Luận văn Thiết kế và nghiên cứu hệ thống Bioreactor cho cây dứa Cayenne

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** NGUYỄN BẰNG PHI THIẾT KẾ VÀ NGHIÊN CƢ́U HÊ ̣THỐNG BIOREACTOR CHO CÂY DƢ́A CAYENNE Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh -2006- 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** THIẾT KẾ VÀ NGHIÊN CƢ́U HÊ ̣THỐNG BIOREACTOR CHO CÂY DƢ́A CAYENNE Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TRẦN THỊ DUNG NGUYỄN BẰNG PHI NGUYỄN VĂN HÙNG Thành phố Hồ Chí Minh -2006- 3 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ************ DESIGN AND RESEARCH BIOREACTOR SYSTEM FOR CAYENNE PINEAPPLE Graduation thesis Major: Biotechnology Professor Student TRAN THI DUNG NGUYỄN BẰNG PHI NGUYỄN VĂN HÙNG Ho Chi Minh City -2006- 4 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP THIẾT KẾ VÀ NGHIÊN CỨU HỆ THỐNG BIOREACTOR CHO CÂY DỨA CAYENNE NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NIÊN KHÓA: 2002 – 2006 SINH VIÊN THỰC HIỆN: NGUYỄN BẰNG PHI Thành phố Hồ Chí Minh 2006 5 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC THIẾT KẾ VÀ NGHIÊN CỨU HỆ THỐNG BIOREACTOR CHO CÂY DỨA CAYENNE GVHD: TS. TRẦN THỊ DUNG SVTH: NGUYỄN BẰNG PHI TS. NGUYỄN VĂN HÙNG MSSV: 02126078 Thành phố Hồ Chí Minh 2006 6 LỜI CẢM TẠ Để hoàn tất cuốn luận văn này tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giảng dạy, góp ý, giúp đỡ của các thầy cô, bạn bè và gia đình. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: -Ba mẹ đã dày công nuôi dưỡng, dạy dỗ con -Các Thầy cô Bộ môn Công Nghệ Sinh Học- trường Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. - TS.TRẦN THỊ DUNG, Trưởng Bộ môn Công Nghệ Sinh Học- Trường Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. - TS.NGUYỄN VĂN HÙNG, Trưởng Bộ môn điều khiển tự động khoa Cơ khí Trường Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh -KS.NGÔ THANH HOÀNG, Giảng viên khoa Cơ khí- Trường Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh -Các kỹ sư ở Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học- Trường Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. -Tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học 28 Tháng 08 năm 2006 Nguyễn Bằng Phi 7 TÓM TẮT NGUYỄN BẰNG PHI, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 08/2006. “THIẾT KẾ VÀ NGHIÊN CỨU HỆ THỐNG BIOREACTOR CHO CÂY DỨA CAYENNE” Hội đồng hướng dẫn:  TS. Trần Thị Dung  TS.Nguyễn Văn Hùng Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Công nghệ sinh học-Trường Đại học Nông Lâm Tp. HCM trên đối tượng cây dứa Cayenne in vitro. Tiến hành nhân chồi dứa Cayenne bằng bioreactor. Mẫu cấy là chồi dứa 3 tháng tuổi của phòng Nuôi cấy mô thực vật, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học- Đại Học Nông Lâm tp.HCM. Chồi dứa nuôi cấy 6 tuần bằng bioreactor. Quá trình thực hiện bao gồm 2 giai đoạn : +Giai đoạn 1: Thiết kế hệ thống bioreactor sục khí tự tạo và bioreactor ngâm chìm định kỳ tự tạo. +Giai đoạn 2: Nghiên cứu hệ thống bioreactor trên qua 2 thí nghiệm : Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố thể tích dinh dưỡng trong hệ thống bioreactor sục khí đối với hệ số nhân chồi Thí nghiệm 2: Thay đổi yếu tố thời gian đối vơi hệ thống bioreactor ngâm chìm định kỳ(Temporary immersion bioreactor) Những kết quả thu được : +Bioreactor sau khi thiết kế đã hoạt động tốt. +Hình thức nuôi cấy cây dứa bằng bioreactor sục khí là không phù hợp cho sự phát triển của cây dứa. +Thể tích môi trường 1,5L cho kết quả khả quan hơn so với thể tích 1L khi nuôi cấy bằng bioreactor sục khí liên tục. +Bioreactor sục khí liên tục giúp cho cây dứa phát triển tốt hơn so với bioreactor sục khí gián đoạn. 8 +Bioreactor ngâm chìm định kỳ là loại bioreactor phù hợp cho sự phát triển của cây dứa. +Bioreactor ngâm chìm định kỳ với thời gian ngâm chìm định kỳ 10’/2h cho hiệu quả nhân chồi dứa tốt nhất. 9 MỤC LỤC Trang Tóm tắt luận văn ......................................................................................................... 7 Danh sách các bảng .................................................................................................... 11 Danh sách các hình ..................................................................................................... 12 Danh mục viết tắt ........................................................................................................ 13 Phần 1 : Giới thiệu 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................ 14 1.2. Mục đích-yêu cầu ................................................................................................. 15 1.3. Giới hạn đề tài ...................................................................................................... 15 Phần 2 : Tổng quan tài liệu 2.1. Đặc điểm thực vật học và sinh thái cây dứa ........................................................ 16 2.2.Phân loại .............................................................................................................. 17 2.3. Các nhóm dứa chính và các giống dứa phổ biến ở Việt Nam ............................. 18 2.4. Tình hình sản xuất và sản lượng dứa ................................................................... 20 2.5. Giới thiệu về nuôi cấy mô ................................................................................... 22 2.6. Các yếu tố ảnh hưởng trong nuôi cấy invitro ...................................................... 25 2.7. Tổng quan về bioreactor ...................................................................................... 28 2.8. Giới thiệu các phương pháp nhân chồi cây dứa .................................................. 34 2.9. Các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình nuôi cấy ngâm chìm điṇh kỳ .................. 38 2.10. Ảnh hưởng hệ thống ngâm chìm định kỳ đến chất lượng cây trồng ................. 40 2.11. Ảnh hưởng của hệ thống ngập chìm đến chi phí sản xuất ................................. 44 2.12. Các nghiên cứu và ứng dụng bioreactor trên đối tượng cây dứa ...................... 44 Phần 3 : Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu 3.1. Thời gian và địa điểm .......................................................................................... 45 3.2 Nội dung nghiên cứu ............................................................................................ 45 3.3 Vật liệu ................................................................................................................. 45 3.4. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 45 3.4.1Thiết kế hệ thống tự động cho bioreactor sục khí tự tạo và ngâm chìm định kỳ (TIB) ..................................................................................................... 45 10 3.4.2 Tiến hành thí nghiệm ......................................................................................... 48 3.5. Xử lý số liệu ........................................................................................................ 50 Phần 4 : Kết quả và thảo luận 4.1 Thiết kế hệ thống tự động cho bioreactor sục khí tự tạo và ngâm chìm định kỳ (TIB) ........................................................................................................................... 51 4.1.1Thiết kế hệ thống tự động bioreactor sục khí tự tạo ........................................... 51 4.1.2 Thiết kế hệ thống bioreactor ngâm chìm định kỳ tự động ................................ 51 4.2 Kết quả thí nghiệm ............................................................................................... 53 4.2.1 Thí nghiệm 1 Khảo sát hiệu quả nhân chồi dứa bằng bioreactor sục khí liên tục. .......................................................................................... 53 4.2.2 Thí nghiệm 2 : Ảnh hưởng của thời gian ngâm chìm định kỳ đến khả năng nhân chồi dứa bằngTIB ............................................................................... 55 Phần 5 : Kết luận và đề nghị 5.1. Kết luận................................................................................................................ 60 5.2. Đề nghị ............................................................................................................... 60 Tài liệu tham khảo ...................................................................................................... 61 Phần phụ lục ............................................................................................................... 63 11 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 3.1 Các nghiệm thức của thí nghiệm 1a ........................................................... 45 Bảng 3.2 Các nghiệm thức của thí nghiệm 1b ........................................................... 45 Bảng 3.3 Các nghiệm thức của thí nghiệm 2 ............................................................. 45 Bảng 4.1- Các chỉ tiêu theo dõi của thí nghiệm 1a .................................................... 49 Bảng 4.2- Ảnh hưởng của yếu tố thể tích đến hệ số nhân chồi của cây dứa Cayenne trong bình bioreactor sục khí liên tục ........................................................................ 49 Bảng 4.3- Các chỉ tiêu theo dõi của thí nghiệm 1b .................................................... 51 Bảng4.4- Ảnh hưởng của yếu tố thể tích đến hệ số nhân chồi của cây dứa Cayenne trong bình bioreactor sục khí gián đoạn .................................................................... 51 Bảng 4.5- Các chỉ tiêu theo dõi của thí nghiệm 2 ...................................................... 53 Bảng 4.6- Ảnh hưởng của yếu tố thời gian ngâm chìm đến hệ số nhân chồi của cây dứa Cayenne trong bình bioreactor TIB .............................................................. 54 12 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình Trang Hình 2.1- Cấu trúc bioreactor ............................................................................ 26 Hình 3.1- Sơ đồ lắp ráp hệ thống bioreactor sục khí hình cầu kiểu Hàn Quốc .... 42 Hình 3.2-Sơ đồ lắp ráp hệ thống bioreactor ngâm chìm định kỳ.......................... 43 Hình 4.1-Bioreactor sục khí .................................................................................. 47 Hình 4.2- Sơ đồ mạch điện thiết kế cho TIB tự động ........................................... 47 Hình 4.3-Hộp điều khiển tự động TIB tự chế ....................................................... 48 Hình 4.4-Chồi dứa sau 4 tuần nuôi cấy trong bình bioreactor sục khí liên tục và sục khí gián đoạn .............................................................................................. 50 Hình 4.5- Chồi dứa sau 4 tuần nuôi cấy trong bình TIB 10’/2h ........................... 53 Hình 4.6-Biểu đồ hệ số nhân chồi ......................................................................... 55 13 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BAP : 6-benzylaminopurine GA3 : Gibberellic acid IAA : Indole-3-acetic acid IBA : Indole-3-butyric acid NAA : -Naphthaleneacetic acid TDZ : Thidiazuron MS : Môi trường Murashige và Skoog, 1962 TIB : Temporary immersion bioreactor 14 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Nước ta thuộc vùng nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm khá phù hợp cho nhiều loại cây trồng khác nhau phát triển. Dứa là cây ăn quả nhiệt đới, là một trong ba loại cây ăn quả hàng đầu của nước ta (chuối-dứa-cam quýt) dùng để ăn tươi, đặc biệt có thể chế biến xuất khẩu. Chính vì vậy, cây dứa được trồng ở nhiều vùng trong nước và với điều kiện thích hợp nhiệt độ và ẩm độ cao thì cây dứa có thể sinh trưởng quanh năm. Do là loại cây không kén đất, dứa có thể trồng ở vùng gò đồi, đất dốc (200 trở xuống), đất xấu nghèo dinh dưỡng. Vì vậy chúng ta có thể nói cây dứa giúp con người tận dụng quỹ đất để có thêm sản phẩm và mang lại hiệu quả kinh tế khi thu hoạch. Dứa còn dùng để chiết xuất enzyme bromelin dùng trong công nghiệp thuộc da, vật liệu làm film. Quả dứa dùng để chế biến đồ hộp, làm rượu, giấm, nước ép, nước cô đặc, làm bột dứa dùng cho giải khát….. Lá dứa dùng để lấy sợi (2-2.5% cellulose). Chính vì khả năng ứng dụng khá lớn của cây dứa mà cây dứa ngày càng chiếm vị thế quan trọng được thể hiện qua năm 1993 thì kim ngạch xuất khẩu chỉ đạt 658 triệu đô la Mỹ và cho đến năm 1998 thì đã đạt 3450 triệu đô la Mỹ. Để phục vụ nhu cầu ngày càng cao của con người thì việc tận dụng lại chồi con của cây dứa từ cây mẹ không mang lại hiệu quả kinh tế. Do những cây này thường cho quả nhỏ dần trong các mùa vụ sau. Việc cung ứng đủ giống dứa đạt chất lượng và sạch bệnh là vấn đề cấp thiết. Nhân giống vô tính in vitro có thể đáp ứng được những yêu cầu về chất lượng đồng đều với số lượng lớn. Tuy nhiên việc nhân chồi dứa bằng phương pháp nuôi cấy mô vi nhân giống tốn nhiều chi phí về lao động, phải cấy từng chai một trong điều kiện vô trùng nghiêm ngặt, và phải cấy chuyền sau khoảng 4-6 tuần do cạn kiệt môi trường dinh dưỡng. Việc sản xuất giống ở quy mô công nghiệp khó có thể thực hiện một cách tự động hóa được. Từ những thực trạng đó, năm 1981 Takayama lần đầu tiên ứng dụng bioreactor để nhân giống với số lượng lớn trên đối tượng cây Begonia. Qua quá trình phát triển, nhiều kiểu bioreactor khác nhau ra đời như : bioreactor sục khí, bioreactor khuấy, bioreactor ngâm chìm định kỳ....Trong đó, bioreactor ngâm chìm định kỳ trong môi trường lỏng đem lại hiệu quả cao hơn phương pháp nhân giống thông thường trên 15 môi trường thạch và phương pháp nuôi cấy trong dịch lỏng có khuấy và sục khí liên tục, đồng thời cây con khi ra vườn cũng tốt hơn so với cây con nuôi ở môi trường thạch. Hiện nay ở Việt Nam những nghiên cứu về bioreactor còn rất ít, đặc biệt là trên đối tượng cây dứa. Do vậy, đề tài : “ THIẾT KẾ VÀ NGHIÊN CỨU HỆ THỐNG BIOREACTOR CHO CÂY DỨA CAYENNE” được tiến hành tại Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học Đại Học Nông Lâm Tp.HCM. 1.2 Mục đích - Yêu cầu Mục đích Xác định được cấu trúc, cách vận hành và mô hình của hệ thống bioreactor ngâm chìm định kỳ trong môi trường lỏng (temporary immersion bioreactor (TIB)) cho cây dứa. So sánh hiệu quả nhân chồi giữa 2 kiểu bioreactor : ngâm chìm định kỳ và sục khí. Xác định thời gian ngâm chìm định kỳ trong TIB thích hợp để cho hiệu quả nhân chồi cây dứa tốt nhất. Yêu cầu Nắm được cấu trúc và cách vận hành hệ thống bioreactor ngâm chìm định kỳ trong môi trường lỏng(TIB) Đánh giá hiệu quả nhân chồi của hệ thống bioreactor ngâm chìm định kỳ(TIB) 1.3 Giới hạn đề tài : - Do giới hạn về thời gian và điều kiện trang thiết bị thí nghiệm nên đề tài chỉ tiến hành quá trình nhân chồi trong phòng thí nghiệm, chưa thực hiện thí nghiệm ngoài đồng - Do giới hạn về kinh phí nên hệ thống điều khiển chưa kiểm soát các yếu tố pH, dinh dưỡng, ánh sáng ... trong quá trình nuôi cấy một cách tự động. 16 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm thực vật học và sinh thái cây dứa  Đặc điểm thực vật học Dứa là cây thân thảo lâu năm, thuộc lớp đơn tử diệp. Sau khi thu hoạch quả các mầm nách ở thân tiếp tục phát triển và hình thành một cây mới giống như cây trước; quả thứ hai thường bé hơn quả trước. Cây dứa trưởng thành cao đến 1 m và rộng 0,5 m trong khi cây dứa Smooth Cayenne trưởng thành cao 1,5 m và có đường kính từ 1,3 – 1,5 m. Đây là giống dứa được trồng nhiều nhất trên thế giới. Hoa Hoa gồm có 3 lá đài, 3 cánh hoa, 6 nhị đực xếp thành 2 vòng tròn, 1 nhị cái có 3 tâm bì và bầu hạ. Cánh hoa màu xanh, đỏ tía, gốc có màu trắng nhạt và trên mặt cánh hoa có những vảy. Tràng hoa dạng ống dài hơi loe ở phía đầu, ở giữa lồi lên 3 núm nhụy tím mờ của vòi nhụy. Hoa tự bất thụ (self-sterile) và phát triển quả không hạt; thụ phấn nhờ gió không xảy ra và sinh sản hữu tính hiếm thấy trong tự nhiên. Nhân giống vô tính là hình thức sinh sản tiêu biểu sử dụng chồi bao gồm chồi đỉnh, chồi bên và chồi rễ. Quả Quả dứa thuộc loại quả tụ do 100 – 200 quả nhỏ hợp lại. Các giống khác nhau thì hình dạng quả và mắt quả cũng khác nhau. Bộ phận ăn được của dứa là do trục của chùm hoa và lá bắc phát triển nên. Sau khi hoa tàn thì quả bắt đầu phát triển. Hạt Hạt dứa nhỏ, màu tím đen, có vỏ và nội nhủ rất cứng, tỉ lệ nảy mầm thấp và bất thường nếu không qua tiền xử lí. Mỗi quả con chỉ có vài hạt. Dứa thường không hạt nếu để thụ phấn tự do. Hạt dứa thường do thụ phấn nhân tạo và được sử dụng trong các chương trình lai tạo giống mới. Thân Thân cây dứa chia làm 2 phần: một phần trên mặt đất và một phần dưới mặt đất. Phần ở trên thường bị các lá che kín nên khó nhìn thấy. Khi cây đã phát triển đến mức độ nhất định, có thể dùng các mầm ngủ trên các đốt để nhân giống. Lá 17 Lá dứa mọc trên thân cây theo hình xoắn ốc. Lá thường dày, không có cuống, hẹp ngang và dài. Bề mặt và lưng lá thường có một lớp phấn trắng hoặc một lớp sáp có tác dụng làm giảm độ bốc hơi nước ở lá. Các giống dứa thường có gai nhọn và cứng ở mép lá, nhưng cũng có giống lá không gai như Cayenne. Tùy theo giống, một cây dứa trưởng thành có khoảng 60 – 70 lá. Rễ Rễ dứa gồm rễ cái và rễ nhánh (mọc ra từ phôi hạt); rễ bất định (mọc ra từ mầm rễ trên các đốt của các loại chồi dứa trước khi đem trồng). Rễ dứa thuộc loại ăn nông, phần lớn do nhân giống bằng chồi nên mọc từ thân ra, rễ nhỏ và phân nhiều nhánh. Bộ rễ dứa thường tập trung ở tầng đất 10 – 26 cm và phát triển rộng đến 1 m. Sinh thái cây dứa Dứa là cây ăn quả nhiệt đới thích nhiệt độ cao, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng 28 – 320C, nhiệt độ giới hạn 15 – 400C. Nhiệt độ có ảnh hưởng đặc biệt quan trọng đến quá trình hình thành quả chín của quả do đó là yếu tố đầu tiên ảnh hưởng đến phẩm chất của quả. Yếu tố quan trọng không kém là chế độ nước bao gồm lượng mưa hàng năm và phân bố mưa. Dựa vào 2 chỉ tiêu trên, các vùng sinh thái thích hợp được thiết lập đảm bảo việc trồng dứa trên diện rộng đạt năng suất cao. Theo kinh nghiệm, lượng mưa thích hợp nhất cho dứa là 1000 – 1.500 mm. Tuy nhiên dứa vẫn phát triển tốt ở những vùng có lượng mưa thấp nhưng thuộc khí hậu đại dương, quanh năm ấm mát. Cây dứa ưa ánh sáng tán xạ hơn ánh sáng trực xạ. Lượng chiếu sáng thích hợp làm tăng năng suất và cải thiện phẩm chất hương vị quả. Độ chiếu sáng còn ảnh hưởng đến màu sắc quả. Dứa có bộ rễ tập trung ở lớp đất mặt do đó yêu cầu đất phải tơi xốp, thoáng, có kết cấu hạt, không có nước đọng vào mùa mưa. Về pH, các giống khác nhau có yêu cầu khác nhau. pH 5,6 – 6,0 có thể lên đến 7,5 đối với giống Cayenne; nhóm dứa Queen có thể sinh trưởng tốt trên đất phèn pH 4,0 trong khi giống Spanish (các giống dứa ta) thích nghi với pH từ 4,5 – 5,0. 2.2.Phân loại Dứa có tên khoa học là Ananas comosus (L.) Merr thuộc:  Phân lớp: Magnoliophyta 18  Lớp: Liliopsida  Bộ: Poales  Họ: Bromeliaceae  Giống: Ananas  Loài: A. comosus 2.3. Các nhóm dứa chính và các giống dứa phổ biến ở Việt Nam Các nhóm dứa chính Dứa gồm khoảng 50 giống và 2000 loài phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Mỹ . Các giống dứa đang được trồng trọt hiện nay được chia thành 3 nhóm: nhóm dứa Cayenne, nhóm dứa Queen (còn gọi là hoàng hậu) và nhóm Spanish (nhóm Tây Ban Nha). Nhóm Cayenne Lá dài, không có gai hoặc có một ít ở đầu chóp lá, dày, lòng máng lá sâu, có thể dài hơn 100 cm, hoa có màu xanh nhạt, hơi đỏ, quả có dạng hình trụ, mắt rất nông, quả nặng bình quân 1,5 – 2,0 kg rất phù hợp cho việc chế biến làm đồ hộp. Khi chưa chín quả màu xanh đen, sau đó chuyển dần và đến lúc chín quả có màu đỏ hơi pha da đồng. Cây đẻ yếu, trung bình chỉ cho 1 – 2 chồi một gốc trong một năm. Trong điều kiện chăm sóc kém có thể không có chồi cuống. Quả dứa Cayenne chứa nhiều nước và vỏ mỏng nên rất dễ thối khi vận chuyển. Vì thế việc chọn vùng, địa điểm trồng và qui hoạch đồng ruộng phải quan tâm đến đặc điểm này. Nhóm Queen Lá hẹp, cứng, có nhiều gai ở mép. Mặt trong của lá có 3 đường vân trắng hình răng cưa chạy song song theo chiều dài, hoa có màu xanh hồng. Quả có nhiều mắt, mắt nhỏ và lồi, cứng do đó tương đối dễ vận chuyển. Thịt quả vàng, ít nước và có vị thơm hấp dẫn. Ưu điểm của nhóm dứa này là không kén đất, có thể trồng trên các loại đất nghèo dinh dưỡng, cây có hệ số nhân giống cao, trung bình 4 – 6 chồi/gốc, có thể chịu được bóng râm. Thịt quả dòn, có màu sắc và hương vị phù hợp để ăn tươi. 19 Nhược điểm: quả bé, trọng lượng bình quân chỉ đạt từ 500 – 700 g. Dạng quả hơi bầu dục khó thao tác trong khi chế biến. Thịt quả có nhiều khe hở, không chặt nên khó đạt tiêu chuẩn để làm đồ hộp xuất khẩu. Nhóm Spanish Lá mềm, mép lá cong, hơi ngả về phía lưng, hoa tự có màu đỏ nhạt. Quả ngắn, kích thước to hơn so với nhóm Queen nhưng bé hơn so với nhóm Cayenne. Trọng lượng quả trung bình xấp xỉ 1kg. Khi chín vỏ quả có màu nâu đỏ, sẫm hơn nhiều so với quả Cayenne và cũng có dạng hình trụ cân đối. Thịt quả màu vàng trắng không đều, mắt quả sâu, vị hơi chua. Chồi ngọn và đặc biệt là chồi cuống nhiều, ảnh hưởng đến phẩm chất quả. Nhìn chung, các giống dứa trong nhóm Spanish tuy dễ trồng, chịu được bóng nhưng phẩm chất kém nên được trồng chủ yếu ở qui mô hộ gia đình, không nên tập trung thành vùng lớn. Ngoài ba nhóm dứa trên, còn có nhóm Abacaxi tách ra từ nhóm Spanish nhưng mức độ phổ biến còn thấp.  Các giống dứa phổ biến ở Việt Nam Dứa hoa Phú Thọ Còn được gọi là Queen cổ điển. Nó có những đặc tính điển hình nhất của giống Queen như quả nhỏ; mắt nhỏ, lồi; gai ở rìa lá nhiều và cứng…Đây là giống nhập nội vào Việt Nam khoảng đầu thế kỉ XX, được trồng rải rác ở các tỉnh phía Bắc và miền Trung. Ưu điểm nổi bật của dứa hoa Phú Thọ là thịt vàng giòn, rất thơm và hấp dẫn nên nó được dùng để pha trộn vào nước dứa ép từ các giống khác hay các loại quả khác để tạo ra mùi thơm đặc trưng. Giống này dễ trồng, chịu được đất xấu, đất chua, dễ ra hoa trái vụ. Nhược điểm là quả nhỏ, năng suất nhìn chung thấp, khó chế biến đồ hộp nên hiệu quả kinh tế không cao. Dứa hoa Na Hoa (Hoa Bali) 20 Giống dứa này có đặc tính của nhóm mắt nhỏ, lồi, khi chín vỏ và thịt quả đều có màu vàng. So với dứa hoa Phú Thọ, giống này có lá ngắn và to, quả cũng to hơn. Bình quân trọng lượng từ 0,9 – 1,2 kg/quả. Khi chín kĩ, nước trong thịt quả cũng nhiều hơn. Đây là giống dứa khá phổ biến ở các vùng trồng tập trung với ưu điểm dễ canh tác, có thể duy trì năng suất đến vụ thứ 2, thứ 3 nếu áp dụng kĩ thuật chăm sóc thích hợp; hệ số nhân giống tương đối cao. Tuy nhiên, do có mắt sâu, quả hơi bầu dục nên khó đạt tỉ lệ cái cao khi chế biến đồ hộp, hiệu quả kinh tế thấp. Dứa Kiên Giang và dứa Bến Lức (từ địa phƣơng là “khóm”) Một số tác giả liệt kê các giống này vào cùng với giống dứa Na Hoa. Trong điều kiện khí hậu miền Nam, cây sinh trưởng mạnh, quả có kích thước lớn hơn so với trồng ở miền Bắc, đồng thời một số đặc điểm cũng khác đi. So với dứa Bến Lức, dứa Kiên Giang có dạng hình trụ hơn, mắt quả to hơn và thịt quả có nhiều nước hơn. Đây là những giống trồng khá phổ biến ở vùng đồng bằng sông Cửu Long. Nhóm dứa Cayenne Đặc điểm của nhóm dứa này là lá không gai ngoài một vài gai ở đầu mút lá, lá dày, lòng máng sâu, có nhiều phấn ở mặt dưới nhất là ở phía gốc. Giống này du nhập vào nước ta cuối những năm ba mươi, đầu những năm bốn mươi ở một số địa phương miền Bắc chủ yếu trong những đồn điền do người Pháp quản lí. Chân Mộng (thuộc Vĩnh Phú) là một trong những nơi tiếp nhận giống đầu tiên, về sau người ta quen gọi là Cayenne Chân Mộng. Các giống Cayenne được trồng phổ biến hiện nay là giống Cayenne Thái Lan, Cayenne Trung Quốc và Cayenne Lâm Đồng. Theo tài liệu của Viện cây ăn quả miền Nam , giống Cayenne Thái Lan và Trung Quốc đều cho trái to và phát triển tốt; tuy nhiên là giống mới nhập nội nên cần có thời gian để kết luận. Với ưu điểm năng suất cao, quả to và dễ thao tác trong chế biến làm đồ hộp, có chất lượng cao cả về hóa sinh lẫn tỉ lệ cái nên giống Cayenne đang được chú ý phổ biến ra diện rộng. Các vùng trồng dứa nguyên liệu được hình thành nhằm cung cấp nguyên liệu cho các nhà máy chế biến dứa. 2.4. Tình hình sản xuất và sản lƣợng dứa Tình hình sản xuất và sản lƣợng dứa trên thế giới 21 Theo thống kê năm 2001 sản lượng dứa của thế giới đạt 13.739.000 tấn, phân bố theo các châu lục và khu vực như sau: Châu Phi 2.229.000 tấn, Bắc Mỹ 1.512.000 tấn, Nam Mỹ 2.556.000 tấn, Châu Á 7.275.000 tấn, Châu Phi 2.000 tấn và Châu Đại Dương 164.000 tấn. Các nước có sản lượng dứa cao như Thái Lan 2.300 tấn, Philipin 1.572 tấn, Brazil 1.442 tấn, Trung Quốc 1.284 tấn, Nigeria 881 tấn… Tình hình sản xuất và sản lƣợng dứa ở Việt Nam Tình hình sản xuất Theo tài liệu thống kê , diện tích trồng dứa cả nước năm 1995 là 25.734 ha đến năm 2000 lên đến 36.541 ha. Tính đến năm 2000 diện tích trồng dứa của miền Bắc là 9.675 ha chiếm 26,48% diện tích trồng dứa cả nước, chủ yếu ở vùng Đông Bắc và đồng bằng sông Hồng; trong khi diện tích gieo trồng của miền Nam là 26.866 ha chiếm 73,52% diện tích trồng dứa cả nước, chủ yếu tập trung ở vùng đồng bằng sông Cửu Long. Các tỉnh có diện tích gieo trồng dứa khá lớn là Kiên Giang (9.200 ha), Tiền Giang (7.803 ha), Bạc Liêu (3.625ha), Cần Thơ (1.338 ha), Long An (661 ha), Quảng Nam (2.320 ha), Bình Định (500 ha), Thanh Hóa (2.900 ha), Ninh Bình (1.572 ha), Nghệ An (600 ha), Bắc Giang (657 ha)… Bên cạnh đó, các tỉnh miền Đông Nam Bộ có diện tích dứa tăng đáng kể trong khoảng thời gian từ năm 1998 đến năm 2000: Tp. HCM tăng từ 76 ha lên đến 150 ha, Đồng Nai tăng từ 61 ha lên 123 ha, Bình Thuận tăng từ 12 ha lên 40 ha. Hiện nay cây dứa Cayenne được các nhà nông học đánh giá cao do phù hợp với đất đai thổ nhưỡng của các tỉnh miền Trung, Tây Nguyên và các vùng đất nhiễm phèn khác. Nhiều dự án mở rộng vùng trồng dứa Cayenne được thực hiện ở khu vực Đông Nam Bộ như Chương trình phát triển cây dứa Cayenne ở Tp. HCM thời kì 2003 – 2005 , ở khu vực Tây Nguyên (Gia Lai, Đaklak) . Một số tỉnh miền Trung như Bình Định, Phú Yên …cũng đề nghị Tp. HCM cung cấp giống dứa Cayenne để nhân rộng .  Sản lƣợng dứa Theo tài liệu thống kê sản lượng dứa của cả nước năm 2000 là 291.428 tấn phân bố trên các khu vực trồng dứa cả nước như sau: miền Bắc đạt 57.246 tấn, khu vực Bắc trung bộ 25.218 tấn, miền Nam 234.164 tấn trong đó các tỉnh thuộc khu vực Duyên Hải Nam Trung Bộ đạt 20.832 tấn, Tây Nguyên 2.357 tấn, khu vực Đông Nam Bộ 22 1.417 tấn và khu vực có sản lượng dứa lớn nhất trong nước – Đồng Bằng Sông Cửu Long 209.558 tấn. Các tỉnh có sản lượng dứa cao là Kiên Giang (89.094 tấn), Tiền Giang (79.880 tấn), Bạc Liêu (24.860 tấn), Ninh Bình (20.315 tấn), Quảng Nam (15.724 tấn), Thanh Hóa (11.107 tấn), Hà Tây (1.725 tấn), Bắc Giang (1.495 tấn), Phú Thọ (1.159 tấn)… 2.5. Giới thiệu về nuôi cấy mô Nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật hay còn gọi là nuôi cấy in vitro là công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành công nghệ sinh học. Nhờ áp dụng kĩ thuật nuôi cấy mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần so với tự nhiên. Do đó tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đưa giống mới vào sản xuất. Hơn nữa dựa vào kĩ thuật nuôi cấy mô có thể duy trì và bảo quản nhiều giống cây trồng quí hiếm để phục tráng giống cây trồng. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật bắt đầu từ một mảnh nhỏ thực vật vô trùng được đặt trong môi trường dinh dưỡng thích hợp. Chồi mới hay mô sẹo mà mẫu cấy này sinh ra bằng sự tăng sinh được phân chia và cấy chuyền để nhân giống. Lịch sử phát triển Năm 1838, hai nhà sinh vật học Đức là Schleiden và Schwann đề xướng học thuyết tế bào và nêu rõ: Mọi sinh vật phức tạp đều gồm nhiều sinh vật nhỏ, các tế bào hợp thành, các tế bào phân chia mang thông tin di truyền chứa trong tế bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh và là những đơn vị độc lập từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể. Năm 1902, Haberlandt đề xướng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào, nghĩa là mỗi tế bào đều mang đầy đủ thông tin di truyền của cá thể. Ông tiến hành trên cây họ hòa thỏa (cây một lá mầm) một lọai cây khó thực hiện và ông bị thất bại. Năm 1922, Kote (học trò Haberlandt) và Robbins (nhà khoa học người Mỹ) đã lặp lại thí nghiệm của Haberlandt và nuôi cấy được đỉnh sinh trưởng tách ra từ đầu rễ của một loại cây thuộc họ hòa thảo tạo ra hệ rễ nhỏ và có cả rễ phụ. Tuy nhiên sự sinh 23 trưởng như vậy chỉ tồn tại trong một thời gian sau đó chậm lại và ngừng hẳn mặc dù tác giả đã chuyển sang môi trường mới. Năm 1934, White đã nuôi cấy thành công đầu rễ cây cà chua (Lycopersicum esculentum). Năm 1937, Gautheret và Nobecout đã tạo ra và duy trì được sự sinh trưởng mô sẹo cây cà rốt trong một thời gian dài trong môi trường thạch cứng. Năm 1941, Overbeck đã chứng minh được vai trò của chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy phôi họ cà. Trong thời gian này chất hích thích sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin đã được nghiên cứu và tổng hợp hóa học thành công. Và năm 1948 Steward đã xác định được tác dụng của nước dừa trong nuôi cấy mô sẹo cây cà rốt Năm 1955, người ta tìm ra tác dụng kích thích phân bào của kinetin.Sau đó các chất cytokinine khác như BAP, 2 IP, Zeatin cũng được phát hiện. Năm 1957, SKoog và Miller công bố kết quả nghiên cứu về ty lệ giữa kinetin/auxin đối với sự hình thành các cơ quan từ mô sẹo trên cây thuốc lá. Từ năm 1954, đến năm 1959 kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn đã được phát triển, các tác giả đã gieo tế bào đơn và nuôi cấy tạo được cây hoàn chỉnh. Năm 1966, Guha và Mahheswari nuôi cấy thành công tế bào đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây cà độc dược. Năm1967, Bougin và Nistsh tạo thành công cây đơn bội từ túi phấn cây thuốc lá. Ứng dụng Năm 1986, một số lượng lớn cây trồng sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy mô đã được tiêu thụ tên thị trường thương mại với hàng chục triệu dollar. Kỹ thuật này thể hiện một số ưu điểm đã được ứng dụng: - Nhân giống vô tính với tốc độ nhanh. - Tạo cây sạch bệnh và kháng bệnh. - Cảm ứng và tuyển lựa dòng đột biến. - Sản xuất cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn. - Lai xa. - Lai tế bào soma và tạo dòng protoplast. - Gây biến tính thực vật qua hấp thụ DNA và ngoại lai. - Cố định nitrogen. 24 - Cải thiện hiệu quả của quang tổng hợp. - Bảo quản nguồn gen quý. Các phƣơng pháp nuôi cấy in vitro Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng Mẫu cấy bao gồm: đỉnh sinh dưỡng, chồi đỉnh, chồi bên, có kích thước khoảng 0.58 - 1 cm. Đây là phương pháp dễ dàng nhất, mẫu sau khi vô trùng và được nuôi cấy trong môi trường thích hợp cho loại cây đó thì sau một thời gian nuôi cấy tạo thành một hay nhiều chồi. Sau đó, nuôi cấy trong môi trường có bổ sung chất kích thích sinh trưởng thì sẽ tạo thành nhiều chồi, rễ, tạo thành cây hoàn chỉnh. Nuôi cấy mô sẹo Mẫu cấy là những tế bào đỉnh sinh trưởng hay nhu mô được tách ra trong môi trường giàu auxin thì mô sẹo được hình thành. Mô sẹo là những tế bào vô tổ chức có màu trắng. Khối mô sẹo này có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong môi trường không có chất kích thích sinh trưởng tạo mô sẹo. Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với những cây không có khả năng nuôi cấy từ đỉnh sinh trưởng. cây tái sinh từ mô sẹo có nhiều chồi hơn so với cây tái sinh từ đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị tế bào soma của phương pháp này rất cao. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào đơn Những khối sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng, đặt trong máy lắc thì khối sẹo dứơi tác dụng cơ học và hóa học sẽ tách ra nhiều tế bào đơn lẻ gọi là tế bào đơn. Những tế bào đơn này nuôi cấy trong môi trường đặc biệt thì sẽ tăng sinh khối. Sau một thời gian nuôi cấy trong môi trường lỏng tế bào đơn tách ra và đặt trải trong môi trường thạch thì sẽ phát sinh thành những tế bào mô sẹo. Những tế bào mô sẹo này được nuôi cấy trong môi trường cytokinin/auxin thích hợp thì sẽ tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Trong chọn giống cây trồng người ta dựa vào phương pháp này để tạo ra giống mới bằng cách đột biến tế bào đơn bằng hóa chất hay phóng xạ. Nuôi cấy protoplast- chuyển gen Protoplast (tế bào trần ), thực chất là tế bào đơn được tách vỏ cellulose, có sức sống và duy trì chức năng sẵn có. Protoplast có thể tái sinh trực tiếp từ thân, lá, rễ bằng cơ học, hoặc từ những tế bào đơn sẵn có. Trong môi trường thích hợp các protoplast có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh. 25 Trong chọn giống cây trồng người ta sử dụng phương pháp này để cải tiến giống cây trồng bằng cách cho dung hợp protoplast ở 2 protoplast cùng loài hoặc khác loài. Protoplast có khả năng hấp thu tế bào ngoại lai để cải thiện đặc tính của một số loại cây trồng mà không thông qua các phương pháp chuyển gen khác. Nuôi cấy tế bào đơn bội Hạt phấn của cây trồng được nuôi cấy trong môi trường thích hợp tạo thành mô sẹo, những mô sẹo này có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh có bộ nhiễm sắc thể n gọi là cây đơn bội. Trong nuôi cấy mô thực vật người ta sử dụng những mô sẹo này xử lý colchicin để tạo thành cây đa bội. 2.6. Các yếu tố ảnh hƣởng trong nuôi cấy in vitro Chất điều hoà sinh trƣởng Chất sinh trưởng thực vật hay còn gọi là chất điều hòa sinh trưởng thực vật là các hợp chất hữu cơ (bao gồm các sản phẩm thiên nhiên của thực vật và các hợp chất tổng hợp nhân tạo) có tác dụng điều tiết các quá trình sinh trưởng và phát triển, làm biến đổi một quá trình sinh lý thực vật nào đó, ở những nồng độ rất thấp. Chúng không phải là các chất dinh dưỡng hay các sinh tố dùng trong thực vật.  Một số chất điều hoà sinh trƣởng thƣờng dùng: Auxin Auxin là một nhóm các chất được tổng hợp chủ yếu ở đầu thân, đầu rễ, được vận chuyển đến các bộ phận khác nhau của cơ thể để kích thích sự tăng trưởng của tế bào. Các phản ứng auxin và sự tăng trưởng có liên quan với vô số quá trình sinh lý và trao đổi chất khác và mối quan hệ nhân quả giữa auxin, ARN và chuyển hóa protein không phải hoàn toàn rõ ràng. Phản ứng chủ yếu và nhanh chóng nhất đối với việc xử lý auxin là làm tăng độ kéo dài của tế bào, điều này xảy ra chỉ một vài phút sau khi xử lý. Một đặc trưng quan trọng là vách tế bào, là một vị trí quan trọng chịu sự tác động 26 của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Torry và csv, 1981). Auxin làm giảm pH do kích thích sự bài xuất proton H+, pH hoạt hóa các enzym tác động nới lỏng vách tế bào và enzym tổng hợp vách tế bào, nhờ đó khởi động quá trình giản nở tế bào (Roger Prat, 1993). Auxin hoạt hóa sự sinh tổng hợp các hợp chất cao phân tử (protein, xenluloza, pectin, …) và ngăn cản sự phân giải chúng (Grodzinxki, 1981). Cytokinin Đây là chất hoạt hóa sự phân chia tế bào (Mitsuhashi và csv, 1969; Mai Trần Ngọc Tiếng, 1989), đồng thời làm tăng quá trình chuyển hóa acid nucleic và protein (Vũ Văn Vụ và csv, 1993). Cytokinin được sử dụng khá nhiều trong kỹ thuật nuôi cấy mô, những chất thường được dùng là Kinetin và BA (Benzyl Adenin). Cytokinin phá vỡ trạng thái ngủ của hạt, kích thích hạt nẩy mầm, làm tăng sự nở hoa. Cytokinin gây nên sự hình thành chồi mầm trong nhiều mô bao gồm mô sẹo sinh trưởng (cals) trong mô nuôi cấy, hay việc tạo thành các mô bứu ở các cây gỗ lâu năm (Nester và csv, 1985; Taiz L. và csv, 1991). Cytokinin kích thích sự tổng hợp mới enzym Rubisco (Ribulozo-1,5-biphotphat cacboxylaza/oxygenaza) hoặc ở mức sao chép (làm tăng hoạt tính ARN-polymeraza) hoặc ở mức dịch mã (thành lập các polyriboxom) (Parthier, 1985). Ảnh hưởng của Cytokinin thấy rõ khi phối hợp sử dụng với auxin (Meredith và csv, 1970). Skoog và csv (1948) ghi nhận lượng benzyl amino purine cao có tác dụng kích thích sự tạo chồi, đồng thời ức chế sự phân hóa tạo rễ. Gibbérelline Gibbérelline đã nổi bật rất lâu trước khi được nhận dạng. Chất Gibbérelline đầu tiên được nhận dạng là acid gibbérellique hoặc là GA3, kế đến là GA4 + GA7 và GA7. Tất cả các Gibbérelline thể hiện một nhân giống nhau; chúng có sự khác nhau bởi chất lượng và vị trí của các chất gắn trên nhân.  Tính chất sinh lý của Gibbérelline -Hoạt động kéo dài các đốt của cây, hoạt động này cũng có thể áp dụng lên các cuống hoa và điều này cho phép có một sự chín tốt hoặc những phát hoa phát triển hơn. 27 Trong nuôi cấy in vitro, Gibbérelline có tác động đối với nhiều đỉnh sinh trưởng, nếu thiếu Gibbérelline đỉnh sinh trưởng thể hiện một dạng hình cầu, tạo nên các mắt cây. -Hoạt động phức tạp trong sự ra hoa. -Tác động lên sự đậu trái của các trái không hạt. -Tác động gây thức giấc các chồi, mầm ngủ trên các hạt giống làm thuận lợi cho sự nảy mầm. -Trong lĩnh vực sinh tạo cơ quan thực vật, Gibbérelline cho thấy các hoạt động đối kháng: chúng dường như đối ngược với hiện tượng phân hóa tế bào. Trong nuôi cấy in vitro Gibbérelline không được sử dụng vào mục đích này, nhưng chúng có công dụng với các mô đã có tổ chức (đỉnh sinh trưởng, chồi ngọn, chồi thân…). Ảnh hƣởng của nguồn carbon Trong môi trường nuôi cấy, các mô không có khả năng tự dưỡng do không quang hợp đầy đủ trong điều kiện thiếu sự trao đổi khí với bên ngoài, do vậy cần cung cấp đường để giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp các chất hữu cơ, giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối. Các loại đường thường được sử dụng là sucrose, d-glucose, d-fructose (Doods và Roberts, 1987). Sucrose là nguồn carbon được sử rụng rộng rãi nhất cho các loại cây, nồng độ sucrose thay đổi từ 2%-12% hoặc cao hơn tùy thuộc vào giống và tuổi phôi cấy. Ảnh hƣởng của nƣớc dừa Nước dừa (CW-coconut water) thêm vào môi trường với lượng thích hợp sẽ kích thích sự phát triển của chồi bên cũng như sự hình thành cây con (Urata và Iwanaga, 1965; Scully, 1966; Tanaka và Sakanishi, 1978). Từ việc sử dụng CW, nhiều mô thực vật được nghiền tách dịch chiết và bổ sung vào môi trường nuôi cấy có tác dụng kích thích sự phát triển phôi như nội nhũ bắp, chà là, chuối, mầm đậu, mầm lúa mì, nước chiết cà chua … nhưng thông thường các dịch chiết chỉ có tác dụng trên các loài cây trồng không cùng nguồn gốc (Trần Văn Minh, 2002). Theo Vũ Văn Vụ và csv (1993), trong CW khá giàu các hợp chất nitơ dạng khử như các acid amin, ngoài ra trong CW còn chứa các hormon sinh trưởng như cytokinine. 28 Theo sự phân tích thành phần dinh dưỡng của Tổ chức Y tế Thế giới, thì trong CW có chứa protein, cacbohydrat, canxi, sắt và một số vitamin như thiamin, riboflavin, niacin, acid ascorbic và đường. Ảnh hƣởng của than hoạt tính Phải có những thực nghiệm xác định nồng độ than hoạt tính thích hợp cho quá trình nuôi cấy. Than hoạt tính thêm vào môi trường kích thích sự phát triển phôi của cây bắp, jujube và đu đủ. Than hoạt tính thường được bổ sung vào môi trường để hấp thụ các chất độc ( dạng phenol) do cây tiết ra. Ảnh hƣởng của độ pH và Agar pH của môi trường nuôi cấy thường ở khoảng 6, thấp hơn 4,5 hoặc cao hơn 7 đều ức chế sự phát triển của mô (Nguyễn Văn Uyển, 1993 và Bùi Bá Bổng, 1995). Ảnh hƣởng của các điều kiện vật lý Ánh sáng cần thiết cho sự phát sinh hình thái của mô cấy. Trong tạo chồi ban đầu và nhân chồi tiếp theo, cường độ ánh sáng chỉ cần trong khoảng 1.000 lux. Nhưng trong giai đoạn tạo rễ, cây cần chiếu sáng ở cường độ cao từ 3.000-10.000 lux để kích thích cây chuyển từ giai đoạn dị dưỡng sang tự dưỡng có khả năng quang hợp. Dưới cường độ ánh sáng cao, cây lùn và có màu xanh hơi giảm nhưng có tỷ lệ sống sót cao khi chuyển sang môi trường đất. Chưa có nhiều nghiên cứu về chế độ sáng trong môi trường cấy mô, nhưng thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày của bóng đèn néon huỳnh quang là thích hợp cho sự phát triển mô cấy của nhiều loài. Cấy phôi thường không sử dụng ánh sáng đèn. Theo Scozzoli và Pasini, 1992; Pinto và csv, 1994, cấy phôi đào nên để trong tối 14 ngày. Tương tự, ở cây bơ nên để 21 ngày trong tối ở nhiệt độ 210C (Lano và csv, 1995). Ngoài ra, để mô cấy phát triển tốt thì môi trường nuôi cấy phải thông thoáng và có nhiệt độ thích hợp, nhiệt độ trong phòng nuôi cấy thường được giữ ở 25-28oC (Nguyễn Văn Uyển, 1993). 2.7.Tổng quan về bioreactor Hệ thống bioreactor được thiết kế vớí mục đích cải thiện và nâng cao hiệu quả cũng như năng suất của quá trình vi nhân giống. Mô hình bioreactor được thiết kế theo dạng fermentor trong nuôi cấy vi sinh vật, tùy vào đối tượng cây mà có nhiều kiểu 29 bioreactor khác nhau nhằm mục đích nhân số lượng lớn tế bào, mô hay cơ quan trong môi trường lỏng có hệ thống làm thoáng khí. Tế bào thực vật khác với tế bào nấm men. Nếu được bảo quản trong điều kiện giống nhau thì tế bào thực vật không sinh trưởng đơn độc mà cũng không xảy ra sự sinh trưởng đồng thời giống như nấm men. Tuy nhiên bằng kỹ thuật nuôi cấy mô thì việc nhân sinh khối, nghiên cứu dinh dưỡng và sinh hóa trong môi trường lỏng thì tỏ ra hiệu quả(Gamborg, 1966; Gamborg, et al, 1968; Gamborg and Shyluk, 1970). Việc sử dụng bioreactor cho nhân giống thực vật được thực hiện đầu tiên vào năm 1981 do Takayama thực hiện trên đối tượng cây Begonia (Takayama và Miasawa,1981). Hệ thống này còn được ứng dụng có hiệu quả trên nhiều loại thực vật khác(Takayama,1991). Sử dụng một bioreactor cỡ nhỏ ( từ 4-10l) trong khoảng 1-2 tháng có thể tạo ra đến 4000-20.000 cây con. Điều này cho thấy một triển vọng lớn trong việc áp dụng bioreactor thương mại đồng thời mở ra một hướng mới trong sản xuất các sản phẩm có hoạt tính sinh học có nguồn gốc thực vật(Takayama,1991). Mục đích của nuôi cấy lỏng lắc và bioreactor là tăng nhanh số lượng lớn các chồi đồng nhất và đồng thời giúp giảm chi phí trong nhân giống thực vật(Nhut et al,2004) 1. Cửa nạp nguyên liệu 2. Ống dẫn khí vào 3. Hệ thống sục khí 4. Ống dẫn nướ c 5. Ống thoát nướ c 6. Motor 7. Đai bả o v ệ 8. Thanh truyền độ n g 9. Cánh quạt 10. Bộ phận cảm biến 11. Vách ngăn 12. Lớp giữ nhiệt 13. Cửa rút nguyên liệu Hình 2.1- Cấu trúc bioreactor 30 Thuận lợi của nuôi cấy bằng bioreactor Theo Takayama và Akita (1994) thì một số thuận lợi chính của bioreactor trong vi nhân giống thực vật đó là: - Sự tiếp xúc tốt hơn giữa sinh khối thực vật với môi trường. - Không có sự hạn chế về trao đổi khí. - Có thể điều khiển sinh khối thực vật tùy theo thể tích môi trường. - Tiết kiệm được thời gian và nhân công trong việc nuôi cấy chuyền. - Dễ dàng cho nhân giống số lượng lớn tạo nhiều sinh khối. - Dễ dàng điều khiển được thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy. - Tốc độ sinh trưởng và phát triển được tăng hơn nếu được tăng cường không khí. - Mẫu cấy được tiếp xúc đầy đủ hơn với môi trường dinh dưỡng nên làm cho tốc độ sinh trưởng và phát triển được tăng nhanh. - Nhờ việc liên tục di chuyển trong môi trường nuôi cấy nên ít xảy ra hiện tượng ưu thế ngọn, sự ngủ của chồi biến mất và kết quả là tạo được nhiều chồi hơn. Khó khăn của nuôi cấy bằng bioreactor Mặc dù phương pháp nuôi cấy lỏng lắc và bioreactor đã tỏ ra vượt trội hơn so với các phương pháp nuôi cấy trên môi trường bán rắn nhưng bên cạnh đó nó vẫn còn có những hạn chế nhất định. Chẳng hạn như (Ziv, 2000): - Tuỳ vào từng đối tượng mà thiết kế một kiểu bioreactor thích hợp, khó áp dụng đồng loạt cho nhiều giống khác nhau. - Thường gặp hiện tượng bất thường về phát sinh hình thái như: hiện tượng thuỷ tinh thể (vitrification), hiện tượng bất thường của phôi, hiện tượng stress tế bào. Những hiện tượng trên làm giảm hiệu suất nhân giống và sản xuất sản phẩm trao đổi chất thứ cấp. Một vấn đề lớn nữa thường gặp trong nuôi cấy môi trường lỏng đó là việc nhiễm vi sinh vật. Nấm, vi khuẩn, nấm mốc và côn trùng là những nguồn gây nhiễm nghiêm trọng. Chúng là nguyên nhân chủ yếu gây mất nguồn mẫu thực vật trong các phòng thí nghiệm thương mại. Vì là môi trường lỏng nên sự lây nhiễm vi sinh vật sẽ xảy ra rất nhanh và gây hậu quả nghiêm trọng hơn so với các loại môi trường khác (rắn, bán 31 rắn). Sự lây nhiễm có thể xuất phát từ các giai đoạn thao tác chuẩn bị và điều khiển thiết bị. Trong một số phòng thí nghiệm để hạn chế nguy cơ bị nhiễm thì người ta thường tạo một không gian vô trùng trong phòng cấy bằng dòng không khí tạo áp lực dương (Ziv, 2000). Phân loại bioreactor Bioreactor khuấy thoáng khí (Aeration-agitation bioreactor) Kiểu bioreactor này thường được đề cập dưới dạng những bình phản ứng khuấy trộn (stirred tank bioreactors – STRs) có cánh khuấy chẳng hạn như: tua-bin, chân vịt, mái chèo hay ruy-băng xoắn ốc. Mặc dù STRs có ý nghĩa trong nuôi cấy tạo huyền phù nhưng nó cũng gây ra những lực khuấy mạnh. Tuy nhiên, gần đây STRs đã được cải tiến nhằm khắc phục các bất lợi trên. Kiểu cánh khuấy ruy-băng xoắn ốc được xem là có hiệu quả đối với nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật có mật độ cao và nuôi cấy tạo phôi soma (Archambault et al., 1994). Nói chung thì bioreactor dạng này thường được sử dụng trong nuôi cấy tạo phôi. Nhưng hiện nay vẫn còn quá ít các nghiên cứu tiến hành so sánh hiệu quả giữa các kiểu bioreactor khác nhau.  Bioreactor hình trống quay (Rotating drum bioreactor) Kiểu bioreactor này gồm có một bình chứa có dạng hình trống được gắn trên một trục quay, trục này có nhiệm vụ nâng đỡ và quay bình chứa. Bình được quay với tốc độ khoảng 2 – 6 vòng/phút nhằm hạn chế tối đa lực xé làm tổn thương tế bào. Một bình phản ứng không có tấm ngăn cách có thể được sử dụng trong nuôi cấy tạo cây con thông qua quá trình tạo chồi và tạo phôi (Takayama và Akita, 1994).  Bioreactor màng lọc xoay (Spin filter bioreactor) Kiểu bioreactor này có một màng lọc xoay có nhiệm vụ hòa trộn huyền phù nuôi cấy và đồng thời lấy đi môi trường đã sử dụng và bổ sung môi trường mới vào. Các màng lọc quay khuấy trộn môi trường không làm xé rách màng tế bào chính là nhờ vào việc tạo ra được những đường khuấy mỏng. Để có thể duy trì được lâu sự tăng trưởng liên tục của mô sẹo và sự phát triển của phôi đạt được sự nhân nhanh, người ta đã thiết kế một bioreactor có hai màng lọc cùng quay. Một chiến lược nhằm nuôi cấy hiệu quả hơn đó là trong giai đoạn tăng sinh tế bào, người ta tiến hành nuôi cấy liên tục. Nhằm tạo sự đồng nhất, ổn định điều kiện nuôi cấy cho các tế bào và duy trì được 32 nhóm tế bào đang tăng trưởng phù hợp cho sự phát triển tạo phôi bất cứ lúc nào. Giai đoạn thứ hai của bioreactor là tạo phôi theo chu kỳ. Sự phát triển của phôi có thể được điều khiển thông qua nguồn dinh dưỡng thiết yếu hoặc các thành phần khí. Việc tạo ra các cây con thông qua con đường tạo phôi soma được nhận thấy là thích hợp nhất đối với quá trình nhân sinh khối bằng cách sử dụng bioreactor màng lọc xoay (Honda et al., 2001). Bioreactor có khuấy và không khuấy bằng nén khí (Pneumatically agitated and non-agitated bioreactor) Đây là kiểu bioreactor đơn giản, được thiết kế với một bộ phận sủi bọt khí ở phía dưới đáy bình, nó có nhiệm vụ là khuấy trộn môi trường và cung cấp oxygen (đối với bioreactor sục khí đơn giản, bioreactor tạo bọt dạng hình cột). Trong một số trường hợp, bình nuôi cấy có thể gắn thêm các ống thông (đối với bioreactor air-lift). Bioreactor air-lift Kiểu bioreactor này cũng tương tự với bioreactor được khuấy trộn bằng dòng xoáy-STRs (nhưng ở đây thì không có cánh khuấy). Bioreactor air-lift khắc phục được hai nhược điểm của bioreactor khuấy bằng cánh khuấy đó là: ít tốn năng lượng cho việc khuấy trộn môi trường và ít gây ra lực xé rách các tế bào, nhờ những dòng khí nhỏ di chuyển nhẹ nhàng từ phía dưới lên. Sự hòa trộn dòng khí vào trong pha lỏng trở nên có hiệu quả hơn do có sự lưu trú các bong bóng khí trong môi trường. Để có thể tạo được các bọt khí nhỏ mịn thì dòng khí phải được thổi qua một màng lọc với những lỗ có kích thước rất nhỏ 0,01 – 0,1 mm. Thường sử dụng màng ceramic. Chính nhờ sự nhỏ mịn của các bong bóng khí đã làm cho các tế bào giảm đáng kể sự cọ sát nên ít bị tổn thương, nhất là đối với những tế bào có độ nhạy cảm cao (Paek và Debasis, 2003) Bioreactor sục khí dạng đơn giản và bioreactor sủi bọt khí dạng hình cột (Simple aeration bioreactor and bubble column bioreactor) Cũng giống như bioreactor air-lift, bioreactor sủi bọt hình cột cũng tạo ra ít sự cọ sát. Điểm khác biệt chủ yếu giữa bioreactor air-lift và bioreactor sủi bọt hình cột là hệ thống tuần hoàn và chế độ thủy động lực học. Loại bioreactor này thích hợp cho nuôi cấy nhiều loại cây khác nhau thông qua quá trình nuôi cấy chồi, thân củ, rễ củ… (Takayama, 1991). Hơn nữa, việc chia bioreactor sủi bọt hình cột thành nhiều phần và 33 cài đặt nhiều bộ phận sủi bọt khí sẽ đẩy nhanh tốc độ tăng sinh khối (Buitelaar et al., 1991). Những hạn chế chung của cả air-lift bioreactor và bioreactor sủi bọt hình cột là: a) có bọt nổi lên do tăng cường một lượng khí lớn, b) các tế bào có khuynh hướng bị tống ra khỏi dung dịch bởi bọt khí, c) tế bào lớn lên trên thành của bình nuôi cấy (trong bọt). Số lượng tế bào bên trong bình biểu thị tổng sinh khối của tế bào. Hiện tượng nổi bọt và tăng trưởng trên thành bình là do đường kính của bình và nắp bình có cùng kích thước. Vấn đề này đã được giải quyết bằng cách cải tiến bình nuôi cấy như miệng bình có đường kính lớn hơn, hay bình có kiểu dạng cầu (Paek et al., 2001). Bioreactor sủi bọt dạng cầu (Ballon type bubble bioreactor – BTBB) Bioreactor dạng này có hình cầu và có nắp ở trên đỉnh. Ở gần đáy của bình có một khóa hình chữ Y hoặc chữ T có nhiệm vụ châm thêm môi trường và là cổng thu sản phẩm. Bằng việc sử dụng một thiết bị sủi bọt với các lỗ đồng tâm đặt đáy bình, điều này đã làm cho lượng bọt được giảm. Ngoài ra, trên nắp bình còn có gắn thêm các thiết bị đo pH, oxy hòa tan. Những bioreactor dạng này được sử dụng trong vi nhân giống tạo phôi soma (Son et al., 1999; Kim, 1999; Lian, 2001; Paek et al., 2001). Bioreactor thổi khí trên bề mặt (Overlay aeration bioreactor) Dạng bioreactor này thổi khí từ trên bề mặt xuống dung dịch lỏng và đôi khi kết hợp với sục khí nhẹ nhưng hệ số oxy hòa tan khá thấp (nhỏ hơn 1). Kiểu bioreactor này được báo cáo là chưa thành công lắm trong nuôi cấy mô (Ishibashi et al., 1987). Bioreactor ngập chìm gián đoạn tự động (Automated temporary immmersion bioreactor) Hệ thống ngập chìm tự động này đã được thương mại dưới tên gọi là “RITA” do Teisson và Alvard thiết kế (1995). Hệ thống bioreactor này gồm hai bình chứa, một bình dùng cho sự tăng trưởng của thực vật, một bình dùng để chứa môi trường lỏng. Hai bình này được nối với nhau bằng ống silicon và thủy tinh. Không khí nén từ một thiết bị bơm khí sẽ đẩy môi trường lỏng từ bình chứa thứ nhất sang bình chứa thứ hai, làm ngập chìm hoàn toàn mẫu thực vật. Sau đó thì khí sẽ rút khỏi bình chứa môi trường, làm cho môi trường ở bình nuôi cấy hạ xuống. Trong mỗi trường hợp như vậy thì không khí được thổi qua một màng lọc vô trùng với kích thước lỗ 0,2 mm. Một thiết bị điều khiển có thể hẹn giờ được dùng để ấn định khoảng thời gian cho một chu 34 trình dâng lên và hạ xuống. Có một hệ thống van 3 cổng dạng so-le được dùng trong trường hợp điều khiển đóng mở này. Hệ thống bioreactor này đã được báo cáo là nuôi cấy thành công trên một số cây như: cây lê (Damiano et al., 2000), cây dứa (Esscalo et al., 1999) và cây coffea arabica (Etienne et al., 1999). 2.8. Giới thiệu các phƣơng pháp nhân chồi cây dứa  Hệ thống nuôi cấy in vitro bán rắn Là hệ thống nuôi cấy in vitro sử dụng giá thể chứa chất dinh dưỡng để giữ cho cây đứng vững đồng thời cung cấp chất dinh dưỡng cho cây. Khái niệm về giá thể Giá thể là một loại hay một hỗn hợp vật liệu được sử dụng làm vật nâng đỡ, là chỗ cho rễ bám vào trong suốt quá trình sinh trưởng và phát triển. Vật liệu làm giá thể phải chắc chắn và ổn định trong các điều kiện khác nhau, chịu được hấp vô trùng mà không bị biến tính, trơ với các chất trong môi trường nuôi cấy. Ngoài ra, vật làm giá thể phải sạch và không được chứa các chất lạ do thành phần của môi trường dinh dưỡng là xác định và cần kiểm soát được trong từng trường hợp nuôi cấy. Chất tạo đông thông dụng nhất là agar, nhưng theo thời gian, nhiều loại giá thể khác được phát triển với những tính năng ưu việt hơn như rockwool, oasis, v.v. Agar Agar là một polysaccharide chiết xuất từ rong biển. Agar được sử dụng như một tác nhân tạo đông trong hầu hết các môi trường nuôi cấy mô in vitro. Agar là loại giá thể sử dụng phổ biến nhất trong các phòng thí nghiệm. Alginate Giá thể này có đặc tính tương tự như agar nhưng có nồng độ ion calcium cao hơn. Phytagel Được tổng hợp từ glucuronic acid, glucose và rhamnose. Môi trường tạo ra từ loại gel này rất sạch, độ bền cao, trong suốt nên dễ phát hiện ra hiện tượng nhiễm vi sinh vật. Agargel 35 Là hỗn hợp của agar và phytagel. Ưu điểm của giá thể này là có tác dụng giảm được hiện tượng thủy tinh thể (mọng nước) trong nuôi cấy in vitro. Hơn nữa, loại gel này cũng có độ trong cao nên dễ dàng phát hiện vi sinh vật nhiễm trong môi trường. Transfergel Được sử dụng làm đông môi trường nuôi cấy chồi mầm, chồi đỉnh, phôi soma. Các chất tạo gel khác như bacto agar, gellam gum, v.v, có tác dụng tương tự như agar nhưng giá thành cao hơn do có độ tinh khiết cao hơn và có nhiều công dụng hỗ trợ khác cho nuôi cấy mô. Tuy vậy, nuôi cấy mô trên môi trường bán rắn vẫn bộc lộ nhiều khiếm khuyết: - Chất tạo gel biến môi trường dinh dưỡng thành một hệ kín, hạn chế khả năng di chuyển của các thành phần dinh dưỡng, do đó mẫu cấy chỉ hấp thụ được một phần dinh dưỡng ở vị trí gần nó nhất. Hơn nữa, những chất độc do chính thực vật tiết ra bị tích lũy xung quanh mẫu cấy và ức chế trở lại sự sinh trưởng và phát triển của thực vật (thường gặp nhất là hiện tượng tích tụ phenol gây chết mẫu). - Chất dinh dưỡng được bổ sung cùng với agar trước khi hấp, kết quả là các cấu tử dinh dưỡng phân bố đều khắp các lỗ, trong khi mô cấy chỉ sử dụng được một lượng nhỏ chất dinh dưỡng ở phạm vi hẹp quanh mẫu nên hệ số hấp thu chất dinh dưỡng của mẫu cấy trong môi trường thạch thấp. Khi cây sử dụng hết chất dinh dưỡng xung quanh, cây khó có thể hấp thu phần dinh dưỡng phân bố ở những vị trí xa mẫu, do vậy khả năng sinh trưởng và phát triển của mẫu bị giảm sút. - Môi trường bán rắn chỉ sử dụng được một lần, không cho phép thay đổi thành phần môi trường cho những giai đoạn phát triển khác nhau của thực vật vi nhân giống, đòi hỏi mẫu cấy phải được cấy chuyền liên tục. - Để hòa tan agar, ta cần sử dụng một nhiệt lượng để nâng nhiệt độ lên 60oC, kết hợp với giá thành agar hiện nay tương đối cao đã làm giảm hiệu quả kinh tế của việc sử dụng agar vào nhân giống in vitro. - Khi đặt mẫu vào môi trường thạch, mẫu sẽ phát triển không đồng đều do có những vị trí trên mẫu không được tiếp xúc với môi trường. Ví dụ như khi nuôi cấy mô sẹo trên môi trường thạch, sự tăng trưởng của mô sẹo sẽ không đều do sự trao đổi khí, gradient của các hợp chất gây độc, chất ức chế mà thực vật tiết ra môi trường không giống nhau ở những vị trí tiếp xúc khác nhau giữa khối mô sẹo và môi trường Những 36 nhược điểm trên đã đưa đến yêu cầu về một hệ thống nuôi cấy mới phù hợp hơn, đáp ứng những đòi hỏi ngày càng cao của công tác nhân giống in vitro. Trước tình hình đó, hệ thống nuôi cấy sử dụng môi trường lỏng tỏ ra có triển vọng hơn cả. Hệ thống nuôi cấy in vitro sử dụng môi trƣờng lỏng tĩnh Nuôi cấy lỏng là một cách thức lý tưởng cho mục tiêu giảm chi phí và tự động hóa vi nhân giống thực vật. Nuôi cấy lỏng cung cấp điều kiện nuôi cấy đồng nhất hơn, môi trường có thể thay mới mà không cần phải chuyển mẫu sang bình chứa khác, có thể thực hiện khử trùng bằng vi lọc và việc cọ rửa chai lọ sau khi nuôi cấy cũng đơn giản hơn. So với việc nuôi cấy trên thạch, nuôi cấy lỏng cho phép sử dụng những loại bình nuôi cấy dung tích lớn từ đó giảm được số lần cấy chuyền. Mô của một số loài thực vật biểu hiện tốt hơn trên môi trường lỏng so với trên môi trường đặc, chẳng hạn như chồi cây đào (Prunus persica), phôi soma lúa mì (Triticum aestivum), và phôi soma cây bông (Gossypium hirsutum). Nuôi cấy lỏng thực ra đã có từ rất lâu đời. Trong thời kỳ đầu, Haberlandt đã tiến hành nuôi cấy mô lá của các cây đơn tử diệp bằng môi trường lỏng. Việc nghiên cứu nồng độ khoáng và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật cũng được thực hiện với môi trường lỏng. Tuy nhiên, môi trường lỏng được sử dụng trong thời kỳ này đơn giản chỉ là môi trường lỏng tĩnh. Hệ thống nuôi cấy lỏng có nhiều lợi điểm không thể phủ nhận: - Môi trường nuôi cấy lỏng có độ đồng nhất cao do các chất tinh dưỡng khuếch tán đều trong dung môi lỏng, tạo điều kiện để mẫu cấy sử dụng triệt để chất dinh dưỡng sẵn có. Hơn nữa, toàn bộ bề mặt mẫu được tiếp xúc trực tiếp với môi trường nên việc hấp thu chất dinh dưỡng hiệu quả hơn, cây sinh trưởng tốt hơn, thời gian nuôi cấy có thể được rút ngắn. - Nuôi cấy lỏng cho phép kiểm soát các thông số hóa lý một cách chủ động, đây là một điều kiện cần có để thực hiện tự động hóa. Do vậy, nuôi cấy lỏng rất phù hợp khi triển khai ra quy mô công nghiệp. - Chi phí sản xuất và giá thành sản phẩm thấp hơn so với nuôi cấy bán rắn, tiết kiệm được thời gian và lao động. Bên cạnh những mặt mạnh, việc nuôi cấy lỏng cũng vấp phải nhiều khó khăn, nhất là khả năng thoáng khí kém, hiện tượng thủy tinh thể và đòi hỏi nhiều thiết bị phức tạp. Để hạn chế những nhược điểm này, một số phương pháp đã được đề xuất như bổ sung thêm các giá đỡ mẫu nuôi cấy trong môi trường 37 lỏng tĩnh, bổ sung môi trường lỏng vào môi trường thạch đã sử dụng trước đó, và sử dụng các bioreactor sục khí. Một vấn đề lớn thường gặp trong nuôi cấy môi trường lỏng đó là sự nhiễm vi sinh vật. Nấm mốc, vi khuẩn và côn trùng là những nguồn gây nhiễm nghiêm trọng. Chúng là nguyên nhân gây mất nguồn mẫu thực vật chủ yếu trong các phòng thí nghiệm thương mại. Vì là môi trường lỏng nên sự nhiễm vi sinh vật sẽ là rất nhanh và nghiêm trọng hơn cả so với các loại môi trường khác. Sự gây nhiễm có thể xuất phát từ các giai đoạn thao tác chuẩn bị và điều khiển thiết bị. Trong một số phòng thí nghiệm, để hạn chế nguy cơ bị nhiễm, người ta thường tạo một không gian vô trùng bằng dòng không khí được lọc qua các lớp màng lọc. Trước hai mặt được và chưa được của hệ thống này, các nhà khoa học tích cực nghiên cứu phát triển những hệ thống mới để vừa tận dụng được các ưu điểm của nuôi cấy lỏng, vừa khắc phục những yếu điểm cố hữu của nó. Hệ thống nuôi cấy lỏng sử dụng giá thể Giá thể được sử dụng với mục đích nâng một phần hoặc toàn bộ mẫu cấy lên khỏi môi trường lỏng mà vẫn đảm bảo dinh dưỡng cho cây nhờ sự thẩm thấu của các cấu tử dinh dưỡng qua giá thể đến mẫu. Các loại vật liệu làm giá thể rất đa dạng, từ những vật liệu dễ kiếm như bông gòn, giấy lọc đến những vật liệu cao cấp như rockwool, oasis, v.v. Điển hình cho giá thể cao cấp là rockwool. Bản chất của rockwool là thể sợi (wool) có nguồn gốc từ đá (rock). Đá, chủ yếu là đá basalt, được đun chảy ở nhiệt độ 1600oC, được đổ vào các ống và quay với tốc độ cao, biến dịch đá lỏng thành các sợi. Chiều dài và đường kính sợi được kiểm soát thông qua tốc độ quay, nhiệt độ nung và một số các yếu tố khác. Khi nghiên cứu trên đối tượng cây chuối Nam Định, Nhut (2002) đã chứng minh rằng cây nuôi cấy trên rockwool và oasis có chiều cao thân và số lượng lá nhiều hơn hẳn các hệ thống sử dụng agar truyền thống. Hệ thống nuôi cấy lỏng lắc Mẫu cấy được đặt trong môi trường lỏng và được lắc trên máy lắc tròn với tốc độ thích hợp. Chuyển động lắc tạo điều kiện cho không khí tự do khuếch tán vào môi trường tốt hơn, tăng lượng oxygen hòa tan trong môi trường, thỏa mãn nhu cầu hô hấp của cây. Tewary P.K. và Oka S. (1999) đã sử dụng hệ thống lỏng lắc để nhân giống chồi bên cây dâu tằm với tốc độ lắc 120 vòng/phút. Kết quả thu được sau 6 tuần rất tốt: 90% mẫu cảm ứng tạo chồi mới với chiều dài mỗi chồi khoảng 3,3cm. 38 Hệ thống nuôi cấy lỏng trong bioreactor Khi nuôi mẫu trong dung dịch lỏng kết hợp với tăng cường độ thoáng khí, mẫu cấy vẫn hô hấp tốt dù bị ngập trong dung dịch. Có thể mở rộng quy mô của hệ thống này bằng cách sử dụng các bình chứa dung tích lớn (hệ thống bioreactor cấp khí cưỡng bức) để nhân sinh khối hay thu hợp chất thứ cấp từ thực vật. Các phương pháp tạo điều kiện thoáng khí khi nuôi cấy lỏng trong các bioreactor gồm có: sục khí cưỡng bức, ngập chìm tạm thời, v.v. Hiện nay có rất nhiều hệ thống bioreactor sục khí được thiết kế nhằm nhân giống cây hoa lily với số lượng lớn. Trong các hệ thống này, mặc dù vảy củ lily chìm xuống đáy bình nhưng sự tăng trưởng của chúng vẫn rất tốt. E. Jiménez và cộng sự (1999) đã chứng minh rằng hệ thống ngập chìm tạm thời cho hiệu quả tạo củ khoai tây bi tốt hơn so với môi trường bán rắn truyền thống: củ bi được hình thành trên tất cả các đốt thân sau 9 tuần nuôi cấy, trung bình khoảng 3,1 củ/đốt. Trọng lượng tươi và kích thước củ cũng lớn hơn củ hình thành trên môi trường thạch. Tóm lại, các hệ thống cải tiến đều có những tiến bộ và hầu hết đều tập trung giải quyết vấn đề thoáng khí khi nuôi cấy trong môi trường lỏng. Ngoài ra, một yếu tố không thể thiếu cần cân nhắc khi thiết kế các hệ thống mới là hiệu quả kinh tế của hệ thống. Có như vậy, hệ thống mới được nhanh chóng thương mại hóa và có khả năng cạnh tranh với những hệ thống nhân giống truyền thống khác. Các hệ thống bioreactor nuôi cấy in vitro được tìm hiểu trong đề tài này cũng hướng đến các yếu tố đó với mục đích chọn lựa được hệ thống nuôi cấy phù hợp cho một số đối tượng thực vật cụ thể. 2.9. Các yếu tố ảnh hƣởng trong quá trình nuôi cấy ngâm chìm định kỳ Thời gian ngập chìm Thời gian để mẫu ngập trong môi trường dinh dưỡng có ý nghĩa rất quan trọng do nó ảnh hưởng đến sự hấp thu chất dinh dưỡng của mô thực vật cũng như tham gia điều khiển hiện tượng thủy tinh thể. Yếu tố này thay đổi theo đối tượng nuôi cấy, mục đích nuôi cấy và loại hệ thống ngập chìm được sử dụng. Thời gian ngập chìm dài (1 giờ ngập trong chu kỳ 6 giờ) tỏ ra hiệu quả cho sự hình thành củ khoai tây bi, trong khi thời gian ngập chìm rất ngắn (1 phút ngập trong chu kỳ 12 giờ) lại tốt cho sự hình thành phôi soma ở cây cà phê (C. arabica) và cao su. Ngoài ta, tần số ngập chìm cao (30 giây ngập, 30 giây rút) cho hiệu quả nhân chồi cao khi nuôi cấy chồi nho trong hệ 39 thống bioreactor nghiêng lắc. Krueger và cộng sự (1991) đã chứng minh được tầm quan trọng của tần số ngập chìm lên hiệu quả nhân chồi ở cây “serviceberry”. Cây bị mọng nước khi xử lý ở chế độ ngập chìm 5 phút/30 phút (5 phút ngập trong chu kỳ 30 phút), và không bị mọng nước khi xử lý ngập chìm 5 phút/60 phút. Tuy nhiên, chế độ xử lý trước (5 phút/30 phút) lại tốt cho sự nhân về số lượng chồi. Từ kết quả này, tác giả đề nghị sử dụng chu kỳ 5 phút/30 phút ở giai đoạn đầu nuôi cấy để nhân số lượng và áp dụng chu kỳ sau 5phút/60 phút để duy trì chất lượng chồi. Qua thí nghiệm này, tác giả cũng quan sát được khoảng thời gian thích nghi của thực vật khi thời gian ngập chìm bị thay đổi. Khi chuyển từ tần số cao sang tần số thấp, một số chồi bị stress và bị chết, nhưng phục hồi trở lại sau đó. Thể tích môi trƣờng dinh dƣỡng Thể tích môi trường cần được tối ưu hóa khi nuôi cấy bằng bioreactor ngập chìm mà không thay môi trường mới (bioreactor nghiêng lắc, bình đôi hoặc RITA®). Lorenzo và cộng sự (1998) xác định thể tích môi trường 50 ml cho một mẫu cấy là tối ưu khi nhân chồi Saccharum spp. trong hệ thống bioreactor bình đôi BIT®. Khi tăng dần thể tích môi trường từ 5,0 đến 50,0 ml/mẫu cấy, hệ số nhân chồi tăng từ 8,3 chồi lên đến 23,9 chồi sau 30 ngày nuôi cấy. Tuy nhiên, thể tích môi trường sử dụng không ảnh hưởng lên chiều dài chồi. Thể tích nhiều hơn tỏ ra không hiệu quả cho nhân chồi. Giải thích hiện tượng này, tác giả cho rằng trong quá trình nuôi cấy, thực vật tiết ra ngoài tế bào những hợp chất có tác dụng kích thích tạo chồi, và với thể tích nuôi cấy lớn, lượng chất này có thể bị pha loãng đi. Cũng sử dụng hệ thống nuôi cấy tương tự, Escalona và cộng sự (1999) chứng minh rằng thể tích tối ưu cho nhân chồi dứa là 200 ml/mẫu cấy. Sử dụng thể tích lớn hơn đã làm giảm hệ số nhân chồi trong trường hợp này. Thể tích bình nuôi cấy Tất cả các hệ thống bioreactor ngập chìm đều có thể tích và không gian thoáng khí bên trên lớn hơn các bình nuôi cấy truyền thống. Hơn nữa, có thể áp dụng các loại bình chứa khác nhau với thể tích từ 1 đến 20 l để thiết lập hệ thống. Krueger và cộng sự (1991) chứng minh rằng thể tích bình chứa lớn (7 l) có ảnh hưởng tích cực lên hiệu quả vi nhân giống cây “serviceberry”, đặc biệt là hệ thống giúp tránh được hiện tượng mẫu cấy tập trung quá nhiều, đồng thời kích thích kéo dài chồi so với các bình cấy 40 dung tích nhỏ (140 ml). Monette (1983) đã chỉ ra rằng khi nuôi cấy chồi cây nho trong những bình chứa lớn sẽ thu được chồi có kích thước dài hơn. Chồi cây nho tăng trưởng rất nhanh trong môi trường lỏng sử dụng hệ thống bioreactor nghiêng lắc (trong những hộp vuông Mason 910 ml, miệng rộng) so với trong bình tam giác dung tích 125 ml do mẫu không bị dồn quá nhiều một chỗ, dễ dàng thu mẫu sau nuôi cấy và ngăn chặn được sự thiếu hụt chất dinh dưỡng. Việc sử dụng những vật chứa lớn để nuôi cấy cho phép sử dụng nhiều môi trường, điều này có ảnh hưởng tích cực đến sự hình thành và phát triển của thực vật nuôi cấy bằng bioreactor. Sự thoáng khí tự nhiên và thoáng khí cƣỡng bức Thí nghiệm vi nhân giống cây chuối trong môi trường lỏng đã chứng minh rằng sự thiếu hụt oxygen khi nuôi cấy lỏng là nguyên nhân chính dẫn đến sự hình thành những cây con có kích thước nhỏ. Cung cấp oxygen bằng phương pháp sục khí có thể kích thích cây tăng trưởng nhưng phương pháp ngập chìm tạm thời tỏ ra có hiệu quả nhất trong trường hợp này.Hệ thống ngập chìm tạm thời có thay môi trường mới bằng áp lực khí sẽ tạo ra điều kiện thoáng khí cưỡng bức và làm mới bầu khí quyển trong bình cấy sau mỗi chu kỳ chìm ngập. Theo Teisson và Alvard (1995), không khí được thay mới trong quá trình chất lỏng di chuyển và do một lượng khí mới được cấp vào từ máy bơm khí. Trong điều kiện cấp khí bắt buộc, hàm lượng khí và độ ẩm tương đối sinh ra trong bình cấy có thể có ảnh hưởng tích cực đến việc nuôi cấy. Độ ẩm tương đối sinh ra do ảnh hưởng của trao đổi khí có tác dụng kích thích sự thoát hơi nước ở thực vật, giúp cây in vitro có khả năng thích nghi tốt hơn khi chuyển ra môi trường ex vitro 2.10. Ảnh hƣờng hệ thống ngâm chìm định kỳ đến chất lƣợng cây trồng Đặc điểm hình thái của thực vật sản xuất từ các bioreactor ngập chìm tạm thời : Lá của những chồi phát sinh trong hệ thống ngập chìm tạm thời có kích thước nhỏ hơn lá từ chồi nuôi cấy trong môi trường lỏng. Những cụm chồi phát triển từ các chồi bên trong bioreactor thường có hình cầu và chồi có xu hướng phát triển tỏa tròn quanh tâm. Do đó, một số chồi con có kích thước không lớn và cần được kéo dài trong cùng hệ thống trước khi cho ra rễ ngoài ống nghiệm. Ngược lại, chồi cây “cow tree” có 41 thân dài hơn và ra nhiều lá hơn khi nuôi cấy trong hệ thống ngập chìm tạm thời so với nuôi cấy trên thạch. Chồi cây “serviceberry” nuôi cấy trong hệ thống này cũng dài và nặng hơn chồi nuôi cấy trên môi trường bán rắn. Chồi cây nho và Amelanchier alnifolia khi nuôi cấy trong hệ thống bioreactor nghiêng-lắc có kích thước lớn và ra rễ nhanh hơn so với khi nuôi cấy trên thạch. Những ảnh hưởng có lợi từ hệ thống ngập chìm tạm thời lên sự phát triển chồi có thể là kết quả của việc sử dụng những bình chứa dung tích lớn. Hệ thống ngập chìm tạm thời có ảnh hưởng rất tốt đến sự phát triển phôi soma của các cây Citrus, cho phép hình thành lá mầm và vỏ phân sinh ngọn (protoderm) ngay trong hệ thống. Điều này không xảy ra được trong nuôi cấy huyền phù tế bào. Hình thái của các phôi này rất giống với phôi nhân. Mặt khác, ở các cây cà phê, cao su, chuối, phôi soma tạo ra trong hệ thống RITA® có chất lượng tốt hơn phôi hình thành trên môi trường thạch hay lỏng trong các bình erlen. Ở cao su, tỷ lệ phôi soma bất thường giảm đi phân nửa khi nuôi cấy bằng hệ thống ngập chìm tạm thời so với nuôi cấy trên thạch. Hệ thống này cũng đã được áp dụng thành công lần đầu tiên khi cho phôi soma C. arabica nảy mầm trong môi trường lỏng. Mật độ 1600 phôi/1 ảnh hưởng tốt lên hình thái nảy mầm của phôi do kích thích sự kéo dài đỉnh phôi (4-5 mm), tăng trọng lượng tươi (100%) và giảm diện tích lá mầm. Ba yếu tố này sẽ có liên quan đến tỷ lệ phát triển thành cây con cũng như hệ số tăng trưởng của cây con sau này. Hiện tƣợng thuỷ tinh thể Vi nhân giống trong môi trường lỏng giúp cho sự hấp thu chất dinh dưỡng thực hiện dễ dàng hơn và do đó kích thích cây tăng trưởng, tuy nhiên, hiện tượng mọng nước cũng thường xảy ra. Hiện tượng này xuất hiện khi cho tiếp xúc liên tục với chất lỏng. Đặc trưng của thực vật bị mọng nước là mô có những rối loạn về hình thái và sinh lý như biểu hiện mọng nước, có màu trong như thủy tinh, chồi sinh trưởng bất thường, đặc biệt là những dị thường ở lá. Có thể giảm bớt hiện tượng mọng nước bằng cách tăng cường độ thoáng khí, cho mô tiếp xúc gián đoạn với môi trường lỏng. Cả hai yếu tố này đều được thỏa mãn với hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời 2.11. Ảnh hƣởng của hệ thống ngập chìm tạm thời đến chi phí sản xuất Những tính toán ban đầu đã cho thấy hệ thống có tác dụng làm tăng hiệu quả của việc nhân giống trong môi trường lỏng. Khi nhân chồi mía (Saccharum spp.), Lorenzo 42 và cộng sự (1998) đã chứng minh được rằng sử dụng hệ thống ngập chìm tạm thời giúp giảm được 46% chi phí so với quy trình nuôi cấy chuẩn trên môi trường thạch. Chi phí tiết kiệm được chủ yếu nhờ vào việc giảm được nhân công và không gian sử dụng cho nuôi cấy mô. Ở cây dứa, chồi được nhân trong hệ thống bioreactor ngập chìm tạm thời có tỷ lệ nhân gấp 100 lần so với nuôi cấy trên thạch trong khoảng thời gian 4 tháng. Quy trình này giúp giảm 20% chi phí sản xuất tính cho 1 cây so với phương pháp nuôi cấy lỏng truyền thống. Theo tác giả, yếu tố dẫn đến thành công là ở việc giảm được số lượng bình chứa, dụng cụ thao tác; giảm thiểu các công đoạn cấy, trồng; loại bỏ công đoạn ra rễ in vitro và hạn chế được mức độ nhiễm vi sinh vật. Khả năng duy trì mẫu chồi Pinus radiata trong thời gian dài (18 tháng) mà không cần cấy chuyền của hệ thống bioreactor ngập chìm tạm thời có sự thay mới môi trường giúp giảm chi phí lao động và mở ra khả năng tự động hóa sản xuất, kết quả cuối cùng là giảm được giá thành cho cây vi nhân giống . Từ hệ thống này (sử dụng bình chứa dung tích 600 ml), chồi được thu hoạch với sản lượng 672 chồi/giờ so với khoảng 1100 chồi thu hoạch từ 1 m2 diện tích môi trường thạch trong 1 tháng. Theo tỷ lệ này, hệ thống chỉ tiêu tốn 1/7 chi phí so với quy trình sản xuất Pinus radiata theo phương pháp cấy chuyền trên thạch thông thường. Trong sản xuất phôi soma, công đoạn cho phôi nảy mầm là tốn kém nhất do mất nhiều lao động trong việc cấy chuyền. Hệ thống nuôi cấy ngập chìm có thể được sử dụng để vừa nhân phôi, vừa cho phôi nảy mầm. Sản xuất phôi soma nảy mầm trong hệ thống kết hợp với gieo mầm trực tiếp ra đất giúp giảm 13% cho phí thao tác và 6,3% diện tích so với chi phí khi sử dụng kỹ thuật đưa cây nuôi cấy từ môi trường thạch ra vườn ươm. Ngoài ra, hệ thống này giúp rút ngắn giai đoạn cho phôi trưởng thành và nảy mầm ba tháng. Hệ thống ngập chìm tạm thời hiện nay đang từng bước được thương mại hóa. CIRAD sử dụng hệ thống RITA® để sản xuất một lượng lớn cây giống lai C.abrabica F1 ở Trung Mỹ và Tanzania. Một nhóm các nhà nghiên cứu thuộc Trung tâm Sinh học Thực vật ở Centro de Bioplantas ở Ciego de Avila, Cuba đang phát triển một quy trình nhân giống thương mại trên hai đối tượng thực vật là cây mía và cây dứa sử dụng phương pháp nhân mô phân sinh trong hệ thống bình đôi BIT®. Tóm lại, hệ thống ngập chìm tạm thời có những tác động tích cực lên tất cả các giai đoạn nuôi cấy chồi và phôi soma của thực vật. Hệ số nhân và sự tăng trưởng ở 43 thực vật nuôi cấy trong hệ thống này thường cao hơn nuôi cấy trên thạch hoặc trong các hệ thống bioreactor khác. Cây con tái sinh và phôi soma tạo thành có chất lượng tốt hơn, khả năng thích ứng với môi trường tự nhiên và tỷ lệ sống sót ngoài vườn ươm cũng cao hơn. Hệ thống này kết hợp được hai ưu điểm của nuôi cấy lỏng và nuôi cấy rắn. Trong môi trường lỏng, mô thực vật hấp thu chất dinh dưỡng dễ dàng hơn, trong khi khả năng trao đổi khí của thực vật tốt hơn trên môi trường rắn. Khi sử dụng hệ thống để nuôi cấy mô thực vật, thời gian và tần số ngập chìm là các thông số quan trọng nhất cần được xác định. Việc tối ưu hóa các thông số này trên từng đối tượng thực vật và ở từng đối tượng nuôi cấy sẽ cho hiệu suất nuôi cấy cao hơn, cho phép điều khiển tốt hơn sự phát sinh hình thái của thực vật cũng như khống chế được hiện tượng mọng nước thường xảy ra khi nuôi cấy lỏng. Ngoài ra, thành phần môi trường dinh dưỡng sử dụng cũng như mật độ mẫu cấy cũng là những yếu tố quan trọng, tuy nhiên những yếu tố này vẫn chưa được hiểu cặn kẽ và do đó cần có nhiều nghiên cứu, tìm hiểu sâu hơn nữa. Không những ứng dụng tốt trong nuôi cấy mô, hệ thống ngập chìm tạm thời còn có thể trở thành công cụ đắc lực cho việc nghiên cứu cơ chế của các quá trình trao đổi chất. Chẳng hạn như những nghiên cứu trên cây cà phê (Coffea spp.) đã cho thấy rằng thời gian ngập chìm có ảnh hưởng đến hiện tượng mọng nước và trạng thái nước của mô sẹo và phôi soma. Chính xác hơn, các thông số về nước (hàm lượng, thế nước) có liên quan mật thiết đến hiện tượng mọng nước và chịu ảnh hưởng mạnh mẽ của tần số và thời gian xử lý ngập. Ở cây cao su, hệ thống cho phép nghiên cứu những cảm ứng của hiện tượng stress oxygen hóa trong giai đoạn ngập khi nuôi cấy phôi. Các dạng hệ thống ngập chìm khác nhau có thể được sử dụng thích hợp trong việc nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần không khí trong khí quyển đến sự sinh trưởng của thực vật. Từ khi Harris và Mason (1983) công bố hệ thống ngập chìm đầu tiên, đã có một số hệ thống bán tự động hoạt động theo nguyên lý tương tự được chế tạo, và vấn đề này ngày càng thu hút nhiều sự quan tâm. Hệ thống đã được đơn giản hóa rất nhiều so với những hệ thống bioreactor đầu tiên và có thể trở thành một phương pháp nuôi cấy thực vật in vitro phổ biến. Các hệ thống hiện nay đã giúp giảm được chi phí sản xuất và hoàn toàn thích hợp để đưa vào sản xuất lớn. Những nghiên cứu trên hệ thống này 44 vẫn tiếp tục được thực hiện để giảm chi phí đồng thời tối ưu hóa điều kiện sản xuất những chủng loài thực vật khác nhau 2.12. Các nghiên cứu và ứng dụng bioreactor trên đối tƣợng cây dứa Nghiên cứu và ứng dụng bioreactor trên đối tƣợng cây dứa ở trong nƣớc Chưa thấy có cơ quan nào nghiên cứu và ứng dụng bioreactor trên đối tượng cây dứa được công bố Nghiên cứu và ứng dụng bioreactor trên đối tƣợng cây dứa ở ngoài nƣớc : Năm 1999, Esscalo và cộng sự đã nghiên cứu trên đối tượng cây dứa. Nhiều nghiên cứu tiếp theo đã cho thấy hiệu quả của việc sử dụng bioreactor trên đối tượng cây dứa : số chồi thu được trên 1 chồi ban đầu là 30 (Plant Cell Rep,2003), giá thành hạ, chi phí nhân công thấp, cây trồng khi đưa ra vườn cũng phát triển tốt hơn (Plant Cell Rep, 2005), 45 Phần3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 2 đến tháng 7 năm 2006 tại phòng nuôi cấy mô của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM 3.2 Nội dung nghiên cứu - Thiết kế hệ thống điều khiển tự động cho bioreactor ngâm chìm định kỳ : Dựa trên nguyên lý hoạt động của bioreactor TIB (dòng dung dịch được chuyển qua lại giữa bình môi trường và bình nuôi cấy theo một quy trình). - So sánh hiệu quả nhân chồi dứa giữa TIB và nuôi cấy bằng bioreactor sục khí - Khảo sát thời gian ngâm chìm định kỳ thích hợp cho sự phát triển chồi của cây dứa 3.3. Vật liệu Trang thiết bị Tủ cấy, nồi hấp,máy đo pH, cân điện tử, đèn huỳnh quang, timer Omron, , máy bơm khí (Resun, TQ),.... Dụng cụ Bình erlen 2l, kẹp, kéo, dây silicon, film lọc vô trùng Satorius(0,2 m), adapter 220-110V, pipet 5ml, co L.... Mẫu cấy Mẫu cấy l cây dứa được nuôi cấy trong phòng tăng trưởng của bộ môn CNSH trong thời gian 6 tháng. Mẫu dứa invitro được nuôi cấy trong môi trường MS+30g/l đường sucrose + 2mg/l BA 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1Thiết kế hệ thống tự động cho bioreactor sục khí tự tạo và ngâm chìm định kỳ (TIB) Thiết kế hệ thống tự động bioreactor sục khí tự tạo Hệ thống được thiết kế với yêu cầu đảm bảo vô trùng và tự động - Dùng nút cao su số 9 đục 2 lỗ có kích thước vừa với pipet 5ml và đầu co L( đường kính 1cm). Dùng pipet 5ml và co L đút vô 2 lỗ trên nút cao su. - Dùng dây silicone tạo thành vòng tròn, bịt kín một đầu. Trên ống dây silicone dùng kim đục có lỗ với kích thước <=2mm. Nối đầu còn lại với pipet 5ml 46 -Gắn một đầu dây silicone vào ống pipet 5ml, đầu dây silicone còn lại được bịt kín nên khí đi vào sẽ thoát qua theo đường các lỗ kim trên thân ống silicone. - Khí được sục qua đầu lọc 2 m , khí ra cũng được đưa qua đầu lọc 2 m tạo thành hệ thống kín vô trùng. Hình 3.1- Sơ đồ lắp ráp hệ thống bioreactor sục khí hình cầu kiểu Hàn Quốc 47  Thiết kế hệ thống bioreactor ngâm chìm định kỳ tự động Hệ thống được thiết kế gồm 2 bình thông nhau, môi trường dinh dưỡng được di chuyển qua lại một cách tự động. Toàn bộ hệ thống phải đảm bảo vô trùng. Hình 3.2-Sơ đồ lắp ráp hệ thống bioreactor ngâm chìm định kỳ *Giải thích quá trình vận hành: bơm đưa dòng khí theo hướng mũi tên qua đầu lọc vô trùng tạo một áp suất trong bình, áp suất tác động lên bề mặt chất lỏng và đẩy chất lỏng theo ống pipet qua bình chứa mẫu. Tắt máy bơm khí (ở hình i), dung dịch 48 được ữ trong bình mẫu một thời gian quy định. Sau đó, bật máy bơm để tạo dòng khí theo hình mũi tên(hình h) tạo áp suất lên bề mặt chất lỏng trong bình mẫu, đẩy dung dịch từ bình mẫu trở về bình môi trường ban đầu, giữ dung dịch trong bình môi trường trong một thời gian quy định. 3.4.2 Tiến hành thí nghiệm Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (Completely Randomized Design, CRD), một yếu tố, 2 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại. Mỗi nghiệm thức gồm 8 chồi dứa hủy đỉnh sinh trưởng. Các bƣớc tiến hành : Các bước tiến hành sau đều giống nhau ở các thí nghiệm - Bước 1: Hấp khử trùng riêng từng bộ phận của bình bioreactor - Bước 2: Hủy đỉnh sinh trưởng của 8 chồi dứa và đưa chồi dứa đã hủy đỉnh sinh trưởng bỏ vào bình bioreactor. - Bước 3 : Gắn đầu lọc vào 2 đầu dây silicone tạo thành hệ thống kín vô trùng - Bước 4 : Dùng băng keo quấn quanh nút cao su thật chặt. Từ bước 2 đến bước 4 thực hiện trong tủ cấy vô trùng. *Các chỉ tiêu theo dõi : -Trọng lượng tươi trung bình(g) : Trọng lượng tươi của tất cả các mẫu sau khi loại bỏ hết nước bám quanh mẫu/8 -Trọng lượng khô trung bình(g) : Trọng lượng tươi tất cả các mẫu được sấy ở nhiệt độ 37oC trong 72 giờ/tổng số mẫu -Hệ số nhân chồi: tổng số chồi tạo ra/8. -Chiều cao chồi(cm) : tính từ rễ cho đến lá cao nhất của chồi dứa. Thí nghiệm 1:Khảo sát hiệu quả nhân chồi dứa bằng bioreactor sục khí. Thí nghiệm 1a: Ảnh hưởng của thể tích môi trường đến khả năng nhân chồi dứa bằng bioreator sục khí liên tục 49 Bảng 3.1 Các nghiệm thức của thí nghiệm 1a Nghiệm thức Thể tích môi trƣờng(lít) 1 1 2 1,5 Thí nghiệm 1b: Ảnh hưởng của thể tích môi trường đến khả năng nhân chồi dứa bằng bioreactor sục khí gián đoạn (10phút/1chu kỳ) Bảng 3.2 Các nghiệm thức của thí nghiệm 1b Nghiệm thức Thể tích môi trƣờng(lít) 1 1 2 1,5 * Ngoài các bước tiến hành chung ở trên cần tiến hành gắn thêm timer vào hệ thống, bơm sục khí gián đoạn 10 phút/1 chu kỳ ( 10 phút sục khí, 10 phút nghỉ) Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian ngâm chìm định kỳ thích hợp cho việc nhân chồi cây dứa. Bảng 3.3 Các nghiệm thức của thí nghiệm 2 Nghiệm thức Thời gian ngâm chìm(phút/giờ) 1 10 phút/1giờ 2 10 phút/2giờ 50 * Ngoài các bước tiến hành chung ở trên cần tiến hành gắn bình TIB vào hệ thống điều khiển tự động đã được thiết kế. 3.5 Xử lý số liệu : Số liệu được xử lý trên phần mềm Statgraphic 7.0 51 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thiết kế hệ thống tự động cho bioreactor sục khí và ngâm chìm định kỳ (TIB) 4.1.1Thiết kế hệ thống tự động bioreactor sục khí Hệ thống được thiết kế đã hoạt động tốt. Khí được sục qua các lỗ kim trên thành ống silicone tạo thành các bọt khí, cung cấp oxy cho môi trường. Hình 4.1-Bioreactor sục khí 4.1.2 Thiết kế hệ thống bioreactor ngâm chìm định kỳ tự động Dựa trên nguyên lý hoạt động của bioreactor ngâm chìm định kỳ(TIB) mạch điện được thiết kế với mục đích tự động hoá quá trình trên : T4A T2B T1 T1A T3A T2B T1B T2 T3 T3A T3B T4 Bom B Van V K CHÚ THÍCH -T: timer -1,2,3,4:số thứ tự timer -Kí hiệu A :cổng ra của timer -Kí hiệu B : cổng ra của timer -Bom : máy bơm sục khí - Van : van solenoid 3 lỗ -K : công tắc nguồn -Kí hiệu :thường đóng -Kí hiệu :thường mở -Kí hiệu : cuộn dây của timer. 52 Hình 4.2- Sơ đồ mạch điện thiết kế cho TIB tự động *Giải thích mạch điện : Khi đóng nguồn thì T1 hoạt động để bơm khí vào bình 1 trong một thời gian quy định, sau đó T1 tắt và T2 mở làm cho máy bơm ngừng hoạt động trong một thời gian đã định. Tiếp đó T2 nghỉ và T3 hoạt động đồng thời valve 3 chiều cũng mở theo làm dòng khí đi qua bình 2(thay vì qua bình 1 như lúc trước) sau trong một thời gian đã định. Tiếp đó, T3 nghỉ và bơm ngừng hoạt động đồng thời T4 hoạt động làm cho máy bơm ngừng hoạt động trong một thời gian đã định . Cuối cùng T4 nghỉ và T1 lại họat động, lặp lại chu kỳ như trên. Hệ thống tự động này tiết kiệm được 1 máy bơm thay vì 2 máy bơm nhờ sử dụng van solenoid 3 lỗ, đồng thời tiết kiệm được sức lao động trong quá trình canh thời gian để chạy máy bơm, bên cạnh đó có thể chủ động được thời gian cho môi trường qua lại giữa 2 bình một cách hiệu quả. Hình 4.3-Hộp điều khiển tự động TIB tự chế 53 4.2 Kết quả thí nghiệm. 4.2.1 Thí nghiệm 1 : Khảo sát hiệu quả nhân chồi dứa bằng bioreactor sục khí liên tục. Thí nghiệm 1a:Ảnh hưởng của thể tích môi trường đến khả năng nhân chồi dứa bằng bioreator sục khí liên tục Bảng 4.1- Các chỉ tiêu theo dõi của thí nghiệm 1a Nghiệm thức MT lỏng sục khí liên tục 1L MT lỏng sục khí liên tục 1,5L Trọng lƣợng tƣơi trung bình(g) 3,12 3,75 Trọng lƣợng khô trung bình(g) 0,3 0,35 Hệ số nhân chồi 12,5 13,5 Chiều cao chồi(cm) 2,15 2,32 Đặc điểm hình thái Lá bị đen, cứng, dòn tích nhiều nước, không có hiện tượng thủy tinh thể Lá bị đen, cứng, dòn tích nhiều nước, không có hiện tượng thủy tinh thể Bảng 4.2-Ảnh hưởng của yếu tố thể tích đến hệ số nhân chồi của cây dứa Cayenne trong bình bioreactor sục khí liên tục Nghiệm thức Hệ số nhân chồi SỤC LIÊN TỤC THỂ TÍCH 1L 10,97a SỤC LIÊN TỤC THỂ TÍCH 1,5L 14,10b 54 Nhận xét : -Kết quả nhận được cho thấy với cùng một mẫu cây dứa như nhau khi xử lý với thể tích khác nhau cho kết quả tăng chồi trung bình khác nhau. Khi phân tích trên thống kê cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa giữa 2 phương pháp. -Mẫu chồi dứa trong bình thể tích 1,5 lít có số chồi tăng hơn so với thể tích 1 lít. Giải thích điều này là do trong thể tích 1,5 lít lượng chất dinh dưỡng cần thiết cho việc nhân chồi nhiều hơn so với thể tích 1 lít. Với hệ thống ngâm chìm định kỳ, Escalona và cộng sự (1999) chứng minh rằng thể tích tối ưu cho nhân chồi dứa là 200 ml/mẫu cấy. Sử dụng thể tích lớn hơn đã làm giảm hệ số nhân chồi. Lorenzo và cộng sự (1998) khi nhân chồi Saccharum spp. trong hệ thống bioreactor bình đôi BIT® cũng đã chứng minh khi tăng dần thể tích môi trường từ 5,0 đến 50,0 ml/mẫu cấy, hệ số nhân chồi tăng từ 8,3 chồi lên đến 23,9 chồi sau 30 ngày nuôi cấy. Sục khí liên tục Sục khí gián đoạn 10’/1lần Hình 4.4-Chồi dứa sau 4 tuần nuôi cấy trong bình bioreactor sục khí liên tục và sục khí gián đoạn. Thí nghiệm 1b: Ảnh hưởng của thể tích môi trường đến khả năng nhân chồi dứa bằng bioreactor sục khí gián đoạn (10phút/1chu kỳ) 55 Bảng 4.3-Các chỉ tiêu theo dõi của thí nghiệm 1b Bảng4.4-Ảnh hưởng của yếu tố thể tích đến hệ số nhân chồi của cây dứa Cayenne trong bình bioreactor sục khí gián đoạn Nhận xét : -Kết quả trên cho thấy phương pháp sục khí gián đoạn với 2 thể tích khác nhau cho kết quả thống kê khác nhau. Nghiệm thức Sục khí gián đoạn 1L Sục khí gián đoạn 1,5L Trọng lƣợng tƣơi trung bình (g) 0,71 0,96 Trọng lƣợng khô trung bình (g) 0,078 0,11 Hệ số nhân chồi 11 7,25 Chiều cao chồi(cm) 1,3 1,63 Đặc điểm hình thái Lá bị đen, cứng, dòn tích nhiều nước, không có hiện tượng thủy tinh thể Lá bị đen, cứng, dòn tích nhiều nước, không có hiện tượng thủy tinh thể Nghiệm thức Hệ số nhân chồi SỤC KHÍ GIÁN ĐOẠN 1L 11,13 a SỤC KHÍ GIÁN ĐOẠN 1,5L 7,24 b 56 -Trong phương pháp sục khí gián đoạn lượng oxy cung cấp cho mẫu cây dứa không đủ. Do vậy, bình 1,5L có thể tích lớn hơn nên lượng oxy trung bình cung cấp cho mẫu dứa không bằng lượng oxy trung bình cung cấp cho bình 1L. Kết quả là mẫu cây dứa không thể phát triển cũng như sử dụng chất dinh dưỡng một cách hiệu quả. Oxygen chỉ hòa tan một phần trong nước (0,25 mmol l-1 ở 25oC, 1 atm, oxygen chiếm 21% thể tích không khí) nên để đáp ứng nhu cầu oxygen cho sự phát triển của mô thực vật, một lượng lớn oxygen cần được khuếch tán vào môi trường nuôi cấy. Những yếu tố liên quan đến vấn đề hòa tan oxy gồm có độ thoáng khí, tốc độ khuấy đảo, hình dạng cánh khuấy, độ hòa trộn không khí và kết cấu của bioreactor. Ngoài ra, mức độ đảo trộn của mẫu cấy cũng là một yếu tố cần quan tâm do oxygen hòa tan trong môi trường cần nhanh chóng được mô, tế bào hấp thu. Tóm lại, để đáp ứng tốt nhất nhu cầu oxygen cho sự phát triển của mô và tế bào thực vật, lượng oxygen hòa tan trong dung dịch nuôi cấy luôn phải lớn hơn ngưỡng oxygen hòa tan cực đại mà tế bào mô hấp thu (DO2 htcđ). Trong thực tế, người ta căn cứ vào giá trị DO2htcđ để thiết kế bioreactor và giá trị này cũng là yếu tố được quan tâm hàng đầu khi tiến hành phóng đại hệ thống lên quy mô lớn hơn (Leather, 1995) 4.2.2 Thí nghiệm 2 : Ảnh hưởng của thời gian ngâm chìm định kỳ đến khả năng nhân chồi dứa bằngTIB. 57 Bảng 4.5-Các chỉ tiêu theo dõi của thí nghiệm 2 Nghiệm thức MT lỏng ngâm chìm định kỳ 10'/1h MT lỏng ngâm chìm định kỳ 10'/2h Trọng lƣợng tƣơi trung bình(g) 2,07 4,73 Trọng lƣợng khô trung bình(g) 0,15 0,287 Hệ số nhân chồi 14,83 21,25 Chiều cao chồi (cm) 2,27 2,76 Đặc điểm hình thái Cây con phát triển tốt, lá xanh ,mềm,không tích nước, không có hiện tượng thủy tinh thể Cây con phát triển tốt, lá xanh ,mềm,không tích nước, không có hiện tượng thủy tinh thể 58 Chồi dứa sau 4 ngày nuôi Chồi dứa sau 4 tuần nuôi Hình 4.5- Chồi dứa sau 4 tuần nuôi cấy trong bình TIB 10’/2h 59 Bảng 4.6-Ảnh hưởng của yếu tố thời gian ngâm chìm đến hệ số nhân chồi của cây dứa Cayenne trong bình bioreactor TIB Nhận xét: Hiệu quả nhân chồi ở 2 nghiệm thức là khác nhau. Hệ số nhân chồi trung bình của nghiệm thức 10’/2h(10 phút trong chu kỳ 1h) có kết quả vượt trội so với nghiệm thức 10’/1h. Kết quả trên cũng là một điều hợp lý. Vì cây dứa vốn là loại thực vật thích hợp với điều kiện khô ráo thoáng khí. Do vậy khi ngâm chìm với tần số 10’/1h làm cho cây dứa phát triển không tốt, hiệu quả nhân chồi không cao. Krueger và cộng sự (1991) đã chứng minh được tầm quan trọng của tần số ngập chìm lên hiệu quả nhân chồi ở cây “serviceberry”. Cây bị mọng nước khi xử lý ở chế độ ngập chìm 5 phút/30 phút (5 phút ngập trong chu kỳ 30 phút), và không bị mọng nước khi xử lý ngập chìm 5phút/60phút. Tuy nhiên, chế độ xử lý 5 phút/30 phút lại tốt cho sự nhân về số lượng chồi. Từ đó, tác giả đề nghị sử dụng chu kỳ 5phút/30phút ở giai đoạn đầu nuôi cấy để nhân số lượng và áp dụng chu kỳ sau 5phút/60phút để duy trì chất lượng chồi. Qua thí nghiệm này, tác giả cũng quan sát được khoảng thời gian thích nghi của thực vật khi thời gian ngập chìm bị thay đổi. -Thí nghiệm cho thấy cây dứa thích hợp với điều kiện ngâm chìm 10phút/2giờ hơn so với 10phút/1h. -Trong quá trình tiến hành thí nghiệm có một sự khác biệt so với một số tác giả khi thiết lập hệ thống : sử dụng bông gòn lót ở mặt dưới đáy giúp cho việc giữ môi trường dinh dưỡng lâu hơn. Còn ở thí nghiệm của một số tác giả : sử dụng một miếng lưới lót phía dưới dẫn tới chất dinh dưỡng được rút hết toàn bộ. Nghiệm thức Hệ số nhân chồi TIB 10’/1H 14,78 a TIB 10’/2H 21.32 b 60 HỆ SỐ NHÂN CHỒI 0 5 10 15 20 25 SKLT 1L SKGĐ 1L SKLT 1,5L SKGĐ 1,5L TIB 10'/1h TIB 10'/2h Hình 4.6-Biểu đồ hệ số nhân chồi CHÚ THÍCH :  SKLT 1L : sục khí liên tục 1lít  SKGĐ 1L : sục khí gián đoạn 1 lít  SKLT 1,5L : sục khí liên tục 1,5 lít  SKGĐ 1,5L : sục khí gián đoạn 1,5 lít  TIB 10’/1h : ngâm chìm định kỳ 10 phút/1 giờ  TIB 10’/2h : ngâm chìm định kỳ 10 phút/2 giờ *Nhận xét : Biểu đồ trên cho thấy phương pháp nuôi cấy ngâm chìm định kỳ (TIB) cho hiệu quả nhân chồi cao hơn hẳn so với phương pháp nuôi cấy sục khí. Đặc biệt, tần số ngâm chìm đình kỳ 10’/2h cho hiệu quả cao nhất. 61 Phần 5.KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết Luận : Hệ thống bioreactor đã chứng tỏ khả năng nhân sinh khối với nhiều ưu điểm. Tuy nhiên, mỗi loại cây cần có một kiểu bioreactor thích hợp.Trong các kiểu bioreactor đó, TIB đã cho thấy những ưu điểm phù hợp với sự phát triển của cây dứa. Từ những kết quả đạt được có thể kết luận như sau : +Bioreactor sau khi thiết kế đã hoạt động tốt +Hình thức nuôi cấy cây dứa bằng bioreactor sục khí là không phù hợp cho sự phát triển của cây dứa. +Thể tích môi trường 1,5L cho kết quả khả quan hơn so với thể tích 1L khi nuôi cấy bằng bioreactor sục khí liên tục. +Bioreactor sục khí liên tục giúp cho cây dứa phát triển tốt hơn so với bioreactor sục khí gián đoạn. +Bioreactor ngâm chìm định kỳ là loại bioreactor phù hợp cho sự phát triển của cây dứa. +Thời gian ngâm chìm định kỳ 10 phút/2h là thích hợp hơn cho cây dứa. +Cây con ở bioreactor ngâm chìm định kỳ có hình thái đẹp (lá xanh non, không bị đen) hơn so với bioreactor sục khí. 5.2. Đề nghị : -Cần khảo sát thêm thời gian ngâm chìm đình kỳ thích hợp nhất cho khả năng ra chồi của cây dứa. -Nghiên cứu quá trình thay đổi thành phần môi trường trong quá trình nuôi cho phù hợp với sự tăng sinh chồi của cây dứa. -Nghiên cứu cải tiến thêm hệ thống bioreactor ngâm chìm định kỳ, khắc phục các nhược điểm của hệ thống, kiểm soát và điều khiển một cách tự động các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát triển của cây dứa(pH, không khí, dinh dưỡng...) -Tiếp tục nghiên cứu quá trình đưa cây dứa ra ngoài vườn sau thời gian nuôi cấy thích hợp. -Nghiên cứu ứng dụng hệ thống bioreactor ngâm chìm định kỳ cho các đối tượng khác như : chuối, tiêu... 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1.Dương Công Kiên, 2002. Nuôi cấy mô thực vật. NXB Đại học Quốc gia Tp.HCM. 2.Dương Tấn Nhựt và csv, 2004. Nuôi cấy lỏng và nuôi cấy thoáng khí trong việc gia tăng sinh khối và năng cao chất lượng cây hoa lily (Lilium longiflorum). Tạp Chí Công Nghệ Sinh Học, 2(4), 487 – 499 3.Nguyễn Thành Hải, 2005. Nghiên cứu chế tạo bioreactor mô hình phục vụ công tác nhân giống nhanh cây cây hoa Thu hải đường (Begonia tuberous) – một loài hoa có giá trị kinh tế cao. Khoá luận cử nhân khoa học, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp.HCM 4.Nguyễn Đức Lượng và Lê Hồng Thủy Tiên, 2002. Công nghệ Tế bào. NXB Đại học Quốc gia, Tp.HCM 5. Tôn Bảo Linh, 2005. Nghiên cứu tạo cây dứa Cayenne in vitro sạch virus gây bệnh héo đỏ đầu lá (PMWaV- Pineapple mealybug wilt associated virus). Khóa luận tốt nghiệp khoa Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm, Tp. HCM TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI 6.Aitken-Christie J., 1991. Automation. In: Debergh P.C. & Zimmerman R.J.(eds). Micropropagation: Technology and Application. Kluwer Academic 7.Alvard D., Cote F.&Teisson C., 1993. Comparison of methods of liquid medium cultures for banana micropropagation. Effects of temporary immersion of explants. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 32, 55 – 60. 8.Debergh P., 1988. Improving mass propagation of in vitro plantlets. In: Proceedings of the International Symposium on High Technology in Protected Cultivation, Tokyo, 45 – 57. 9.Escalona M. và csv, 1999. Pineapple (Ananas comosus L. Merr) micropropagation in temporary immersion systems.(Plant Cell R ep) 10.E. Firoozabady · N. Gutterson, (2003). Cost-effective in vitro propagation methods for pineapple (Plant Cell Rep) 11.Gawel N.J & Robacker C.D, 1990. Gossypium hirsutum genotypes in semi-solid versus liquid proliferation media. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 23, 201 – 204. 63 12.Hammerschlag F , 1982. Factors affecting establishment and growth of peach shoots in vitro. HortSci., 17, 85 – 86 13.Jones A.M. & Petolino J.F., 1988. Effects of support medium on embryo and plant production from cultured anthers of soft-red winter wheat. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 12, 243 – 261. 14.Lian M.L., Chkrabarty D. & Peak K.Y, 2002 Growth and the uptake of sucrose and mineral ions by Lilium bulblets during bioreactor culture. L. Hortic. Sci. Biotechnol, 77, 253 – 257. 15.Leathers R.R., Smith M.A.L. & Christie J.A., 1995. Automation of the bioreactor process for mass propagation and secondary metabolism. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, TheNetherlands, 187 – 214 16.Maene L. & Debergh P, 1985. Liquid medium additions to established tissue cultures to improve elongation and rooting in vivo. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 5, 23–33. 17.Nhut D.T., 2002. In vitro growth and physiological aspects of some horticultural plantlets cultured under red and blue light – emitting diodes (LEDs). Doctoral thesis, Kagawa University, Japan 18.Peak K.Y., Chkrabarty D. & Hahn E.J, 2005. Application of bioreactor systems for large scale production of horticultural and medicinal plants. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 81, 287 – 300. 19.Takayama S, 1991. Mass propagation of plants through shake and bioreactor culture techniques. Biotechnology in Agriculture and Forestry 20.Teisson C. & Alvard D, 1999. In vitro production of potato microtubers in liquid medium using temporary immersion. Potato Res., 42, 499 – 504. 64 PHẦN PHỤ LỤC  Bảng ANOVA phân tích hệ số nhân chồi trong phương pháp sục khí liên tục với thể tích khác nhau : One-Way Analysis of Variance ---------------------------------------------------------------------- - Data: SUCLT.nhanchoi Level codes: SUCLT.T Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance ---------------------------------------------------------------------- - Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ---------------------------------------------------------------------- - Between groups 14.726667 1 14.726667 10.322 .0325 Within groups 5.706667 4 1.426667 ---------------------------------------------------------------------- - Total (corrected) 20.433333 5 0 missing value(s) have been excluded.  Bảng Multiple Range Analysis của PP sục khí liên tục(hệ số nhân chồi) Multiple range analysis for SUCLT.nhanchoi by SUCLT.T ---------------------------------------------------------------------- - Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups ---------------------------------------------------------------------- - 1L 3 10.966667 X 1,5L 3 14.100000 X ---------------------------------------------------------------------- - contrast difference +/- limits 1 - 2 -3.13333 2.70869 * ---------------------------------------------------------------------- - * denotes a statistically significant difference. 65  Bảng ANOVA phân tích hệ số nhân chồi trong phương pháp sục khí gián đoạn với thể tích khác nhau : One-Way Analysis of Variance ---------------------------------------------------------------------- - Data: SUCGD.NHANCHOI (pp sục khí gián đoạn) Level codes: SUCGD.T Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance ---------------------------------------------------------------------- - Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ---------------------------------------------------------------------- - Between groups 22.698150 1 22.698150 86.805 .0007 Within groups 1.045933 4 .261483 ---------------------------------------------------------------------- - Total (corrected) 23.744083 5 0 missing value(s) have been excluded.  Bảng Multiple Range Analysis của PP sục khí gián đoạn(hệ số nhân chồi) : Multiple range analysis for SUCGD.NHÂNCHOI by SUCGD.T --------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------- 1,5L 3 7.243333 X 1L 3 11.133333 X ---------------------------------------------------------------------- - contrast difference +/- limits 1 - 2 3.89000 1.15963 * ---------------------------------------------------------------------- - * denotes a statistically significant difference. 66  Bảng ANOVA phân tích hệ số nhân chồi trong phương pháp ngâm chìm định kỳ với thời gian ngâm chìm khác nhau : One-Way Analysis of Variance ---------------------------------------------------------------------- - Data: TIB.NHANCHOI (pp ngâm chìm định kỳ) Level codes: TIB.T Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance ---------------------------------------------------------------------- - Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ---------------------------------------------------------------------- ---------- Between groups 64.137782 1 64.137782 31.206 .0050 Within groups 8.221259 4 2.055315 ---------------------------------------------------------------------- - Total (corrected) 72.359041 5 0 missing value(s) have been excluded.  Bảng Multiple Range Analysis của PP ngâm chìm định kỳ(TIB) : Multiple range analysis for TIB.NHANCHOI by TIB.T ---------------------------------------------------------------------- - Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups ---------------------------------------------------------------------- - 10'/1h 3 14.777667 X 10'/2h 3 21.316667 X ---------------------------------------------------------------------- - contrast difference +/- limits 1 - 2 -6.53900 3.25115 * ---------------------------------------------------------------------- - * denotes a statistically significant difference.