Luận văn Tách dòng và xác định trình tự nucleotit một số đoạn trong genome của virut vàng lùn lúa (rgsv) tại Việt Nam

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM -------------- Nguyễn Ngọc Sơn TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA VIRUT VÀNG LÙN LÚA (RGSV) TẠI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên – 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM -----  ----- NGUYỄN NGỌC SƠN TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA VIRUT VÀNG LÙN LÚA (RGSV) TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Nguyễn Trung Nam Viện Công nghệ sinh học (IBT) Thái Nguyên - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố. Tác giả Nguyễn Ngọc Sơn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Trung Nam (Viện Công nghệ Sinh học) đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS. TS Lê Trần Bình, TS. Chu Hoàng Hà, TS. Nguyễn Hữu Cường, KS. Hoàng Thị Thu Hằng và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Tế bào thực vật – Viện Công nghệ Sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt nhiều kinh nghiệm đồng thời hỗ trợ tôi trong suốt thời gian thực nghiệm và hoàn thành khóa luận này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới TS. Nguyễn Như Cường (Viện Bảo vệ Thực vật) chủ nhiệm đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu đặc tính sinh học của virut gây bệnh và môi giới truyền bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá, các biện pháp quản lý tổng hợp cây trồng (ICM) trong sản xuất lúa” đã cung cấp mẫu bệnh và cộng tác trong quá trình tôi thực hiện công trình nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học sư phạm – Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sau đại học, Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN, các thày cô giáo, và cán bộ trong Khoa đã truyền đạt kiến thức cũng như tạo điều kiện cho tôi được thực hiện khóa luận này. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tác giả luận văn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ 2 MỤC LỤC .............................................................................................................. 3 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................. 5 DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................... 7 MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 9 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 11 1.1. TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH VL&LXL TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM .. 11 1.1.1. Thế giới ............................................................................................... 11 1.1.2. Việt Nam ............................................................................................. 12 1.2. TRIỆU CHỨNG LÖA NHIỄM BỆNH VL&LXL ...................................... 13 1.3. ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC LOẠI VIRUT GÂY BỆNH VL&LXL Ở LÖA ..... 14 1.3.1. Virut vàng lùn lúa (RGSV) ............................................................... 14 1.3.2. Các loại virut khác ............................................................................. 16 1.3.2.1. Virut lùn xoắn lá lúa (RRSV)....................................................... 16 1.3.2.2. Virut tungro hình cầu (RTSV) ..................................................... 17 1.3.2.3. Virut tungro hình nhộng (RTBV) ................................................ 18 1.4. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA RẦY NÂU – MÔI GIỚI CHỦ YẾU TRUYỀN BỆNH VL&LXL .............................................................................. 19 1.4.1. Đặc điểm hình thái ............................................................................ 19 1.4.2. Đặc điểm sinh học, sinh thái và gây hại ............................................ 19 1.5. PHÕNG TRỪ BỆNH VL&LXL ................................................................. 20 1.6. MỘT SỐ ENZYM VÀ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU BỆNH VIRUT .......................................................................... 21 1.6.1. Một số enzym sử dụng trong sinh học phân tử ................................. 21 1.6.2. Kỹ thuật RT-PCR .............................................................................. 22 1.6.3. Kỹ thuật PCR ..................................................................................... 23 1.6.4. Kỹ thuật biến nạp plasmit vào E.coli ................................................ 24 1.6.5. Kỹ thuật tách dòng gen ...................................................................... 24 1.6.6. Kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony – PCR) ...................... 25 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 26 2.1. VẬT LIỆU .................................................................................................. 26 2.2. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỊA ĐIỂM .......................................................... 27 2.2.1. Hóa chất .............................................................................................. 27 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 2.2.2. Thiết bị ................................................................................................ 27 2.2.3. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 27 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................... 27 2.3.1. Thu mẫu thí nghiệm ........................................................................... 27 2.3.2. Thiết kế mồi đặc hiệu ......................................................................... 28 2.3.3. Tách chiết RNA tổng số của virut ở lúa ............................................ 28 2.3.4. Phản ứng RT-PCR ............................................................................. 29 2.3.5. Tạo plasmit tái tổ hợp mang gen mong muốn (Ligation) ................. 29 2.3.6. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt................................................................................. 30 2.3.7. Colony-PCR........................................................................................ 31 2.3.8. Tách chiết plasmit .............................................................................. 32 2.3.9. Cắt gen bằng enzym giới hạn............................................................. 32 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................. 34 3.1. THIẾT KẾ MỒI.......................................................................................... 34 3.2. TÁCH DÕNG CÁC ĐOẠN TRONG GENOME CỦA RGSV ................... 34 3.2.1. RT-PCR .............................................................................................. 34 3.2.2. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α ............. 37 3.2.3. Chọn lọc plasmit tái tổ hợp bằng colony-PCR .................................. 37 3.2.4. Tách plasmit và cắt kiểm tra sự có mặt của gen ............................... 39 3.3. XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT CỦA MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA RGSV ..................................................................................... 40 3.4. SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN CP-RGSV CỦA HAI TỈNH NINH THUẬN VÀ BÌNH THUẬN VỚI CÁC TRÌNH TỰ TƢƠNG ỨNG TRÊN GENBANK. 41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................................. 46 CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ ................................................. 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 48 PHỤ LỤC ............................................................................................................. 53 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT µg microgram µl microlitre µm micrometer bp base pair cDNA Complementary DNA (DNA bổ sung đƣợc tổng hợp nhờ enzym phiên mã ngƣợc từ RNA thông tin) CS Cộng sự CLRRI Cuulong Delta Rice Research Institute (Viện nghiên cứu lúa đồng bằng sông Cửu Long), CP/NCP Coat protein/Nucleocapsid Protein (Protein vỏ) Đ/c Đối chứng ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long DEPC Diethyl pyroCarbonate DNA Deoxyribonucleic acid DPV Description of Plant Viruses (Miêu tả các virus thực vật), EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetic Acid ELISA Enzyme linked immunsorbent assay (kỹ thuật hấp thụ miễm dịch liên kết với enzym) g gram ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses (Ủy ban quốc tế về phân loại virus). ICTVdB The Universal Virus Database of the International Committee on Taxonomy of Viruses (Ngân hàng dữ liệu về virus của ICTV), IPTG Isopropylthio-β-D-galactoside IRRI International Rice Research Institute (Viện nghiên cứu Lúa quốc tế), Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 Kb Kilobase LB Luria và Bertani M Nồng độ mol/lit ml mililitre mm milimeter NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm Quốc gia về thông tin Công nghệ Sinh học), ng Nanogram nm Nanometer PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) PEG Polyethylene glycon RdRp RNA dependent RNA polymerase (Enzym nhân bản RNA và tạo ra phân tử RNA) RGSV Rice grassy stunt virus (Virut vàng lùn lúa) RNA Ribonucleic acid RNase Ribonuclease RRSV Rice ragged stunt virus (Virut lùn xoắn lá lúa) RSV Rice stripe virus RT- PCR Reverse transcription polymerase chain reaction (phản ứng PCR phiên mã ngƣợc) RTBV Rice tungro bacilliform virus (Virut tungro hình nhộng) RTSV Rice tungro spherical virus (Virut tungro hình cầu) RWSV Rice wilted stunt virus (Virut héo lùn lúa) TAE Tris - Acetate – EDTA Taq Thermus aquaticus v/p vòng/phút vcRNA viral complementary RNA (đoạn RNA bổ sung của virus) VL&LXL Vàng lùn, lùn xoắn lá vRNA viral RNA (đoạn RNA của virus) X-gal 5-brom-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Cây lúa bị bệnh vàng lùn, bụi lúa giảm chồi........................................ 13 Hình 1.2. RGSV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử............................................ 15 Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc bộ gen của RGSV......................................................... 16 Hình 1.4. RRSV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử............................................. 17 Hình 1.5. RTSV và RTBV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử............................ 18 Hình 1.6. Các giai đoạn phát triển của rầy nâu..................................................... 19 Hình 2.1. Các điểm thu mẫu lúa nghi nhiễm bệnh VL&LXL tại Nam Trung Bộ.... 26 Hình 2.2. Sơ đồ vectơ pBT ................................................................................. 30 Hình 3.1. Điện di sản phẩm RT-PCR phân đoạn 1 và 4 của RGSV từ mẫu của tỉnh Bình Thuận bằng 2 cặp mồi RNA1-RGSV và RNA4-RGSV....................... 35 Hình 3.2. Điện di sản phẩm RT-PCR gen CP của RGSV bằng cặp mồi CP-RGSV 36 Hình 3.3. Điện di sản phẩm RT-PCR gen CP của RGSV bằng cặp mồi CP-RGSV 36 Bảng 3.1. Trình tự mồi sử dụng để nhân một số đoạn trong genome RGSV… 34 Bảng 3.2. Mã số đăng ký trên GenBank của các trình tự đã thu đƣợc............... 41 Bảng 3.3. Hệ số tƣơng đồng và sai khác giữa trình tự nucleotit của gen CP- RGSV tại Bình Thuận, Ninh Thuận với các trình tự tƣơng ứng của các tỉnh ĐBSCL và thế giới (GenBank).......................................................................... 42 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 Hình 3.4. Khuẩn lạc E.coli DH5α mang vectơ tái tổ hợp của các dòng CP của RGSV tỉnh Bình Thuận trên môi trƣờng LB đặc................................................. 37 Hình 3.5. Điện di sản phẩm colony-PCR các dòng RGSV bằng cặp mồi pUC 18.. 38 Hình 3.6. Điện di sản phẩm colony-PCR từ các dòng của phân đoạn 1 và 4 RGSV bằng cặp mồi pUC 18............................................................................... 38 Hình 3.7. Điện di sản phẩm cắt plasmit mang gen CP của RGSV bằng BamHI.................................................................................................................. 39 Hình 3.8: Điện di sản phẩm cắt plasmit mang phân đoạn 1 và 4 của RGSV tại Bình Thuận bằng BamHI..................................................................................... 40 Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên việc so sánh trình tự 02 gen CP- RGSV Nam Trung Bộ (NT, BT) với các trình tự tƣơng ứng của ĐBSCL và thế giới đã đƣợc đăng ký vào GenBank........................................................... 43 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Lúa gạo là nguồn lƣơng thực giàu chất dinh dƣỡng chủ yếu trên thế giới, đứng thứ ba sau ngô và lúa mì về sản lƣợng, cung cấp trên 20% calo, 15% protein, các chất khoáng và chất xơ cho con ngƣời. Năm 2009, Việt Nam dự kiến sẽ tiếp tục đứng thứ hai thế giới về xuất khẩu gạo (khoảng 5,3 triệu tấn/năm) và tổng sản lƣợng đạt khoảng 36 triệu tấn/năm [62]. Khoảng 52% diện tích lúa đƣợc trồng ở ĐBSCL. Khi đánh giá về những thành tựu đạt đƣợc trong sự nghiệp đổi mới kinh tế ở Việt Nam, các nhà kinh tế thế giới đều thống nhất nhận định: Thành công lớn nhất là nông nghiệp và cây lúa vẫn luôn là cây lƣơng thực quan trọng bậc nhất của Việt Nam. Tuy nhiên, sản lƣợng lúa bị giảm sút nghiêm trọng bởi các bệnh virut do rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal) lây truyền, đặc biệt là bệnh VL&LXL xảy ra trong thời gian gần đây. Bệnh này do sự tổ hợp từ một đến bốn loại virut gây ra, gồm virut vàng lùn lúa (Rice Grassy Stunt Virus- RGSV), virut lùn xoắn lá lúa (Rice Ragged Stunt Virus- RRSV), virut tungro hình cầu (Rice Tungro Spherical Virus- RTSV) và virut tungro hình nhộng (Rice tungro bacilliform virus- RTBV) [8], [43], [48], [59]. Trong một số trƣờng hợp, cây lúa bị nhiễm cùng một lúc 2 đến 4 loại virut này. Trong đó, RGSV thƣờng chiếm tỷ lệ cao nhất. Từ năm 2006 đến nay dịch bệnh lại phát triển rộng ở các tỉnh ĐBSCL với diện tích nhiễm rất lớn. Do ảnh hƣởng của dịch bệnh này trên cây lúa, năm 2009 Việt Nam có nguy cơ tiếp tục bị giảm sản lƣợng gạo xuống 1 triệu tấn so với năm 2008 [12]. Rất nhiều thành tựu đã đạt đƣợc trong nghiên cứu các biện pháp phòng chống rầy nâu- môi giới chủ yếu truyền bệnh VL&LXL nhƣ: nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh thái học của rầy nâu, các biện pháp phòng trừ bằng thuốc hóa học, sinh vật học, kỹ thuật canh tác, giống kháng... Tuy nhiên, hiệu quả của các phƣơng pháp này vẫn chƣa cao. Do dịch bệnh VL&LXL đang gây hại nặng nề về sản lƣợng lúa gạo cho các tỉnh ĐBSCL [7] và có nguy cơ lây lan ra các khu vực lân cận, nên nhiệm vụ cấp bách là phải kiểm tra sự có mặt của các chủng virus gây bệnh tại khu vực Nam Trung Bộ, nơi có diện tích trồng lúa khá lớn và tiếp giáp với ĐBSCL. Đồng thời, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 đánh giá độ tƣơng đồng di truyền của các chủng virut gây bệnh, góp phần vào việc đề ra những biện pháp đối phó kịp thời với dịch bệnh tại khu vực miền Trung. Với những lí do trên, chúng tôi tiến hành đề tài : “Tách dòng và xác định trình tự nucleotit một số đoạn trong genome của virut vàng lùn lúa (RGSV) tại Việt Nam”. 2. Mục tiêu Phân lập và so sánh trình tự nucleotit của một số đoạn trong genome của virut vàng lùn lúa (RGSV). 3. Nội dung nghiên cứu 1> Tách dòng, xác định trình tự một số đoạn trong genome của chủng RGSV. 2> So sánh các trình tự nucleotit của gen CP- RGSV thu đƣợc với các trình tự tƣơng ứng trên GenBank để đánh giá độ tƣơng đồng về mặt di truyền giữa các chủng virut. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH VL&LXL TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 1.1.1. Thế giới Từ thập kỷ 70 của thế kỷ XX trở lại đây, rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal) đã nổi lên nhƣ một vấn đề thời sự trong nghề trồng lúa ở Châu Á. Nhiều trận dịch rầy đã xảy ra trên quy mô rộng lớn chƣa từng thấy ở nhiều nƣớc nhƣ Ấn Độ, Indonesia, Triều Tiên, Nhật Bản, Philippin, Đài Loan... gây tổn thất nặng nề về kinh tế [17]. Rầy nâu phá hại làm giảm một phần năng suất, hoặc khi cháy rầy làm mất trắng. Ngoài tác hại trực tiếp, rầy nâu còn là môi giới truyền bệnh virut nguy hiểm cho cây lúa nhƣ bệnh VL&LXL, bệnh héo lùn cây lúa ở Trung Quốc và bệnh vàng lá lúa ở vùng núi phía Bắc Việt Nam. Theo thống kê của Dyck và Thomas (1979) thiệt hại do rầy nâu và bệnh vàng lụi ở Châu Á trong năm 1966 – 1975 lên tới hơn 300 triệu USD [22]. Năm 1966, RGSV lần đầu tiên đƣợc phát hiện ở Nam và Đông Nam châu Á [43]. Năm 1977, dạng héo lùn do RWSV xuất hiện ở vụ mùa thứ hai ở Đài Loan, biểu hiện cây lúa bệnh và hình thái, cấu tạo của RWSV tƣơng tự RGSV [20]. Năm 1974 – 1977, khoảng 1,2 triệu ha lúa ở Indonesia bị nhiễm rầy và virut, gây thiệt hại 03 triệu tấn thóc [40]. Năm 1992 – 1993 cả vụ mùa giống SP60 ở Thái Lan bị mất do tác hại của rầy nâu [50]. Rầy nâu mang các loại virut gây bệnh trên cây lúa nhƣ RGSV và RRSV, nên có nguy cơ gây “cháy rầy” làm giảm đáng kể năng suất cây trồng. Hai phƣơng pháp truyền thống đƣợc sử dụng để bảo vệ cây lúa là phun thuốc trừ sâu và dùng giống cây kháng rầy. Dùng thuốc trừ sâu hóa học đắt, độc hại và ô nhiễm môi trƣờng, do đó biện pháp trồng cây lúa mang gen kháng rầy thông qua lai giống đƣợc nghiên cứu và áp dụng rộng rãi. Tinjuangjun và CS (2000) đã chuyển gen gna thành công vào hai giống gạo Thái Lan là Khao Dawk Mali 105 (KDML 105) và Supanburi 60 (SP60), 37% số lƣợng rầy giảm đi khi gna biểu hiện bằng promoter RSs1 và 42% khi gna biểu hiện bằng promoter Ubi-1 [50]. Tuy nhiên, việc trồng lúa mang gen kháng rầy đang gặp trở ngại do sự thay đổi đặc điểm thích nghi nhanh chóng của rầy nâu. Tại các Hội nghị quốc tế về rầy nâu họp tại IRRI- Philippin (05/1977), Việt Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 Nam (11/2001), Trung Quốc (11/2002) và Việt Nam (04/2006), rầy nâu đƣợc coi là mối đe dọa thƣờng xuyên đối với sản xuất lúa ở Châu Á [41], [61]. 1.1.2. Việt Nam Bệnh VL&LXL trên lúa đƣợc ghi nhận sớm nhất tại Mỹ Tho và Long An vào năm 1963. Tại miền Bắc, bệnh đƣợc ghi nhận trong những năm 1964, 1966 và 1970 trên giống Mộc Tuyền với diện tích khá lớn (khoảng 50.000 ha) [8]. Bệnh cũng xuất hiện và gây thiệt hại 20.000 ha vụ Hè Thu 1990 tại vùng ven biển miền Trung nhƣ Bình Định, Phú Yên và Khánh Hoà. Năm 1999 có 13.120 ha lúa bị nhiễm ở các tỉnh Bến Tre, TPHCM, Bạc Liêu và Long An, riêng TPHCM có 242 ha bị bệnh và không trổ bông đƣợc [9]. Đầu vụ Hè Thu 2006 dịch bệnh lại phát triển và lan rộng trên hầu hết các tỉnh ĐBSCL, với mật số rầy nâu rất cao, diện tích bị nhiễm bệnh vàng lụi riêng tại Đồng Tháp với thiệt hại dƣới 30% là 613 ha, và trên 30% là 2636 ha trong đó tiêu huỷ khoảng 500 ha [54]. Cuối năm 2006, dịch bệnh VL&LXL đã đƣợc công bố ở ĐBSCL và miền Đông Nam bộ. Bệnh VL&LXL lây lan trên lúa vụ Thu Đông và vụ Đông Xuân ở các tỉnh vùng ĐBSCL, Đông Nam Bộ, Nam Trung Bộ và Tây Nguyên. Theo báo cáo của các địa phƣơng, đến tháng 10 năm 2006, diện tích lúa vụ Thu Đông 2006 và vụ Đông Xuân 2006- 2007 bị nhiễm rầy nâu của các tỉnh vùng ĐBSCL và Đông Nam bộ là 33.323 ha, và diện tích nhiễm bệnh VL&LXL là 51.768 ha, trong đó có 26.283 ha nhiễm bệnh nặng cần phải tiêu huỷ [1]. Cũng trong năm 2006, Rogelio Cabunagan (IRRI) cùng các chuyên gia Việt Nam đã đi thực tế đồng lúa ở Trà Vinh, Long An, Bình Chánh (TPHCM), Bình Phƣớc, Đồng Nai, Tiền Giang quan sát thấy cây lúa có dấu hiệu bị bệnh VL&LXL và xuất hiện nhiều rầy nâu gây hiện tƣợng “cháy rầy”. Qua xét nghiệm bằng phƣơng pháp ELISA dƣơng tính với kháng thể đặc hiệu của RGSV và RRSV đã khẳng định tỉ lệ nhiễm RGSV, RRSV khá cao, đồng thời có sự xuất hiện của RTSV [56]. Năm 2008, dịch rầy nâu và các bệnh virut hại lúa tuy có giảm so với năm trƣớc nhƣng vẫn đang ở mức nghiêm trọng. Lúa Hè Thu ở khu vực ĐBSCL, diện tích bị nhiễm rầy nâu: 76.795 ha, trong đó có 4.298 ha bị nhiễm nặng. Diện tích bị nhiễm bệnh VL&LXL trong vụ Hè Thu là 206 ha, tập trung trên lúa hè thu giai đoạn đòng trổ, trong đó diện tích nhiễm nhẹ là 55 ha (tỉ lệ bệnh từ 5-10%), nhiễm trung bình 13 ha (tỉ lệ bệnh trên 10-20%), nhiễm nặng 138 ha (tỉ lệ bệnh trên 20-50%) [11]. Năm 2009, dịch rầy nâu và bệnh VL&LXL vẫn xảy ra trên nhiều vùng với diện tích lớn. Tính đến tháng 08/2009 tại các tỉnh phía Nam diễn tích nhiễm rầy vụ Hè Thu là 87.246 ha tập trung tại các tỉnh Kiên Giang, Long An, Sóc Trăng, Bạc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 Liêu, Tiền Giang, Trà Vinh, Bình Thuận; Vụ Thu Đông là 18.747 ha tại Vĩnh Long, Đồng Tháp, Cần Thơ, Bình Phƣớc, Trà Vinh, Hậu Giang, Tây Ninh. Diện tích nhiễm VL&LXL vụ Hè Thu là 68 ha chủ yếu ở hai tỉnh Đồng Nai và Bình Thuận [12]. 1.2. TRIỆU CHỨNG LÖA NHIỄM BỆNH VL&LXL Triệu chứng ban đầu chƣa thấy rõ giữa cây bệnh và cây lúa bình thƣờng. Bụi lúa bệnh chỉ hơi ngã màu xanh nhạt, đôi khi có những lá màu vàng đến cam. Thời gian sau cây lúa bệnh có vẻ kém phát triển hơn (lúc này rất dễ nhầm lẫn với hiện tƣợng kém dinh dƣỡng nên nông dân thƣờng bón thêm phân đạm) [8]. Lúa nhiễm bệnh trong giai đoạn còn non thƣờng rất lùn, mọc nhiều chồi và có lá thẳng đứng. Các lá bệnh thƣờng ngắn, hẹp, có màu nhạt, và có nhiều đốm nhỏ màu nâu với hình dạng không cố định [32],[43]. Các lá non mọc sau khi bị nhiễm bệnh thƣờng bị sọc loang lổ, tuy nhiên lá lúa có thể vẫn xanh bình thƣờng nếu đƣợc cung cấp đủ phân đạm [32]. Nhìn toàn cảnh thấy lúa hồi xanh không đều sau khi cấy, lá hẹp và dựng đứng, lá có màu vàng, mềm và hơi rũ hoặc lá có màu xanh đậm có thể có nhiều đốm màu rỉ sắt (Hình 1.1). Hình 1.1. Cây lúa bị bệnh vàng lùn, bụi lúa giảm chồi “Nguồn: ” Thời kỳ đẻ nhánh, bụi lúa bệnh đẻ quá nhiều nhánh, bụi lúa to hơn, vẫn có chiều cao tƣơng đƣơng với các bụi khác, chƣa khác biệt lắm [64]. Càng về sau nhìn toàn cảnh thấy lúa phát triển không đều do bụi lúa bị bệnh không phát triển chiều cao, cuối cùng các bụi lúa bệnh sẽ khô và lụi dần nhƣ cháy rầy từng chòm. Cây lúa bệnh có thể không có bông hoặc có rất ít bông nhƣng hạt bị đen và lép. Triệu chứng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 tồn tại rất lâu sau khi phát bệnh [26]. Lúa trƣởng thành khi bị nhiễm bệnh có lá bị vàng, bông bị nâu và hạt lép [43]. 1.3. ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC LOẠI VIRUT GÂY BỆNH VL&LXL Ở LÖA 1.3.1. Virut vàng lùn lúa (RGSV) Virut vàng lùn lúa đƣợc phát hiện chủ yếu trên lúa Oryza sativa [25], [43] và có tên khoa học là Rice grassy stunt virus (RGSV), thuộc chi Tenuivirus [57]. Virut phân bố tại nhiều nƣớc vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới, và gây thiệt hại kinh tế rất đáng kể. Các chủng RGSV gây vàng lá, mất mầu và chết cây đƣợc phát hiện năm 1977 tại Đài Loan [19], năm 1982- 1983 tại Philippin và Thái Lan [25], và năm 1984 tại Ấn Độ [33]. Ngoài ra, virut còn phân bố tại các nƣớc châu Á khác nhƣ Indonesia, Malaysia, Nhật Bản, Sri Lanka, Trung Quốc, và Việt Nam [8], [9], [19], [51]. RGSV ký sinh chủ yếu trên các loài lúa Oryza spp. và rầy Nilaparvata spp. Vì vậy có thể nói Nilaparvata spp là vectơ duy nhất truyền bệnh này cho lúa [31]. Thất thu năng suất do RGSV thƣờng khó đƣợc tính toán chính xác vì thiệt hại do virut thƣờng không thể đƣợc tách biệt rõ ràng với thiệt hại của rầy nâu và của virut lùn xoắn lá (RRSV- cũng đƣợc truyền bởi rầy nâu) [40]. Trong năm 1974- 1977, có tổng cộng 1,2 triệu ha lúa ở Indonesia bị nhiễm bởi rầy nâu và virut vàng lùn lúa. Sự thất thu năng suất do cả hai loài dịch hại này gây nên khoảng 03 triệu tấn lúa [40]. RGSV không đƣợc truyền qua hạt của cây lúa bệnh hoặc qua phấn hoa [31]. Virut cũng không đƣợc truyền bằng cách tiếp xúc giữa cây lúa khoẻ mạnh với cây lúa bệnh, hoặc qua lây bệnh bằng tay. Virut chỉ đƣợc truyền bằng rầy nâu (Nilaparvata lugens) và một số loài rầy khác (N. bakeri, N. muiri) [28], [43]. Virut đƣợc truyền dạng bền vững qua các tuổi của rầy và nhân mật số trong rầy ký chủ, nhƣng không đƣợc truyền qua trứng rầy [36]. Rầy nâu một khi nhiễm bệnh sẽ truyền virut cho đến lúc chết. Kể từ năm 1984, RGSV thƣờng ít xuất hiện và gây thiệt hại tại châu Á. Mặc dù không đƣợc báo cáo nhiều, sự ít xuất hiện của RGSV có lẽ là do sự thay đổi trong khả năng truyền bệnh của quần thể rầy nâu. Tại Philippin, tỉ lệ rầy nâu có thể lấy và truyền RGSV thay đổi từ 3- 5% trƣớc năm 1977 [32] sang 0- 15% trong năm 1984 [26]. Từ đây ta có thể giả thiết là một trong những khả năng của sự bùng phát của dịch RGSV tại miền Nam Việt Nam hiện nay là do sự thay đổi về khả năng truyền bệnh của rầy nâu: tỉ lệ rầy có khả năng lấy và truyền virut có thể đã tăng lên đáng kể trong quần thể rầy nâu tại vùng này trong Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 những năm vừa qua. Thể virut bao gồm nhiều đoạn vRNA, vcRNA, protein vỏ virut, và vài phân tử RdRp [35]. Thể virut khó đƣợc quan sát thấy trong dịch trích thực vật dƣới kính hiển vi điện tử. Thể virut sau khi đƣợc ly trích có dạng sợi dài 2µm và rộng 6- 8 nm khi đƣợc quan sát bằng cách nhuộm trong uranyl acetate [16], [29] (Hình 1.2). Hình 1.2. RGSV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử Thanh đen dài 100 nm. “Nguồn: DPV”. Lúa bị nhiễm virut có nhiều bó sợi đƣợc quan sát trong nhân và tế bào chất hoặc trong các thể có màng bao bọc hiện diện ở phần tế bào chất của các tế bào diệp lục [20]. Các thể hình ống đi kèm với các hạt có đƣờng kính 25 nm còn đƣợc tìm thấy trong các tế bào mạch rây của lá lúa bệnh [47]. Các hạt 25 nm tƣơng tự cũng xuất hiện dƣới dạng các mảng kết tinh trong các thể béo và khí quản của rầy nâu nhiễm virut [43]. RGSV có 6 đoạn RNA khác nhau, với tổng chiều dài bộ gen của RGSV là khoảng 25 kb (Hình 1.3) [21], [32]. Cả 6 đoạn RNA đều lƣỡng tính (ambisense, mã hoá protein theo cả 2 chiều dƣơng và chiều bổ sung của phân tử RNA) và đều mang đoạn mã kết thúc dài 17 nucleotit tƣơng tự nhau. Các đoạn mã kết thúc này có khả năng tự cuốn lại và tạo nên cấu trúc hình cán chảo. Đoạn mã theo chiều bổ sung của đoạn RNA dài nhất (RNA1) chứa một ORF mã hoá cho một RdRp tƣơng tự nhƣ RdRp của RSV, loài chuẩn của chi Tenuivirus [35], [38] và có cùng 37 ± 9% axit amin giống nhau trong tổng số 2140 axit amin. Tuy nhiên, khác với các Tenuivirus khác, RNA1 của RGSV còn có thêm một ORF ngắn có chiều dƣơng ở gần đầu 5’. Hai protein dự đoán đƣợc mã hoá bởi RNA2 chỉ tƣơng tự chút ít với các protein đƣợc mã hoá bởi RNA2 của các Tenuivirus khác. Các protein dự đoán đƣợc mã hoá bởi RNA3 và RNA4 rất khác biệt so với các protein đƣợc biết. Sự khác biệt giữa Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 các protein đƣợc mã hoá bởi các chuỗi RNA2, 3, 4 5 và 6 cho thấy RGSV rất khác biệt so với các Tenuivirus khác [51]. Các đoạn RNA1, 2, 5, 6 của RGSV theo thứ tự tƣơng đƣơng với RNA1, 2, 3, 4 của RSV. Protein vỏ của RGSV đƣợc mã hoá bởi đoạn mã theo chiều bổ sung với RNA5 [21]. Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc bộ gen của RGSV Các thanh đen hình sợi chỉ tƣợng trƣng cho các RNA với chiều dài đã đƣợc xác định. Các mũi tên đen tƣợng trƣng cho các sản phẩm protein. Chiều mũi tên là chiều của quá trình dịch mã để tạo ra chuỗi polypeptide. “Nguồn: Hồ Xuân Thiện, 2006” 1.3.2. Các loại virut khác 1.3.2.1. Virut lùn xoắn lá lúa (RRSV) Bệnh lùn xoắn lá lúa đƣợc miêu tả đầu tiên năm 1977 [48]. Bệnh xuất hiện chủ yếu trên các loài lúa Oryza spp. và đƣợc gây ra bởi virut có tên khoa học là Rice ragged stunt virus (RRSV), thuộc chi Oryzavirus, họ Reoviridae [58]. RRSV xuất hiện tại nhiều nƣớc trồng lúa châu Á nhƣ Ấn Độ, Bangladesh, Đài Loan, Indonesia, Malaysia, Nhật Bản, Philippin, Sri Lanka, Thái Lan, Trung Quốc [60], và Việt Nam. RRSV là một virut quan trọng gây thiệt hại kinh tế đáng kể. Virut không đƣợc truyền qua hạt của cây lúa bệnh [20]. Virut không đƣợc truyền qua phấn hoa, qua chủng bệnh bằng tay, hoặc qua tiếp xúc giữa cây lúa khoẻ mạnh với cây lúa bệnh [60]. Rầy nâu Nilaparvata lugens là tác nhân truyền bệnh duy nhất đƣợc biết [18], [48]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 Thể virut của RRSV có dạng hình cầu, bao gồm một vỏ, một phần trung tâm, và một phức hợp nucleoprotein. Vỏ virut không có màng bao và mang nhiều thành phần nhỏ tạo thành các gai (Hình 1.4). Vỏ virut có 12 gai dạng “B” dài 8 – 10 nm, rộng 23- 26 nm ở phần chân đế và 14- 17 nm ở phần trên [36]. Thể virut có rất nhiều ở tế bào chất của các tế bào nhu mô của mạch rây và thƣờng liên kết với nhau tạo thành các sợi dài. Virut không đƣợc phát hiện ở các mô khác [48]. Khi bị nhiễm virut, các tế bào nhu mô của mạch rây nhân lên và phình ra, tạo thành các u sần trên lá và bẹ lá [26]. RRSV có 10 đoạn RNA sợi đôi khác nhau [59]. Hình 1.4. RRSV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử (A): Thể virut với các protein gai dạng B “nguồn ”.; (B): Các thể virut liên kết lại tạo thành sợi dài, xem trong uranyl acetate, thanh đen dài 50 nm. “Nguồn: DPV”. 1.3.2.2. Virut tungro hình cầu (RTSV) Virut tungro hình cầu có tên khoa học là Rice tungro spherical virus (RTSV), chi Waikavirus, thuộc họ Sequiviridae [27]. RTSV phân bố trên các loài lúa Oryza spp. ở hầu hết các nƣớc trồng lúa tại vùng Nam và Đông Nam Á. RTSV còn có thể phân bố ở những quốc gia khác nhƣng không đƣợc phát hiện bởi vì virut này thƣờng không gây ra triệu chứng bệnh. Sự phân bố của RTSV có lẽ liên quan lớn đến sự phân bố của côn trùng truyền bệnh [59]. RTSV kết hợp với RTBV gây nên bệnh Tungro [14]. Đây là bệnh hại lúa gây thiệt hại kinh tế rất lớn với thiệt hại ƣớc tính hàng năm tại vùng Đông Nam Á lên đến hơn 1,5 tỉ USD [24]. RTSV không đƣợc truyền qua hạt của cây lúa bị bệnh. Virut không đƣợc truyền qua chủng bệnh bằng tay hoặc tiếp xúc giữa cây lúa lành với cây lúa bị bệnh. RTSV có tác dụng nhƣ là một loài giúp đỡ cho RTBV trong việc truyền bằng côn trùng [42]. RTSV đƣợc truyền dƣới dạng bán bền bởi một số loài rầy xanh. Loài rầy truyền bệnh chủ yếu của RTSV tại vùng Đông Nam Á là rầy xanh đuôi đen Nephotettix virescens (tên khác là N. impicticeps) [47], [59]. A B Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 Hình 1.5. RTSV và RTBV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử Xem trong dung dịch uranyl acetate. “Nguồn: Hull R., 1996” RTSV có thể virut hình cầu, đƣờng kính 30 nm (Hình 1.5), chứa một phân tử RNA sợi đơn có chiều dƣơng và dài khoảng 12 kb [37], và ba protein cấu tạo vỏ virut là CP1 (kích thƣớc 22.900 kDa), CP2 (22.300 kDa) và CP3 (33.000 kDa) [23],[46], [49], [52], [53]. 1.3.2.3. Virut tungro hình nhộng (RTBV) Virus tungro hình nhộng có tên khoa học là Rice tungro bacilliform virus (RTBV), thuộc chi Tungrovirus, họ Caulimoviridae [27], [34]. RTBV đƣợc tìm thấy tại hầu hết các nƣớc trồng lúa tại Nam và Đông Nam Á. Sự phân bố của virut có lẽ có mối quan hệ chặt chẽ với sự phân bố của rầy xanh (côn trùng truyền bệnh tungro) [59]. Giống nhƣ RTSV, RTBV không đƣợc truyền qua hạt của cây lúa bị bệnh. Virut không đƣợc truyền qua chủng bệnh bằng tay hoặc tiếp xúc giữa cây lúa lành với cây lúa bị bệnh. Virut chỉ đƣợc truyền bằng rầy xanh (Nephotettix virescens) khi có sự giúp đỡ của RTSV. RTBV chỉ đƣợc truyền khi rầy xanh hút RTSV trƣớc hoặc cùng thời gian [16]. RTBV có thể virut dạng hình nhộng, chứa 01 DNA sợi đôi và có dạng vòng. Sợi DNA đôi này có một điểm đứt ở các vị trí nhất định trên mỗi sợi đơn [15], [13]. Bộ gen của RTBV đƣợc dịch sang một RNA dài hơn chiều dài của bộ gen ban đầu và RNA này đƣợc dịch ngƣợc sang DNA để tái tạo lại bộ gen của virut. RNA này còn đƣợc dùng để dịch mã protein của các ORF 1, 2, 3. Ngoài ra, RNA này còn đƣợc cắt nhỏ để dịch mã và tạo ra ORF 4 [27]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 1.4. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA RẦY NÂU – MÔI GIỚI CHỦ YẾU TRUYỀN BỆNH VL&LXL 1.4.1. Đặc điểm hình thái - Rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal), thuộc họ Delphacidae, bộ Homoptera [65]. - Trứng rầy nâu có dạng “quả chuối tiêu”, mới đẻ trong suốt, gần nở chuyển màu vàng và có hai điểm mắt đỏ. Trứng rầy nâu đẻ thành từng ổ từ 5-12 quả nằm sát nhau theo kiểu “úp thìa”, đầu nhỏ quay vào trong, đầu to quay ra ngoài biểu bì ngoài của bẹ lá (Hình 1.10.A). - Rầy non rất linh hoạt, mới nở có màu xám trắng, tuổi 2-3 trở lên có màu nâu vàng, trong điều kiện mật độ cao có màu nâu sẫm (Hình 1.10.B). - Con trƣởng thành có màu nâu tối, con đực nhỏ hơn con cái. Có 2 dạng rầy trƣởng thành: loại cánh ngắn (Hình 1.10.C) và loại cánh dài (Hình 1.10.D). Hình 1.6 . Các giai đoạn phát triển của rầy nâu A. Trứng rầy; B. Rầy con (ấu trùng); C. Rầy nâu trƣởng thành cánh ngắn; D. Rầy nâu trƣởng thành cánh dài “Nguồn: ” 1.4.2. Đặc điểm sinh học, sinh thái và gây hại Vòng đời của sâu gai từ 25- 30 ngày và thay đổi theo mùa + Thời gian trứng: 5- 14 ngày + Thời gian rầy non: 12- 32 ngày + Thời gian rầy trƣởng thành: 3- 20 ngày A B C D Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 Rầy cái trƣởng thành có thể đẻ 150- 250 trứng và có tính hƣớng sáng mạnh. Con trƣởng thành và rầy non đều hút nhựa cây từ dảnh và lá lúa. Rầy nâu xâm nhập vào ruộng lúa ngay từ khi mới cấy và hại cả trên mạ. Rầy nâu phát sinh với mật độ cao và gây hại nặng vào giai đoạn trƣớc lúc lúa trỗ bông, ngậm sữa và bắt đầu chín [65]. Nếu chỉ đơn thuần rầy gây hại không là môi giới truyền bệnh thì đánh giá mức gây hại của rầy nâu là không lớn nhƣng cách phòng trừ loại rầy này lại tƣơng đối khó. Rầy nâu có phản ứng kháng, nhiễm với các giống lúa rất rõ, nó có khả năng hình thành các nòi sinh học mới khi có sức ép chọn lọc của môi trƣờng đủ lớn. Rầy có khả năng di cƣ đám đông rất xa và kháng thuốc cao. Rầy nâu còn có tác hại chủ yếu là truyền lan các loại virut [10]. Nguy hiểm hơn cả là bệnh VL&LXL lúa khi truyền các loại virut là RGSV và RRSV. Rầy nâu thích hợp với điều kiện khí hậu ấm nóng, độ ẩm cao, mƣa nắng xen kẽ. Ở Miền Nam rầy có thể gây hại liên tục các vụ lúa, còn ở phía Bắc cháy rầy thƣờng xảy ra vào tháng 5 (vụ xuân) và cuối tháng 9 đầu tháng 10 (vụ mùa) [54]. Tỉ lệ rầy nâu N. lugens có thể truyền bệnh khác nhau theo từng vùng trên ruộng lúa, và biến động từ 5- 60 % [22], [28], [29]. Tỷ lệ rầy truyền bệnh có thể đƣợc tăng lên bằng cách chọn lọc và nhân mật số các cá thể rầy có khả năng truyền virut, nhƣng lại giảm đi khi không còn áp lực chọn lọc [28]. Với rầy nâu N. lugens, tỉ lệ truyền bệnh không khác biệt rõ ràng giữa rầy đực và cái, giữa rầy đen đậm và đen nhạt, giữa rầy cánh dài và cánh ngắn [28]. Tuy nhiên, rầy non có khả năng truyền bệnh cao hơn và có giai đoạn ủ virut ngắn hơn rầy trƣởng thành [22]. 1.5. PHÕNG TRỪ BỆNH VL&LXL Bệnh VL&LXL cho đến nay chƣa có thuốc đặc trị. Vì vậy, biện pháp an toàn và hữu hiệu nhất vẫn là phòng bệnh thông qua việc ngăn chặn, tiêu diệt rầy nâu (môi giới truyền bệnh trực tiếp). Sự phát triển và lây truyền bệnh virut tùy thuộc vào số lƣợng cây mang nguồn bệnh, số lƣợng và sự hoạt động của côn trùng truyền bệnh, sự mẫn cảm của giống lúa với virut, với côn trùng truyền bệnh và thời tiết. Nhiều biện pháp phòng trừ bệnh VL&LXL đã đƣợc tiến hành nhƣ canh tác lúa theo tinh thần 3G, 3T, trong đó không bón thừa N, giảm mật độ xạ cấy, giảm sử dụng thuốc hóa học, bón phân cân đối tạo sức đề kháng cho cây lúa, phun thuốc diệt trừ rầy [5]. Thuốc hóa học có thể làm giảm mật số rầy nhƣng vẫn không thể giải quyết đƣợc bệnh vàng lùn lúa, vì sự truyền bệnh có thể xảy ra giữa rầy và cây lúa trong khoảng thời gian rất ngắn [2],[5]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 Từ năm 2003 đến nay tại Sóc Trăng đã áp dụng chế phẩm sinh học trên đồng ruộng, và đã cho kết quả khả quan. Chế phẩm sinh học dựa trên nuôi cấy các loại nấm kháng rầy trong tự nhiên, rồi đƣa loại nấm này ra đồng ruộng, rầy nâu gặp nấm sẽ mang bệnh rồi truyền bệnh sang rầy khác, bằng phƣơng pháp này có thể diệt trừ rầy nâu một cách hiệu quả mà không gây ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời [55]. Hiện nay, phƣơng pháp này cũng gặp nhiều hạn chế: về mặt qui mô (mỗi lần áp dụng chỉ trên diện tích vài chục ha đất), về công nghệ chế biến, mƣa sau khi phun sẽ làm trôi thuốc, phun thuốc phải trúng rầy, mƣa nhiều, nắng nhiều cũng làm ảnh hƣởng tới chất lƣợng chế phẩm và hạn chế về mặt thời gian (rầy nâu không bị tiêu diệt ngay sau khi phun thuốc) [6]. Nhiều kết luận cho rằng không một biện pháp đơn lẻ nào có thể phòng trừ rầy nâu một cách hoàn hảo. Vấn đề chỉ có thể giải quyết bằng cách thực hiện một chƣơng trình phòng trừ tổng hợp, trong đó giống kháng, biện pháp sinh học, biện pháp canh tác và dùng thuốc hóa học phải đƣợc kết hợp với nhau một cách hợp lý [9], [44]. Vì vậy, đòi hỏi phải có những nghiên cứu chi tiết về các chủng virut gây bệnh và môi giới truyền bệnh VL&LXL trên qui mô rộng lớn. 1.6. MỘT SỐ ENZYM VÀ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU BỆNH VIRUT 1.6.1. Một số enzym sử dụng trong sinh học phân tử Trong sinh học phân tử, có nhiều loại enzym quan trọng, trong đó phải kể đến những loại sau: Enzym phiên mã ngƣợc có vai trò quyết định trong quá trình hình thành ngành sinh học phân tử Eucaryot. Enzym này do các retrovirut sản sinh nhằm sao chép bộ gen RNA của chúng trong tế bào vật chủ. Enzym phiên mã ngƣợc tổng hợp nên một mạch DNA bổ sung (cDNA- complementary DNA) từ RNA khuôn theo chiều 5’-3’, khi có mặt của mồi. Các ứng dụng chủ yếu là: Thiết lập ngân hàng cDNA, tiến hành phản ứng PCR trên mRNA, và xác định trình tự của các axit nucleic bằng phƣơng pháp sử dụng các dideoxynucleotit. DNA ligase là enzym xúc tác sự hình thành liên kết nối hai đoạn DNA hay RNA (RNA ligase). Enzym này đƣợc tách chiết từ E.coli và xúc tác cho phản ứng nối hai trình tự DNA có đầu so le. T4 DNA ligase có nguồn gốc từ phage T4 xâm nhiễm E.coli. Enzym này có cùng chức năng với ligase tách chiết từ E.coli nhƣng đặc biệt còn có khả năng nối hai trình tự DNA đầu bằng nên T4 DNA ligase đƣợc dùng phổ biến nhất trong kỹ thuật tạo dòng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 Enzym DNA polymerase xúc tác sự tổng hợp DNA theo chiều 5’-3’. phần lớn các DNA polymerase dùng một bản mẫu là DNA đề làm khuôn cho sự tổng hợp (DNA polymerase I, T4 DNA polymerase, Taq polymerase). Một DNA polymerase đặc biệt là enzym phiên mã ngƣợc (Reverse Transciptase) sử dụng khuôn là RNA để tổng hợp DNA. Ngoài ra, còn có Terminal transferrase là một DNA polymerase không tổng hợp mạch mới từ mạch khuôn mà chỉ thêm các nucleotit vào đầu của một phân tử DNA có sẵn. Các DNA mồi, là một đoạn DNA hay RNA ngắn bắt cặp bổ sung với phần đầu của mạch khuôn (đầu 3’), để từ đó các polymerase mới nối dài tạo mạch bổ sung. Enzym cắt giới hạn (RE) là các endonuclease có khả năng cắt DNA mạch đôi một cách lặp lại ở những vị trí (trình tự) xác định. Do đặc tính cơ bản của các RE là khả năng nhận biết và cắt một trình tự xác định trên phân tử DNA, dựa vào khả năng này, ngƣời ta chia chúng làm ba loại: (1) Khi enzym nhận biết đƣợc trình tự, nó sẽ di chuyển trên phân tử DNA đến cách đó khoảng 1000 – 5000 nucleotit và giải phóng độ vài chục nucleotit; (2) Enzym nhận biết trình tự và cắt ngay tại vị trí đó; (3) Enzym nhận biết một trình tự và cắt DNA ở vị trí cách đó khoảng 20 nucleotit. Trình tự nhận biết của RE loại 2: Mỗi RE nhận biết một trình tự nucleotit đặc trƣng. Các trình tự này thƣờng bao gồm 4-8 nucleotit (thƣờng là 4 hoặc 6). Đối với một số RE, trình tự nhận biết không có tính chuyên biệt tuyệt đối – một số nucleotit của trình tự có thể đƣợc thay thế bởi nucleotit khác. Đặc trƣng quan trọng nhất của các trình tự nhận biết là chúng có cấu trúc palindromic, nghĩa là hai mạch của trình tự hoàn toàn giống nhau khi chúng đƣợc đọc theo cùng chiều 5’-3’. Nhƣ vậy, vị trí cắt là giống nhau trên hai mạch. 1.6.2. Kỹ thuật RT-PCR Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase - PCR) là sự kết hợp của hai phản ứng phiên mã ngƣợc (Reverse Transcriptase) và PCR để nhân lên đƣợc đoạn gen quan tâm từ RNA [3]. Kỹ thuật này gồm hai giai đoạn: - Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất: Nguyên lý của phƣơng pháp này là sử dụng enzym phiên mã ngƣợc (reverse transcriptase) để tổng hợp sợi cDNA thứ nhất từ RNA. Tùy theo mục đích của thí nghiệm mà các loại RNA đƣợc sử dụng là khác nhau. Nếu muốn nhân một đoạn gen của sinh vật nhân chuẩn mà không muốn có intron thì ngƣời ta thƣờng tổng hợp cDNA từ mRNA với mồi oligo(dT)s. Nếu là sinh vật nhân sơ hoặc virrut ngƣời ta có thể tổng hợp cDNA từ RNA tổng số với mồi ngẫu nhiên hoặc mồi đặc hiệu cho gen cần nhân. Khi mồi gắn bổ sung với sợi RNA khuôn, enzym phiên mã ngƣợc sẽ xúc tác cho quá trình tổng hợp cDNA từ các Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 nucleotit tự do có trong thành phần phản ứng ở một nhiệt độ thích hợp. Phản ứng tổng hợp cDNA chỉ xảy ra trong một chu kỳ, theo lý thuyết sau khi kết thúc phản ứng ta sẽ thu đƣợc lƣợng cDNA tƣơng ứng với lƣợng RNA khuôn ban đầu. Để tăng hiệu quả của qua trình tổng hợp, lƣợng mồi đƣợc cho vào lớn hơn rất nhiều lƣợng RNA khuôn và chất kìm hãm RNase cũng đƣợc đƣa vào để bảo vệ cho RNA khỏi bị cắt bởi RNase. Khuếch đại gen bằng PCR: Sử dụng cDNA làm khuôn để khuếch đại gen quan tâm bằng phản ứng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu (gồm mồi xuôi và mồi ngƣợc). Nguyên tắc của kỹ thuật PCR đƣợc trình bày ở mục 1.6.3. 1.6.3. Kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction – chuỗi phản ứng trùng hợp) đƣợc Karl Mullis và cộng sự mô tả đầu tiên vào năm 1985. Đây là kỹ thuật in vitro tƣơng đối đơn giản, cho phép nhân một số lƣợng không giới hạn nguyên bản một đoạn DNA nhất định trong một khoảng thời gian ngắn, nhờ sự xúc tác của DNA polymerase. Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một đoạn DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự có mặt của những mồi đặc hiệu. Mồi là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Quá trình nhân bản bằng enzym này bao gồm 3 bƣớc đƣợc lặp lại nhiều lần: 1> Biến tính (denaturation): DNA từ dạng sợi kép thành dạng sợi đơn bằng cách nâng cao nhiệt độ lên 94-95oC trong khoảng thời gian từ 0,5- 1 phút. 2> Lai (hybridization): Nhiệt độ đƣợc hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi bắt cặp với khuôn; trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40oC – 70oC, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 0,5- 1 phút. 3> Kéo dài (elongation): Phản ứng polymerase tổng hợp phân tử DNA kéo dài từ đoạn mồi. Hai phân tử DNA mới đƣợc tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung từ hai đầu phân tử khuôn ban đầu. Thời gian kéo dài từ 30 giây đến vài phút. Để tránh hiện tƣợng bắt cặp không đặc thù, phản ứng thƣờng đƣợc thực hiện ở 72oC. Loại polymerase dùng trong PCR là loại chịu nhiệt, ví dụ nhƣ Taq- polymerase đƣợc tách triết từ vi khuẩn Thermus aquaticus, một loại vi khuẩn đƣợc phân lập từ suối nƣớc nóng. Hiện nay, enzym này chủ yếu đƣợc tổng hợp theo con đƣờng tái tổ hợp. Sau mỗi chu kỳ phản ứng lƣợng DNA cần nhân bản sẽ tăng gấp đôi, với N sợi khuôn ban đầu sau n chu kỳ sẽ có N*2n sợi DNA đƣợc tạo ra. Ví dụ, sau khoảng 20 chu kỳ, có khoảng 30 triệu bản đƣợc tạo ra từ một sợi khuôn ban đầu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 1.6.4. Kỹ thuật biến nạp plasmit vào E.coli Lần đầu tiên biến nạp ở vi khuẩn đƣợc Frederick Griffith mô tả vào năm 1928 trong thí nghiệm nổi tiếng của ông về cái gọi là “nguyên lý biến nạp”. Tuy nhiên, không phải tất cả các vi khuẩn đều có thể biến nạp đƣợc một cách dễ dàng. Để có thể biến nạp ở E.coli có hiệu quả, các tế bào cần trở nên khả biến (competent). Để đạt đƣợc điều này, trƣớc khi biến nạp, ngƣời ta ngâm các tế bào trong dung dịch CaCl2 lạnh. Việc biến nạp các tế bào khả biến đƣợc thực hiện bằng cách trộn DNA plasmit tái tổ hợp với các tế bào, rồi ủ trong đá từ 20- 30 phút, sau đó tạo một sốc nhiệt ngắn ở 420C trong khoảng 1- 1,5 phút, làm nhƣ vậy DNA sẽ chui vào tế bào. Sau khi biến nạp, vi khuẩn đƣợc nuôi phục hồi trong môi trƣờng LB lỏng ở 370C trong khoảng 60- 90 phút. Sau đó, các tế bào đƣợc đƣa lên môi trƣờng chọn lọc để nhân lên các tế bào có plasmit tái tổ hợp. Trong quá trình biến nạp, chỉ một phần rất nhỏ các tế bào khả biến đƣợc biến nạp. Mặc dù có nhƣợc điểm rất lớn này, biến nạp vẫn là một kỹ thuật quan trọng, nó có thể tạo ra tới 109 các tế bào biến nạp (tức cá thể biến nạp) khi đƣa 1µg DNA vào thí nghiệm. Trong thực tế, với 1µg DNA ngƣời ta tạo ra đƣợc 106 đến 107 tế bào biến nạp. 1.6.5. Kỹ thuật tách dòng gen Tách dòng gen là một công cụ hữu hiệu đƣợc sử dụng trong kỹ thuật di truyền và là bƣớc khởi nguồn cho các kỹ thuật sau này. Mục đích của việc tách dòng là nhằm thu đƣợc một lƣợng lớn bản sao của trình tự gen quan tâm. Đầu tiên, DNA ngoại lai đƣợc nối vào một vectơ nhằm tạo ra DNA tái tổ hợp. Vectơ sử dụng là plasmit thích ứng của vi khuẩn E.coli. Sau đó, vectơ tái tổ hợp đƣợc biến nạp vào tế bào chủ và tế bào chủ đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng thích hợp để nhân vi khuẩn lên nhiều lần. Tế bào chủ ở đây là vi khuẩn E.coli. Cuối cùng qua các bƣớc tách chiết DNA, ngƣời ta sẽ thu đƣợc một lƣợng lớn plasmit tái tổ hợp. Các nhân tố nhƣ vectơ, tế bào chủ có thể thay đổi nhƣng tiến trình tách dòng nói chung đƣợc thực hiện qua 4 bƣớc: xử lý DNA cần tạo dòng, tạo vectơ tái tổ hợp, biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ, chọn dòng. - Xử lý DNA cần tạo dòng Trƣớc hết DNA cần tạo dòng đƣợc khuếch đại bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR sau đó đƣợc làm sạch để thu đƣợc phân đoạn DNA có kích thƣớc nhƣ mong muốn, loại bỏ mồi và các thành phần khác trong phản ứng PCR. Bƣớc này nhằm tạo điều kiện cho bƣớc chọn dòng đƣợc thực hiện nhanh và hiệu quả, tránh những plasmit tái tổ hợp có kích thƣớc không mong muốn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 - Tạo vectơ tái tổ hợp Vectơ tái tổ hợp đƣợc tạo ra bằng cách gắn gen quan tâm (đoạn DNA cần tạo dòng) vào vectơ tách dòng. Thông thƣờng, sau khi chạy PCR với enzym Taq- polymerase, enzym này sẽ gắn thêm một nucleotit là Adenin vào đầu 3’ của đoạn gen đƣợc nhân lên. Lợi dụng tính chất này, các nhà khoa học đã nghiên cứu, thiết kế các thế hệ vectơ tách dòng có mang 1 nucleotit là Thymin ở đầu 5’ của vectơ đã đƣợc mở vòng sẵn tại PCS (polycloning site- vùng nhân dòng đa điểm cắt). Hiện nay, có rất nhiều vectơ tách dòng có điểm cắt này, nhƣ pBT, pCR®2.1- TOPO, pGEM ® -T... Vectơ tách dòng và DNA cần tạo dòng đƣợc trộn chung theo một tỷ lệ nhất định dƣới sự xúc tác của enzym T4 ligase, DNA sẽ đƣợc gắn vào vectơ theo nguyên tắc bổ sung A – T tại vị trí mở vòng. - Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ Trong quá trình gắn gen vào vectơ sẽ hình thành nên các vectơ tái tổ hợp khác nhau. Bƣớc này nhằm sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vectơ tái tổ hợp thành một số lƣợng lớn bản sao. - Chọn dòng Chọn dòng vi khuẩn tái tổ hợp theo hai cách thông dụng: chọn lọc theo phƣơng pháp kháng sinh (kanamycin, ampicillin,...) nhằm loại trừ các tế bào vi khuẩn không đƣợc biến nạp và các loại vi khuẩn nhiễm tạp khác và chọn lọc theo phản ứng với cơ chất (X-gal) nhằm loại trừ những vi khuẩn có mang vectơ nhƣng không có đoạn gen nào đƣợc gắn vào. 1.6.6. Kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony- PCR) Nguyên tắc kỹ thuật colony- PCR dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật PCR, chỉ khác ở mẫu DNA đƣợc thay bằng DNA plasmit giải phóng từ khuẩn lạc ở nhiệt độ cao 94 0C đến 950C, màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ, giải phóng plasmit tái tổ hợp. Plasmit tái tổ hợp sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR nhân gen bằng cặp mồi đặc hiệu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU - Vật liệu thực vật sử dụng trong nghiên cứu là các mẫu lá lúa nghi nhiễm bệnh VL&LXL đƣợc thu từ các tỉnh đại diện có tỷ lệ nhiễm bệnh từ trung bình đến cao ở khu vực Nam Trung Bộ, mỗi tỉnh thu mẫu từ 2- 3 địa điểm khác nhau (Hình 2.1). STT Tên tỉnh thu mẫu Ký hiệu mẫu 1 Bình Định BĐ 2 Phú Yên PY 3 Khánh Hòa KH 4 Ninh Thuận NT 5 Bình Thuận BT Hình 2.1. Các điểm thu mẫu lúa nghi nhiễm bệnh VL&LXL tại Nam Trung Bộ 1 2 3 5 4 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 2.2. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỊA ĐIỂM 2.2.1. Hóa chất - Các cặp mồi dùng để tách dòng gen mã hóa protein vỏ và các phân đoạn khác đƣợc tổng hợp bởi hãng Invitrogen (Mỹ). Các hóa chất sinh học phân tử và các thiết bị đều đƣợc các hãng nổi tiếng nhƣ Fermentas (Đức), QIAGEN (Đức), Invitrogen (Mỹ), BIONEER (Hàn Quốc)... cung cấp. - Thang DNA chuẩn (Fermentas, Invitrogen) - QIAamp ® Viral RNA Mini Kit (QIAGEN). - Bộ hóa chất sử dụng cho RT-PCR (Invitrogen- Super ScriptTM III One- Step RT-PCR system with Platinium ® Taq High Fidelity) (Invitrogen). - Kit tinh sạch DNA (QIAquick Gel Extraction Kit- QIAGEN). - Kit tách và tinh sạch plasmit (QIAprep Spin Miniprep- QIAGEN) - Các hóa chất thông dụng khác nhƣ: Ampicillin, IPTG, X-gal, agarose, ... (Merck, Sigma, Amersham Pharmacia Biotech). - Các hóa chất cho phản ứng PCR, H2O khử DEPC. - Vectơ pBT (Viện Công nghệ Sinh học). 2.2.2. Thiết bị Máy ly tâm, máy soi gel, bộ điện di, tủ cấy vô trùng, máy chụp ảnh, pipet man, máy PCR, máy xác định trình tự nucleotit tự động và các trang thiết bị khác. 2.2.3. Địa điểm nghiên cứu - Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Phòng thí nghiệm Di truyền học và Công nghệ gen, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên. 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Thu mẫu thí nghiệm Mẫu lúa đƣợc thu tại các địa phƣơng nghi có hiện tƣợng nhiễm bệnh, do các chuyên gia tại địa phƣơng trực tiếp dẫn đi thu mẫu. Mẫu lúa đƣợc thu là những cây lúa có nhiều biểu hiện khác biệt so với những cây bên cạnh: lá vàng, xoắn, lùn hơn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 bình thƣờng. Mẫu lúa đƣợc chứa trong các ống đã khử trùng và bảo quản trong điều kiện -840C đến khi sử dụng. 2.3.2. Thiết kế mồi đặc hiệu Quy trình thiết kết mồi đƣợc thực hiện theo các bƣớc sau. i) Thu thập các trình tự gen quan tâm từ Ngân hàng gen (GenBank); ii) Sử dụng các phần mềm thiết kết primer chuyên dụng nhƣ Primer3 để thiết kế các đoạn primer đặc hiệu cho các đoạn gen quan tâm. i) Thu thập các trình tự gen quan tâm từ GenBank: Trƣớc khi thiết kế đoạn mồi đặc hiệu cho gen và các trình tự cần phân lập của các chủng virut nghiên cứu (Ví dụ: trình tự gen CP của RGSV), trình tự đoạn gen này đƣợc thu thập từ GenBank tại địa chỉ www.ncbi.nlm.nih.gov [63]. Trình tự của các đoạn gen quan tâm có thể tìm kiếm thông qua tên của gen hoặc số hiệu của gen đƣợc đăng kí trong ngân hàng gen. Sau khi có đƣợc trình tự của gen quan tâm, các đoạn primer sẽ đƣợc thiết kế bằng việc sử dụng các chƣơng trình thiết kế. ii) Sử dụng các phần mềm thiết kết primer chuyên dụng nhƣ Primer3 để thiết kế các đoạn primer đặc hiệu cho các đoạn gen quan tâm. Chƣơng trình Primer3 đƣợc đăng kí tại địa chỉ bin/primer3plus/primer3plus.cgi [67]. Trong quá trình thiết kế mồi cần căn cứ vào một số điểm sau: Mồi phải có độ đặc hiệu và hiệu suất khuếch đại cao. Cố gắng chọn trình tƣ̣ mồi có khoảng 50% GC khi đó Tm trong khoảng 56- 62 0C sẽ tạo điều kiện để quá trình ủ đạt kết quả tốt. Tránh G và C ở đầu 3’ của mồi vì nó có thể làm tăng cơ hội tạo ra hiện tƣợng primer-dimers (hai primer bắt cặp với nhau ). Tránh chọn các vùng có trình tự tƣơng đồng để hạn chế các mồi tƣ̣ gắn với nhau . Tính toán nhiệt độ nóng chảy (Tm) của primer với tổng số 40C cho GC và 20C cho AT theo công thức Tm = 4(G+C) + 2(A+T), sau đó trƣ̀ đi 50C tƣ̀ giá trị này và đây chính là nhiệt độ ủ (Ta) của primer [30], [39]. 2.3.3. Tách chiết RNA tổng số của virut ở lúa RNA tổng số từ các mẫu lá lúa nghi nhiễm bệnh VL&LXL đƣợc tách chiết theo hƣớng dẫn sử dụng hóa chất trizol reagents. Lá lúa (khoảng 200g) đƣợc nghiền trong nitrogen thành bột mịn; Bổ sung 1 ml trizol reagents, đảo nhẹ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút; Bổ sung 200 µl chloroform : isoamyl (24:1), đảo nhẹ và ly tâm 10.000v/p trong 10 phút; Hút dịch nổi, kết tủa RNA bằng Isopropanol. Ly tâm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 ở 10.000v/p trong 10 phút, bỏ dịch nổi, thu tủa; Rửa tủa bằng cách bổ sung 700µl ethanol 70%, ly tâm ở 7000v/p trong 5 phút (lặp lại 2 lần), làm khô và pha loãng RNA trong nƣớc khử DEPC 0,01%; Cất mẫu ở -840C. 2.3.4. Phản ứng RT-PCR - Thành phần: Thành phần phản ứng RT-PCR (one-step) trong thể tích 25l: 5l đệm RT-PCR 5X; 10pg- 5g RNA tổng số (1l); 75pmol mỗi loại mồi đặc hiệu (0,75l); 1l 10mM dNTP mix (10mM mỗi loại dATP, dGTP, dTTP và dCTP, ở pH trung tính); 1l hỗn hợp enzym (Reverse transcriptase và Taq polymerase); 0,2 l chất ức chế Ribonuclease tái tổ hợp RNase OUTTM (40u/l); Bổ sung nƣớc khử ion đã đƣợc khử trùng tới thể tích 25l. - Chu kỳ nhiệt: Thực hiện phản ứng RT-PCR theo chu kỳ nhiệt sau: bƣớc 1: 50 0C, 30 phút; bƣớc 2: 950C, 15 phút; bƣớc 3: 940C, 30 giây; bƣớc 4: 530C, 30 giây; bƣớc 5: 720C, 3 phút; từ bƣớc 3 đến bƣớc 5 lặp lại 10 chu kỳ; bƣớc 6: 940C, 30 giây; bƣớc 7: 550C, 30 giây; bƣớc 8: 720C, 5 phút; từ bƣớc 6 đến bƣớc 8 lặp lại 30 chu kỳ; bƣớc 9: 720C, 10 phút; bƣớc 10: 40C, bảo quản mẫu. Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose 1% trong đệm 1X TAE [45], nhuộm gel trong dung dịch ethidium bromide và thôi gel bằng bộ Kit của QIAGEN. 2.3.5. Tạo plasmit tái tổ hợp mang gen mong muốn (Ligation) Sản phẩm PCR của gen quan tâm đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% và đƣợc làm sạch theo bộ kit QIAquick Gel Extraction rồi gắn vào vectơ tách dòng pBT (Hình 2.2). Các bƣớc tiến hành nhƣ sau: - Thôi gel sản phẩm PCR: Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm, có kích thƣớc khoảng 1kb; bổ sung dung dịch QG theo tỷ lệ: Vmẫu : VQG = 1 : 3 (1mg mẫu tƣơng ứng với 1µl); ủ ở 50 0 C trong 10- 15 phút, cứ 3 phút đảo mẫu nhẹ một lần, sau khi gel tan hết ủ thêm 5 phút để đảm bảo gel tan hoàn toàn; chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột thôi gel Qiaquick spin, ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột; bổ sung 500µl dung dịch QG, ly tâm 13.000v/p trong 1 phút; thêm 750µl dung dich PE vào cột, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút; ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút, đổ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung 1 phút để loại bỏ hết dung dịch PE; hòa tan DNA trong 30- 50µl nƣớc cất hoặc dung dịch EB, đã đƣợc làm ấm đến 500C, để ở nhiệt độ phòng 1 phút, ly tâm 13.000v/p để thu DNA. - Gắn gen vào vectơ: Sản phẩm thôi gel đƣợc gắn vào vectơ pBT với sự xúc tác của T4 ligase. Phản ứng gắn dựa vào sự hình thành mối liên kết photphodieste Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 giữa nucleotit Adenin của sản phẩm PCR và nucleotid Thymin của vectơ. Các thành phần của vectơ pBT đƣợc thể hiện trong hình 2.2. Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở nhiệt độ phòng trong 02 giờ để phản ứng xảy ra hoàn toàn. Vectơ tái tổ hợp sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α và đƣợc cấy trải trên môi trƣờng LB đặc có bổ sung ampicillin 0,01mg/l ampicillin, X-gal 0,004‰, IPTG 100µM. Thành phần phản ứng gắn gen vào vectơ pBT: Buffer T4 ligase 10X (2µl); DNA (8µl); plasmit pBT (1µl); T4 ligase 2u/µl (1µl); H2O (8µl). Tổng thể tích 20µl. Hỗn hợp đƣợc ủ ở 220C trong 2 giờ, sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt. Hình 2.2. Sơ đồ vectơ pBT. 2.3.6. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt - Chuẩn bị tế bào khả biến: Tế bào E.coli DH5α đƣợc cấy ria trên môi trƣờng LB đặc và nuôi qua đêm ở 370C. Chọn một khuẩn lạc nuôi cấy trong 3ml LB lỏng, lắc 200 v/p, ở 370C trong 2- 3 giờ, đo OD600nm đạt 0,4- 0,6 thì chuyển dịch nuôi cấy sang ống ly tâm, để 15 phút ở trong đá (hoặc ở 40C). Ly tâm 4000v/p, ở 40C, trong 15 phút (lặp lại ba lần, để trong đá lần thứ hai 30 phút, lần thứ ba 60 phút). Đổ dịch CaCl2, hòa tan trong 1ml CaCl2/100ml LB ban đầu. Bổ sung 15- 20% glycerol. Chia 50µl dịch tế bào khả biến vào mỗi ống eppendorf 1,5ml. Bảo quản tế bào khả biến trong tủ lạnh -840C. - Biến nạp: Bổ sung 20µl vectơ tái tổ hợp vào ống đựng tế bào khả biến và trộn nhẹ, đặt ngay vào đá trong 30 phút rồi ủ ở 420C chính xác trong 1,5 phút, sau Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 đó đặt vào đá 5 phút. Bổ sung 700µl môi trƣờng LB lỏng, hỗn hợp đƣợc nuôi ở 37 0C, lắc 200v/p trong 1 giờ. Sử dụng que cấy trải, trải 150- 250µl dịch khuẩn lên đĩa môi trƣờng LB đặc có chứa 0,1mg/l ampicillin, X-gal 0,004‰, IPTG 100µM. Ủ đĩa ở 370C trong 16 giờ. 2.3.7. Colony-PCR Sau khi nuôi khuẩn đã biến nạp trên môi trƣờng chọn lọc, thu đƣợc những khuẩn lạc xanh và trắng. Nguyên lý của khuẩn lạc xanh và trắng: Toàn bộ khuẩn lạc phát triển trên môi trƣờng có ampicillin đều là khuẩn lạc mang plasmit (vectơ). Vì sự có mặt của gen kháng ampicillin trong plasmit giúp vi khuẩn có khả năng kháng kháng sinh ampicillin. Những khuẩn lạc xanh xuất hiện do trong vectơ mang gen lac-operon hoạt động bình thƣờng, không có đoạn gen đƣợc xen vào, khi có chất cảm ứng của IPTG sẽ tổng hợp enzym β-galactosidase, enzym này sẽ chuyển hóa cơ chất X-gal thành hợp chất có mầu xanh. Còn những khuẩn lạc trắng có thể là do nhận đƣợc plasmit mang lac-operon không hoạt động, chính vì vậy khi có chất cảm ứng IPTG thì gen không tổng hợp enzym β-galactosidase và không xảy ra hiện tƣợng chuyển hóa X-gal. Lac-operon bị bất hoạt là do đoạn DNA ngoại lai xen vào giữa promoter của operon gen lacZ. Do đó, lac-promoter không thể điều khiển gen cấu trúc phiên mã, nên không cóc sự dịch mã thành enzym. Tuy nhiên, không phải tất cả các khuẩn lạc trắng đều mang plasmit tái tổ hợp chứa đoạn DNA quan tâm. Mặc dù vậy, việc chọn khuẩn lạc trắng để nghiên cứu tiếp đã loại bỏ đƣợc phần lớn các trƣờng hợp không mong muốn. Để phản ứng hiệu quả hơn cần kiểm tra bằng cách chạy phản ứng colony-PCR. Khuẩn lạc trắng của mỗi mẫu đƣợc chọn lọc và đánh số thứ tự, thực hiện phản ứng colony-PCR với cặp mồi pUC18 để xác định khuẩn lạc có plasmit mang gen quan tâm. Sản phẩm colony-PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,9% để chọn ra các khuẩn lạc mang gel có kích thƣớc nhƣ mong muốn, đồng thời nuôi những khuẩn lạc này trong 3ml LB lỏng có bổ sung ampicillin 100mg/l để tách plasmit. Thành phần phản ứng colony-PCR: Dung dịch đệm PCR 10X (2µl); MgCl2 25mM (2µl); dNTPs 2,5mM (2µl); Mồi pUC18-xuôi 10 pmol/µl (1µl); Mồi pUC18- ngƣợc 10 pmol/µl (1µl); DNA polymerase 1u/1µl (1 µl); H2O khử ion (11µl). Tổng thể tích là 20µl. Chu kỳ nhiệt của phản ứng colony-PCR: bƣớc 1: 950C, 5 phút; bƣớc 2: 940C, 30 giây; bƣớc 3: 520C, 30 giây; bƣớc 4: 720C, 3 phút; từ bƣớc 2 đến bƣớc 4 lặp lại Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 10 chu kỳ; bƣớc 5: 940C, 30 giây; bƣớc 6: 550C, 30 giây; bƣớc 7: 720C, 5 phút; từ bƣớc 5 đến bƣớc 7 lặp lại 25 chu kỳ; bƣớc 8: 720C, 10 phút; bƣớc 9: 40C, bảo quản mẫu. 2.3.8. Tách chiết plasmit Sử dụng bộ kit QIAprep Spin Miniprep và chỉ dẫn của nhà sản xuất để tách chiết plasmit. Đây là phƣơng pháp tách plasmit lƣợng nhỏ từ 1 – 1,5 ml dịch khuẩn E.coli, có số bản sao plasmit cao. Qui trình bao gồm: Hút 1,5ml dịch khuẩn E.coli đã nuôi qua đêm trong môi trƣờng LB lỏng cho vào ống eppendorf 1,5ml. Ly tâm 8.000v/p trong 5 phút để thu tế bào vi khuẩn. Hòa tan tế bào trong 250µl buffer RS có bổ sung RNase (sản phẩm tách không còn RNA). Bổ sung 250µl BL, đảo ống nhẹ nhàng 4-6 lần để trộn đều hỗn hợp. Cần thiết có thể đảo ống cho đến khi nhìn thấy dịch trắng sữa. Không để phản ứng phân giải quá 5 phút. Các dung dịch RS và BL có tác dụng phá vỡ thành tế bào, màng sinh chất... và giải phóng ra các thành phần trong tế bào. Bổ sung 350µl NE, đảo ống ngay lập tức nhƣng nhẹ nhàng 3- 4 lần. Tránh kết tủa cục bộ, đảo đều dung dịch nhẹ nhàng nhƣng liên tục ngay khi bổ sung NE. Dung dịch trở nên có màu trắng sữa. Dung dịch NE có tác dụng kết tủa protein, polysaccarit... tạo kết tủa bám vào thành ống eppendorf. Ly tâm 13.000v/p trong 15 phút. Hút dịch nổi cho vào cột QIAprep Spin Miniprep. Ly tâm 13.000v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột, rửa cột QIAprep Spin Miniprep bằng cách bổ sung 0,5ml buffer PB và ly tâm 13.000v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Bƣớc này là rất cần thiết để loại bỏ hoạt tính của nuclease khi sử dụng chủng endA + nhƣ JM, HB101 hoặc các thế hệ khác của nó hoặc các chủng dại mà có mức độ hoạt tính cao của nuclease hoặc nồng đọ carbohydrate cao. Chủng tế bào chủ nhƣ XL-1 và DH5α không cần thiết phải thực hiện bƣớc rửa này. Rửa cột QIAprep Spin Miniprep bằng cách bổ sung 0,75ml buffer WP và ly tâm ở 13.000v/p. Loại bỏ dịch chảy qua cột, và ly tâm bổ sung 13.000v/p trong 1 phút để loại bỏ hết buffer rửa. Chuyển cột sang một ống eppendorf 1,5ml mới. Hòa tan DNA bằng cách bổ sung 50µl EL hoặc nƣớc cất tới tâm của mỗi cột QIAprep Spin Miniprep, để ở nhiệt độ phòng 1 phút rồi ly tâm ở 13.000v/p trong 1 phút. Tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm tinh sạch plasmit trên gel agarose 0,9%. 2.3.9. Cắt gen bằng enzym giới hạn Bƣớc đầu tiên trong quá trình cắt gen bằng enzym giới hạn, chúng ta phải xác định những enzym có thể sử dụng để cắt đƣợc đoạn gen quan tâm. Những enzym đƣợc lựa chọn là những enzym dự tính không có điểm cắt trên đoạn gen quan tâm, không có quá nhiều vị trí cắt trên vectơ. Đặc biệt, những enzym cắt Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 không cho các đoạn gen có kích thƣớc chênh lệch nhỏ, vì nhƣ vậy, không thể xác định đƣợc đoạn gen quan tâm. Sau khi đã xác định đƣợc enzym cắt giới hạn, đối chiếu với bảng enzym để xác định đƣợc đệm phù hợp nhất, cho khả năng cắt cao nhất. Tiến hành cắt enzym, cho lần lƣợt các thành phần theo thứ tự: Đệm cho enzym cắt, chất phụ trợ (nếu có), plasmit, enzym. Hỗn hợp đƣợc cắt ở 37oC trong 02 tiếng, bất hoạt enzym ở 65oC trong 20 phút. Thành phần phản ứng cắt bằng enzym giới hạn : DNA plasmit 2,5- 3 µg/µl (5µl); Enzym 10u/µl (1µl); Dung dịch đệm 10X (1µl); H2O khử ion (3,5µl ). Tổng thể tích là 10µl. 2.3.10. Xác định trình tự và so sánh trình tự gen thu đƣợc với các trình tự tƣơng ứng trên GenBank Tách dòng và xác định trình tự gen: Sản phẩm PCR đƣợc gắn vào trong vector tách dòng pBT [4] và biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α. Chọn lọc các khuẩn lạc xanh/trắng trên môi trƣờng thạch LB có bổ sung 50 mg/l Ampicilin, 0,004% X-gal và 0,1 mM IPTG. Tách chiết plasmit theo hƣớng dẫn sử dụng của Plasmit Extraction Kit. Kiểm tra sự có mặt của DNA tái tổ hợp bằng phƣơng pháp colony-PCR với cặp mồi pUC18-xuôi và pUC18-ngƣợc. Chọn các mẫu plasmit tái tổ hợp có kích thƣớc nhƣ mong muốn để tinh sạch và xác định trình tự trên máy tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer. Sử dụng các phần mềm DNAstar, BioEdit và MEGA 4 để so sánh các trình tự gen và dựng cây phát sinh chủng loại theo phƣơng pháp tối đa (Maximum Parsimony (MP)) trên cở sở các số liệu thu đƣợc qua so sánh các trình tự gen. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. THIẾT KẾ MỒI Để thực hiện đƣợc kỹ thuật PCR và RT-PCR, bƣớc đầu tiên là thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gen muốn khuếch đại. Dựa trên trình tự các gen quan tâm của chủng RGSV đã công bố trên GenBank, kết hợp sử dụng các phần mềm thiết kế mồi nhƣ Primer3, DNAclub, Oligo... Với mục đích đánh giá đa dạng di truyền vừa để xác định sự có mặt của các chủng virut gây bệnh VL&LXL trong lúa tại các tỉnh Nam Trung Bộ, chúng tôi đã lựa chọn gen CP và các đoạn có trình tự bảo thủ cao khác. Các cặp mồi đƣợc thiết kế thể hiện trong bảng 3.1. Bảng 3.1. Trình tự mồi sử dụng để nhân một số đoạn trong genome RGSV. STT Tên mồi Trình tự mồi Chiều dài gen (bp) 1 RNA1-RGSV- xuôi 5’-CAAACATCCTCCCAAGCATTI-3’ 423 RNA1-RGSV- ngƣợc 5’-ATGATCCAACGAGGAACTGGI-3’ 2 RNA4-RGSV-xuôi 5'-AGCTGCCACTCAAGGTGTTTI-3' 441 RNA4-RGSV- ngƣợc 5'-GAGCTAGTGGGTGGTTCTCGI-3' 3 CP-RGSV- xuôi 5'-CTATACACTACGCTAAAGGCTI-3' 1021 CP-RGSV- ngƣợc 5'-GTGTAAGATGGGTAAAGTGCAI-3' (I: Inosine – là một loại nucleotit đặc biệt có khả năng gắn với nucleotit A, C hoặc U) Cặp mồi RNA1-RGSV-xuôi, RNA1-RGSV-ngƣợc sử dụng để khuếch đại phân đoạn RNA1 của RGSV với kích thƣớc dự kiến là 423bp. Cặp mồi RNA4-RGSV- xuôi, RNA4-RGSV-ngƣợc khuếch đại phân đoạn RNA4 của RGSV với kích thƣớc dự kiến là 441bp. Cặp mồi CP-RGSV-xuôi, CP-RGSV-ngƣợc sử dụng để khuếch đại gen CP của RGSV với kích thƣớc dự kiến là 1021bp. 3.2. TÁCH DÕNG CÁC ĐOẠN TRONG GENOME CỦA RGSV 3.2.1. RT-PCR Sau khi tách đƣợc RNA tổng số của virut từ lúa, RNA tổng số đƣợc sử dụng để thực hiện phản ứng RT-PCR. Trong quá trình tiến hành phản ứng cần điều chỉnh lƣợng mẫu, nồng độ mồi, nồng độ Mg2+, nhiệt độ bắt cặp mồi đƣợc tối ƣu hóa để Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 đảm bảo cho hiệu quả của các phản ứng RT-PCR là cao nhất. Sản phẩm RT-PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,9% (Hình 3.1, Hình 3.2, Hình 3.3). Hình 3.1. Điện di sản phẩm RT-PCR phân đoạn 1 và 4 của RGSV từ mẫu BT bằng 2 cặp mồi RNA1-RGSV và RNA4-RGSV. M. Thang chuẩn 1Kb; (-). Đ/c âm; (+). Đ/c dƣơng; 1. Phân đoạn1; 2. Phân đoạn 4. Hình 3.1 cho thấy khi điện di sản phẩm RT-PCR từ các phân đoạn của RGSV, tại giếng đối chứng âm không lên băng chứng tỏ thành phần phản ứng không nhiễm DNA hoặc RNA, giếng đối chứng dƣơng lên 1 băng có kích thƣớc khoảng 500bp (kết quả PCR từ plasmit mang đoạn DNA có kích thƣớc 500bp) chứng tỏ phản ứng diễn ra tối ƣu. Giếng số 1 xuất hiện băng có kích thƣớc khoảng 423bp tƣơng đƣơng với kích thƣớc phân đoạn RNA1-RGSV. Giếng số 2 xuất hiện băng có kích thƣớc khoảng 441bp tƣơng đƣơng với kích thƣớc phân đoạn RNA4- RGSV. Nhƣ vậy, khi thực hiện phản ứng PCR bằng 2 cặp mồi đặc hiệu với phân đoạn 1 và phân đoạn 4 của RGSV là RNA1-RGSV và RNA4-RGSV với mẫu RNA phân lập từ lúa của tỉnh Bình Thuận đều thu đƣợc các băng điện di có kích thƣớc nhƣ mong muốn. Kết quả hình 3.2 cho thấy tại giếng số 1 không lên băng, trong khi tại giếng số 2 xuất hiện băng có kích thƣớc khoảng 1Kb tƣơng đƣơng với băng đối chứng dƣơng. Nhƣ vậy, khi thực hiện phản ứng RT-PCR bằng cặp mồi CP-RGSV-xuôi và CP-RGSV-ngƣợc với các mẫu lúa BĐ và NT, chỉ mẫu NT thu đƣợc băng có kích thƣớc phù hợp với đoạn gen CP của RGSV. 0,5 Kb Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 Hình 3.2. Điện di sản phẩm RT-PCR gen CP của RGSV bằng cặp mồi CP-RGSV M: Thang chuẩn: 1kb; (+): Đ/c dƣơng; (-): Đ/c âm; 1: BĐ; 2: NT. Hình 3.3 cho thấy rằng khi thực hiện phản ứng RT-PCR bằng cặp mồi đặc hiệu với gen CP của RGSV (CP-RGSV-xuôi và CP-RGSV-ngƣợc), tại giếng số 1 (BT) xuất hiện 1 băng có kích thƣớc 1Kb trong khi các giếng còn lại (2 (BĐ), 3 (PY), 4 (KH)) không xuất hiện băng sản phẩm. Hình 3.3. Điện di sản phẩm RT-PCR gen CP của RGSV bằng cặp mồi CP-RGSV M: Thang chuẩn: 1Kb; (+): Đ/c dƣơng; (-): Đ/c âm; 1: BT; 2: BĐ; 3: PY; 4: KH. Nhƣ vậy, khi thực hiện phản ứng RT-PCR với 3 cặp mồi đặc hiệu (bảng 3.1) và điện di trên gel agarose chỉ thu đƣợc các băng có kích thƣớc phù hợp với gen CP-RGSV tại mẫu lúa của hai tỉnh Ninh Thuận, Bình Thuận và băng có kích thƣớc ~1 Kb 1 Kb Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 phù hợp với các phân đoạn 1, 4 RGSV tại mẫu lúa của tỉnh Bình Thuận. Các phân đoạn DNA có kích thƣớc nhƣ mong muốn đƣợc tinh sạch rồi gắn vào vectơ tách dòng pBT. 3.2.2. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α Quá trình tách dòng đƣợc thực hiện bằng cách gắn sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pBT do phòng Công nghệ Tế bào thực vật cung cấp. Hình 3.4. Khuẩn lạc E.coli DH5α mang vectơ tái tổ hợp của các dòng CP của RGSV tỉnh Bình Thuận trên môi trƣờng LB đặc. Sau khi biến nạp vectơ vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt, đĩa petri đƣợc ủ ở 370C trong 16 giờ. Kết quả đƣợc thể hiện trong hình 3.4. Kết quả thu đƣợc gồm khuẩn lạc xanh và trắng. Toàn bộ khuẩn lạc phát triển trên môi trƣờng có ampicillin đều là khuẩn lạc mang plasmit biến nạp. Vì sự có mặt của gen kháng ampicillin trong plasmid biến nạp mà những vi khuẩn này có thể phát triển trên môi trƣờng có ampicillin. Để kiểm tra các khuẩn lạc trắng chứa plasmit mang đoạn DNA quan tâm, chúng tôi lựa chọn từ mỗi đĩa khuẩn một số khuẩn lạc trắng để thực hiện phản ứng colony-PCR với cặp mồi pUC18-xuôi và pUC18-ngƣợc. 3.2.3. Chọn lọc plasmit tái tổ hợp bằng colony-PCR Chọn 4 đến 7 khuẩn lạc trắng của mỗi mẫu để chạy phản ứng colony-PCR với cặp mồi pUC18-xuôi và pUC18-ngƣợc để xác định khuẩn lạc có plasmit mang đoạn DNA mong muốn. Vì hai mồi nằm trên vectơ nên kích thƣớc của đoạn DNA Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 đƣợc khuếch đại sẽ lớn hơn đoạn DNA mong muốn khoảng 0,2Kb [4]. Sản phẩm colony-PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,9% (Hình 3.5, Hình 3.6). . Hình 3.5. Điện di sản phẩm colony-PCR từ các dòng của phân đoạn 1 và 4 RGSV bằng cặp mồi pUC 18 M: Thang chuẩn 1Kb; (+). Đ/c dƣơng; (-). Đ/c âm; 1,2. phân đoạn 1; 3,4. phân đoạn 4. Kết quả điện di trên hình 3.5 cho thấy tại giếng đối chứng dƣơng xuất hiện băng điện di có kích thƣớc khoảng 0,6Kb đây là kích thƣớc của đoạn DNA đã xác định trong plasmit sử dụng để PCR, giếng đối chứng âm không lên băng chứng tỏ thành phần phản ứng không lây nhiễm DNA, phản ứng diễn ra đạt yêu cầu. Tại các giếng 1, 2, 3, 4 xuất hiện băng có kích thƣớc khoảng 0,6Kb. Đây là kích thƣớc phù hợp với phân đoạn 1 và 4 của RGSV. Nhƣ vậy, có thể plasmit của các khuẩn lạc tƣơng ứng với các giếng số 1, 2, 3, 4 đều mang đoạn DNA có kích thƣớc tƣơng ứng với phân đoạn 1 và 4 của RGSV. Hình 3.6. Điện di sản phẩm colony-PCR các dòng RGSV bằng cặp mồi pUC 18. M: Thang chuẩn 1 Kb; (-): Đ/c âm; (+): Đ/c dƣơng; 1, 2, 3, 4, 5, 6: mẫu NT; 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13: mẫu BT. ~1Kb 0,5 Kb Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 Dựa vào kết quả điện di trên hình 3.6 thấy rằng, các giếng số 1, 2, 6 và 13 xuất hiện băng tƣơng đƣơng với kích thƣớc của băng đối chứng dƣơng. Nhƣ vậy, có thể plasmit của các khuẩn lạc tƣơng ứng với các giếng số 1, 2, 6 và 13 mang đoạn DNA đã ligation ban đầu. Plasmit của khuẩn lạc tƣơng ứng với các giếng còn lại không mang đoạn DNA mong muốn. Phƣơng pháp colony-PCR có tác dụng loại trừ phần lớn các khuẩn lạc (trắng) mang plasmit không mong muốn. Từ kết quả colony-PCR, chúng tôi lựa chọn các dòng khuẩn lạc 1, 3 (Hình 3.5) và 1, 2, 13 (Hình 3.6) để nuôi trong môi trƣờng LB lỏng có bổ sung ampicillin 100mg/l. Sau đó, chúng tôi tiến hành tách plasmit từ các khuẩn lạc đã nuôi trong môi trƣờng LB lỏng để phục vụ cho việc xác định trình tự. 3.2.4. Tách plasmit và cắt kiểm tra sự có mặt của gen Sau khi chọn khuẩn lạc trắng tƣơng ứng với các giếng sản phẩm colony-PCR có kích thƣớc nhƣ mong muốn và nuôi trong 3ml LB lỏng trong 16 giờ, chúng tôi tiến hành tách plasmit theo bộ kit QIAprep Spin Miniprep nhƣ đã trình bày ở mục 2.3.8. Để kiểm tra sản phẩm tách plasmit và khẳng định một lần nữa sự có mặt của đoạn DNA quan tâm trong plasmit đã đƣợc tinh sạch, plasmit đƣợc cắt bằng enzym cắt BamHI. Kết quả đƣợc thể hiện trong hình 3.7 và 3.8. Hình 3.7: Điện di sản phẩm cắt plasmit mang phân đoạn 1 và 4 của RGSV tại Bình Thuận bằng BamHI M: Thang chuẩn 100 bp; 1. phân đoạn 1; 2. phân đoạn 4. Hình 3.7 cho thấy các giếng số 1, 2 đều xuất hiện 2 băng trong đó 1 băng có kích thƣớc khoảng 2,7 Kb phù hợp với kích thƣớc của vectơ pBT. Băng còn lại lần 0,5 Kb ~ 2,7 Kb Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 lƣợt có kích thƣớc khoảng 423bp (giếng số 1) và băng có kích thƣớc khoảng 441bp (giếng số 2) phù hợp với kích thƣớc phân đoạn 1 và 4 của RGSV đã gắn vào vectơ ban đầu. Hình 3.8. Điện di sản phẩm cắt plasmit mang gen CP của RGSV bằng BamHI. M: Thang chuẩn 1Kb; (-): Plasmit không cắt (1): BT; (2): NT; Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmit mang gen CP của RGSV bằng BamHI (Hình 3.8) cho thấy, các giếng plasmit không cắt chỉ xuất hiện 1 băng có kích thƣớc khoảng 3,7Kb chứng tỏ plasmit đã tinh sạch và có chất lƣợng tốt. Các giếng số 1, 2 đều xuất hiện 2 băng: một băng có kích thƣớc khoảng 2,7Kb phù hợp với kích thƣớc của vectơ pBT và một băng có kích thƣớc khoảng 1Kb phù hợp với kích thƣớc đoạn DNA mong muốn. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmit trong hình 3.7 và hình 3.8 khẳng định plasmit đã tinh sạch, có mang những đoạn DNA phù hợp với kích thƣớc mong muốn. Sau đó, các mẫu plasmit này đƣợc sử dụng để giải trình tự bằng máy xác định trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer. 3.3. XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT CỦA MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA RGSV Các trình tự của RGSV thu đƣợc trên máy xác định trình tự tự động ABI PRISM ® 3100 Avant Genetic Analyzer đƣợc phân tích, xử lý bằng chƣơng trình DNAstar, BioEdit và MEGA 4. Căn cứ vào kích thƣớc thấy rằng các phân đoạn 1, 4 của RGSV từ mẫu BT thu đƣợc sau khi xác định trình tự phù hợp với kích thƣớc lý thuyết khi thiết kế mồi. Khi so sánh các trình tự này bằng cách Blast trên NCBI thấy rằng, hệ số tƣơng đồng ~1 Kb ~2,7 Kb ~3,7 Kb Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 giữa các trình tự đem so sánh với trình tự các phân đoạn 1 và 4 RGSV trong GenBank là rất cao (96- 99%). Kết quả này chứng tỏ hai trình tự trên đúng là các trình tự của phân đoạn 1 và 4 của RGSV. Các trình tự thu đƣợc đƣợc đăng ký vào GenBank với mã số nhƣ trong bảng 3.2. Hai trình tự thu đƣợc có kích thƣớc tƣơng đối ngắn và có độ bảo thủ cao nên khi thực hiện phản ứng PCR ở nhiệt độ thích hợp sẽ có độ nhạy rất cao. Do đó có thể sử dụng 2 cặp mồi này để kiểm tra sự có mặt của RGSV trong mẫu lúa với hiệu quả cao. Bảng 3.2. Mã số đăng ký trên GenBank của các trình tự đã thu đƣợc STT Tên gen (phân đoạn) Tỉnh phân lập Mã số trên GenBank 1 RNA1-RGSV Bình Thuận FM995215 2 RNA4-RGSV Bình Thuận FN179368 3 CP-RGSV Bình Thuận FM882251 4 CP-RGSV Ninh Thuận FM882252 Căn cứ vào kích thƣớc thấy rằng gen CP-RGSV từ các mẫu NT và BT thu đƣợc sau khi xác định trình tự phù hợp với kích thƣớc lý thuyết khi thiết kế mồi. So sánh các trình tự này bằng cách so sánh trên chƣơng trình Blast (NCBI), hệ số tƣơng đồng giữa các trình tự đem so sánh với trình tự gen CP của RGSV trong GenBank là rất cao (96,5- 99%). Kết quả này chứng tỏ đây đúng là các trình tự của gen CP-RGSV. Các trình tự thu đƣợc đƣợc đăng ký vào GenBank với mã số nhƣ trong bảng 3.2. 3.4. SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN CP-RGSV CỦA HAI TỈNH NINH THUẬN VÀ BÌNH THUẬN VỚI CÁC TRÌNH TỰ TƢƠNG ỨNG TRÊN GENBANK Kết quả ở bảng 3.3, hệ số tƣơng đồng giữa các trình tự của gen CP- RGSV là rất cao (96,5%- 99,9%) cho thấy gen CP- RGSV có mức độ bảo thủ cao. Đặc biệt, hệ số tƣơng đồng giữa hai trình tự Ninh Thuận và Bình Thuận với các trình tự tƣơng ứng đem so sánh đạt từ 98,0- 99,9%. Trong đó, hai trình tự này giống nhất với trình tự VL2 (EU076544) của tỉnh Vĩnh Long (99,9%) và khác nhất với trình tự CN(AF290947) của Trung Quốc (98,0%). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 Bảng 3.3. Hệ số tƣơng đồng và sai khác giữa trình tự nucleotit của gen CP- RGSV tại Bình Thuận, Ninh Thuận với các trình tự tƣơng ứng của các tỉnh ĐBSCL và thế giới (GenBank). AG(GQ306203): An Giang, BL1(EU076531): Bạc Liêu1, BL2(EU976532): Bạc Liêu2, BT(FM882251): Bình Thuận, CT1(EU076533): Cần Thơ1, CT2(EU076534): Cần Thơ2, CN(AF290947): Trung Quốc, DT1(EU076535): Đồng Tháp1, DT2(EU076536): Đồng Tháp2, HG(GQ329709): Hậu Giang; JP(AB000403): Nhật Bản, JP(AB023779): Nhật Bản, LA(FN433644): Long An; LA(GQ329710): Long An; NT(FM882252): Ninh Thuận, ST1(EU076537): Sóc Trăng1, ST2(EU076538): Sóc Trăng2, TG1(EU076539): Tiền Giang1, TG2(EU076540): Tiền Giang2, TV1(EO076541): Trà Vinh1, TV2(EU076542): Trà Vinh2, VL1(EU076543): Vĩnh Long1, VL2(EU076544): Vĩnh Long2. Hệ số tƣơng đồng H ệ số s ai k h ác Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 Cây phát sinh chủng loại đƣợc xây dựng theo phƣơng pháp Bootstrap của phần mềm MEGA4 sử dụng kết quả so sánh ClustalW trình tự các gen CP-RGSV của hai tỉnh Ninh Thuận, Bình Thuận với trình tự của một số trình tự tƣơng ứng đại diện cho các dòng RGSV khác nhau tại Việt Nam và trên thế giới (Hình 3.9). Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên cơ sở so sánh 02 trình tự nucleotit của gen CP- RGSV Nam Trung Bộ (Ninh Thuận, Bình Thuận) với các trình tự tƣơng ứng của ĐBSCL và thế giới công bố trên GenBank. Cây phát sinh chủng loại đƣợc xây dựng trên cơ sở so sánh 23 trình tự (Nam Trung Bộ (2), ĐBSCL(18) và thế giới (3)) gen CP-RGSV lấy từ GenBank. Thanh bar trình bày số thay thế nucleotide. Các số trên mỗi đốt của cây phát sinh chủng loại là giá trị bootstrap tính theo phần trăm (1000 lần lặp lại). Chỉ những giá trị bootstrap > 50% đƣợc chỉ ra trên hình. AG(GQ306203): An Giang, BL1(EU076531): Bạc Liêu1, BL2(EU976532): Bạc Liêu2, BT(FM882251): Bình Thuận, CT1(EU076533): Cần Thơ1, CT2(EU076534): Cần Thơ2, CN(AF290947): Trung Quốc, DT1(EU076535): Đồng Tháp1, DT2(EU076536): Đồng Tháp2, HG(GQ329709): Hậu Giang; JP(AB000403): Nhật Bản, JP(AB023779): Nhật Bản, LA(FN433644): Long An; LA(GQ329710): Long An; NT(FM882252): Ninh Thuận, ST1(EU076537): Sóc Trăng1, ST2(EU076538): Sóc Trăng2, TG1(EU076539): Tiền Giang1, TG2(EU076540): Tiền Giang2, TV1(EO076541): Trà Vinh1, TV2(EU076542): Trà Vinh2, VL1(EU076543): Vĩnh Long1, VL2(EU076544): Vĩnh Long2. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 Qua hình 3.9 thấy rằng cây phát sinh chủng loại đƣợc chia thành hai nhánh chính là: nhánh gồm các trình tự gen CP-RGSV của thế giới và nhánh gồm các trình tự gen CP-RGSV của Việt Nam. Nhánh gồm các trình tự của Việt Nam lại đƣợc chia thành hai nhánh nhỏ, trong đó hai trình tự gen phân lập tại hai tỉnh Nam Trung Bộ thuộc nhánh nhỏ thứ hai gồm các trình tự: VL1, VL2, BL2, TG2, DT1, TV2 (ĐBSCL) và NT, BT (Nam Trung Bộ). Nhƣ vậy, hai dòng RGSV phân lập từ các tỉnh Nam Trung Bộ có quan hệ gần gũi với các dòng RGSV phân lập từ ĐBSCL, đặc biệt là với tỉnh Vĩnh Long và có sự khác biệt nhỏ với nhóm của thế giới. Vì vậy, có thể giả thiết rằng các chủng virut RGSV phân lập đƣợc từ Ninh thuận và Bình Thuận có quan hệ về nguồn gốc với các trình tự của gen CP- RGSV phân lập từ ĐBSCL. Đồng thời, có thể thấy rằng các dòng virut phân lập tại Việt Nam (ĐBSCL và Nam Trung Bộ) đều có nguồn gốc nội địa, nhƣ vậy dịch bệnh VL&LXL tại các khu vực nghiên cứu của Việt Nam do virut nội địa gây ra chứ không phải do virut ngoại lai xâm nhập vào. Căn cứ vào hệ số tƣơng đồng và mối quan hệ giữa các trình tự của gen CP- RGSV (bảng 3.3 và hình 3.9) thấy rằng hai trình tự của Ninh Thuận và Bình Thuận giống nhất với trình tự VL2 của tỉnh Vĩnh Long (99,9%) và khác nhất với trình tự của Trung Quốc (CN- AF290947). Vì vậy chúng tôi lần lƣợt so sánh 2 trình tự trên với trình tự VL2 và trình tự của Trung Quốc nhằm phân tích mức độ đa dạng ở cấp độ nucleotit để đánh giá mức ý nghĩa của những sai khác ở trên. Từ quả kết quả phân tích bằng phần mềm DNAsp thấy hai trình tự của gen CP- RGSV là Bình Thuận và Vĩnh Long2 khác nhau 01 vị trí, tại cặp nucleotit thứ 93. Đồng thời, hai trình tự Ninh Thuận và Vĩnh Long2 cũng chỉ khác nhau tại vị trí cặp nucleotit thứ 585. Sự sai khác tại 01 vị trí giữa trình tự Bình Thuận và Long An2 không ảnh hƣởng tới thành phần và số lƣợng axit amin trong chuỗi polypeptit do 2 trình tự trên mã hóa. Kết quả này cũng tƣơng tự với 2 trình tự Ninh Thuận và Vĩnh Long2. Nhƣ vậy, một lần nữa khẳng định mối quan hệ về nguồn gốc giữa 2 dòng RGSV Bình Thuận và Ninh Thuận với các dòng thuộc khu vực ĐBSCL, đặc biệt là với dòng của tỉnh Vĩnh Long. Mặt khác, khi so sánh trình tự gen CP- RGSV của Bình Thuận và Trung Quốc khác nhau tại 20 vị trí. Các vị trí khác biệt không tập trung tại một vùng gen mà tại nhiều vị trí khác nhau trên cả đoạn gen. Khi so sánh trình tự gen CP- RGSV của Ninh Thuận và Trung Quốc cũng khác nhau tại 20 vị trí. Đồng thời các vị trí khác biệt cũng không tập trung tại 1 khu vực mà trải đều trên gen. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 Mặc dù số vị trí sai khác là rất lớn (20/978 = 2,05%), nhƣng cả trình tự của Bình Thuận và Ninh Thuận khi so sánh với trình tự của Trung Quốc trong 20 vị trí bị biến đổi chỉ 2 vị trí làm thay đổi axit amin trong chuỗi polypeptit của gen CP gồm các axit amin số 19 và 221. Nhƣ vậy, mức độ ảnh hƣởng từ sự sai khác trong gen đến sản phẩm protein là không nhiều. Tuy nhiên, vẫn có thể cho rằng sự sai khác giữa các trình tự của gen CP- RGSV là có ý nghĩa. Điều này cũng khẳng định rằng gen CP- RGSV có độ bảo thủ khá cao. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận 1> Đã hoàn thiện và tối ƣu phản ứng RT-PCR với các cặp mồi đƣợc thiết kế đặc hiệu để phát hiện virut RGSV với độ đặc hiệu cao. 2> Đã tách dòng, xác định trình tự các phân đoạn 1, 4 RGSV của mẫu lúa Bình Thuận và gen CP- RGSV từ mẫu lúa của hai tỉnh Ninh Thuận, Bình Thuận. Kích thƣớc của gen CP đã đƣợc xác định trình tự đầy đủ là 978 nucleotit, của các phân đoạn 1 và 4 lần lƣợt là 423 và 441 nucleotit. Mã số đăng ký trên GenBank của các trình tự thu đƣợc là: FM995215, FN179368, FM882251, FM882252. 3> Hệ số tƣơng đồng giữa các trình tự của gen CP- RGSV là rất cao (96,5%- 99,9%) cho thấy gen CP- RGSV có mức độ bảo thủ cao. Đặc biệt, hệ số tƣơng đồng giữa hai trình tự Ninh Thuận và Bình Thuận với các trình tự tƣơng ứng đem so sánh đạt từ 98,0- 99,9%. Trong đó, hai trình tự này giống nhất với trình tự VL2 (EU076544) của tỉnh Vĩnh Long (99,9%) và khác nhất với trình tự CN(AF290947) của Trung Quốc (98,0%). 4> So sánh trình tự gen CP- RGSV Bình Thuận và Ninh Thuận với trình tự tƣơng ứng của Trung Quốc thấy 20 điểm sai khác phân bố khá đều trên gen và dẫn đến 2 sự sai khác có ý nghĩa trong hai chuỗi polypeptit do gen này mã hóa. 2. Đề nghị 1> Tiếp tục phân lập các phân đoạn khác trong genome của RGSV và của các chủng virut khác gây bệnh VL&LXL (RRSV, RTSV, RTBV). 2> Nghiên cứu sự có mặt của các chủng virut trên trong rầy nâu nhằm tăng khả năng cảnh báo sự xuất hiện bệnh tại các tỉnh trên. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ 1. Nguyễn Ngọc Sơn, Hoàng Thị Thu Hằng, Đặng Thị Lan Anh, Nguyễn Nhƣ Cƣờng, Nguyễn Hữu Cƣờng, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình, Nguyễn Trung Nam (2008), Quan hệ di truyền giữa các chủng virut gây bệnh vàng lùn ở lúa tại các tỉnh Nam Trung bộ, Tạp chí Công nghệ sinh học, 6(3): 301-309. 2. Nguyễn Ngọc Sơn, Hoàng Thị Thu Hằng, Nguyễn Hữu Cƣờng, Hoàng Thị Nga, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình, Đặng Thị Lan Anh, Nguyễn Trung Nam, Nguyễn Nhƣ Cƣờng (2009), Kiểm tra sự có mặt của virut gây bệnh vàng lùn lúa (RGSV) trong rầy nâu tại các tỉnh Nam Trung Bộ bằng RT-PCR. Tạp chí Bảo vệ thực vật, 1: 23- 27. 3. Nguyen Trung Nam, Hoang Thi Thu Hang, Chu Hoang Ha, Nguyen Huu Cuong, Dang Thi Lan Anh, Nguyen Nhu Cuong, Nguyen Ngoc Son, Hoang Thi Nga, Hoang The Hung, Le Tran Binh (2009), Detection of rice ragged stunt virus (RRSV) in Vietnamese rice using RT-PCR and DNA sequencing. Proceeding of the Analytical Vietnam Conference 2009: 233- 240. 4. Nguyen, S.N. et al. (2008, 2009), Các trình tự DNA của virus RGSV đã đăng ký trên GenBank với mã số FM882251, FM882252, FM956076, FM958187, FM995215, FM994933, FM995502, FM995503, FM995504, FM995505, FN179368. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Bùi Bá Bổng (2006), Tổng kết hội nghị phòng chống rầy nâu, bệnh vàng lùn và lùn xoắn lá năm 2006. 2. Phạm Văn Dƣ (2007), Các giải pháp quản lý bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá ở Đồng bằng Sông Cửu Long. Các giải pháp kỹ thuật thích hợp cho vụ lúa Hè thu năm 2007 ở Nam bộ. Diễn đàn khuyến nông @ Công nghệ. 3. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng (2002), Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục. 4. Phan Trọng Hoàng, Nông Văn Hải, Lê Trần Bình, Chu Hoàng Hà (2005), “Sử dụng enzym XcmI để thiết kế vector pBT phục vụ tách dòng và đọc trình tự gen”, Tạp chí Công nghệ sinh học, 3: 459-463. 5. Vũ Triệu Mân (2007), Một số ý kiến về việc phòng chống bệnh lùn cỏ, vàng lùn và lùn xoắn lá ở miền Nam Việt Nam. Các giải pháp kỹ thuật thích hợp cho vụ Hè Thu năm 2007 ở Nam Bộ. Diễn đàn khuyến nông @ Công nghệ. 6. Nguyễn Thơ (2007), Một số suy nghĩ về phòng trừ bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá trên lúa. Các giải pháp kỹ thuật thích hợp cho vụ Hè Thu năm 2007 ở Nam Bộ. Diễn đàn khuyến nông @ Công nghệ. 7. Nguyễn Trung Nam, Nguyễn Minh Hùng, Chu Hoàng Hà, Hoàng Thị Thu Hằng , Lê Trần Bình (2007), “Đánh giá đa dạng di truyền các dòng virus gây bệnh lùn lúa cỏ tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 5: 479-484. 8. Hà Minh Trung, Phạm Văn Doãn, Đặng Vũ Thị Thanh, Trần Thị Thuần, Ngô Vĩnh Viễn (1980), Kết quả nghiên cứu bệnh lúa lùn xoắn lá ở các tỉnh phía Nam 1978 – 1979/ Kết quả nghiên cứu khoa học kỹ thuật (1969 - 1979), Nhà xuất bản Nông nghiệp. 9. Ngô Vĩnh Viễn (1994), Bệnh vàng lá lúa do virut và Mycoplasma gây ra và biện pháp phòng trừ ở Việt Nam, Luận án Phó tiến sĩ khoa học nông nghiệp, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, Hà Nội. 10. Ngô Vĩnh Viễn (2007), Kết quả nghiên cứu và xây dựng mô hình phòng chống rầy nâu, bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá tại Long An và Bến Tre, vụ Đông Xuân 2006- 2007. Hội nghị toàn quốc tổng kết công tác Bảo vệ thực vật năm 2006, kế hoạch công tác năm 2007. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 11. Ban chỉ đạo phòng chống rầy nâu, bệnh VL&LXL các tỉnh phía Nam (2008), Báo cáo tình hình dịch rầy nâu, bệnh VL&LXL ở các tỉnh phía Nam. 12. Ban chỉ đạo phòng chống rầy nâu, bệnh VL&LXL các tỉnh phía Nam (2009), Báo cáo tình hình dịch rầy nâu, bệnh VL&LXL ở các tỉnh phía Nam. Tài liệu tiếng nƣớc ngoài 13. Azzam O., Arboleda M., Umadhay K.M.L., Cruz F.S., Mackenzie A., McNally K.L. (2000), “Genetic composition and complexity of virus populations at tungro-endemic and outbreak rice sites”, Arch Virol, 145: 2643-2657. 14. Azzam O., Imbe T., Ikeda R., Nath P.D., Coloquio E. (2001), “Inheritance of resistance to rice tungro spherical virus in a near-isogenic line derived from Utri Merah and in rice cultivar TKM6”, Euphytica, 122: 91-97. (RTSV) 15. Bao Y., and Hull R. (1992), “Characterization of the discontinuities in rice tungro bacilliform virus DNA”. J Gen Virol, 73:1297-1301. 16. Cabauatan P.Q, Hibino H., Lapis D.B. , Omura T., and Tsuchizaki T. (1985), “Transmission of rice tungro bacilliform and spherical viruses by Nephotettix virescens Distant. Philippine”, Phytopathology, 21:103-109. 17. Cabauatan P.Q., Cabunagan R.C., and Koganezawa H. (1995), “Biological variants of rice tungro viruses in the Philippines”, Phytopathology, 85:77-81. 18. Chaogang S., Jianhua W., Guoying Z., Gang S., Baozhen P., Juanli L., Dendi J., Shenxiang C., Upadhyaya N.M., Waterhouse P., and Zuxun G. (2003), “Ectopic expression of the spike protein of Rice Ragged Stunt Oryzavirus in transgenic rice plants inhibits transmission of the virus to insects”, Mol Breeding, 7:295- 301. 19. Chen C., and Chiu R. (1982), “Three symptomatological types of rice virus diseases related to grassy stunt in Taiwan”, Plant Dis, 66 : 5-18. 20. Chen C., Chiu R., Wang E. (1979) “Rice ragged stunt: a virus disease new to Taiwan”, Plant Prot Bull, (Taiwan) 21:447 (Abstr.). 21. Chomchan P., Li S.F., Shirako Y. (2003), “Rice Grassy Stunt Tenuivirus Nonstructural Protein p5 Interacts with Itself To Form Oligomeric Complexes In Vitro and In Vivo”, J Virol, 77: 769–775. 22. Dyck V.A., Thomas B. (1979), The brown planthopper problem. In: Brown Planthopper: Threat to Rice Production in Asia. IRRI, Philippines. pp. 3-17. 23. Druka A., Burns T., Zhang S., Hull R. (1996), “Immunological characterization of rice tungro spherical virus coat proteins and differentiation of isolates from the Philippines and India”, J Gen Virol, 77:1975-1983. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 24. Herdt R.W. (1991), Rice Biotechnology, Eds Khush & Toenniessen, pp. 19-54, CABI, Wallingford, UK. 25. Hibino H., Cabauatan P., Omura T., and Tsuchizaki T. (1985b), “Rice grassy stunt virus strain causing tungro like symptoms in the Philippines”, Plant Dis, 69:538-541. 26. Hibino H. (1996), “Biology and epidemiology of rice viruses”, Ann Rev Phytopathol, 34:249-274. 27. Hull R. (1996), “Molecular biology of rice tungro viruses”, Ann Rev Phytopathol, 34:275-297. 28. Iwasaki M., Nakano M., and Shinkai A. (1982), “Variation in the transmission rates of rice grassy stunt virus in various colonies of brown planthopper”, Proc Assoc Plant Prot Kyushu, 28:1-3. 29. Iwasaki M., Nakano M., and Shinkai A. (1985b), “Detection of rice grassy stunt virus in planthopper vectors and rice plants by ELISA”, Ann Phytopathol Soc Jpn. 51:450-458. 30. Lin P.K.T., Brown D.M. (1992), “Synthesis of oligodeoxyribonucleotides containing degenerate bases and their use as primers in the polymerase chain reaction”, Nucleic Acids Res, 19:5149-5152. 31. Ling K.C., Aguiero V.M., and Lee S.H. (1970), “A mass screening method for testing resistance to grassy stunt disease of rice”. Plant Dis Rep, 56:565–569. 32. Ling K.C. (1972), Rice Virus Diseases. International Rice Research Institute, Los Baños Philippines. 33. Mariappan V., Hibino H., and Shanmugam N. (1984), “A new rice virus disease in India”. Int Rice Res Newsl, 9:9-10. 34. Marmey P., Bothner B., Jacquot E., Kochko A.d., Ong C.A., Yot P., Siuzdak G., Beachy R.N., and Fauquet C.M. (1999), “Rice Tungro Bacilliform Virus Open Reading Frame 3 Encodes a Single 37-kDa Coat Protein”, Virolog, 253:319-326. 35. Mayo M.A., Miranda J.R.D., Falk B.W., Goldbach R., Haenni A.L., Toriyama S. (2000), Genus Tenuivirus. In: van Regenmortel M.H.V., Fauquet C.M., Bishop D.H.L., Carstens E.B., Estes M.K., Lemon S.M., Maniloff J., Mayo M.A., McGeoch D.J., Pringle C.R., Wickner R.B. (eds) Virus Taxonomy. Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, Academic Press, San Diego, pp 622–627 36. Milne R., Ling K. (1982), “Rice ragged stunt virus”. CMI/AAB Desc Pl Viruses, 248:5p. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 37. Miranda J.G., Aliyari R., Shirako Y. (2001), “Nucleotide sequence of a Dianthovirus RNA1-like RNA found in grassy stunt- diseased rice plants”, Arch Virol, 146: 225–238. 38. Miranda J.R.D., Wu R., Espinoza A.M. (2001), “Phylogenetic Placement of a Novel Tenuivirus from the Grass Urochloa plantaginea”, Virus Genes, 22: 329– 333. 39. Montpetit M.L., Cassol S., Salas T., and O'Shaughnessy M.V. (1992), “OLIGOSCAN: A computer program to assist in the design of PCR primers homologous to multiple DNA sequences”, J Virol Methods, 36: 119-128. 40. Palmer L.T., Soepriaman Y., Sunendar K., Kartaatmadja S. (1978), “Rice yield losses due to brown planthopper and rice grassy stunt disease in Java and Bali”, Plant Dis Rep, 62: 962-965. 41. Pham V.D., Cabunagan R.C., Choi I.R. (2005), “Rice Yellowing Syndrone in Mekong River Delta”, Omonrice, 13: 135-138. 42. Rivera C.T., Ou S.H.(1965), “Leafhopper transmission of tungro disease of rice”. Plant Dis Rep, 49:127- 131. 43. Rivera C.T., Ou S.H., and Ida T. (1966), “Grassy stunt disease of rice and its transmission by the planthopper Nilaparvata lugens Stal”, Plant Dis Rep, 50:453- 456. 44. Saha P., Dasgupta I., Das S. (2006), “A novel approach for developing resistance in rice against phloem limited viruses by antagonizing the phloem feeding hemipteran vectors”, Plant Mol Biol, 62:735–752. 45. Sambrook J., Russell D. (2001), Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 46. Shen P., Kaniewska M., Smith C., Beachy R.N. (1993) “Nucleotide sequence and genomic organization of rice tungro spherical virus”, Virology, 193: 621- 630. 47. Shikata E., Senboku T., and Ishimizu T. (1980), “The Causal Agent of Rice Grassy Stunt Disease”, Proc Japan Acad, Ser B 56. 48. Shikata E., Senboku T., Tiongco E.R., and Ling K.C. (1979), ”Rice ragged stunt virus, a new member plant reovirus group”, Ann Phytopath soc Jpn, 45: 436-443. 49. Thole V., Hull R. (1996), “Rice tungro spherical virus: nucleotide sequence of the 3' genomic half and studies on the two small 3' open reading frames”, Virus Genes, 13:239-246. 50. Tinjuangjun P., Loc N.T., Gatehouse A.M.R., Gatehous J.A., Christou P. (2000), “Enhanced insect resistance in Thai rice varieties generated by particlebombardment”, Mol Breeding, 6: 391-399. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 51. Toriyama S., Kimishima T., Takahashi M., Shimizu T., Minaka N., Akutsu K. (1998), “The complete nucleotide sequence of the rice grassy stunt virus genome and genomic comparisons with viruses of the genus Tenuivirus”, J Gen Virol, 79: 2051–2058. 52. Zhang S., Davies J.W., Hull R. (1997), “Sequences of the Three Coat Protein Genes of a Malaysian Isolate of Rice Tungro Spherical Virus Reveal a Close Relationship to the Philippine Isolate”, Virus Genes, 15, 61-64. 53. Zhang S., Jones M.C., Barker P., Davies J.W., Hull R. (1993), “Molecular cloning and sequencing of coat protein encoding cDNA of rice tungro spherical virus - a plant picornavirus”, Virus Genes, 7: 121-132. Các trang web: 54. Nguyễn Văn Đức Tiến (2007), Chi cục bảo bệ thực vật thành phố Hồ Chí Minh. Những bệnh nguy hiểm có liên quan đến rầy gây hại trên lúa 55. Trung tâm khuyến nông quốc gia (2006) Sổ tay hướng dẫn phòng trừ rầy nâu truyền bệnh VL&LXL hại lúa. 08&id=1080&langid=0. 56. Cabunagan R.C. (2006), “Yellowing Syndrome” in Mekong Delta, Vietnam: A trip report by Rogelio Cabunagan, PBGB, IRRI August 27- September 2, 2006, Omon, Cantho, www.clrri.org/benhvanglun/tech/benhvanglun.pdf. 57. RGSV description: 58. RRSV description: 59. 60. 61. 62. 63. 64. 65. 66. 67. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết quả so sánh bằng chƣơng trình Blast (NCBI) của phân đoạn 1 và 4 của RGSV 1. Phân đoạn 1 (RG1) > emb|FM995215.1| Rice grassy stunt virus partial RNA polymerase, segment RNA1, isolate Binhthuan1 from brown planthopper, genomic RNA Length=423 Score = 760 bits (411), Expect = 0.0 Identities = 419/423 (99%), Gaps = 0/423 (0%) Strand=Plus/Plus RG1 1 CAAACATCCTCCCAAGCATTTCACAGTCTCTGTTACCATATGCCATAGTGTAGTGAGAAT 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GB 1 CAAACATCCTCCCAAGCATTTCACAGTCTCTGTTACCATATGCCATAGTGTAGTGAGAAT 60 RG1 61 TTCCCACTCGGTGTTCTCTTGACCATTCCTTCAATGATTGTATAGTATCTGATAGGTGCA 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GB 61 TTCCCACTCGGTGTTCTCTTGACCATTCCTTCAATGATTGTATAGTATCTGATAGGTGCA 120 RG1 121 TTGCACTAGATAGACTAACACTTTTGATGTAAGACTCCATATTTTGATCAGAGTTTACTT 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GB 121 TTGCACTAGATAGACTAACACTTTTGATGTAAGACTCCATATTTTGATCAGAGTTTACTT 180 RG1 181 CAATCTGAACTGCTACATCATGTAGATAACCTCTCCATACACCTGGTCCGAAGTACTTCT 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GB 181 CAATCTGAACTGCTACATCATGTAGATAACCTCTCCATACACCTGGTCCGAAGTACTTCT 240 RG1 241 TTTCCTCCCTGTTATATGATTGCTTTTGGACGTAGCCACCCAGTAGACCTAGATTACCAA 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GB 241 TTTCCTCCCTGTTATATGATTGCTTTTGGACGTAGCCACCCAGTAGACCTAGATTACCAA 300 RG1 301 TTCTTATCTTCTCCATAATGTCTCTCCTACAGTATTTAGCTTCATCCCTCAGTTTCATTA 360 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| || GB 301 TTCTTATCTTCTCCATAATGTCTCTCCTACAGTATTTAGCTTCATCCCTCAGTTTCAATA 360 RG1 361 GGTCATAACTACTCTTAACAATCCTGTGACCAATCATTGTTAACCAGTTCCTCGTTGGAT 420 ||||||||||||||||||||||| | |||||||||||||| ||||||||||||||||||| GB 361 GGTCATAACTACTCTTAACAATCTTATGACCAATCATTGTCAACCAGTTCCTCGTTGGAT 420 RG1 421 CAT 423 ||| GB 421 CAT 423 Hình 1: Kết quả so sánh trình tự nucleotit giữa trình tự RG1- Bình Thuận với trình tự tƣơng ứng trên GenBank. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 2. Phân đoạn 4 (RG4) > emb|FM995504.1| Rice grassy stunt virus segment S4, partial putative p4V protein, isolate Khanhhoa from brown planthopper, genomic RNA Length=441 Score = 804 bits (435), Expect = 0.0 Identities = 439/441 (99%), Gaps = 0/441 (0%) Strand=Plus/Plus RG4 1 AGCTGCCACTCAAGGTGTTTGCCAGTATGGCAAACTTATTCTTCAGTACTCCACAGGAGC 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GB 1 AGCTGCCACTCAAGGTGTTTGCCAGTATGGCAAACTTATTCTTCAGTACTCCACAGGAGC 60 RG4 61 TGAGGATTTTAAATTATATAATAACTAGGAATACTGTACAATTTCACTGGACGATTCCTA 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GB 61 TGAGGATTTTAAATTATATAATAACTAGGAATACTGTACAATTTCACTGGACGATTCCTA 120 RG4 121 AAAATTCTGATAACCCTATTATTTACACAACACTCTTGCAGAACACTAAAGATTTCTACT 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| | GB 121 AAAATTCTGATAACCCTATTATTTACACAACACTCTTGCAGAACACTAAAGATTTCTATT 180 RG4 181 TCACAGAGTTGAGAAGTAAAGATTTAAACACTGAAATGCTGGGCTTATGCATCAAGTTAA 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GB 181 TCACAGAGTTGAGAAGTAAAGATTTAAACACTGAAATGCTGGGCTTATGCATCAAGTTAA 240 RG4 241 TAATTAAAGTAGTGATCAAAATAAACCAAGGAATCAATATACCATTAGAAGATGTGTTCA 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GB 241 TAATTAAAGTAGTGATCAAAATAAACCAAGGAATCAATATACCATTAGAAGATGTGTTCA 300 RG4 301 AGAAAATTTATGATGATAGAGGTAGAAACATTTATTTATATACAAATTTTAGTGATAAAG 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GB 301 AGAAAATTTATGATGATAGAGGTAGAAACATTTATTTATATACAAATTTTAGTGATAAAG 360 RG4 361 ACTTAGAAAGAAAGGTTAACCAATATGTACATTGCGCATCTCTTAAATTACCTATCGATT 420 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||| GB 361 ACTTAGAAAGAAAGGTTAACCAATATGTACATTGCGCATCTCTTAAACTACCTATCGATT 420 RG4 421 TCGAGAACCACCCACTAGCTC 441 ||||||||||||||||||||| GB 421 TCGAGAACCACCCACTAGCTC 441 Hình 2: Kết quả so sánh trình tự nucleotit giữa trình tự RG