 6 Lượng Tyrosin tương ứng (M) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Dung dịch HCl 0.2N (ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Dung dịch NaOH 0.5N (ml) 5.0 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sĩng 720nm Ống số 1 là ống thử khơng (TK), các ống cịn lại là ống thí nghiệm (TT). Vẽ đường chuẩn Tyrosin tương quan giữa lượng Tyrosin (M) và độ hấp thu quang ở bước sĩng 720nm. Vẽ đường chuẩn Tyrosin tương quan giữa lượng Tyrosin (M) và OD. Xác định lƣợng Tyrosin trong dung dịch nghiên cứu Cân chính xác 0.1g mẫu protein hịa tan trong 100ml nước cất, tạo thành dung dịch protein cĩ nồng độ 0.001g/ml. 24 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Dung dịch hĩa chất Ống nghiệm 1 2 Dung dịch casein 1% (ml) 5 5 Dung dịch TCA 5% (ml) 0 10 Dung dịch enzyme mẫu (ml) 1 1 Lắc đều và giữ ở 35.5oC Dung dịch TCA 5% (ml) 10 0 Để yên 30 phút, lọc lấy dịch bên dưới Lấy 4 ống nghiệm mới, sạch, chia thành hai lơ, mỗi lơ hai ống để lấy trung bình đánh dấu A và B. Cho vào ống A 5ml dịch lọc từ ống nghiệm 1 và ống B 5ml dịch lọc từ ống nghiệm 2. Thêm vào mỗi ống 10ml dung dịch NaOH 0.5N và 3ml thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau 10 phút, đo OD ở bước sĩng 660nm hoặc 720nm. Dựa vào đồ thị chuẩn để suy ra được M Tyrosin. 2.2.5 Xác định đạm tổng số theo phƣơng pháp Kjeldahl[1, 4] 2.2.5.1 Nguyên tắc: Chất đạm khi đem vơ cơ hĩa sẽ chuyển thành dạng ammonium sulfat, khi cho tác dụng với chất kiềm mạnh như NaOH sẽ phĩng thích ra amoniac theo phương trình như sau: (NH4)2SO4 + NaOH ---> 2NH3 + H2O + Na2SO4 Lượng amoniac phĩng thích ra sẽ được hơi nước lơi cuốn bằng một dụng cụ là máy Parnas – Wargner và được dẫn đến một bình tam giác cĩ chứa một lượng thừa H2SO4. Từ đây, cho phép chúng ta xác định được lượng amoniac phĩng thích ra, cĩ nghĩa là xác định hàm lượng đạm trong mẫu nguyên liệu. 2NH3 + H2O + H2SO4 ---> (NH4)2SO4 + H2O 2.2.5.2 Cách tính: N = 1.4*V (mg/ml) Trong đĩ: 25 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM N: Số gam đạm tổng số cĩ trong 1 lít nguyên liệu lỗng hay 1kg nguyên liệu rắn. V = V0 – V V0: thể tích NaOH N/100 mẫu thử khơng. V: thể tích NaOH N/100 mẫu thử thật. 2.2.6 Phƣơng pháp xác định đạm formol (phƣơng pháp Sorensen)[1, 4] 2.2.6.1 Nguyên tắc Trong phân tử acid amin, peptid, protein cĩ một đầu chức là nhĩm –COOH như là một acid cịn đầu kia là nhĩm –NH2 được xem như là một base, cịn các amin tự do cũng như amoniac khi hịa tan thường ở dưới dạng amonium NH4 + kết hợp với một anion thường là clorur, sulfat, phosphat… Như vậy khi ta cho tác dụng các phân tử “phi protein” này với formol, formol sẽ tác dụng lên nhĩm -NH2 để tạo thành phức chất methylen (mono, tri hoặc hexamethylen). HOOC C R NH2 H + HCHO HOOC C R N H CH2 + H2O + HCHO R N CH2 + H2ORNH4 +Cl- + HCl Sản phẩm của phản ứng là hợp chất methylen và một chức –COOH tự do (trong trường hợp acid amin) hoặc HCl (trong trường hợp amin tự do hoặc amoniac). Nên ta cĩ thể định phân bằng NaOH, từ đây cho phép ta xác định một cách gián tiếp được lượng –NH2. Khi hàm lượng đạm formol khơng tăng theo thời gian cĩ nghĩa là phản ứng thủy phân đã kết thúc 2.2.6.2 Tiến hành Trung hịa formol ½: lấy 50ml formol ½, thêm vào đĩ vài giọt phenolphtalein 3%, cho NaOH N/10 từng giọt cho đến khi dung dịch chuyển màu hồng nhạt, ta được formol ½ đã trung hịa. 26 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Hút 10ml dung dịch nguyên liệu đã pha lỗng từ 5 đến 20 lần (trong đề tài này chúng tơi tiến hành pha lỗng mẫu 10 lần) thêm vào đĩ 10ml dung dịch formol ½ đã trung hịa và vài giọt phenolphtalein 3%, lắc đều để phản ứng xảy ra hồn tồn, sau đĩ định phân bằng NaOH x N/10 cho đến khi dung dịch chuyển màu hồng. Thực hiện ba sự thử thật và ba sự thử khơng (thay dung dịch đạm bằng nước cất) lấy trị số trung bình. 2.2.6.3 Cách tính Số gam đạm formol cĩ trong 1 lít nguyên liệu = 1.4*V (g/lít) Trong đĩ: V = V – V0 V0: thể tích NaOH N/10 mẫu thử khơng. V: thể tích NaOH N/10 mẫu thử thật. 2.2.7 Xác định đạm amoniac[1, 4] 2.2.7.1 Nguyên tắc Trong nguyên liệu chứa đạm thường cĩ một loại đạm nằm dưới dạng “vơ cơ” (muối amonium hay những amin dễ bay hơi). Đây là dạng đạm tạo thành do sự phân hủy của protein (bị lên men thối hoặc quá trình khử carboxyl của acid amin), vì thế nếu đứng về khía cạnh dinh dưỡng thì loại đạm này khơng cần cho cơ thể, nếu cĩ sự hiện diện của nĩ với hàm lượng cao thì nguyên liệu được đánh giá là “mất phẩm chất’. Những loại đạm này thường cĩ tính kiềm yếu, vì vậy khi cho tác dụng với MgO thì những loại đạm này sẽ bị đuổi ra khỏi dung dịch, nên chúng sẽ được lơi cuốn theo hơi nước qua một bình đựng lượng thừa acid. Sau đĩ đem định phân lượng acid dư, cho phép chúng ta xác định được loại đạm này. 2(NH4) + + Mg(OH)2 ---> 2NH3 + 2H2O + Mg 2+ 2NH3 + H2SO4 ----> (NH4)2SO4 27 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 2.2.7.2 Tiến hành Lấy 50ml dung dịch nguyên liệu đã pha lỗng 20 lần (hoặc cân chính xác một lượng m gam nguyên liệu đã nghiền nhuyễn cho đồng nhất) cho vào trong bình cầu 500ml, thêm vào đĩ 150ml nước cất và vài giọt phenolphtalein, tiếp tục thêm vào bình cầu 5g MgO, dung dịch phải cĩ màu hồng nhạt, đậy nút ngay để tránh amoniac bay ra, lắc đều, đun sơi và hơi nước được chưng cất sang một bình tam giác cĩ chứa sẵn 10ml H2SO4 N/10 và vài giọt thuốc thử Tashiro, đầu nhọn của ống sinh hàn nhúng chìm trong dung dịch H2SO4 N/10. Chưng cất trong 15-20 phút kể từ khi dung dịch trong bình cầu sơi. Sau 15-20 phút chất đạm amoniac sẽ được hấp thụ vào dung dịch H2SO4. Lấy bình tam giác ra (rửa đầu ống sinh hàn trước khi lấy ra). Định phân lượng acid dư bằng NaOH cĩ chuẩn độ là x N/10 từ màu xanh tím sang màu xanh xám, nếu dư NaOH thì chuyển thành màu xanh ve chai. Thực hiện ba lần thử thật và ba lần thử khơng. 2.2.7.3 Cách tính Số gam đạm NH3 cĩ trong 1 lít nguyên liệu = (1.4*V)/2.5 V = (Vt – V0) là lượng NaOH tương đương với lượng đạm phĩng thích đã được hấp thụ trong H2SO4. 2.2.8 Phƣơng pháp chung tiến hành phản ứng thủy phân bánh dầu đậu phộng với xúc tác papain thơ.[15, 27] 2.2.8.1 Phƣơng pháp loại béo: Sử dụng dung mơi eter dầu hỏa: cho dung mơi vào bánh dầu đậu phộng đã xay nhuyễn với tỷ lệ khối lượng dung mơi trên cơ chất là 3:2. Khuấy đều trong 3 giờ ở 70oC, sau đĩ lọc bỏ dung mơi (tiến hành 3 lần). Sau đĩ cho nước vào với tỷ lệ trên sản phẩm là 2:1, khuấy đều, đem lọc. Thực hiện sự rửa này 7 lần. Sản phẩm thu được đem sấy khơ ta được bánh dầu đậu phộng đã loại béo. 2.2.8.2 Phƣơng pháp thực hiện phản ứng[5, 30, 31, 37] Phản ứng thủy phân được thực hiện tại tỉ lệ của bánh dầu đậu phộng với dung dịch đệm phosphate là 1:10. Cân 5g bánh dầu đậu phộng đã loại béo cho vào 28 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM erlen 100ml, thêm vào 50ml dung dịch đệm phosphate 0.1M. Bánh dầu đậu phộng được trộn với dung dịch đệm phosphate để đạt được pH mong muốn, hỗn hợp sau đĩ được gia nhiệt và khuấy từ liên tục. Khi phản ứng đạt đến nhiệt độ cần khảo sát, cho enzyme vào với tỉ lệ thích hợp, phản ứng được tiến hành trong 26 giờ. Sau mỗi 2 giờ phản ứng, lấy 0.1 gam dịch thủy phân từ erlen trên, thêm nước sơi để ngừng phản ứng, định mức thành 100ml dung dịch, đem lọc. Hút 10ml dịch lọc đem xác định hàm lượng đạm formol theo phương pháp Sorensen, phần dung dịch cịn lại trong bình định mức dùng để xác định lượng protein theo phương pháp Lowry. 2.2.8.3 Hiệu suất thủy phân[39] Papain cĩ tính chất của endopeptidase thủy phân protein trong bánh dầu đậu phộng chủ yếu thành peptide theo phản ứng sau: R1 N C H H R3 C O N H C R4 C H R2 O HOH+ N C H H R3 C O R1 OH H2N C R4 CO R2 H + Ngồi ra, papain cịn cĩ tính chất của exopeptidase thủy phân các peptide thành các acid amin theo phản ứng sau: H2N C H R2 C O N H C R3 C H R1 O HOH+ H2N C H R3 C O OH H2N C R4 CO R1 H + Hiệu suất gần đúng của phản ứng thủy phân (%) được tính dựa trên tỉ lệ hàm lượng acid amin hịa tan trong nước của dung dịch sau phản ứng so với hàm lượng protein ban đầu được xác định thơng qua hàm lượng nitơ tổng. Hiệu suất gần đúng của phản ứng thủy phân H(%) được tính theo cơng thức như sau: 100* P G H  Trong đĩ: H: hiệu suất gần đúng của phản ứng thủy phân (%). 29 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM G: hàm lượng acid amin tan của dung dịch sau thủy phân xác định theo phương pháp Lowry. P: hàm lượng protein ban đầu trong bánh dầu đậu phộng xác định theo phương pháp Kjeldahl. 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KHẢO SÁT LƢỢNG NHỰA Ở QUẢ ĐU ĐỦ Chúng tơi đã tiến hành khảo sát lượng nhựa ở ba loại quả (quả non, quả già xanh, quả gần chín) ở trên cùng một lồi và cùng một phương pháp làm khơ. Kết quả được trình bày trong bảng 3.1 Bảng 3.1. Hàm lƣợng phần trăm của nhựa đu đủ trong các loại quả khác nhau. Loại quả Khối lượng quả (g) Khối lượng nhựa lấy (g) Tỉ lệ nhựa thơ trên quả (%) Quả non (dưới 40 ngày tuổi) 120 0.2576 0.21 Quả già xanh (50-100 ngày tuổi) 580 1.5153 0.26 Quả gần chín (100-120 ngày tuổi) 1700 3.0292 0.18 Nhận xét: lượng papain thơ thu được ở quả già xanh cao hơn so với quả non và quả gần chín đồng thời chiếm hàm lượng khá cao. Qua kết quả này, chúng tơi nhận thấy thời gian thích hợp để thu nhận nhựa thơ là khi quả đu đủ được 50 – 100 ngày tuổi. 3.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SƠ CHẾ NHỰA TƢƠI Nhựa tươi được làm khơ ngay, ở nhiệt độ nhỏ hơn 50oC bằng các phương pháp khác nhau. Kết quả được trình bày trong bảng 3.2 Bảng 3.2. Các phƣơng pháp làm khơ nhựa đu đủ Phương pháp làm khơ Hình thức cảm quan Phơi nắng 1-2 nắng Vĩn cục,vàng nâu Sấy nĩng, cĩ quạt giĩ 24 giờ Vĩn cục, vàng nhạt Đơng khơ chân khơng 8 giờ Vẩy mỏng, ĩng ánh và trắng sáng Nhận xét: Chất lượng papain thơ thu được từ các phương pháp xử lý khác nhau rất khác nhau. Hình thức cảm quan phản ánh rõ chất lượng của sản phẩm: màu càng thẫm chất lượng càng kém. 31 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Tuy cĩ nhiều phương pháp khác nhau để làm khơ nhựa tươi nhưng phương pháp đơng khơ chân khơng là phương pháp hiệu quả nhất và ít ảnh hưởng đến chất lượng nhựa. Do đĩ, tồn bộ nhựa tươi được đơng khơ chân khơng để loại nước và nhựa sau đơng khơ được bảo quản trong tủ lạnh để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. Từ 100ml dung dịch nhựa tươi, chúng tơi tiến hành đơng khơ trong 8 giờ và thu được 5 gam chế phẩm đơng khơ. 3.3 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN THU NHẬN PAPAIN TỪ NHỰA KHƠ Nhựa tươi sau khi đã đơng khơ chân khơng, chúng tơi tiến hành sơ chế bằng dung mơi hữu cơ được làm lạnh để loại bỏ các tạp chất. Sản phẩm sau quá trình sơ chế được chạy điện di để phân tích sơ bộ thành phần protein. Kết quả chạy điện di của sản phẩm sau giai đoạn sơ chế được trình bày trong hình 3.1a: Hình 3.1a. Điện di đồ của nhựa khơ ở trái non sơ chế bằng dung mơi etanol 32 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 1 – thang protein chuẩn 2 – nhựa đu đủ non đơng khơ sơ chế bằng etanol Nhận xét: quá trình sơ chế bằng dung mơi cịn lẫn khá nhiều protein tạp, do đĩ chúng tơi tiến hành qui trình tinh chế với các phân đoạn khác nhau để tinh sạch protein. Đồng thời, chúng ta cũng dễ dàng nhận thấy rằng trong vạch điện di của nhựa đu đủ non khơng cĩ xuất hiện enzyme papain do đĩ chúng tơi tiến hành lấy nhựa trên trái trưởng thành để thu nhận papain. Điều này hồn tồn phù hợp với các nghiên cứu trước đây về enzyme trong nhựa đu đủ: enzyme papain chỉ hình thành trong giai đoạn trưởng thành của trái. Tinh chế: Tiến hành tinh chế papain từ nhựa đơng khơ theo phương pháp đã trình bày trong phần thực nghiệm, từ 90 gam nhựa khơ ban đầu chúng tơi thu được 1g papain. Kết quả điện di được trình bày trong hình 3.1b: Hình 3.1 b. Điện di đồ của chế phẩm Merk và papain tinh chế từ nhựa đu đủ đơng khơ. 1- Thang protein chuẩn 2- Chế phẩm Merck 3 - papain 33 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 3.4 PHƢƠNG PHÁP LOWRY XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG PROTEIN Kết quả đo mật độ quang ∆OD ở bước sĩng 750nm của các ống nghiệm cĩ nồng độ albumin từ 50 – 250mg/ml được trình bày trong bảng 3.3 (phụ lục 1) Bảng 3.3. Mật độ quang của albumin ở bƣớc sĩng 750nm Mẫu 01 02 03 04 05 Nồng độ Albumin (mg/ml) 50 100 150 200 250 Độ hấp thu quang OD (AU) 0.0432 0.0648 0.1192 0.135 0.1942 Từ kết quả trên, vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang ∆OD (AU) theo nồng độ protein chuẩn (mg/ml) theo hình 3.2 với phương trình đường chuẩn là y = 0.0007x – 0.0004 Hình 3.2. Đƣờng chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ albumin. Cách tính Từ phương trình đường chuẩn so sánh mật độ quang của ống nghiệm chứa mẫu protein. Từ đĩ suy ra nồng độ của protein trong nguyên liệu là x (mg/ml) Hàm lượng protein M (cĩ trong 1g nguyên liệu được tính theo cơng thức): 34 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM m nx M *001.0*  (mg/g) với x: là nồng độ protein trong dung dịch đã pha lỗng (mg/ml). n: hệ số pha lỗng m: khối lượng nguyên liệu lấy phân tích (g) 3.5 PHƢƠNG PHÁP ANSON XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PROTEASE Kết quả đo mật độ quang ∆OD ở bước sĩng 720nm của các ống nghiệm cĩ lượng tyrosin tương ứng từ 0.2 – 1.0M được trình bày trong bảng 3.4 (phụ lục 2) Bảng 3.4. Mật độ quang của tyrosin ở bƣớc sĩng 720nm Mẫu 02 03 04 05 06 Lượng tyrosin tương ứng (M) 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Độ hấp thu quang OD(AU) 0.1059 0.1812 0.3138 0.3464 0.4688 Ống số 1 là ống thử khơng (TK), các ống cịn lại là ống thí nghiệm (TT). Vẽ đường chuẩn Tyrosin tương quan giữa lượng Tyrosin (M) và biến thiên độ hấp thu quang ở bước sĩng 720nm như hình 3.3 với phương trình đường chuẩn là y = 0.4454x + 0.016. Đường chuẩn Anson y = 0.4454x + 0.016 0 0.05 0.1 0. 5 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 Lượng Tyrosin (mM) M ật đ ộ qu an g (A U) Hình 3.3. Đƣờng chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ tyrosin. 35 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Cách tính Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lượng enzyme tối thiểu trong điều kiện chuẩn (35.5oC, pH 7.6 …) thủy phân casein trong 1 phút tạo thành sản phẩm hịa tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở bước sĩng 660nm tương ứng với 1M Tyrosin trong đường chuẩn. Hđ P = Tyrosin*V*L t*m*v (UI) với Hđ P: hoạt tính protein (UI) V: tổng thể tích hỗn hợp trong ống nghiệm 1 hoặc 2 (ml). v: thể tích dịch lọc đem phân tích (ml). t: thời gian thủy phân (phút) m: khối lượng mẫu enzyme đem xác định hoạt tính (g) L: độ pha lỗng mẫu enzyme. M Tyrosin: lượng M Tyrosin trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn. 3.6 KHẢO SÁT LƢỢNG ENZYME THU ĐƢỢC SAU CÁC GIAI ĐOẠN TINH CHẾ. Trong quá trình tinh chế enzyme chúng tơi tiến hành khảo sát lượng protein thu được sau mỗi phân đoạn bằng cách lấy ra 0,1g dung dịch enzyme, sau đĩ định mức thành100ml bằng nước cất để xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry. Kết quả được trình bày trong bảng 3.5 với cách tính như sau: Thế giá trị mật độ quang ∆OD ở mỗi phân đoạn vào phương trình đường chuẩn xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry là y = 0.0007x – 0.0004 ta suy ra được nồng độ protein trong dung dịch đã pha lỗng là x. Sau đĩ, áp dụng cơng thức m nx M *001.0*  (mg/g) với x: là nồng độ protein trong dung dịch đã pha lỗng (mg/ml). n: hệ số pha lỗng m: khối lượng nguyên liệu lấy phân tích (g) 36 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM để tính lượng protein trong nguyên liệu là M (mg/g). Bảng 3.5. Lƣợng protein thu đƣợc ở các phân đoạn tinh chế khác nhau. 247.71 199.14 184.86 179.14 174.86 162.00 0 50 100 150 200 250 300 pH 5.7 pH 9 (NH4)2SO4 NaCl Kết tinh Tái kết tinh Các giai đoạn tinh chế Lư ợn g p ro tei n ( mg /g) Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự biến thiên lƣợng protein sau mỗi giai đoạn tinh chế. Nhận xét: Từ bảng số liệu và biểu đồ trên ta nhận thấy rằng, trong quá trình tinh chế enzyme bằng phương pháp tủa muối thì hàm lượng protein trong mẫu giảm dần. Điều này cĩ thể được giải thích như sau: lượng protein ban đầu cao là do trong nhựa khơ chưa tinh chế ngồi papain cịn cĩ nhiều protein khác, sau mỗi giai đoạn tinh chế thì protein tạp được loại bỏ dần làm cho hàm lượng protein cũng giảm theo. Các phân đoạn ∆OD M (mg/g) Phụ lục Phân đoạn pH 5.7 0.173 247.71 3 Phân đoạn pH 9.0 0.139 199.14 4 Phân đoạn tủa với ammonium sulfat 0.129 184.86 5 Phân đoạn bằng NaCl 0.125 179.14 6 Phân đoạn kết tinh 0.123 174.86 7 Phân đoạn tái kết tinh 0.113 162.00 8 37 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 3.7 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CỦA ENZYME SAU CÁC GIAI ĐOẠN TINH CHẾ Trong quá trình tinh chế enzyme ngồi việc khảo sát lượng protein thu được sau mỗi phân đoạn, chúng tơi cũng tiến hành đồng thời việc khảo sát hoạt tính protein ở mỗi giai đoạn tinh chế với cách thực hiện như sau: Cân 0.1g mẫu protein ở mỗi giai đoạn tinh chế định mức thành 100ml dung dịch bằng nước cất. Cho vào mỗi ống nghiệm 1ml dung dịch protein đã pha lỗng và các dung dịch khác như sau Dung dịch hĩa chất Ống nghiệm 1 2 Dung dịch casein 1% (ml) 5 5 Dung dịch TCA 5% (ml) 0 10 Dung dịch enzyme mẫu (ml) 1 1 Lắc đều và giữ ở 35.5oC Dung dịch TCA 5% (ml) 10 0 Để yên 30 phút, lọc lấy dịch bên dưới Lấy 2 ống nghiệm mới, sạch đánh dấu A và B. Cho vào ống A 5ml dịch lọc từ ống nghiệm 1 và ống B 5ml dịch lọc từ ống nghiệm 2. Thêm vào mỗi ống 10ml dung dịch NaOH 0.5N và 3ml thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau 10 phút, đo ∆OD1 và ∆OD2 ở bước sĩng 720nm từ đĩ dựa vào đồ thị chuẩn để suy ra được M Tyrosin. Hoạt tính protein được xác định theo phương pháp Anson. Kết quả được trình bày trong bảng 3.6 với cách tính như sau: Thế giá trị y = (∆OD1 - ∆OD2) vào phương trình đường chuẩn xác định hoạt tính theo Anson y = 0.4454x + 0.016 ta suy ra được x chính là lượng tyrosin. Từ giá trị của x ta tính được hoạt tính protease theo cơng thức: Hđ P = Tyrosin*V*L t*m*v (UI) với 38 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Hđ P: hoạt tính protein (UI) V: tổng thể tích hỗn hợp trong ống nghiệm 1 hoặc 2 (ml). v: thể tích dịch lọc đem phân tích (ml). t: thời gian thủy phân (phút) m: khối lượng mẫu enzyme đem xác định hoạt tính (g) L: độ pha lỗng mẫu enzyme. M Tyrosin: lượng M Tyrosin trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn. Bảng 3.6. Hoạt tính protease của enzyme sau các giai đoạn tinh chế Các phân đoạn ∆OD1 ∆OD2 P(UI/ml) Tỉ lệ hoạt tính sau mỗi giai đoạn tinh chế (%) Phụ lục Nhựa khơ ban đầu 0.308 0.012 70.353 9 Phân đoạn pH 5.7 0.264 0.063 66.46 94.47 10 Phân đoạn pH 9.0 0.150 0.035 57.39 81.57 11 Phân đoạn tủa với ammonium sulfat 0.372 0.185 49.30 70.08 12 Phân đoạn bằng NaCl 0.240 0.074 45.60 64.81 13 Phân đoạn kết tinh 0.115 0.055 36.36 51.68 14 Phân đoạn tái kết tinh 0.097 0.062 36.78 55.34 15 39 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 66.46 57.39 49.30 45.60 36.36 36.78 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 pH 5.7 pH 9 (NH4)2SO4 NaCl Kết tinh Tái kết tinh Các giai đoạn tinh chế Ho ạt tín h p ro tea se (U I) Series1 Hình 3.5. Sự biến thiên hoạt tính của protein sau các giai đoạn tinh chế. Qua bảng số liệu và đồ thị, ta nhận thấy rằng trong quá trình tinh chế enzyme bằng phương pháp tủa muối thì hoạt tính protein trong mẫu giảm dần. Nguyên nhân cĩ thể là do ban đầu nhựa khơ ngồi chứa enzyme papain ra cịn chứa những enzyme khác cĩ chức năng bảo vệ papain nên hoạt tính cao, sau khi qua những giai đoạn tinh chế tiếp theo đã loại bỏ hầu hết những protein tạp chỉ cịn lại papain tinh khiết nên dẫn đến hoạt tính protein cũng giảm theo. Sau phân đoạn kết tinh, sản phẩm đem đi kết tinh lại thì độ tinh sạch của sản phẩm cao hơn dẫn đến hoạt tính protein tăng lên đơi chút. 3.8 KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI LƢỢNG PROTEIN TRONG CÁC CHẾ PHẨM PROTEASE THU ĐƢỢC THEO THỜI GIAN Nhằm đánh giá tính ổn định của mỗi chế phẩm, chúng tơi tiến hành khảo sát sự biến đổi hàm lượng protein của mỗi chế phẩm theo thời gian. Cân chính xác 0.10 gam các chế phẩm thu được bằng các phương pháp khác nhau sau khi đã đơng khơ, cho vào bình định mức 100ml. Thêm nước cất đến vạch định mức, sau đĩ lắc đều đến khi chế phẩm tan hồn tồn. Các chế phẩm này được bảo quản ở 4oC để dùng dần. Hút 0,4ml dung dịch protein đã pha ở trên để tiến hành xác định lượng protein cho mỗi lần thí nghiệm Thời gian tiến hành thí nghiệm là 5 ngày. Kết quả được trình bày trong bảng 3.7 (phụ lục 16 -19): 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Bảng 3.7. Hàm lƣợng protein của các chế phẩm theo thời gian Ngày ∆OD Hàm lượng protein (mg/g) M0 M1 M2 M3 M0 M1 M2 M3 1 0.155 0.112 0.115 0.110 222.00 160.57 164.86 157.71 2 0.136 0.141 0.101 0.109 199.14 202.00 144.86 156.29 3 0.142 0.124 0.162 0.131 203.43 177.71 232.00 187.71 4 0.135 0.116 0.133 0.122 193.43 166.29 190.57 174.86 5 0.125 0.106 0.133 0.116 179.14 147.71 190.57 169.14 100 0 160 190 220 250 1 2 3 4 5 Ngày khảo sát Lư ợn g p ro tei n ( mg /g) M0 M1 M2 M3 Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lƣợng protein theo thời gian Trong đĩ: M0: mẫu nhựa đu đủ tươi được đem đơng khơ M1: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa với ammonium sulfate sau khi đơng khơ. M2: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa bằng ethanol sau khi đơng khơ. 41 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM M3: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa bằng dung mơi aceton sau khi đơng khơ. Nhận xét: Qua biểu đồ trên chúng ta thấy rằng hàm lượng protein của các chế phẩm hầu như khơng thay đổi nhiều theo thời gian chúng tơi khảo sát. Chế phẩm M0 cĩ hàm lượng protein cao nhất cịn M1 cĩ hàm lượng protein nhỏ nhất. Như vậy phương pháp kết tủa bằng muối đã loại bỏ hầu hết các protein tạp cĩ trong mẫu nghiên cứu, cịn lại chủ yếu là papain nên cĩ hàm lượng protein nhỏ nhất trong các phương pháp. Phương pháp đơng khơ giữ lại hầu hết những protein trong chế phẩm M0 vì quá trình đơng khơ giúp cố định mẫu nên cĩ hàm lượng protein cao nhất. Cịn hai phương pháp cịn lại dùng dung mơi để tủa enzyme đã loại bỏ một số protein cĩ trong chế phẩm nhưng khơng thể loại bỏ hồn tồn các protein khác nên cĩ hàm lượng protein trung bình nằm giữa chế phẩm M0 và M1. 3.9 KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI HOẠT TÍNH CỦA CÁC CHẾ PHẨM THEO THỜI GIAN. Nhằm đánh giá tính ổn định của chế phẩm, chúng tơi đã tiến hành khảo sát sự biến đổi hoạt tính của chế phẩm theo thời gian. Cân 0.1 gam các chế phẩm thu được bằng các phương pháp khác nhau sau khi đã đơng khơ, cho vào bình định mức 100ml. Thêm nước cất đến vạch định mức, sau đĩ lắc đều đến khi chế phẩm tan hồn tồn. Chế phẩm được bảo quản ở 4oC để dùng dần, thời gian tiến hành thí nghiệm là 5 ngày. Hút 1ml dung dịch trong bình định mức tiến hành xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson. Thí nghiệm được lặp lại mỗi ngày và kết quả được thể hiện trong bảng 3.8: 42 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Bảng 3.8. Hoạt tính protein của các chế phẩm theo thời gian Ngày ∆OD P(UI/ml) M0 M1 M2 M3 M0 M1 M2 M3 1 0.296 0.212 0.144 0.116 70.353 49.286 32.187 25.146 2 0.197 0.158 0.192 0.124 65.081 51.010 63.224 38.797 3 0.125 0.107 0.081 0.080 54.728 45.766 32.690 32.187 4 0.265 0.071 0.064 0.087 44.702 9.879 8.621 12.753 5 0.264 0.059 0.044 0.033 26.749 4.634 3.018 1.832 Kết quả này được biểu diễn bằng đồ thị như hình 3.7 0 10 0 30 40 50 60 70 80 1 2 3 4 5 Thời gian (ngày) Ho ạt tín h ( UI /m l) M0 M1 M2 M3 Hình 3.7. Sự biến đổi hoạt tính của các chế phẩm theo thời gian Trong đĩ: M0: mẫu nhựa đu đủ tươi được đem đơng khơ M1: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa với ammonium sulfate sau khi đơng khơ. M2: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa bằng ethanol sau khi đơng khơ. M3: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa bằng dung mơi aceton sau khi đơng khơ. 43 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Nhận xét: Nhựa đu đủ là hỗn hợp các protease cĩ tính thủy phân mạnh, trong đĩ papain là một trong những enzyme cĩ hoạt tính mạnh và chiếm hàm lượng cao nhất, thủy phân protein tới oligopeptide. Papain ở dạng tự nhiên, nhĩm –SH tự do bị bao vây, cĩ tính ổn định cao hơn papain dạng hoạt động trong dung dịch. Khơng chỉ là proteza cĩ tính chất đặc hiệu cơ chất rộng, papain cịn cĩ khả năng tự thủy phân do một phân tử papain xúc tác cho sự thủy phân một phân tử khác. Do trong thời gian tiến hành thí nghiệm, dung dich enzyme chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khách quan như chịu ảnh hưởng của 2 yếu tố oxy trong khơng khí và sự tự thủy phân của papain, nên hoạt tính của các chế phẩm sẽ giảm dần theo thời gian. Theo kết quả ở bảng, hoạt tính của các chế phẩm giảm dần mỗi ngày. Sạu 5 ngày chúng tơi khảo sát thì hoạt tính của các chế phẩm giảm đi rất nhiều so với ngày đầu tiên (M0 cịn 47.91%, M1: 9.4%, M2: 9.37 %, M3:7.29 %). Chế phẩm M0 giữ hoạt tính tốt hơn là do trong nhựa đu đủ cịn cĩ một số chất khác đã gĩp phần bảo vệ papain. Các phương pháp kết tủa thu nhận papain đã loại bỏ một số chất cĩ trong nhựa nên độ bền của những chế phẩm cịn lại kém hơn so với M0. Trên hình biểu diễn sự biến động hoạt tính của các chế phẩm theo thời gian đã cho chúng ta thấy rằng hoạt tính của chế phẩm M1 cĩ hoạt tính cao hơn hẳn các chế phẩm khác. Lý do cĩ thể là do phương pháp tủa muối khơng cĩ ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme, phương pháp này chỉ loại đi nhiều proteaza tạp, cịn lại phần lớn là papain. Cồn và aceton cũng là một dung mơi hữu cơ được sử dụng rộng rãi để kết tủa proteaza nhưng phương pháp này cĩ nhược điểm làm giảm hoat tính proteolytic, nhiều khi dẫn đến mất hoạt tính hồn tồn. Từ những số liệu thực nghiệm cho ta cĩ thể đánh giá rằng chế phẩm papain được tách bằng muối cĩ hoạt tính cao hơn so với các phương pháp sử dụng dung mơi hữu cơ và khá bền khi tồn tại ở dạng hoạt động. 44 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 3.10 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME PAPAIN. 3.10.1. Khảo sát ảnh hƣởng của pH Tiến hành thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme ở các pH khác nhau từ 7.5 đến 9.0. Xác định hoạt tính theo phương pháp Anson, mẫu được đo độ hấp thu quang ở bước sĩng 720nm. Kết quả được trình bày trong bảng 3.9 (phụ lục 20) Bảng 3.9. Hoạt tính của protein P(UI) biến đổi theo pH pH ∆OD1 ∆OD2 ∆OD P(UI/ml) 7.0 0.355 0.087 O.268 72.34 7.5 0.295 0.030 0.265 71.65 8.0 0.232 0.067 0.228 60.80 8.5 0.275 0.064 0.211 56.01 9.0 0.271 0.072 0.200 52.77 50.00 5 .00 60.0 65.00 70.00 75.00 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 pH Ho ạt tín h P (U I/m l) Hình 3.8 Hoạt tính của protein P(UI/ml) trong nhựa khơ biến đổi theo pH Nhận xét: 45 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Khi tăng dần giá trị pH lên thì đồng thời hoạt tính protein cũng tăng lên sau đĩ giảm xuống rất nhanh, đều này chứng tỏ rằng pH đĩng một vai trị rất quan trọng cho sự tồn tại của enzyme trong mơi trường do pH ảnh hưởng đến mức độ ion hĩa của các enzyme và phần nào quyết định dạng tồn tại và hoạt tính của chúng. Và khi pH = 7 – 7.5 thì hoạt tính protein trong nhựa khơ đạt giá trị cao nhất so với các giá trị cịn lại. 3.10.2 Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ Cân 0.0224 g nhựa khơ hịa tan trong 100ml nước cất. Sau đĩ tiến hành thí nghiệm xác định hoạt tính protein trong nhựa khơ theo phương pháp Anson ở các khoảng nhiệt độ khác nhau từ nhiệt độ t = 40OC đến 90oC (với ∆t = 5OC), pH dung dịch đệm được giữ cố định ở pH = 7.6. Kết quả được trình bày trong bảng 3.10: Bảng 3.10. Hoạt tính của protein P(UI) trong nhựa khơ biến đổi theo nhiệt độ t O C ∆OD1 ∆OD2 P(UI/ml) 45 0.1053 0.0646 17.728 50 0.1108 0.0652 21.276 55 0.1619 0.0559 25.844 60 0.2731 0.0659 54.957 65 0.2525 0.0718 59.178 70 0.4136 0.0702 70.560 75 0.1678 0.0415 23.758 80 0.1993 0.0532 28.059 85 0.1697 0.0559 21.075 90 0.1366 0.0486 15.524 46 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 0 10 20 30 40 50 60 70 80 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 Nhiệt độ ( o C) Ho ạt tí nh P (U I/m l) Hình 3.9:Hoạt tính của protein trong nhựa khơ theo nhiệt độ Nhận xét: Khi nhiệt độ thay đổi thì hoạt tính cũng thay đổi đáng kể theo nhiệt độ, tăng dần khi nhiệt độ tăng và đạt giá trị cực đại khi lên tới 70OC và sau đĩ lại giảm dần. Nguyên nhân cĩ thể là do khi ta tăng nhiệt độ thì các protein trong nhựa khơ sẽ thay đổi cấu trúc tâm hoạt động của chúng chuyển từ dạng bất hoạt hay ở dạng cĩ hoạt tính kém do quá trình phân hủy hay oxy hĩa thành dạng hoạt hĩa nên dẫn đến hoạt tính tăng cao, nhưng khi nhiệt độ tăng quá cao thì nĩ lại chuyển thành dạng bất hoạt cĩ khi bất hoạt hồn tồn do cấu trúc tâm hoạt động đã bị thay đổi. Qua các kết quả khảo sát trên chúng tơi nhận thấy rằng: hoạt tính của enzyme papain sau các giai đoạn tinh chế giảm dần đồng thời với lượng protein cũng giảm dần. Do đĩ, chúng tơi sử dụng nhựa đu đủ đã đơng khơ để làm xúc tác cho phản ứng thủy phân protein trong bánh dầu đậu phộng mà khơng tiến hành tinh chế. 3.11 KHẢO SÁT HÀM LƢỢNG ĐẠM FORMOL VÀ AMONIAC THEO THỜI GIAN TRONG PHẢN ỨNG THỦY PHÂN. Tiến hành phản ứng thủy phân protein trong bánh dầu đậu phộng ở điều kiện nhiệt độ phản ứng là 70OC và pH của phản ứng là 7.0 với các hàm lượng xúc tác khác nhau. Sau mỗi 2 giờ phản ứng, cân 10ml dung dịch thủy giải từ bình phản ứng, thêm nước sơi để ngừng phản ứng, định mức thành 100ml dung dịch đem lọc. Hút 47 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 10ml dịch lọc đem xác định đạm formol theo phương pháp Sorensen. Kết quả được trình bày trong bảng 3.11 – 3.13: Bảng 3.11: Biến thiên hàm lƣợng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 0.25% so với cơ chất. Bảng 3.12: Biến thiên hàm lƣợng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 0.50% so với cơ chất. Bảng 3.13: Biến thiên hàm lƣợng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 1.00% so với cơ chất. Sự biến thiên hàm lượng đạm formol ở các hàm lượng xúc tác khác nhau được biểu diễn qua đồ thị hình 3.10 Thời gian phản ứng 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Hàm lượng đạm formol trung bình của dịch thủy phân (g/l) 1.1 1.4 1.8 2.0 2.2 2.4 2.5 2.9 3.1 3.4 3.5 3.6 3.6 Thời gian phản ứng 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Hàm lượng đạm formol trung bình của dịch thủy phân (g/l) 1.9 2.9 3.2 3.5 3.8 4.1 4.2 4.6 4.9 6.1 7.2 8.6 8.6 Thời gian phản ứng 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Hàm lượng đạm formol trung bình của dịch thủy phân (g/l) 1.4 2.8 3.5 4.9 6.3 7.0 7.7 8.3 8.4 8.8 9.1 9.2 9.2 48 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Biến thiên hàm lƣợng đạm formol theo thời gian 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 Thời gian phản ứng (giờ) Hà m lƣ ợn g đ ạm fo rm ol (g /l) Nổng độ xúc tác 0.25% Nồng độ xúc tác 0.50% Nồng độ xúc tác 1.00% Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lƣợng đạm formol theo thời gian phản ứng. Bảng 3.14: Biến thiên hàm lƣợng đạm amoniac ở các nồng độ enzyme khác nhau Nhận xét: Hàm lượng đạm amin = hàm lượng đạm formol – hàm lượng đạm amoniac. Qua kết quả khảo sát trên, hàm lượng đạm amoniac của dịch thủy phân dao động từ 0.06 – 0.07g/l. Như vậy hàm lượng đạm amoniac của dịch thủy phân rất thấp so với các chỉ tiêu cho phép của nước chấm và xem như khơng đáng kể. Do đĩ trong các khảo sát về ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme so với cơ chất cũng như các điều Nồng độ enzyme (%) 0.25 0.50 1.00 Hàm lượng đạm amoniac trung bình của dịch thủy phân (g/l) 0.06 0.07 0.07 49 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM kiện ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân chúng tơi khơng xét đến hàm lượng đạm amoniac của dịch thủy phân. Sau 24 giờ phản ứng, hàm lượng đạm formol đạt tối đa là 9.2 và nếu cứ tiếp tục phản ứng thủy phân thì hàm lượng đạm formol khơng tăng lên nữa điều này chứng tỏ phản ứng đã kết thúc. Do đĩ chúng tơi đã ngưng tất cả các phản ứng khảo sát sau 24 giờ. 3.12 KHẢO SÁT PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG VỚI XÚC TÁC PAPAIN THƠ. Qua tham khảo các tài liệu, chúng tơi tiến hành phản ứng thủy phân bánh dầu đậu phộng sau khi đã loại béo với tỉ lệ bánh dầu đậu phộng và đệm phosphate là 1:10. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH và nồng độ của xúc tác đến phản ứng thủy phân theo thời gian. Hàm lượng protein trong đậu phộng (bao gồm cả protein tan và khơng tan) được xác định thơng qua hàm lượng nitơ tổng xác định bằng phương pháp Kjeldalh. Kết quả thu được như sau: V = 17.5 (ml) P (hàm lượng protein ban đầu) = hàm lượng Nitơ tổng * 5.91 = 17.5*5.91*1.4 = 145.4 (mg/g) Hàm lượng protein trong 5g mẫu cho phản ứng Mđậu phộng = 145.4*5 = 725.2 (mg/g) Hàm lượng protein tan cĩ trong nhựa đu đủ đơng khơ được xác định theo phương pháp Lowry là: M = ((0.4545 + 0.0004)/0.0007) = 649.85 (mg/g). Hàm lượng protein tan cĩ trong mẫu đậu phộng được xác định theo phương pháp Lowry là: M = ((0.2525 + 0.0004)/0.0007) = 361.25 (mg/g) Chúng tơi đã tiến hành phản ứng thủy phân protein trong bánh dầu đậu phộng ở những điều kiện khác nhau và thu được các kết quả như sau: 50 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 3.12.1. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.25% so với cơ chất theo thời gian Ở hàm lượng xúc tác là 0.25%, phản ứng được thực hiện ở 3 giá trị pH khác nhau là 6, 7, 8. Tương ứng với mỗi giá trị pH, tiến hành khảo sát 3 giá trị nhiệt độ là 60 O C, 70 O C, 80 O C. Sau mỗi 2 giờ phản ứng, cân 0.1g dung dịch phản ứng định mức thành 100ml bằng nước sơi để ngừng phản ứng thủy phân. Rút 0.4ml dung dịch phản ứng đã pha lỗng để xác định hàm lượng protein hịa tan theo phương pháp Lowry. Hiệu suất gần đúng của phản ứng thủy phân H(%) được tính theo cơng thức như sau: 100* P G H  Trong đĩ: H: hiệu suất gần đúng của phản ứng thủy phân (%). G: hàm lượng protein tan của dung dịch sau thủy phân xác định theo phương pháp Lowry. P: hàm lượng protein ban đầu (tan và khơng tan) trong bánh dầu đậu phộng xác định theo phương pháp Kjeldahl. Tại pH 6.0 chúng tơi thu được kết quả như bảng 3.15 – 3.17. 51 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Bảng 3.15. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60OC và hàm lƣợng xúc tác là 0.25% Thời gian thủy phân (giờ) Mật độ quang 750nm (AU) Hàm lượng protein (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) 2 0.1320 189.14 19.97% 4 0.1435 205.57 22.24% 6 0.1554 222.57 24.58% 8 0.1668 238.86 26.82% 10 0.1789 256.14 29.21% 12 0.1802 258.00 29.46% 14 0.1857 265.86 30.54% 16 0.1898 271.71 31.35% 18 0.1921 275.00 31.80% 20 0.1956 280.00 32.49% 22 0.1999 286.14 33.34% 24 0.2034 291.14 34.03% Bảng 3.16. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 70OC và hàm lƣợng xúc tác là 0.25% Thời gian thủy phân (giờ) Mật độ quang 750nm (AU) Hàm lượng protein (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) 2 0.1460 209.14 22.73% 4 0.1537 220.14 24.24% 6 0.1676 240.00 26.98% 8 0.1789 256.14 29.21% 0 0.1807 258.71 29.56% 12 0.1857 265.86 30.54% 14 0.1878 268.86 30.96% 16 0.1913 273.86 31.65% 18 0.1921 275.00 31.80% 20 0.1956 280.00 32.49% 22 0.1968 281.71 32.73% 24 0.2059 294.71 34.52% 52 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Bảng 3.17. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 80OC và hàm lƣợng xúc tác là 0.25% Thời gian thủy phân (giờ) Mật độ quang 750nm (AU) Lượng protein (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) 2 0.1102 156.86 15.52% 4 0.1234 175.71 18.12% 6 0.1278 182.00 18.99% 8 0.1302 185.43 19.46% 10 0.1311 186.71 19.64% 12 0.1345 191.57 20.31% 14 0.1346 191.71 20.33% 16 0.1358 193.43 20.56% 18 0.1489 212.14 23.14% 20 0.1460 208.00 22.57% 22 0.1613 229.84 25.58% 24 0.1850 263.71 30.25% Nhận xét: tại giá trị pH 6.0 và hàm lượng xúc tác là 0.25% nhiệt độ khơng ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất phản ứng (hiệu suất cao nhất là 34.52% ở 70OC và thấp nhất là 30.25% ở 80oC). Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng (pH 6.0, Nồng độ xúc tác 0.25%) 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Thời gian phản ứng (giờ) Hi ệu su ất p hả n ứn g (% ) 60oC 70oC 80oC Hình 3.11. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 6.0 và hàm lƣợng xúc tác là 0.25%. 53 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Tại pH 7.0 chúng tơi thu được kết quả như bảng 3.18 - 3.20 Bảng 3.18. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 60OC và hàm lƣợng xúc tác là 0.25% Thời gian thủy phân (giờ) Mật độ quang 750nm (AU) Lượng protein (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) 2 0.1345 192.71 20.46% 4 0.1421 203.57 21.96% 6 0.1433 205.29 22.20% 8 0.1503 215.29 23.58% 10 0.1756 251.43 28.56% 12 0.1878 268.86 30.96% 14 0.1898 271.71 31.35% 16 0.1902 272.29 31.43% 18 0.1921 275.00 31.80% 20 0.1933 276.71 32.04% 22 0.2011 287.86 33.58% 24 0.2168 310.29 36.67% Bảng 3.19. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 70OC và hàm lƣợng xúc tác là 0.25% Thời gian thủy phân (giờ) Mật độ quang 750nm (AU) Lượng protein (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) 2 0.1510 216.29 23.71% 4 0.1543 221.00 24.36% 6 0.1602 229.43 25.52% 8 0.1654 236.86 26.55% 10 0.1787 255.86 29.17% 12 0.1905 272.71 31.49% 14 0.1911 273.57 31.61% 16 0.1923 275.29 31.84% 18 0.1998 286.00 33.32% 20 0.2014 288.29 33.64% 22 0.2056 294.29 34.46% 24 0.2211 316.43 37.51% 54 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Bảng 3.20. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 80OC và hàm lƣợng xúc tác là 0.25% Thời gian thủy phân (giờ) Mật độ quang 750nm (AU) Lượng protein (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) 2 0.1221 175.00 18.02% 4 0.1248 178.86 18.55% 6 0.1303 186.71 19.64% 8 0.1421 203.57 21.96% 10 0.1532 219.43 24.15% 12 0.1655 237.00 26.57% 14 0.1733 248.14 28.10% 16 0.1854 265.43 30.49% 18 0.1876 268.57 30.92% 20 0.1899 271.86 31.37% 22 0.1956 280.00 32.49% 24 0.2073 296.71 34.80% Nhận xét: So với pH 6.0, tại giá trị pH 7.0 hiệu suất phản ứng cĩ tăng đơi chút. Hiệu suất cao nhất là 37.51% ở 70OC và thấp nhất là 34.80% ở 80OC. Trong khoảng từ 2 đến 18 giờ, hiệu suất phản ứng tăng rõ rệt, đặc biệt tăng mạnh trong khoảng từ 8 đến 14 giờ. Hiệu suất phản ứng ở 80OC thường thấp hơn so với 60OC. Điều này cĩ thể được giải thích do nhiệt độ tăng cao làm bất hoạt tâm hoạt động của enzyme. 55 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng (pH 7.0, Nồng độ xúc tác 0.25%) 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Thời gian phản ứng (giờ) Hi ệu su ất p hả n ứn g (% ) 60oC 70oC 80oC Hình 3.12. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 7.0 và hàm lƣợng xúc tác là 0.25%. Hiệu suất phản ứng thủy phân tại pH 8.0 được trình bày trong bảng 3.21 – 3.23 Bảng 3.21. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 60OC và hàm lƣợng xúc tác là 0.25% Thời gian thủy phân (giờ) Mật độ quang 750nm (AU) Lượng protein (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) 2 0.1355 194.14 20.66% 4 0.1434 205.43 22.22% 6 0.1473 211.00 22.98% 8 0.1511 216.43 23.73% 10 0.1632 233.71 26.12% 12 0.1768 253.14 28.79% 14 0.1805 258.43 29.52% 16 0.1909 273.29 31.57% 18 0.1912 273.71 31.63% 20 0.1933 276.71 32.04% 22 0.2011 287.86 33.58% 24 0.2076 297.14 34.86% 56 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Bảng 3.22. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 70OC và hàm lƣợng xúc tác là 0.25% Thời gian thủy phân (giờ) Mật độ quang 750nm (AU) Lượng protein (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) 2 0.1521 217.86 23.93% 4 0.1556 222.86 24.62% 6 0.1608 230.29 25.64% 8 0.1657 237.29 26.61% 10 0.1732 248.00 28.08% 12 0.1970 282.00 32.77% 14 0.1987 284.43 33.10% 16 0.1990 284.86 33.16% 18 0.1998 286.00 33.32% 20 0.2029 290.43 33.93% 22 0.2053 293.86 34.40% 24 0.2197 314.43 37.24% Bảng 3.23. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 80OC và hàm lƣợng xúc tác là 0.25% Thời gian thủy phân (giờ) Mật độ quang 750nm (AU) Lượng protein (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) 2 . 203 172.43 17.67% 4 . 254 179.71 18.67% 6 0.1306 187.14 19.70% 8 0.1423 203.86 22.00% 10 0.1566 224.29 24.82% 12 0.1676 240.00 26.98% 14 0.1730 247.71 28.04% 16 0.1823 261.00 29.88% 18 0.1836 262.86 30.13% 20 0.1858 266.00 30.56% 22 0.1960 280.57 32.57% 24 0.2005 287.00 33.46% 57 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Nhận xét: So với pH 6.0 và pH 7.0 hiệu suất phản ứng ở pH 8.0 cĩ phần giảm nhẹ. Hiệu suất cao nhất là 37.24% ở 70OC và thấp nhất là 33.46% ở 80OC. Trong khoảng từ 2 đến 18 giờ, hiệu suất phản ứng tăng rõ rệt, đặc biệt tăng mạnh trong khoảng từ 8 đến 14 giờ. Hiệu suất phản ứng ở 80OC thường thấp hơn so với 60OC. Điều này cĩ thể được giải thích do nhiệt độ tăng cao làm bất hoạt tâm hoạt động của enzyme. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng (pH 8.0, Nồng độ xúc tác 0.25%) 10.00 15.00 2 .00 25.00 30.00 35.00 40.00 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Thời gian phản ứng (giờ) Hi ệu su ất ph ản ứ ng (% ) 60oC 70oC 80oC Hình 3.13. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 8.0 và hàm lƣợng xúc tác là 0.25%. Qua các điều kiện khảo sát, chúng tơi nhận thấy rằng phản ứng thủy phân với hàm lượng xúc tác là 0.25% cĩ hiệu suất cao nhất ở pH 7.0 và nhiệt độ là 70oC. Nhiệt độ 70OC pH 6.0 7.0 8.0 Hiệu suất (%) 34.52 37.51 37.24 3.12.2. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.50% so với cơ chất theo thời gian Ở hàm lượng xúc tác là 0.50%, phản ứng được thực hiện ở 3 giá trị pH khác nhau là 6, 7, 8. Tương ứng với mỗi giá trị pH, tiến hành khảo sát 3 giá trị nhiệt độ là 58 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 60 O C, 70 O C, 80 O C. Sau mỗi 2 giờ phản ứng, cân 0.1g dung dịch phản ứng định mức thành 100ml bằng nước sơi để ngừng phản ứng thủy phân. Rút 0.4ml dung dịch phản ứng đã pha lỗng để xác định hàm lượng protein hịa tan theo phương pháp Lowry. Bảng 3.24. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60OC và hàm lƣợng xúc tác là 0.50% Thời gian thủy phân (giờ) Mật độ quang 750nm (AU) Lượng protein (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) 2 0.0821 235.71 25.89% 4 0.0996 285.71 32.78% 6 0.1013 290.57 33.45% 8 0.1120 321.14 37.66% 10 0.1245 356.86 42.59% 12 0.1307 374.57 45.03% 14 0.1342 384.57 46.41% 16 0.1398 400.57 48.61% 18 0.1425 408.29 49.67% 20 0.1487 426.00 52.12% 22 0.1509 432.29 52.98% 24 0.1624 465.14 57.51% 59 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Bảng 3.25. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 70OC và hàm lƣợng xúc tác là 0.50% Thời gian thủy phân (giờ) Mật độ quang 750nm (AU) Lượng protein (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) 2 0.0825 236.86 26.05% 4 0.0999 286.57 32.90% 6 0.1025 294.00 33.92% 8 0.1131 324.29 38.10% 10 0.1256 360.00 43.02% 12 0.1320 378.29 45.54% 14 0.1349 386.57 46.68% 16 0.1410 404.00 49.08% 18 0.1439 412.29 50.23% 20 0.1498 429.14 52.55% 22 0.1523 436.29 53.53% 24 0.1659 475.14 58.89% Bảng 3.26. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 80 O C và hàm lƣợng xúc tác là 0.50% Thời gian thủy phân (giờ) Mật độ quang 750nm (AU) Lượng protein (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) 2 0.0768 220.57 23.80 4 0.0886 254.29 28.45% 6 0.0945 271.14 30.77% 8 0.1032 296.00 34.20% 10 0.1153 330.57 38.96% 12 0.1275 365.43 43.77% 14 0.1369 392.29 47.47% 16 0.1404 402.29 48.85% 18 0.1417 406.00 49.36% 20 0.1458 417.71 50.97% 22 0.1503 430.57 52.75% 24 0.1600 458.29 56.57% 60 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Nhận xét: so với hàm lượng xúc tác là 0.25%, ở hàm lượng xúc tác 0.50% hiệu suất phản ứng tương đối cao và trong khoảng 16 giờ phản ứng hiệu suất phản ứng tăng rõ rệt, nhưng sau đĩ hiệu suất phản ứng dao động trong khoảng tương đối hẹp. Ở pH 6.0, hiệu suất cao nhất là 70OC, tuy nhiên khơng cĩ sự chênh lệch nhiều về hiệu suất phản ứng ở các nhiệt độ khác nhau (60 – 80OC). Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng (pH 6.0, Nồng độ xúc tác 0.50%) 10.00 20.00 30.00 40. 0 50.00 60.00 70.00 80.00 90.00 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Thời gian phản ứng (giờ) Hi ệu su ất ph ản ứ ng (% ) 60oC 70oC 80oC Hình 3.14. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 6.0 và hàm lƣợng xúc tác là 0.50%. Hiệu suất thủy phân tại pH 7.0 được trình bày trong bảng 3.27 – 3.29 Bảng 3.27. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 60OC và hàm lƣợng xúc tác là 0.50% Thời gian thủy phân (giờ) Mật độ quang 750nm (AU) Lượng protein (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) 2 0.0975 279.71 31.34% 4 0.0996 285.71 3