Luận văn So sánh tác dụng thủy phân đậu hũ bằng phức hệ enzyme của bacillus subtilis sp. và bacillus natto sp. để chế biến thức uống chức năng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH -------    ------- TRƯƠNG THỊ NHƯ HIẾU SO SÁNH TÁC DỤNG THỦY PHÂN ĐẬU HŨ BẰNG PHỨC HỆ ENZYME CỦA Bacillus subtilis sp. và Bacillus natto sp. ĐỂ CHẾ BIẾN THỨC UỐNG CHỨC NĂNG LUẬN VĂN THẠC SĨ VI SINH VẬT HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2010 LỜI CẢM ƠN Có được thành quả như ngày hôm nay, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến:  Cán bộ hướng dẫn: TS. Lê Chiến Phương đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức chuyên môn cũng như những kinh nghiệm sống quý báu trong suốt quá trình thực hiện luận văn.  Ban giám hiệu trường ĐHSP TP HCM, quý thầy cô bộ môn Vi sinh vật đã giảng dạy, hướng dẫn để tôi có được nền kiến thức như ngày hôm nay.  Các anh chị em phòng thí nghiệm Biến đổi sinh học - Viện Sinh học Nhiệt đới TP HCM đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn.  Các bạn học viên cao học niên khóa 2007- 2010 ngành Vi sinh vật đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến cho tôi trong thời gian thực hiện luận văn.  Cuối cùng tôi xin cảm ơn ba mẹ và những người thân yêu đã động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn! TP.HCM, tháng 08 năm 2010 Trương Thị Như Hiếu LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan những số liệu trong luận văn này là trung thực, kết quả thí nghiệm được lặp lại tối thiểu 3 lần và chưa ai công bố. Tác giả luận văn Trương Thị Như Hiếu DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT BsTC Bacillus subtilis sp. phân lập từ chao Bn Bacillus natto phân lập từ sản phẩm nattospes CP Môi trường cá peptone ĐC Đối chứng ĐVHT Đơn vị hoạt tính MT Môi trường NB Nutrient Broth NA Nutrent agar PGA Potato glucose agar OD Trị số mật độ quang TCA Trichloroacetic TKm Lactobacillus sp. phân lập từ mẻ cơm lên men PTHQ Phương trình hồi quy MỞ ĐẦU 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Đậu nành là một trong những loại cây trồng phổ biến trên thế giới, nó được xem là nguồn dinh dưỡng tuyệt hảo của nhân loại bởi nó chứa đầy đủ các dưỡng chất cần thiết như protein, lipid, cacbohydrat và các hoạt chất hữu cơ khác. Đặc biệt, nó được xem là dạng thực phẩm đứng đầu về hàm lượng protein có nguồn gốc thực vật. Không chỉ vậy, trong nhiều nghiên cứu đã chứng minh đậu nành còn có tác dụng giảm chlolesterol trong máu, giúp ngăn ngừa các bệnh về tim mạch, ngăn ngừa bệnh ung thư, bệnh tiểu đường và các rối loạn tiền mãn kinh phụ nữ …[23] Tháng 10 năm 1999, cơ quan kiểm tra dược phẩm và thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã đưa ra kết luận: “Sử dụng 25 gam protein đậu nành (có trong 65-70 gam đậu nành) trong khẩu phần ăn hàng ngày có thể làm giảm nguy cơ mắc các bệnh lý tim mạch”. [25] Tuy có giá trị dinh dưỡng và chức năng cao nhưng trên thực tế ở nước ta hiện nay đậu nành lại xếp vào nhóm có sức cạnh tranh yếu trong nền kinh tế quốc dân. [24] Một trong những lý do chính là hiện nay các sản phẩm từ đậu nành phần lớn là các sản phẩm truyền thống, thường mặn (tương chứa 18-20% NaCl, chao có 7-9% NaCl) không dùng được một lượng lớn trong một khẩu phần; ít có sản phẩm mới có giá trị công nghệ sinh học và thực phẩm chức năng (dùng vi sinh vật có vai trò probiotic) để chế biến thực phẩm. [23] Trong thời gian gần đây, trên thị trường trong nước có xuất hiện một số sản phẩm như Biosubtil, Bioascimil, Anti-bio, …dạng bột, đóng gói nhỏ, mỗi gói từ 1-3 gam, có chứa khoảng 108- 109 vi khuẩn Bacillus subtilis và vi khuẩn lactic, có tác dụng hỗ trợ tiêu hóa. Từ năm 2007 có sản phẩm Nattospes chứa enzyme nattokinase từ vi khuẩn Bacillus natto, theo quảng cáo là enzyme duy nhất có khả năng làm tan sợi huyết (fibrin) ngăn cản sự tạo huyết khối gây chứng tai biến mạch máu não, nhồi máu cơ tim. Ở nước ta có sản phẩm chao, theo TS. Lê Chiến Phương [20] có chứa vi khuẩn Bacillus subtilis có tác dụng tượng tự và có thể so sánh được với Bacillus natto. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài “So sánh tác dụng thủy phân đậu hũ bằng phức hệ enzyme của Bacillus subtilis sp. và Bacillus natto sp. để chế biến thức uống chức năng”. 2. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU - Xác định được chủng vi khuẩn nào có phức hệ enzyme thủy phân đậu hũ tốt hơn để chế biến thức uống chức năng có tác dụng hỗ trợ tiêu hóa và có vai trò probiotic. - Xây dựng được quy trình sản xuất thức uống chức năng từ đậu hũ. - Đáp ứng xu hướng giảm tiêu thụ chất đạm và chất béo động vật thay bằng đậu nành có nguồn gốc thực vật. - Góp phần đưa đậu nành ra khỏi nhóm có cạnh tranh yếu trong nền kinh tế quốc dân. 3. NÉT MỚI CỦA ĐỀ TÀI - Sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis sp. (sau khi so sánh với Bacillus natto sp.) thủy phân đậu hũ để chế biến thực phẩm chức năng, là tác nhân probiotic thứ nhất. - Dùng vi khuẩn lactic (là tác nhân probiotic thứ 2) ức chế hoạt động vi khuẩn Bacillus vừa đủ để bảo quản thực phẩm mà không dùng hóa chất. - Bước đầu tạo sản phẩm mới: thức uống chức năng từ đậu hũ thủy phân lên men lactic. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐẬU NÀNH 1.1.1. Lịch sử phát triển Đậu nành được xem là một trong những cây trồng cổ nhất của nhân loại. Nhiều nghiên cứu chứng minh rằng đậu nành có nguồn gốc từ Trung Quốc. Nó được trồng trên nhiều loại đất khác nhau và có phạm vi khí hậu rộng khắp, trải dài từ vùng nhiệt đới Brazil đến hòn đảo Hokkaido đầy tuyết nằm ở phía Bắc Nhật Bản. Với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, con người đã tìm thấy vai trò của đậu nành trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt trong lĩnh vực thực phẩm. Vì vậy, đậu nành ngày càng lan rộng khắp thế giới. [36] 1.1.2. Cây đậu nành Cây đậu nành có tên khoa học là Glycine max (L) Merrill, thuộc: Hình 1.1. Cây đậu nành Đậu nành là cây bụi nhỏ, cao trung bình dưới 1m, có lông toàn thân, có 3 chét hình bầu dục, bông trắng hoặc tím, trái có nhiều lông vàng có từ 3-5 hạt. Cây đậu nành là cây ngắn ngày, phát triển tốt ở vùng nhiệt đới, ưa sáng, ưa nhiệt, chịu hạn, trồng vào cuối mùa xuân, đầu mùa hè. [6] Là cây thực phẩm có hiệu quả kinh tế, dễ trồng, sản phẩm từ nó rất đa dạng. Ngoài ra, cây đậu tương còn có tác dụng cải tạo đất, tăng năng suất các cây trồng khác nhờ hoạt động cố định N2 của Rhizobium cộng sinh trên rễ cây họ đậu. 1.1.3. Hạt đậu nành 1.1.3.1. Hình thái, cấu trúc [10] * Hình dạng: hạt đậu nành có nhiều hình dạng khác nhau như hình tròn, bầu dục, tròn dài, tròn dẹt, chùy dài. Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp Magnoliopsida Bộ Fabales Họ Fabaceae Phân họ: Faboideae Chi Glycine Loài G. max * Màu sắc: vàng, xanh, nâu hoặc đen và các màu trung gian nhưng màu vàng là tốt nhất nên được trồng và sử dụng nhiều. * Cấu trúc hạt: gồm 3 phần chính là vỏ hạt, phôi và tử diệp. - Vỏ: là lớp ngoài cùng của hạt đậu nành, có nhiều loại màu sắc và là yếu tố cho việc xác định giống đậu nành, có tác dụng bảo vệ phôi mầm. - Phôi: là rễ mầm, là phần sinh trưởng của hạt khi nảy mầm. - Tử diệp: gồm hai lá mầm tích trữ dinh dưỡng cho hạt. Bảng 1.1. Thành phần các chất có trong hạt đậu nành (% khối lượng) [15] 1.1.3.2. Thành phần hóa học So với các nguyên liệu thực phẩm chính hiện nay, đậu nành thực sự giàu dinh dưỡng, vừa có nguồn protein cao nhất trong các loại đậu vừa là dược liệu quý. Đậu nành có hàm lượng dinh dưỡng thay đổi rộng phụ thuộc vào giống và điều kiện trồng trọt nhưng nhìn chung chúng chứa 35-40% protein, 15-25% chất béo, 15-30% carbohydrate; các muối khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; các vitamin A, B1, B2, D, E, F; các enzyme, sáp, nhựa, cellulose và khoảng 5% tro. [29] Theo số liệu phân tích của công ty Ajinomoto, Thái Lan 1994, hàm lượng dinh dưỡng của hạt đậu nành Việt Nam như bảng 1.2. Bảng 1.2. Hàm lượng dinh dưỡng của hạt đậu nành Việt Nam [20] Chỉ tiêu Đơn vị Hạt đậu nành ở Đồng Nai Hạt đậu nành ở An Giang Khô đậu nành ép công nghiệp Khô đậu nành ép thủ công Protein thô Lipid thô Acid linoleic Lysin Methionin % % % % % 35,56 17,10 8,00 2,05 0,54 38,06 18,00 8,45 0,39 0,59 47,81 1,50 0,60 2,66 0,61 42,94 3,00 1,40 2,72 0,57 Thành phần % khối lượng toàn hạt Protein (%) Lipid (%) Carbohydrate (%) Tro (%) Hạt đậu nành Tử diệp Vỏ hạt Phôi 100 90 8,0 2,0 40,0 43,0 8,8 41,1 20,0 23,0 1,0 11,0 35,0 29,0 86,0 43,0 4,9 5,0 4,3 4,4 Systine Treonin Arginin Phenilalanin Valin Leucin Isoleucin Serin % % % % % % % % 0,61 1,35 2,11 1,49 1,62 2,68 1,51 1,73 0,72 1,53 2,62 1,76 1,74 3,03 1,67 2,05 0,72 1,69 3,03 1,83 1,85 3,39 1,65 2,34 0,75 1,67 2,85 1,95 1,84 3,32 1,77 2,27 Isoflavones trong đậu nành dao động từ 4.39 mg/g đến 15.58 mg/g, có khả năng phòng chống nhiều loại bệnh ung thư và bệnh tim mạch. Ngoài ra, đậu nành cũng rất giàu chất khoáng và nhiều chất xơ. Bảng 1.3. Thành phần khoáng trong đậu nành Thành phần Tỷ lệ (%) Calci 0.16 – 0.47 Phospho 0.41 – 0.82 Mangan 0.22 – 0.24 Kẽm 0.37 g/kg Sắt 90 – 150 mg/kg Bảng 1.4. Thành phần vitamin của đậu nành Thành phần Tỷ lệ (%) Thành phần Tỷ lệ (%) Thiamin 11 – 17.5 % Inositoe 2300 mg% Riboflavin 3.4 – 3.6 % Vitamin A 0.18 – 2.43 % Niacin 21.4 – 23 mg/g Vitamin E 1.4 mg% Pyridoxin 7.1 – 12 mg/g Vitamin K 1.9 mg% Biotin 0.8 mg/g Vitamin B1 0.54 mg% Pantothenic acid 13 – 21.5 mg/g Vitamin B2 0.29 mg% Folic acid 1.9 mg/g Vitamin PP 2.3 mg% Enzyme quan trọng của đậu nành là lipoxygenase, được biết đến là lipoxydase xúc tác phản ứng oxy hóa acid béo không bão hòa bởi O2, gây mùi đậu nành. Enzyme urease có nhiều ở đậu nành sống, phân hủy ure thành amoniac, là một hợp chất độc với cơ thể người do đó không nên ăn đậu nành sống. [15] 1.1.4. Công dụng của đậu nành [37] Đậu nành có chứa rất nhiều protein, 8 loại acid amin thiết yếu và là nguồn cung cấp calci, chất xơ, sắt và vitamin nhóm B. Các hợp chất isoflavon và hóa thảo (phytochemicals) khác trong đậu nành có khả năng phòng ngừa và trị liệu một số bệnh như: đau tim, tai biến mạch máu não, ung thư vú, ung thư kết tràng… (Theo Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ, Viện Đại học Havard, Viện Đại học Alabama. Minnesota, Iowa và Helsinki, Phần Lan). Những hóa thảo đậu nành gồm: - Protease inhibitors: ngăn ngừa sự tác động của một số gene di truyền gây nên chứng ung thư, bảo vệ tế bào cơ thể khỏi tác hại của môi trường sống. - Phytates: ngăn cản tiến trình gây bệnh ung thư kết tràng và ung thư vú, có khả năng tiêu diệt chất làm tế bào bị ung thư và phục hồi những tế bào bị hư hại. - Phytosterols: ngừa các bệnh tim mạch bằng cách kiểm soát lượng cholesterol máu, giảm sự phát triển các bướu ung thư kết tràng và chống ung thư da. - Saponins: hoạt động như chất chống oxy hóa bảo vệ tế bào cơ thể, trực tiếp ngăn cản sự phát triển ung thư kết tràng và làm giảm lượng cholesterol trong máu. - Phenolic acid: là một hóa thảo chống oxy hóa và phòng ngừa các DNA bị tế bào ung thư tấn công. - Lecithin: là một hóa thảo làm tăng trí nhớ bằng cách nuôi dưỡng tốt các tế bào thần kinh, làm chắc các tuyến, tái tạo các mô tế bào cơ thể, cải thiện hệ thống tuần hoàn, bổ xương và tăng cường sức đề kháng. - Omega-3 fatty acid: là chất béo không bão hòa có khả năng làm giảm lượng cholesterol xấu đồng thời làm tăng lượng cholesterol tốt trong máu. - Isoflavones (phytoestrogens): là một hóa thảo hoạt động giống estrogen, có khả năng chống lại các tác nhân gây nên chứng ung thư liên hệ đến hormon. 1.1.5. Một số sản phẩm từ đậu nành trên thế giới 1.1.5.1. Những sản phẩm đậu nành ở phương Tây Hình 1.2. Một số sản phẩm đậu nành ở phương tây Những sản phẩm này, được phát triển tại Tây phương trong nhiều thập niên qua bởi những kỹ thuật cao cấp bao gồm: Defatted soy flour and grits chứa từ 50 đến 52 % protein, được tách dầu trong quá trình xay nghiền hạt đậu thành bột, nhiều xơ. Soy protein concentratres chứa khoảng 70 % protein, thường được dùng để làm giả thịt bằm, thức ăn sáng và thức ăn cho trẻ sơ sinh. Soy protein isolates có chứa từ 90 đến 95% protein, khoảng 19% methionine bị mất trong tiến trình biến chế. Textured soy proteins chứa khoảng 52% protein, được tạo sợi dưới áp suất và nhiệt độ cao từ sản phẩm defatted soy flour, sau đó thêm màu và gia vị để giống như mùi vị thực phẩm có nguồn gốc thịt. Soy flour là loại protein đậu nành đơn giản nhất, nó được xay, sàng lọc và không có chất tinh bột nên được dùng như là một loại thực phẩm ăn kiêng. Dầu đậu nành không có protein nhưng rất giàu chất béo không bão hòa và linoleic acid, lecithin có trong loại dầu đậu nành chưa lọc rất tốt cho não. Thực phẩm đậu nành ăn nhanh (Fast food) Số người ăn chay bằng thực phẩm đậu nành càng ngày càng gia tăng tại Hoa Kỳ nên các nhà chế tạo thực phẩm đã biến chế thực phẩm đậu nành thành những loại thức ăn nhanh, tiện nghi và bổ dưỡng như Vons, Lucky, Hughs v.v… 1.1.5.2. Những sản phẩm đậu nành ở phương Ðông Những sự hiểu biết về đậu nành thực sự bắt đầu ở Ðông phương và đã trở thành một phần của nền văn hóa Châu Á. Họ đã chế biến thành những thức ăn như là một nghệ thuật của gia đình và từng địa phương. Những thực phẩm này bao gồm đậu hũ, sữa, nước tương, mì căn, tàu hũ ky, tempeh, miso, natto..v..v.. * Tempeh là bánh làm từ đậu nành và bột gạo lên men, nổi tiếng tại Indonesia, chứa 9% protein đậu nành, nhiều chất xơ và ít chất béo hơn đậu hũ và sữa đậu nành. Hình 1.3. Sản phẩm tempeh * Miso là hỗn hợp lên men gồm đậu nành, bột gạo, muối và nước, rất phổ thông tại Nhật Bản và Trung Hoa. Có sáu loại miso khác nhau nhưng mỗi thứ đều có chứa khoảng 13% protein, 13% muối, bảo quản trong tủ lạnh. Hình 1.4. Các loại miso * Nước tương (soy sauce) rất phổ thông ở Châu Á. Làm từ hỗn hợp đậu nành, gạo nếp, muối, nấm mốc và nước; ủ từ 3 đến 12 tháng tùy theo loại. Ở Việt nam, có nhiều loại tương như tương Tàu, tàu vị yểu, tương Bần Hưng Yên, tương Cự Ðà hay tương Nam Ðàn. Tương Việt Nam không khử trùng theo phương pháp Pasteur. Hình 1.5. Sản phẩm tương * Chao (soya cheese) là sản phẩm được lên men từ đậu phụ nhờ các loài nấm mốc: Actinormucor elegans, M.hiemalis, M.sivticus, M.subtilis thủy phân đậu hũ thành các chất dinh dưỡng đơn giản, dễ hấp thu. [15] Hình 1.6. Sản phẩm chao * Natto là một loại thực phẩm lên men truyền thống của người Nhật Bản, có hai loại: natto sợi (sử dụng vi khuẩn để lên men) và natto muối (sử dụng nấm mốc để lên men). Đậu nành luộc chín ủ với Bacillus natto ở 40oC từ 14 – 18 giờ thành những hạt đậu có màu nâu, độ nhớt cao và có mùi nồng. Theo kinh nghiệm của nhà sản xuất, độ nhớt càng cao thì chất lượng natto càng tốt và vị càng ngọt. [15] Hình 1.7. Hình sản phẩm natto * Đậu hũ và thành phần dinh dưỡng [3] Ðậu hũ rất phổ thông ở các nước Châu Á. Được làm từ đậu nành, dễ ăn, dễ chế biến và còn được xem như dược phẩm, có tác dụng ngăn ngừa nhiều bệnh tật. Có ba loại là loại loại cứng (firm tofu), loại mềm (soft tofu) và loại đậu hũ lụa (silken tofu). Hình 1.8. Sản phẩm đậu hũ Bảng 1.5. Thành phần dinh dưỡng đậu hũ Thành phần dinh dưỡng Đậu hũ cứng Đậu hũ mềm Đậu hũ lụa Calories 120 86 72 Protein (g) 13 9 9,6 Chất béo (g) 6 5 2,4 Chất béo bão hòa (g) 1 1 0 Carbohydrates (g) 3 2 3,2 Calci (mg) 120 130 40 Natri (mg) 9 8 76 Cholesterol (mg) 0 0 0 Sắt (mg) 8 7 1 Xơ (mg) 1 0 0 % calories từ protein 43 39 53 % calories từ carbohydrate 10 9 17 % calories từ chất béo 45 52 30 Nguồn: Composition of Foods: Legumes and Legume Products. United States Department of Agriculture, Human Nutrition Information Service, Agriculture Handbook 8-16. Revised 12-1986. 1.2. KHÁI QUÁT VỀ THỨC UỐNG CHỨC NĂNG 1.2.1. Định nghĩa [41] * Thực phẩm: tất cả các chất đã hoặc chưa chế biến nhằm sử dụng cho con người gồm đồ ăn, uống, nhai, ngậm, hút và tất cả các chất được sử dụng để sản xuất, chế biến hoặc xử lý thực phẩm, nhưng không bao gồm mỹ phẩm hoặc những chất chỉ được dùng như dược phẩm. * Thực phẩm chức năng Cho đến nay chưa có một tổ chức quốc tế nào đưa ra định nghĩa đầy đủ về thực phẩm chức năng, mặc dù đã có nhiều Hội nghị quốc tế và khu vực về thực phẩm chức năng. Gần đây các định nghĩa về thực phẩm chức năng được đưa ra nhiều hơn và có xu hướng gần thống nhất với nhau. + Hiệp Hội thông tin thực phẩm quốc tế (IFIC), định nghĩa: “ Thực phẩm chức năng là thực phẩm mang đến những lợi ích cho sức khoẻ vượt xa hơn dinh dưỡng cơ bản”. + Hiệp Hội nghiên cứu thực phẩm Leatherhead (châu Âu): “Thực phẩm chức năng là thực phẩm được chế biến từ thức ăn thiên nhiên, được sử dụng như một phần của chế độ ăn hàng ngày và có khả năng cho một tác dụng sinh lý nào đó khi được sử dụng”. + Bộ Y tế Việt Nam: Thông thư số 08/TT-BYT ngày 23/8/2004 về việc “Hướng dẫn việc quản lý các sản phẩm thực phẩm chức năng” đã đưa ra định nghĩa: “Thực phẩm chức năng là thực phẩm dùng để hỗ trợ chức năng của các bộ phận trong cơ thể người, có tác dụng dinh dưỡng, tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt nguy cơ gây bệnh”. Khái quát lại có thể đưa ra một định nghĩa như sau: “Thực phẩm chức năng là thực phẩm (hoặc sản phẩm) dùng để hỗ trợ (phục hồi, duy trì hoặc tăng cường) chức năng của các bộ phận trong cơ thể, có tác dụng dinh dưỡng, tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt nguy cơ bệnh tật”. Như vậy, khái niệm thức uống chức năng nằm trong khái niệm thực phẩm chức năng. 1.2.2. Khái quát về probiotic 1.2.2.1. Khái niệm Probiotic là các vi khuẩn sống khi được cung cấp với liều lượng thích hợp sẽ đem lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ. (Theo định nghĩa của FAO và WHO 2001) 1.2.2.2. Vai trò [26] - Tăng “thành bảo vệ” miễn dịch, một số có khả năng kích thích miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu. - Ngăn cản sự phát triển của các tác nhân gây bệnh trong đường ruột như: Staphylococcus, Salmonella, Yersinia, Clostridia. - Có khả năng xâm chiếm đường ruột, bám vào màng nhầy ruột. - Có khả năng chịu được acid dạ dày, chịu được muối mật. - Phòng và chữa một số bệnh tiêu hóa: tiêu chảy, táo bón, ung loét dạ dày, … - Hạn chế sự hình thành các khối u nhờ làm giảm hoạt động enzyme tiết ra từ vi khuẩn có hại góp phần tạo ra các chất gây ung thư và giảm nguy cơ ung thư ruột. - Probiotic có khả năng sản xuất ra lactase giúp tiêu hóa lactose. - Tái thiết lập hệ vi sinh có ích nhanh chóng sau khi dùng kháng sinh. 1.2.2.3. Các yêu cầu đối với vi sinh vật probiotic [33] Vi sinh vật trong chế phẩm probiotic muốn đạt hiệu quả mong muốn cần phải đáp ứng đúng một số yêu cầu: - Phải được định danh chính xác, đúng tên chủng loài vi sinh vật. - Cư trú ở người, không độc, không gây bệnh. - Đủ số lượng để trị liệu: khoảng 108-109 tế bào trong một ngày. - Có khả năng tồn tại khi đi qua dạ dày, nơi có môi trường acid, pH từ 1-4 . - Chịu đựng được khi qua ruột non, nơi dịch mật toàn phần tiết ra cao nhất. - Sinh ra một số chất kháng sinh, tăng cường sức đề kháng cho cơ thể. - Di truyền ổn định. - Không chuyển gen đề kháng kháng sinh sang những vi sinh vật khác. - Không được mang vào cơ thể những vi sinh vật gây bệnh. - Có khả năng cạnh tranh và lấn át với những vi sinh vật gây bệnh và bám vào niêm mạc đường tiêu hóa. 1.2.2.4. Các chủng vi sinh vật thường dùng làm probiotic Hiện nay, các chủng vi khuẩn được sử dụng với vai trò là các probiotic chủ yếu thuộc Lactobacillus và Bifidobacterium, còn Enterococus và Streptococus cũng được sử dụng nhưng ít hơn. Bên cạnh những vi khuẩn còn có nấm men Saccharomyces boulardii cũng được xem là probiotic. Bảng 1.6. Những vi sinh vật được sử dụng làm probiotic ở người (Taylor & Francis, 2004) 1.2.2.5. Một số loại sản phẩm mới từ đậu nành hiện nay trên thị trường * Sữa chua đậu nành (soy yogurt) Sữa chua đậu nành được làm giống như sữa chua từ sữa bò. Sữa đã tiệt trùng được lên men với Acidophilus, Bifida hoặc với các canh trường phù hợp và được lên men cho tới khi canh trường chuyển từ sữa đậu nành sang dạng sữa chua, có vị tương tự như sữa chua từ sữa bò. [30] Năm 1981, tại Nhật lần đầu tiên sản xuất soy yogurt số lượng lớn. [28] * Nước mắm chay đậu nành Hiện nay, có rất nhiều nghiên cứu để sản xuất nước mắm chay, như theo Lê Minh Hoàng - Trường ĐH An Giang, sử dụng Bacillus subtilis sp. để lên men đậu hũ tạo sản phẩm nước mắm chay, … Ngoài việc sử dụng đậu nành trong thực phẩm, còn có một số chế phẩm đặc biệt đáng chú ý được bán tại các Health Food Store gồm: Chủng Lactobacillus Chủng Bifidobacterium Các vi sinh vật khác L. acidophilus L. amylovocus L. casei L. crispatus L. gallinarum L. gasseri L. johnsonii L. paracaseii L. plantarum L. reuteri B. adolescentis B. laimalis B. bifidum B. brevis B. infantis B. lactis B. longum Propionibacterium freudenreichii Enterococcus faecalis Lactococus lactis Leuconostoc mesenteroides Streptococus thermophilus Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces boulardii - Soy Biotic trị các triệu chứng khó chịu của phụ nữ vào thời kỳ tắt kinh. - Magic 851 giúp tăng sự hoạt động của hệ miễn nhiễm và ngăn ngừa ung thư với các chất cô đặc từ đậu nành . [37] 1.3. CÁC GIỐNG VI SINH VẬT SỬ DỤNG 1.3.1. Bacillus subtilis và Bacillus natto 1.3.1.1. Hệ thống phân loại [40] Giới: Prokaryota Ngành: Protophyta Lớp: Schyzomycetales Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Loài: Bacillus subtilis Bacillus natto 1.3.1.2. Phân bố [20] B.subtilis và B.natto có mặt ở khắp mọi nơi trong tự nhiên, chúng có nhiều trong rơm cỏ nên còn gọi là “trực khuẩn rơm cỏ”. Chúng còn phân bố trên bề mặt các loại hạt và các sản phẩm được chế biến từ các loại hạt đó. Trong bột mì, B.subtilis chiếm khoảng 75-95% vi khuẩn tạo bào tử. Trong các sản phẩm thực phẩm truyền thống như mắm, tương, cơm mẻ (cơm lên men chua)… cũng có mặt của chúng và có vai trò đáng kể trong quá trình biến đổi sinh học. 1.3.1.3. Hình thái [8],[31] Bacillus là trực khuẩn nhỏ, thẳng, có kích thước 0.5-2.5 x 1.2-10m, thường xếp thành cặp đôi hay chuỗi ngắn, hai đầu tế bào tròn hoặc hơi vuông. Bào tử hình bầu dục có kích thước 0.9 – 0.6m, không phân bố theo một nguyên tắc chặt chẽ nào - lệch tâm hoặc gần tâm nhưng không chính tâm. Là trực khuẩn Gram dương, hiếu khí, khi còn non di động bằng tiên mao, về già, tiên mao rụng nên mất khả năng di động. Khuẩn lạc khô hoặc nhớt, vô màu hay có màu trắng xám nhạt, hơi nhăn hay tạo thành lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn, mép lồi lõm nhiều hay ít, bám chặt vào mặt thạch. Hình 1.9. Vi khuẩn B.subtilis Hình 1.10. Vi khuẩn B.natto 1.3.1.4. Cấu trúc [37] Như hầu hết các vi khuẩn Gram dương khác, cấu trúc bề mặt của Bacillus khá phức tạp và có các đặc tính kết dính và chống chịu điều kiện khắc nghiệt cao. Bề mặt tế bào được cấu tạo bởi các lớp giác mạc, lớp bề mặt có tính chất protein (S-layer), một vài lớp lót peptidoglycan và các protein trên mặt ngoài của màng tế bào. Hình 1.11. Bề mặt vi khuẩn Bacillus (C=Capsule, S=S-layer, P=Peptidoglycan) S-layer Hiện diện trong một số thành viên của giống Bacillus. Chức năng chưa được xác định rõ ràng nhưng dường như có liên quan đến tính kết dính của vi khuẩn. Giáp mạc (capsules) Thành phần hóa học của lớp vỏ nhầy ở các vi khuẩn khác nhau cũng khác nhau, thường là được tạo nên từ các polysaccharide, nitrogen, phosphorite và có thể có cả polypeptide nhưng thành phần chủ yếu là nước (98%), có nhiệm vụ như một hàng rào thẩm thấu để bảo vệ tế bào chống lại quá trình khô. Vách tế bào Vách tế bào rất mỏng (100-200A0), trong suốt không màu. Vách tế bào có tính chất đàn hồi và có độ bền rất lớn, có thể chịu được áp suất cao. Thành phần hóa học chủ yếu là glucid, một số chất béo, protide, các acid amin và chúng thay đổi tùy loại vi khuẩn, tùy môi trường sống. Tiên mao (flagella) Hầu hết các vi khuẩn tạo bào tử hiếu khí đều di động nhờ vào các tiên mao là các sợi lông rất mảnh mọc trên những phần xác định của tế bào vi khuẩn, có cấu trúc là protid. Chiều dài tiên mao thường bằng chiều dài tế bào nhưng cũng có thể dài hơn tùy loại vi khuẩn. Số lượng và vị trí tiên mao ở các tế bào vi khuẩn khác nhau ở mỗi loài. Chúng có thể mọc ở một đầu, hai đầu hoặc mọc xung quanh, … 1.3.1.5. Sự hình thành bào tử [5] Một trong những đặc điểm quan trọng của B.subtilis và B.natto là khả năng tạo bào tử trong những điều kiện nhất định. Bào tử có tính kháng nhiệt, kháng bức xạ, kháng hoá chất, kháng áp suất thẩm thấu. Trong thời kỳ nghỉ, bào tử vi khuẩn ở trạng thái sống ẩn (cryptobiosis). Đã có những chứng cứ về việc duy trì sức sống 200-300 năm của bào tử vi khuẩn Bacillus. Các tế bào sinh bào tử khi gặp điều kiện thức ăn hoặc có tích lũy các sản phẩm trao đổi chất có hại sẽ bắt đầu thực hiện quá trình hình thành bào tử. Về mặt hình thái, có thể chia quá trình hình thành bào tử ra thành các giai đoạn: - Hình thành những búi chất nhiễm sắc. - Tế bào phân cắt không đối xứng, tạo ra một vùng nhỏ gọi là tiền bào tử. - Tiền bào tử hình thành hai lớp màng, tăng cao tính kháng bức xạ. - Kết thúc việc hình thành áo bào tử. - Kết thúc tạo vỏ bào tử, bào tử thành thục, bắt đầu có tính kháng nhiệt. - Bào nang vỡ ra; bào tử thoát ra ngoài. 1.3.1.6. Hệ enzyme [13], [27] * Hệ enzyme protease - Các enzyme protease (peptid – hydrolase) xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid trong các peptid hoặc protein. - B. subtilis và B.natto có khả năng tổng hợp protease trung tính và kiềm. - Chúng tổng hợp protease ngoại phân (exoprotease) phân giải protein và các cơ chất cao phân tử khác có trong môi trường dinh dưỡng thành các dạng phân tử thấp để vi sinh vật dễ hấp thụ. Đây là chức năng rõ nhất của protease ngoại bào. - Theo Otrosko và tập thể (1977) thì glucose, saccharose, mantose, fructose, socbit là nguồn cacbon tốt nhất cho quá trình tổng hợp protease ở B.natto var.amylolyquefaciens 795. * Hệ enzyme amylase - B. subtilis, B.natto có khả năng tạo một lượng lớn  - amylase. - Amylase của B. subtilis và B.natto không có các liên kết sulfihidril và có khả năng phân giải tinh bột nhanh gấp 2÷2,5 lần so với  - amylase nấm mốc. -  - amylase của vi khuẩn B. subtilis cũng như của B.natto thủy phân tinh bột tạo ra các dextrin có mạch dài khoảng 6-8 gốc glucose. Các dextrin này lại bị phân giải tiếp tục theo sơ đồ: G6 → G1 + G5 G7 → G1 + G6 hay G2 + G5 (ít) G8 → G2 + G6 hay G3 + G5 (ít) - Sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân cơ chất bởi amylase là glucose và maltose. Ở vi khuẩn tỉ lệ này là 1: 5. - pH tối thích cho dextrin hóa và đường hóa của  - amylase là từ 5,6÷6,2. 1.3.1.7. Công dụng [19],[27] - Tạo kháng sinh: subtilin, eumycin, bacillin, bacillomin chống được nhiều loại vi trùng gây bệnh. - Người ta cũng thường thu  - amylase chịu nhiệt cao, dùng trong công nghiệp dệt để tách hồ tinh bột trên vải từ B. subtilis. - Chế phẩm amylase từ B. subtilis được thay thế đại mạch nảy mầm (malt) làm tác nhân đường hóa tinh bột trong sản xuất rượu, bia từ nguyên liệu có bột. - B.subtilis và B.natto có khả năng tạo một lượng lớn -amylase ngoại bào. -amylase của chúng bền nhiệt hơn và phân giải tinh bột nhanh hơn 2 – 2.5 lần so với enzyme của nấm mốc. 1.3.2. Vi khuẩn lactic 1.3.2.1. Tổng quan về vi khuẩn lactic [5],[3] Là vi khuẩn Gram dương, không tạo bào tử, kị khí tuỳ ý, hầu hết không di động. Tế bào ở dạng cầu khuẩn (đường kính 1µm) hay trực khuẩn (kích thước 1 x 2-3µm). Tồn tại ở dạng tế bào đơn, kết đôi, kết tư (tetracoccus) hay kết thành chuỗi. * Theo khóa phân loại Bergey, vi khuẩn lactic thuộc: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillales Họ: Lactobacillaceae Giống: Lactobacillus Pesiococcus Họ: Enterococcaceae Giống: Enterococcus Họ: Leuconoscaceae Giống: Leuconostoc Họ: Streptococcaceae Giống: Streptococcus Lactococcus * Căn cứ vào kiểu lên men, người ta chia vi khuẩn lactic thành hai nhóm [8]: - Vi khuẩn lactic đồng hình Tham gia vào quá trình lên men lactic đồng hình mà sản phẩm chính tạo thành là acid lactic (90-98% tổng sản phẩm lên men), có thể có một ít các sản phẩm phụ như: ethanol, acid acetic, acetoin, CO2. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong công nghiệp sản xuất acid lactic và công nghiệp thực phẩm, đặc biệt là trong công nghiệp sữa như sản xuất sữa chua, phomai. Chúng đóng vai trò quan trọng cùng với vi khuẩn propionic trong việc tạo hương cho các loại phomai rắn. - Vi khuẩn lactic dị hình Tham gia vào quá trình lên men lactic dị hình mà sản phẩm lên men ngoài acid lactic còn có hàng loạt các sản phẩm khác với tỷ lệ khá cao như sau: acid lactic 40%, acid acetic 10%, các chất khí 20%. Nhiều sản phẩm nên việc tách và cô lập các sản phẩm khác nhau rất tốn kém nhưng cũng có vai trò quan trọng trong chế biến thực phẩm. Vi khuẩn lactic lên men dị hình có thể làm cho sản phẩm có mùi vị thơm ngon và đặc trưng hơn. 1.3.2.2. Lactobacillus [31] Tế bào hình que ngắn, kích thước 0.5 – 1.2 x 1 – 10µm, đôi khi có dạng hình cầu kết chuỗi ngắn. Là vi khuẩn Gram dương, không tạo bào tử, hiếm khi di động bằng lông roi, kị khí không bắt buộc. Khuẩn lạc có kích thước 2-5mm, lồi, mờ đục, không nhuộm màu. Hình thức dinh dưỡng là hóa dưỡng hữu cơ, không khử được nitrate, không làm tan gelatin, không có catalase cũng như cytochrome. Hình 1.12. Lactobacillus Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển là 30 – 40oC. 1.3.2.3. Ứng dụng của vi khuẩn lactic [5], [32] * Bacteriocin Lên men thực phẩm bằng vi khuẩn lactic là phương pháp bảo quản thực phẩm cổ xưa nhất dựa vào sự đối kháng của các vi sinh vật khác nhau. Tuy nhiên, phương pháp này mới nhận được sự chú ý của các nhà khoa học, đặc biệt là việc sử dụng các vi khuẩn lactic khác nhau. Một trong những đặc điểm quan trọng của vi khuẩn lactic là khả năng tạo các hoạt chất kháng khuẩn - bacteriocin có khả năng kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh hay gây hư hỏng thực phẩm như Listeria, Clostridium, Staphylococcus, Bacillus spp., Enterococcus spp.. Bảng 1.7. Đặc tính của một vài loại bacteriocin Bacteriocin Vi sinh vật sản xuất Đặc điểm Nisin Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 11454 Phổ kháng khuẩn rộng, được sinh ra vào cuối chu kỳ tăng trưởng. Pediocin A Pediococcus pentosaceus FBB61, L-7230 Phổ kháng khuẩn rộng. Pediocin AcH Pediococcus acidilactici H Phổ kháng khuẩn rộng. Leucocin Leuconostoc gelidum Phổ kháng khuẩn rộng, được sinh ra vào đầu chu kỳ tăng trưởng. Helveticin L.helveticus 481 Phổ kháng khuẩn hẹp. Carnobacteriocin Carnobacterium piscicola LV17 Phổ kháng khuẩn hẹp, được sinh ra vào đầu chu kỳ tăng trưởng. * Probiotic Vi khuẩn lactic được chú ý sử dụng nhiều trong vai trò probiotic, có nhiều loài được sử dụng như đã trình bày ở phần 1.2.2 của luận văn này. * Một số ứng dụng khác - Ứng dụng trong công nghiệp chế biến sữa để sản xuất sữa chua, kefir, phomai, koumis… - Ứng dụng trong muối chua rau quả: bắp cải muối, dưa chuột muối, … - Ứng dụng trong ủ chua thức ăn gia súc dùng trong chăn nuôi. - Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất acid lactic và các loại muối lactate. - Acid lactic được ứng dụng trong ngành thuộc da, dệt, công nghiệp tổng hợp chất dẻo, công nghiệp thực phẩm. - Lactate calci là loại dược phẩm bổ sung calci dưới dạng dễ hấp thu, lactate sắt dùng để chữa bệnh thiếu máu, lactate đồng dùng làm dung môi, … CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Nguyên liệu * Đậu hũ: đậu hũ Vina Tofu Hình 2.1. Đậu hũ Vina Tofu * Sữa đậu nành không đường Vfresh Nguồn: công ty cổ phần sữa Việt Nam Vinamilk. Dùng làm môi trường tăng sinh các chủng giống vi sinh vật trong đề tài. * Đường aspartam Nguồn: công ty cổ phần dược phẩm dược liệu Pharmedic - TP.HCM. Dùng bổ sung vào sản phẩm tạo vị ngọt. * Hươmg liệu (hương phomai) Nguồn: do công ty FRAGRANCE OILS (International) LMD. của Anh sản xuất, được mua tại cửa hàng Toàn Hưng, số 451 An Dương Vương, Phường 14 - Quận 5, chuyên cung cấp tinh dầu, hương liệu và bột màu thực phẩm. 2.1.2. Giống vi sinh vật Do phòng thí nghiệm Công nghệ biến đổi Sinh học - Viện Sinh học nhiệt đới TP.HCM cung cấp. - Bacillus subtilis sp. được phân lập từ chao, kí hiệu BsTC. - Bacillus natto sp. phân lập từ sản phẩm Nattospes của Nhật Bản, được kí hiệu là Bn. - Lactobacillus sp. phân lập từ mẻ cơm lên men, kí hiệu là TKm. 2.1.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm Do Viện Sinh học nhiệt đới TP.HCM cung cấp. - Dụng cụ thí nghiệm bao gồm: ống nghiệm, becher, erlen, ống đong, pipet, đĩa Petri, buret, phễu lọc, giấy lọc, …. - Thiết bị thí nghiệm như tủ cấy, kính hiển vi, máy lắc, tủ hấp, cân điện tử, bể ổn nhiệt, máy Kjeldahl bán tự động, máy Soxhlet, máy đo quang phổ, … 2.1.4. Môi trường dùng trong thực nghiệm - Môi trường giữ giống BsTC và Bn.: Môi trường thạch nước mắm (CP: cá peptone). - Môi trường nhân giống BsTC và Bn. Môi trường dịch nước mắm (CP: cá peptone). Môi trường sữa đậu nành. - Môi trường giữ giống Lactobacillus sp.: môi trường cà chua (N2) - Môi trường định tính enzyme. Môi trường thạch Czapek – Dox + 1% tinh bột định tính enzyme amylase. Môi trường thạch Czapek – Dox + 1% casein để định tính enzyme protease. Môi trường thạch Czapek – Dox + 1% fibrin để định tính enzyme protease. (Thành phần các môi trường được trình bày rõ ở phần phụ lục của luận văn này). 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính hệ enzyme (amylase, protease) của BsTC và Bn trong điều kiện khác nhau của các yếu tố ảnh hưởng như thời gian, nhiệt độ, pH. Sau đó, tối ưu hóa điều kiện các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính các enzyme của hai chủng giống vi khuẩn trên. Từ kết quả thu được, sẽ chọn ra một chủng giống tối ưu hơn để thủy phân đậu hũ tạo sản phẩm thức uống chức năng. Nội dung nghiên cứu cụ thể của đề tài được trình bày ở sơ đồ sau: Hình 2.2. Sơ đồ nghiên cứu 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu hình thái các chủng vi sinh vật có trong đề tài (vi khuẩn Bacillus subtilis sp., Bacillus natto sp., Lactobacillus sp.) 2.2.2.1. Phương pháp nhuộm Gram [14] * Nguyên tắc Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào với thuốc tím kết tinh (crystal violet) và iod mà vi khuẩn chia làm 2 nhóm khác nhau là: Xác định thành phần hóa học trong nguyên liệu đậu hũ Xây dựng đường cong sinh trưởng. Xác định sinh khối tối đa của BsTC, Bn trong môi trường CP và trong môi trường sữa đậu nành. Khảo sát hoạt tính enzyme amylase, protease trên cơ chất đậu của BsTC và Bn từng yếu tố thời gian, nhiệt độ, pH rồi tối ưu hóa thực nghiệm. Từ đó chọn chủng tối ưu. Khảo sát quá trình lên men Xác định tỷ lệ giống (BsTC hoặc Bn) Thời gian thủy phân đậu hũ. Xác định các chỉ số dinh dưỡng (đạm, đường, lipid, …) Khảo sát quá trình bảo quản Xác định tỷ lệ giống TKm Hàm lượng đường saccharose Thời gian bảo quản Hoàn thiện sản phẩm Khảo sát phụ gia: đường aspartam, hương Đánh giá cảm quan sản phẩm Xác định các chỉ số dinh dưỡng (đạm, đường tổng, lipid, …) Xây dựng quy trình chế biến thức uống chức năng từ đậu hũ Nhóm thứ nhất vẫn giữ nguyên màu tím của thuốc nhuộm, không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn do có lớp vỏ tế bào dày tạo bởi peptidoglycan. Vi sinh vật thuộc nhóm này là Gram dương. Loại thứ hai có lớp vỏ tế bào mỏng hơn (do ít peptidoglycan hơn) và được bao bọc bởi một màng mỏng nên có màu hồng. Vi sinh vật nhóm này là Gram âm. * Cách tiến hành - Lau nhẹ sạch tiêu bản bằng giấy mềm, hơ qua đèn cồn. - Dùng bút lông ghi tên mẫu, vẽ vòng tròn phía dưới mặt lam để đánh dấu vết khuẩn phía trên lame. - Nhỏ dung dịch NaCl 9 ‰ lên giữa vòng tròn. - Dùng que cấy khử trùng để nguội lấy một ít sinh khối vi khuẩn hòa vào giọt NaCl 9 ‰ trên lame. - Dàn mỏng thành vết bôi, hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn. - Đặt tiêu bản lên thanh thủy tinh chữ U, trên thau nhựa. - Đặt miếng giấy lọc lên vòng phết kính. - Nhỏ dung dịch crystal violet thấm ướt hết giấy lọc, để yên từ 30 giây - 1 phút, rửa trôi thuốc nhuộm dư với nước. - Nhỏ dung dịch Lugol, để 30 giây, rửa lại nhẹ nhàng với nước. - Tẩy màu bằng cồn 96o từ 15-20 giây: giữ phiến kính ở góc nghiêng nhỏ và cẩn thận nhỏ giọt cồn cho cồn chảy ngang qua vết bôi cho đến khi không thấy vết thuốc nhuộm chảy theo. Ngay lập tức rửa vết bôi lại với nước. Thời gian khử màu trong bước này đóng vai trò quyết định kết quả của quá trình nhuộm. - Phủ hoàn toàn vết bôi với safranin, để yên trong 30 giây, rửa với nước. - Thấm khô phiến kính với giấy thấm. Khi phiến kính khô hoàn toàn, quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu x100. 2.2.2.2. Phương pháp nhuộm bào tử [14] Với thuốc nhuộm Fuchsin, HCl 0,5%, H2SO4 1% và xanh methylen - Làm vết bôi trên một phiến kính sạch và để khô tự nhiên. - Nhỏ vài giọt HCl 0,5% lên vết bôi, hơ nóng trên ngọn lửa đèn cồn cho đến bốc hơi trong hai phút rồi rửa với nước. - Nhuộm vết bôi với thuốc nhuộm Fuchsin, qua miếng giấy lọc, hơ nóng cho đến bốc hơi trong vòng 5 phút. - Rửa vết bôi bằng nước - Tẩy màu bằng dung dịch H2SO4 1% trong 2 phút. - Rửa vết bôi bằng nước. - Nhuộm vết bôi bằng xanh methylen trong 5-15 phút - Rửa lại với nước và để khô tự nhiên. - Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu (x100). Bào tử sẽ mang màu đỏ, tế bào sinh dưỡng mang màu xanh. 2.2.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh lý vi khuẩn 2.2.3.1. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh lý Lactobacillus sp. * Phương pháp định tính acid lactic Nguyên tắc Khi tác dụng với acid lactic, thuốc thử Ufermen sẽ đổi từ xanh tím sang vàng. Quan sát sự đổi màu thuốc thử xác định được khả năng tạo acid lactic của vi khuẩn. Cách tiến hành Chuẩn bị khoảng 5ml môi trường dinh dưỡng, cấy vi khuẩn đã phân lập vào. Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng khoảng một ngày. Sau đó cho dịch lên men phản ứng với thuốc thử Ufermen. Chuẩn bị các ống nghiệm chứa các thành phần như sau: - Ống 1: 3 ml dịch môi trường, 3 ml thuốc thử Ufermen. - Ống 2: 3 ml dịch lên men, 3 ml thuốc thử Ufermen. - Ống 3: 3 ml acid lactic 98 %, 3 ml thuốc thử Ufermen. Quan sát và nhận xét sự đổi màu của thuốc thử. * Phương pháp định lượng acid lactic [31] Nguyên tắc Acid tổng được đo bằng cách chuẩn độ với NaOH 0,1M; thêm 1-2 giọt phenolphtalein 1% làm chất chỉ thị. Kết quả % acid lactic được tính theo công thức: % acid lactic = 90: trọng lượng phân tử acid lactic (g) D: độ pha loãng Cách tiến hành Cân 10 g mẫu hòa tan vào 90 ml nước cất. Thêm 1 – 2 giọt phenolphtalein 1%. Sau đó chuẩn độ bằng NaOH 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt, bền màu trong 1 phút. Độ therner: một độ Therner tương đương một ml NaOH 0.1M dùng để chuẩn độ 100 ml nguyên liệu. 2.2.3.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh lý vi khuẩn BsTC và Bn * Xây dựng đường cong tăng trưởng trong môi trường CP [23] Khảo sát đường cong sinh trưởng của vi khuẩn là một công việc quan trọng trong công nghiệp lên men. Nó cho biết được tại thời điểm nào thì chất lượng giống vi khuẩn cho vào cơ chất lên men là tốt nhất. VNaOH x NaOH 0,1M x 90 x1 00 mmẫu x 100 x D Nguyên tắc Sự tăng trưởng vi sinh vật là sự gia tăng số lượng tế bào vi sinh vật trong quần thể. Tốc độ tăng trưởng là sự tăng trưởng của vi sinh vật trong một đơn vị thời gian. Theo dõi sự phát triển của vi sinh vật theo thời gian ta có thể xác định được đường cong tăng trưởng của chúng. Dụng cụ và môi trường Dụng cụ: đĩa Petri, ống nghiệm nước cất, đầu típ 1ml đã được hấp khử trùng, micropopet 1 ml. Môi trường: môi trường thạch cá pepton (CP), môi trường CP lỏng. Cách tiến hành - Vi khuẩn được nuôi (tăng sinh) trong môi trường CP lỏng từ ống giống gốc. - Khoảng 4 giờ lấy mẫu cấy trang trên môi trường thạch cá pepton (CP agar). - Đếm khuẩn lạc xác định mật độ tế bào (CFU/ml) có trong mẫu. + Pha mẫu thành nhiều độ pha loãng bậc 10 liên tiếp sao cho có độ pha loãng với mật độ tế bào thích hợp để xuất hiện các khuẩn lạc riêng lẻ trên mặt thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế sai số khi đếm và tính toán. + Số lượng khuẩn lạc tối ưu được đề nghị bởi các cơ quan có uy tín như FDA, AOAC là 30 – 300 khuẩn lạc trên đĩa. + Tính kết quả Mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu tính từ số liệu của độ pha loãng Di được tính theo công thức là: Mi (CFU/ml) = Ai * Di/V Ai: là số khuẩn lạc trung bình trên đĩa Di: là độ pha loãng thứ i. V: là dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml). - Vẽ đồ thị đường cong sinh trưởng giữa log CFU/ml - trục tung và thời gian - trục hoành. * Xây dựng đường cong tăng trưởng trong môi trường sữa đậu nành [23] Thực hiện xây dựng đường cong tăng trưởng của BsTC và Bn trong môi trường sữa đậu nành tương tự như ở môi trường CP nhưng khác là môi trường nuôi (tăng sinh) vi khuẩn là môi trường sữa đậu nành. 2.2.4. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa 2.2.4.1. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Lactobacillus sp. * Thử nghiệm oxydase [23] Nguyên tắc Thử nghiệm này xác định sự hiện diện hệ enzyme oxidase ở vi sinh vật. Quan trọng nhất của hệ thống này là cytochrome oxidase trong chuỗi truyền điện tử với O2 là chất nhận điện tử sau cùng ở các loài hiếu khí hay kị khí tùy ý. Số loại cytochrome trong tế bào thay đổi tùy từng loại vi sinh vật. Hoạt tính cytochrome oxidase được phát hiện nhờ thuốc thử p-phenylendiamin. Khi có cytochrome c khử trong tế bào, thuốc thử này bị oxy hóa thành indolphenol có màu xanh dương. Cách tiến hành Cấy sinh khối chủng thuần lên ống thạch nghiêng nutrient agar, ủ ở 370C trong 24-48 giờ. Chuyển một ít sinh khối từ khuẩn lạc vào nước muối sinh lý vô trùng, lắc đều. Dùng pipette nhỏ một giọt dung dịch trên vào đĩa giấy thử hoạt tính oxydase. Quan sát và ghi nhận sự xuất hiện màu xanh dương trong vài phút. Đọc kết quả Thử nghiệm oxidase dương tính (+) khi xuất hiện màu xanh dương đậm, nếu không có sự xuất hiện của màu xanh này thì phản ứng là âm tính (-). * Thử nghiệm catalase [23] Nguyên tắc Các vi sinh vật hiếu khí và kị khí tùy ý chứa chuỗi chuyền điện tử có cytochrome đều có catalase (trừ các Streptococcus spp.). Enzyme này là một trong các thành viên của hệ thống các enzyme có vai trò bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương bởi các dẫn xuất độc tính cao của oxy phân tử trong tế bào hiếu khí và kị khí tùy ý. Các vi sinh vật này có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp với oxy là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi truyền điện tử tạo H2O2. Catalase thủy phân hydrogen peroxide thành H2O và O2, ngăn cản sự tích tụ các phân tử có độc tính cao này trong tế bào. Sự thủy phân hydrogen peroxide sẽ giải phóng oxy được ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt khí. Cách tiến hành Dùng que cấy vô trùng lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc (tốt nhất là khuẩn lạc không quá 24 giờ) đặt lên 1 lam kính sạch. Nhỏ 1 giọt dung dịch oxy già (H2O2) 3% phủ lên khuẩn lạc. Ghi nhận sự sủi bọt nếu có. Đọc kết quả Nếu thấy xuất hiện bọt khí là catalase (+). * Thử nghiệm nitratase [23] Nguyên tắc Các vi sinh vật có khả năng khử nitrate tổng hợp hệ enzyme nitratase xúc tác sự khử nitrate thành nitrite và nitơ phân tử. Đây là cách biến dưỡng năng lượng theo cách hô hấp kị khí. Sản phẩm cuối cùng của sự khử này có thể là nitrite, amoniac, nitơ phân tử, … tùy thuộc vào từng loài vi sinh vật và điều kiện môi trường. Nitrite được tạo ra từ nitrate sẽ phản ứng với sulphanilamide và N- napthylethyleneiamine hydrocloride ở pH acid cho hợp chất có màu hồng. Cách tiến hành Cấy sinh khối chủng thuần vào ống nghiệm đã có 200 µl nước muối sinh lý vô trùng, lắc đều. Chuyển đĩa giấy nitrate vào ống nghiệm trên, ủ ở 370C qua đêm. Chuyển đĩa giấy đã tẩm thuốc thử tìm nitrate vào ống nghiệm trên. Đọc kết quả Phản ứng (+) có màu hồng xuất hiện. Ngược lại, không chuyển màu là (-). 2.2.4.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Bacillus [31] * Phản ứng nitratase Tương tự như 2.2.4.1. * Phản ứng protease Nguyên tắc Vi sinh vật tiết protease phân giải casein thành polypeptide và acid aimin. Cách tiến hành Tăng sinh vi khuẩn Bacillus trên môi trường sữa đậu nành trong 24 giờ. Đục một lỗ trên môi trường NB thạch đĩa có bổ sung 1% casein. Nhỏ dịch tăng sinh Bacillus vào, ủ ở 370C trong 24 giờ. Đọc kết quả Nhỏ thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần lên trên bề mặt thạch. Kiểm tra vòng phân giải casein. * Phản ứng Fibrin Nguyên tắc Vi sinh vật tiết protease phân giải fibrin thành polypeptide và acid amin. Cách tiến hành Tăng sinh vi khuẩn BsTC và Bn trên môi trường sữa đậu nành trong 24 giờ. Đục một lỗ trên môi trường NB thạch đĩa có bổ sung 1% fibrin. Nhỏ dịch tăng sinh BsTC và Bn vào, ủ ở 37 oC trong 24 giờ. Phương pháp thu sợi fibrin Dùng 5ml huyết heo: bổ sung 0,5% kalioxalat (K2C2O4.H2O), thêm 150ml NaCl 0,8% tiếp theo thêm 5 ml dung dịch CaCl2 (2,5g/100ml nước cất). Để 10-15 phút. Lọc qua giấy lọc. Rửa mẫu trên giấy bằng NaCl 0,8% đến khi sợi fibrin không còn máu (trước khi rửa bằng NaCl 0,8%, khóa van phễu lại để yên khoảng 10 phút cho mỗi lần rửa). Đem sấy khô hoàn toàn ở nhiệt độ 400C. Sau đó đem đi nghiền mịn. Đọc kết quả Nhỏ Folin pha loãng 5 lần lên bề mặt thạch. Kiểm tra vòng phân giải fibrin. Phản ứng (+): môi trường xung quanh vi khuẩn xuất hiện màu xanh. Phản ứng (-): không bắt màu với thuốc thử Folin. * Phản ứng amylase Nguyên tắc Một số vi sinh vật có enzyme α-amylase thuộc nhóm hydrolase phân giải liên kết glycozide tạo thành dextrin và maltose. Vì vậy, dưới tác dụng của α-amylase thì tinh bột bị phân giải thành dextrin không cho phản ứng màu xanh tím với iod. Cách tiến hành Tăng sinh vi khuẩn trên môi trường sữa đậu nành trong 24 giờ. Đục một lỗ trên môi trường starch agar, ủ ở 370C trong 24 giờ. Nhỏ iod lên trên bề mặt môi trường để quan sát đường kính vòng phân giải. Đọc kết quả Phản ứng (+): môi trường xung quanh vi khuẩn không màu, trong suốt, đó là vòng phân giải tinh bột. Phản ứng (-): môi trường xung quanh vi khuẩn có màu xanh tím. 2.2.5. Phương pháp khảo sát hệ enzyme của vi khuẩn BsTC và Bn 2.2.5.1. Phương pháp xác định hoạt tính hệ enzyme của BsTC và Bn * Phương pháp xác định hoạt tính enzyme amylase [18] Nguyên tắc Hoạt tính enzyme amylase được xác định theo phương pháp Smith và Roe (1966). Hoạt tính amylase biểu thị khả năng amylase xúc tác thủy phân tinh bột đến dextrin trong 1 phút ở 50oC và được thể hiện bằng số đơn vị của enzyme đó trong một gam mẫu. Khi phản ứng thủy phân tinh bột xảy ra, lượng tinh bột còn lại chưa bị phân hủy sẽ tạo phản ứng với iod và được đo bằng máy so màu quang học. Dụng cụ và hóa chất - Máy đo quang phổ. - Bể ổn nhiệt. - Dung dịch đệm phosphate (pH 6,2) + Dung dịch mononatri orthophosphate 0,2M: 27,8 g Na2HPO4 hòa tan, dẫn nước đến 1000 ml (dung dịch a). + Dung dịch dinatri hydrophosphate: 53,05 Na2HPO4.7H2O hoặc 71,1 g Na2HPO4.12H2O hòa tan dẫn nước đến 1000 ml (dung dịch b). + Để chỉnh pH = 6,2: 81,5 ml dung dịch a + 18,5 ml dung dịch b. - Dung dịch tinh bột 1%: 1 g tinh bột tan, cho vào bình định mức 100 ml, thêm 50 ml nước cất, lắc đều trong bể cách thủy 10 – 15 phút, đến khi tinh bột tan hoàn toàn, thêm 10 ml dung dịch đệm phosphate 6,2. Thêm nước cất cho đủ 100 ml. - Dung dịch Lugol: 0,5 g Iod + 5 g KI, thêm nước cất cho đủ 200 ml. - Dung dịch HCl 1N: hòa tan 85 ml dung dịch HCl đậm đặc trong nước cất cho vừa đủ 1 lít. - Dung dịch NaCl 3%: cân 3 g NaCl hòa tan với nước cất cho đủ 100 ml. Tiến hành Dùng các ống nghiệm có đánh dấu sẵn và tiến hành cho vào các ống nghiệm các dung dịch và hóa chất Ống chuẩn Ống thử 1 ml nước cất 1 ml dịch enzyme các mẫu 1 ml đệm phosphate pH 6.2 1 ml đệm phosphate pH 6.2 1 ml dung dịch tinh bột 1% 1 ml dung dịch tinh bột 1% 0,5 ml dung dịch NaCl 3% 0,5 ml dung dịch NaCl 3% Đem ủ ở 50oC trong 30 phút, sau đó cho mỗi ống 1 ml dung dịch HCl 1N để kìm hãm sự hoạt động của enzyme. Cho nước cất đến 10 ml mỗi ống. Cho tiếp một giọt dung dịch Lugol vào mỗi ống. Đem đo mật độ quang ở bước sóng 595 nm. Đơn vị hoạt tính của enzyme amylase được tính theo công thức: UI= mta LCba ** **)(  a: mật độ quang học của ống chuẩn. b: mật độ quang học của ống thử. C: lượng tinh bột ban đẩu tham gia phản ứng (10mg). L: hệ số pha loãng m: trọng lượng (g) hoặc thể tích (ml) mẫu. * Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease [11] Nguyên tắc Dùng casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của enzyme protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng enzyme. Dụng cụ hóa chất - Ống nghiệm. - HCl 0,1M. - Bể ổn nhiệt. - NaCl 2M. - Máy đo quang phổ. - NaOH 0,1N. - Giấy lọc. - H3PO41/30M. - Dung dịch trichloroacetic 5%. - Na2CO3 0,4M. - Dung dịch đệm phosphat pH = 6,2. - Ca(CH3COOH)2 0,2M. - Tyrosin tinh khiết. - Dung dịch casein 1%. - Thuốc thử Folin. Tiến hành  Dựng đường chuẩn Pha dung dịch tyrosin ở các nồng độ khác nhau: 10, 20, 30, 40, 50 g tyrosin /1 ml HCl 0,1M. Thêm 5 ml Na2CO3 0,4M vào 1 ml dung dịch tyrosin (các nồng độ khác nhau ở trên) và thêm 1 ml thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần vào dung dịch hỗn hợp. Sau khi trộn đều để ổn định dung dịch ở 37±0,50C trong 20 phút. Đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 660 nm (ghi nhận kết quả AS10, AS20, AS30, AS40, AS50.) Ống đối chứng: dùng 1ml HCl 0,1M thay cho tyrosin, đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 660 nm (ghi nhận kết quả này AS0). Dựng đường chuẩn theo hàm lượng g tyrosin và độ hấp thụ: 5 5040302010 050040030020010 SSSSSSSSSS AAAAAAAAAAF            Định lượng enzyme trong mẫu Cho 1 ml dung dịch cơ chất casein vào ống nghiệm, ủ ở nhiệt độ 37±0,50C trong 15 phút. Sau thời gian ủ, cho 1ml dung dịch enzyme vào, lắc đều, ủ hỗn hợp này ở nhiệt độ 37±0,50C trong 60 phút. Sau đó cho vào hỗn hợp này 2 ml dung dịch trichloroacetic (TCA) 5%. Để ổn định nhiệt trong 25 phút, sau đó lọc dung dịch này qua giấy lọc để loại tủa. Cho 5ml dung dịch Na2CO3vào 1 ml dịch lọc. Cho thêm thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần vào hỗn hợp, để yên ở 37±0,50C trong 20 phút. Khi xuất hiện màu xanh, đem đo độ hấp thu ở bước sóng 660 nm. Mẫu đối chứng: lấy 1 ml nước cất thay cho 1 ml dung dịch enzyme và tiến hành các bước tương tự ở mẫu thí nghiệm với cùng điều kiện. Tính kết quả Một đơn vị hoạt tính enzyme protease chính là lượng enzyme tạo amino acid tương đương 100 µg tyrosin trong 1 ml dịch lọc trong điều kiện thí nghiệm. Hoạt tính enzyme protease: ĐVHT/g hoặc ml dung dịch enzyme= (A60 – A0)*F*n*1/100 A60: độ hấp thụ của mẫu. A0: độ hấp thụ của mẫu đối chứng. F: hệ số tương quan giữa hàm lượng tyrosin và độ hấp thu ở bước sóng 660nm trên đường chuẩn. n: hệ số pha loãng mẫu. 1/100: hệ số chuyển đổi. 2.2.5.2. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hệ enzyme của BsTC và Bn Có ba yếu tố cần khảo sát: thời gian, nhiệt độ và pH vì đây là một trong những yếu tố có ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính hệ enzyme của vi khuẩn. * Yếu tố thời gian - Cấy 1% (v/w) vi khuẩn BsTC , Bn đã hoạt hóa trong môi trường sữa đậu nành vào cơ chất đậu hũ tại cùng thời điểm. - Ủ ở nhiệt độ phòng lần lượt theo các mốc thời gian: 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40 giờ. - Xác định hoạt tính enzyme ở các mốc thời gian trên. * Yếu tố nhiệt độ - Cấy 1% (v/w) vi khuẩn BsTC , Bn đã hoạt hóa trong môi trường sữa đậu nành vào cơ chất đậu hũ tại cùng thời điểm. - Ủ mẫu ở các nhiệt độ: 15, 20, 25, 30, 35, 40, 450C trong 24 giờ, pH cơ chất. - Xác định hoạt tính enzyme ở các mốc nhiệt độ trên. * Yếu tố pH - Cấy 1% (v/w) vi khuẩn BsTC , Bn đã hoạt hóa trong môi trường sữa đậu nành vào cơ chất đậu hũ tại cùng thời điểm. - Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ với pH lần lượt là 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. - Xác định hoạt tính enzyme các mẫu trên. 2.2.5.3. Tối ưu hóa điều kiện ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme của BsTC và Bn [1] Chúng tôi bố trí thí nghiệm theo quy hoạch thực nghiệm với ba yếu tố thời gian, nhiệt độ, pH vì đây là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme của BsTC , Bn. Yếu tố không đổi trong quá trình khảo sát là cơ chất đậu hũ và tỉ lệ giống cấy 1% (v/w). Số thí nghiệm tối ưu 23 = 8, ngoài ra còn có thêm 3 thí nghiệm ở tâm để kiểm tra ý nghĩa các hệ số của phương trình hồi quy. Ba yếu tố cần khảo sát: - X1 là yếu tố thời gian với các giới hạn được xác định sau khảo sát ở trên. - X2 là yếu tố nhiệt độ với các giới hạn được xác định sau khi khảo sát ở trên. - X3 là yếu tố pH với các giới hạn được xác định sau khi khảo sát ở trên. Hàm mục tiêu Y là hoạt tính enzyme được tính sau đo OD595 (amylase) hoặc OD660 (protease). Bảng 2.1. Bố trí quy hoạch thực nghiệm Mẫu thí nghiệm X1 X2 X3 Y 1 + + + 2 + + - 3 + - + 4 + - - 5 - + + 6 - + - 7 - - + 8 - - - 9 0 0 0 10 0 0 0 11 0 0 0 Ghi chú: (-): mức dưới; (0): tâm; (+): mức trên. 2.2.6. Quy trình công nghệ lên men đậu hũ chế biến thức uống chức năng Hình 2.3. Quy trình công nghệ thủy phân đậu hũ làm thức uống chức năng Giải thích quy trình  Nhân giống Sau khi so sánh hoạt tính enzyme của BsTC và Bn, chọn vi khuẩn có hoạt tính enzyme tối ưu hơn để thủy phân đậu hũ tạo sản phẩm thức uống chức năng. Dùng que cấy lấy vi khuẩn được chọn từ ống giống để cấy vào 10 ml môi trường sữa đậu nành đã thanh trùng, nuôi cấy trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng.  Lựa chọn nguyên liệu Chất lượng đậu hũ có ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng, đặc biệt là giá trị cảm quan của sản phẩm. Yêu cầu của đậu hũ: Nhân giống trong môi trường sữa đậu nành Giống vi khuẩn được chọn Đậu hũ Hấp thanh trùng (1000C, 15 phút) Lên men Xay nhuyễn Cấy giống Cấy Lactobacillus sp. Phụ gia Sản phẩm - Trắng, mềm, mịn. - Mùi thơm. - Vị béo. - Đảm bảo vệ sinh và ổn định chất lượng.  Thanh trùng Hấp thanh trùng ở 1000C trong 15 phút nhằm tiêu diệt và ức chế một phần các vi sinh vật có trong đậu hũ để chuẩn bị cấy giống vào cho quá trình lên men.  Xay nhuyễn Dùng máy xay sinh tố gia đình (đã vô trùng) để xay đậu hũ tơi nhuyễn trong thời gian 3 phút.  Cấy giống Cấy giống phải thực hiện trong tủ cấy đã được vô trùng bằng cách lau cồn, chiếu đèn cực tím. Hút giống đã được tăng sinh từ môi trường sữa đậu nành cho vào đậu hũ đã xay nhuyễn với tỉ lệ đã được khảo sát - Tỉ lệ giống khảo sát: 0.5%, 1%, 2% (v/w).  Lên men Quá trình lên men được thực hiện ở điều kiện đã khảo sát. - Khảo sát thời gian lên men: 15, 18, 21, 24, 27 giờ.  Cấy Lactobacillus sp. Cấy vi khuẩn Lactobacillus sp. đã được tăng sinh từ môi trường sữa đậu nành cùng với lượng đường saccharose đã được khảo sát vào đậu hũ đã được lên men nhằm mục đích bảo quản và tạo vị chua đặc trưng vì theo nguyên tắc Lactobacillus sp. sẽ sử dụng đường saccharose làm nguồn dinh dưỡng và lên men tạo acid lactic. - Khảo sát tỉ lệ giống Lactobacillus bổ sung vào: 0%,1%, 2% (v/w). - Khảo sát lượng đường saccharose bổ sung: 0%, 1%, 2% (v/w) - Khảo sát điều kiện bảo quản: nhiệt độ phòng và tủ lạnh (10-200C). - Theo dõi thời gian bảo quản. Bổ sung phụ gia Nhằm tăng giá trị cảm quan của sản phẩm ta cần bổ sung một số phụ gia với nồng độ phù hợp sau khi khảo sát. - Về màu sắc, sản phẩm có màu trắng của đậu hũ rất có giá trị cảm quan nên không bổ sung phụ gia tạo màu. - Về mùi, sản phẩm có mùi đậu hũ lên men nên chúng tôi chọn hương phomai có mùi thơm béo như đậu hũ. Khảo sát tỉ lệ hương bổ sung: 10/00, 2 0/00, 3 0/00, 4 0/00(v/w). - Về vị, chúng tôi sử dụng đường aspartam, là loại đường tạo vị ngọt nhưng không chứa calo. Khảo sát tỉ lệ đường aspartam bổ sung: 0,350/00, 0,7 0/00, 1,05 0/00, 1,4 0/00 (v/w) tương đương 1, 2, 3, 4 gói thành phẩm đường aspartam (35 mg/gói). 2.2.7. Phương pháp phân tích 2.2.7.1. Xác định độ ẩm [3] Nguyên tắc Làm bay hơi hết nước trong thực phẩm. Cân trọng lượng thực phẩm trước và sau khi sấy khô, từ đó tính ra phần trăm nước có trong thực phẩm. Dụng cụ - Tủ sấy điều chỉnh nhiệt độ. - Cân phân tích. - Bình hút ẩm. - Đĩa Petri. Cách tiến hành - Cân đĩa sấy khô. - Cân 10 g mẫu đã chuẩn bị sẵn, nghiền nhỏ cho vào đĩa Petri. - Cho tất cả vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 100 – 1050C, sấy khô đến trọng lượng không đổi, thường tối thiểu là 6 giờ. - Sấy xong, đem làm nguội ở bình hút ẩm (25 – 30 phút) và đem cân ở cân phân tích với độ chính xác đến 0.0001 g. - Cho vào lại tủ sấy 100 – 1050C trong 30 phút, lấy ra để nguội ở bình hút ẩm và cân như trên cho tới trọng lượng không đổi. Kết quả giữa hai lần cân liên tiếp không được cách nhau quá 0.5 mg cho mỗi gam chất thử. Tính kết quả Độ ẩm theo phần trăm (X) được xác định bằng công thức: X = (G1 – G2) * 100 / (G1 – G) G: trọng lượng đĩa Petri. G1: trọng lượng đĩa Petri và mẫu trước khi sấy. G2: trọng lượng đĩa Petri và mẫu sau sấy tới trọng lượng không đổi. 2.2.7.2. Định lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl [12] Nguyên tắc - Vô cơ hóa đạm bằng H2SO4 đậm đặc thành amon sulphate ((NH4)2SO4)). Muối này đem tác dụng với kiềm mạnh như NaOH sẽ giải phóng NH3. H2SO4 đậm đặc Chất đạm (NH4)2SO4 Xúc tác, nhiệt độ (NH4)2SO4 + NaOH  2 NH3 + 2 H2O + Na2SO4 - Sau đó, lượng NH3 được hơi nước lôi cuốn sang một bình tam giác có chứa một lượng thừa H3BO3. Mà ở đó H3BO3 tự phân ly. H3BO3  HBO2 + H2O - Khi cất đạm, NH3 bay sang sẽ phản ứng với HBO2 NH4OH + HBO2  NH 4+ + BO2- + H2O BO2- là một base mạnh, vì vậy dung dịch của bình hứng sẽ chuyển từ màu tím đỏ sang màu xanh lá mạ. Lượng BO2- được tạo thành tương đương với lượng NH3 bị đẩy ra trong quá trình cất đạm. Xác định lượng BO2- bằng cách chuẩn độ ngược với HCl 0,25N. Giai đoạn chuẩn độ kết thúc khi dung dịch chuyển từ màu xanh lá mạ sang màu tím đỏ. BO2- + H+  HBO2 Hóa chất và thiết bị - Máy Kjeldahl bán tự động của hãng Prolabo - Burret 25 ml - Bếp nung - Bình chưng cất - H2SO4 đậm đặc - NaOH 32% - HCl 0,25N - Chất xúc tác: là hỗn hợp của 60 g selenium + 75 g CuSO4+ 865 g K2SO4 - Hỗn hợp chỉ thị màu: + Hòa tan 0,264 g methyl đỏ trong 250 ml cồn tuyệt đối. + Hòa tan 1,28 g bromo cresol blue trong 50 ml cồn tuyệt đối. Trộn đều hai dung dịch trên , bổ sung đến 1 lít bằng cồn tuyệt đối. - Dung dịch acid boric 4% với chỉ thị màu: hòa tan 80 g acid boric trong 1800 ml nước cất, đun nóng một chút, để nguội bổ sung 25 ml hỗn hợp chỉ thị màu. Bổ sung đến 2 lít bằng nước cất. Cách tiến hành - Vô cơ hóa mẫu + Nguyên tắc: sự vô cơ hóa chất đạm là sự vô cơ hóa tất cả các chất đạm dù ở bất cứ dạng nào (hữu cơ, protein, vô cơ) thành hợp chất vô cơ là amoniac sulphate (NH4)2SO4) đậm đặc và chất xúc tác. + Thực hành: cân 100 mg mẫu đã nghiền nhỏ, 1 g chất xúc tác cho vào ống phá mẫu + 5 ml H2SO4 đậm đặc, nối bộ thu khí và bắt đầu phá mẫu. Khi thời gian phá mẫu kết thúc để ống phá mẫu nguội. Bổ sung 50 ml nước cất, trộn đều và để nguội, lắp vào máy chưng cất. + Chưng cất Lắp ống phá mẫu vào máy chưng cất, bổ sung 80 ml NaOH 32%. Khởi động quá trình chưng cất, dịch chưng cất chuyển sang bình tam giác có chứa sẵn 20 ml dung dịch acid boric 4% có chỉ thị màu. Ngừng chưng cất khi dịch chưng cất ra không còn NH3 (thử bằng giấy quỳ). Chuẩn độ bằng HCl 0,25N. Ngừng chuẩn độ khi xuất hiện màu phớt đỏ. Tính kết quả Thông qua lượng HCl 0,25N ta biết được lượng acid boric kết hợp với NH3 và do vậy biết được NH3 giải phóng từ mẫu. 1 ml HCl 0,25N tương ứng với 0,0035 g nitơ hữu cơ. % Nitơ tổng số = C VHCl*100*0035.0 VHCl 0.25N : thể tích HCl 0,25N dùng để chuẩn độ. C (g): trọng lượng mẫu đem xác định. 2.2.7.3. Phương pháp xác định đạm amoniac [12] Nguyên tắc Trong nguyên liệu chứa đạm thường có một loại đạm dưới dạng vô cơ (muối amon hay các amin dễ bay hơi). Đây là dạng đạm tạo thành do sự phân hủy của protein (bị lên men thối hoặc quá trình phân hủy cacboxyl của acid amin) có bản chất là base, vì thế về khía cạnh dinh dưỡng thì loại đạm này không cần cho cơ thể. Nếu có nó ở hàm lượng cao thì nguyên liệu được đánh giá là kém chất lượng. Do loại đạm này có tính kiềm yếu nên dưới tác dụng yếu của MgO thì những loại đạm trên sẽ bị đuổi ra khỏi dung dịch, chúng sẽ bị lôi kéo theo hơi nước đến một bình chứa, có sẵn một lượng thừa acid. Sau đó đem định phân lượng acid dư, cho phép chúng ta xác định được loại đạm amoniac này. 2 (NH4) + + Mg(OH)2  2 NH3 + 2 H2O + Mg 2+ 2 NH3 + H2SO4  (NH4)2SO4. Hóa chất và thiết bị - Máy Kjeldahl bán tự động của hãng Prolabo. - Burret 25 ml. - MgO khan. - Dung dịch H2SO4 0,1N. - Dung dịch NaOH 0,1N. - Phenolphtalein 1%. Cách tiến hành Cân 1 g nguyên liệu hay sản phẩm hòa tan vào 10 ml nước cất cho vào ống phá mẫu. Cho vào 5 g MgO. Lắp ống phá mẫu vào máy chưng cất. Dịch chưng cất đưa vào một bình tam giác chứa 10 ml H2SO4 0,1N + 3 giọt phenolphtalein 1%. Chưng cất tới khi không còn NH3 (thử bằng giấy quỳ). Định phân lượng H2SO4 0,1N bằng NaOH 0,1N, ta sẽ biết được lượng acid phản ứng với NH3. Làm một mẫu đối chứng với 10 ml nước cất. Tính kết quả Gọi V0 là thể tích NaOH 0,1N thử không. Vt là thể tích NaOH 0,1N thử thật. V = V0 - Vt là lượng NaOH 0,1N tương đương với lượng NH3 phóng thích đã được hấp thụ trong H2SO4 0,1N.  Số g đạm amoniac trong 100 g mẫu: V . 0,0014 . 100 = V . 0,14 (g/ 100 g) Với 0,0014 là số gam đạm amoniac tương ứng với 1 ml NaOH 0,1N. 2.2.7.4. Phương pháp xác định đạm formol [12] Nguyên tắc Phương pháp này cho phép xác định đạm có trong acid amin, peptid. Như chúng ta đã biết, phân tử amin hay peptid có một đầu – COOH và đầu kia là – NH2. Formol sẽ tác dụng lên đầu – NH2 để tạo thành hợp chất metylen. Vì thế sản phẩm là hợp chất có chứa nhóm metylen, đầu – COOH có tính acid nên ta có thể định phân bằng NaOH, từ đó gián tiếp cho phép ta xác định được lượng – NH2 (tiêu biểu cho chất đạm trong nguyên liệu). Dụng cụ và thiết bị - Dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm. - Dung dịch formol pha loãng ½ (tỷ lệ 1:1) đã trung hòa bằng NaOH 0,1N: lấy 50ml dung dịch formol pha loãng ½, thêm vào vài giọt phenoltalein 1%, chuẩn độ bằng NaOH 0,1N cho đến khi dung dịch có màu hồng nhạt. - Dung dịch NaOH 0,1N. - Chất chỉ thị màu phenolphtalein 1% trong cồn. Cách tiến hành - Cân 2 g mẫu tươi, thêm 10 ml nước cất, lọc qua giấy lọc, chỉnh nước đến 20 ml. - Hút 10 ml dịch lọc vào bình tam giác, thêm vào 10 ml dung dịch formol pha loãng ½ đã trung hòa bằng NaOH 0,1N + vài giọt phenoltalein 1%, lắc đều để phản ứng xảy ra hoàn toàn. Sau đó, định phân bằng NaOH đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt, lấy màu chuẩn là màu của formol sau khi trung hòa. - Thưc hiện 3 lần thử thật, 3 lần thử không (thay 10 ml dịch lọc bằng 10 ml nước cất) Tính kết quả Gọi: V0 là thể tích NaOH 0,1N trung bình của 3 lần thử không. Vt là thể tích NaOH 0,1N trung bình của 3 lần thử thật. V = Vt - V0 : lượng NaOH trung hòa nhóm – COOH. Từ đó suy ra số mol NaOH có trong V (ml): )(10** 1000 1.0** 4 molXV XV   Với: X là hệ số chỉnh lý dung dịch NaOH 0,1N. - Số mol NaOH tương ứng với số nhóm – COOH, tương ứng với số nhóm – NH2, tương ứng với số mol – NH2 là: V . X . 10-4 (mol) - Số gam đạm có trong 10 ml dung dịch nguyên liệu pha loãng 10 lần là: 14 . V . X . 10-4 (mol) - Số gam đạm có trong 10 ml dung dịch nguyên liệu chưa pha loãng là: 14 . V . X . 10-4 . 10 = 14 . V . X . 10-3 (gam) - Số gam đạm có trong 1 lít nguyên liệu: )/(**141000*10* 10 **14 3 lgXV XV    2.2.7.5. Phương pháp xác định đường tổng [11] Nguyên tắc Sự định phân hàm lượng đường tổng số hòa tan dựa trên phản ứng màu đặc trưng bởi đường và nhiều chất hữu cơ với sự hiện diện của H2SO4. Sự chuẩn xác của kết quả phụ thuộc : - Độ sạch của dụng cụ.. - Độ tinh khiết của thuốc thử nhất là H2SO4. - Nhiệt độ phải cố định trong suốt thời gian phản ứng. Dụng cụ và hóa chất - Bình định mức 500 ml, 100 ml, 50 ml. - Erlen 50 hay 100 ml. - Cối chày sứ. - Phễu lọc. - Ống nghiệm. - Ống hút. - Quang phổ kế. - Cồn 960, cồn 800. - Phenol 5%. - H2SO4 đậm đặc. - Dung dịch đường saccharose 0,1%: 500 mg saccharose sấy khô ở 60oC, hòa tan trong 50 ml nước cất. Cách tiến hành - Cách trích đường: lấy 2 g nguyên liệu tươi đã nghiền nhỏ cho vào cốc thủy tinh 50 ml và thêm 10 ml cồn 96o. Đun sôi trên nồi cách thủy cho sôi 3 lần. Khuấy đều bằng đũa thủy tinh. Sau đó để nguội, lọc qua giấy lọc không tro. - Sau đó, cho 10 ml cồn 80o vào cốc đựng bã, khuấy đều đun sôi 2 lần trên bếp cách thủy. Để nguội lọc tiếp tục, chiết rút như vậy khoảng 2 lần, xong để bã lên lọc và rửa 2 – 3 lần bằng cồn 80o (rửa từng ít một). - Cồn qua lọc được cho bay hơi ở nhiệt độ phòng hoặc trên lò cách thủy đun nhẹ. Sau khi cồn bay hơi hết, mẫu có thể để lâu trong bình hút ẩm. - Cặn khô trong cốc được pha loãng thành 50 ml với nước cất (bình định mức). Nếu có cặn thì để lắng xuống. Khi đem làm hiện màu, dung dịch này có thể pha loãng thành 5 – 10 lần tùy nồng độ nhiều hay ít. - Thực hiện phản ứng màu: hút 1 ml đường cho vào ống nghiệm rồi thêm vào 1 ml dung dịch phenol 5%. Sau đó, cho chính xác 5 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc vào ống nghiệm. Để 10 phút rồi lắc đều, giữ trên nồi cách thủy 10 – 20 phút ở 25 – 30oC để xuất hiện màu. Màu bền vững trong vài giờ. Xác định cường độ màu trong quang phổ kế ở 490 nm. Xây dựng đường chuẩn Lấy 7 bình định mức 100 ml rồi cho vào theo thứ tự 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ml dung dịch đường saccharose mẫu 0,1% cho nước cất tới vạch định mức. Từ mỗi bình lấy ra 1ml cho vào ống rồi nhuộm màu bằng phenol 5% và H2SO4 đậm đặc như ở trên. Trong mỗi ống nghiệm sẽ chứa tương đương 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 g saccharose. So màu ở bước sóng 490 nm, sau đó vẽ đồ thị mẫu. Làm thêm một ống thử với 1 ml nước cất. Tính kết quả Trị số mật độ quang (OD) của những ống đối chứng sau khi trừ đi trị số của ống thử sẽ xác định được một đường cong mẫu.Với dung dịch cần xác định nồng độ, ta cũng trừ đi ống thử rồi chiếu lên đường cong mẫu để suy ra nồng độ x trong ống, từ đó tính % lượng đường trong mẫu. 2.2.7.6. Phương pháp xác định đường khử [2] Nguyên tắc Trong môi trường kiềm, đường khử kali ferixianua thành kali peroxia. Với sự có mặt của gelatin, kali ferixianua kết hợp với sắt sulphate tạo thành một chất có màu xanh bền. Cường độ màu được xác định trên máy so màu. Phương pháp này cho phép xác định lượng đường rất thấp trong dung dịch (0,01 – 0,1 mg/ml). Dụng cụ và hóa chất - Dung dịch kali ferixianua (K3Fe(CN)6): hòa tan 1,65 K3Fe(CN)6và 10 g NaNO3 trong 1 lít nước cất. Bảo quản dung dịch trong lọ thủy tinh màu nâu. - Dung dịch sắt sulphate (Fe2(SO4)3): hòa tan 1 g Fe2(SO4)3 trong 10 ml H2SO4 đậm đặc. Đổ từ từ dung dịch vào nước cất có sẵn trong bình định mức, pha loãng thành 1000 ml. - Gelatin 10%. - Trộn lẫn dung dịch Fe2(SO4)3 và Gelatin 10% theo tỉ lệ 20 : 1. Hỗn hợp dung dịch chỉ sử dụng trong ngày. Cách tiến hành Lấy 1 g nguyên liệu hòa tan trong 20 ml nước cất, lọc lấy dịch lọc (dịch đường), rửa bã lọc sau đó hiệu chỉnh đến mức 50 ml. Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch chiết đường và 2 ml dung dịch kali ferixianua, khuấy đều, đun trên nồi cách thủy sôi 15 phút. Sau đó để nguội, thêm vào ống nghiệm 4 ml dung dịch Fe2(SO4)3 khuấy đều và dẫn đến mức 20 ml. Đo cường độ màu ở bước sóng 710 nm. Tính kết quả Dựa vào mật độ quang (OD) đối chiếu với độ thị chuẩn, tính lượng đường. 2.2.7.7. Phương pháp xác định hàm lượng lipid thô [3] Nguyên tắc Nguyên liệu được làm khô, sau đó trích ly lipid ra khỏi nguyên liệu bằng ether dầu hỏa hoặc ether ethylic trên máy Soxhlet và xác định khối lượng chất béo. Dụng cụ và hóa chất - Máy Soxhlet. - Giấy lọc. - Ether dầu hỏa ether ethylic. Cách tiến hành - Giấy lọc được sấy ở 105oC đến trọng lượng không đổi. - Nguyên liệu và sản phẩm được nghiền nhỏ, sấy ở 105oC đến trọng lượng không đổi. - Cân chính xác 2- 5 g nguyên liệu khô tuyệt đối cho vào giấy lọc và gói lại cho kín không để mẫu rơi ra ngoài. Để giấy lọc có chứa mẫu vào trụ chiết của máy Soxhlet. Chiết bằng ether dầu hỏa hoặc ether ethylic. Sau khi chiết hết lipid (khoảng 8 giờ), lấy túi mẫu ra, cho bay hết dung môi, sấy khô đến trọng lượng không đổi. Tính kết quả Hàm lượng lipid thô được tính theo công thức X= c ba 100*)(  X : hàm lượng lipid %. a : trọng lượng giấy lọc và mẫu trước khi chiết (g). b : trọng lượng giấy lọc và mẫu sau khi chiết (g). c : trọng lượng mẫu lấy để phân tích lipid. 2.2.7.8. Phương pháp xác định peroxide [3] Nguyên lý Chỉ số peroxid là số g iot giải phóng ra bởi peroxid có trong 100 g mẫu. R1 - CH - CH - R2 + 2 KI + 2 CH3COOH O O R1 - CH2 – CH - R2 + 2 CH3COOK + H2O + I2 O I2 + 2 Na2S2O3  2 NaI + Na2S4O6. Nguyên liệu và hóa chất - Acid acetic. - Dung dịch KI bão hòa (pha dùng ngay), lắc kỹ đậy nút cẩn thận. - Dung dịch Na2S2O3 0,01N. - Dung dịch hòa tinh bột 1%. - Cloroform. Cách tiến hành Lấy 1 g mẫu khô tuyệt đối, ống đối chứng 1 ml nước cất. Mỗi bình cho 10 ml dung dịch hỗn hợp acid acetic : Cloroform (2:1), 1 ml dung dịch KI bão hòa (mới pha), cho erlen vào chỗ tối 10 phút. Cho thêm vào erlen 0,5 ml chỉ thị hồ tinh bột 1% chuẩn độ iod tạo thành bằng dung dịch Na2S2O3 (đến khi mất màu nâu). Tính kết quả Chỉ số peroxide P= C fba 100*01269.0**)(  a : số ml dung dịch Na2S2O3 dùng chuẩn mẫu thật. b : số ml dung dịch Na2S2O3dùng chuẩn mẫu thử không . c : trọng lượng mẫu.. f : hệ số hiệu chỉnh của dung dịch Na2S2O3 0,01N. 0,01269: số gam iod tương ứng với 1 ml dung dịch Na2S2O3 0,01N. 100: hệ số quy chuẩn 100 g chất béo. 2.2.7.9. Định lượng bào tử Bacillus subtilis sp. trong sản phẩm bằng phương pháp đếm khuẩn lạc [17] Nguyên tắc Cấy một thể tích xác định mẫu huyền phù vi sinh vật cấy lên môi trường thạch có thành phần cơ chất đặc trưng và thích hợp cho loài vi sinh vật cần định lượng phát triển. Sau một khoảng thời gian nuôi cấy, trên bề mặt thạch sẽ xuất hiện các khuẩn lạc. Dựa vào số khuẩn lạc đếm được, thể tích mẫu đã cấy và hệ số pha loãng, ta có thể suy ra số khuẩn lạc có trong 1 ml mẫu khảo sát ban đầu. Cách tiến hành - Xác định bào tử có trong sản phẩm Nhuộm bào tử: bào tử của Bacillus subtilis sp. có màu hồng, thường nằm giữa tế bào có màu xanh. - Khử trùng mẫu theo kiểu Pasteur là biện pháp hấp nóng nguyên liệu một lần ở nhiệt độ thấp hơn 100oC. Nhiệt độ và thời gian khử trùng theo kiểu Pasteur tùy thuộc vào sức đề kháng của vật liệu đối với nhiệt độ. Đun nóng dịch tế bào thu được từ các thí nghiệm trên ở nhiệt độ 80oC trong 15 phút. - Pha loãng dịch huyền phù bào tử ở các nồng độ thích hợp 10-1, 10-2, 10-3… Tiến hành cấy 0,1 ml dịch mẫu ở các độ pha loãng khác nhau vào các đĩa Petri môi trường NA đã được đổ sẵn. Đặt các đĩa thạch vừa cấy ở nhiệt độ phòng và ủ trong 24 giờ. - Kết thúc thời gian ủ, lấy các đĩa thạch ra, tiến hành đếm khuẩn lạc và tính số lượng bào tử trong 1 ml mẫu. Thí nghiệm lặp lại 2 lần. Tính kết quả Mật độ tế bào được tính theo công thức sau: C (CFU/ml) = N n1V1f1 + …+ niVifi Trong đó: C (CFU/ml): số tế bào vi khuẩn trong 1 ml mẫu. N (CFU): tổng số khuẩn lạc đếm trên các đĩa. ni: số đĩa cấy ở nồng độ pha loãng thứ i. Vi(ml): thể tích mẫu cấy trong mỗi đĩa. fi: độ pha loãng thứ i. 2.2.8. Phương pháp đánh giá cảm quan sản phẩm 2.2.8.1. Phương pháp mô tả mùi - vị [4] Mục đích Xác định nồng độ hương, lượng đường aspartam bổ sung vào thức uống chức năng đậu hũ nhằm cải thiện mùi vị của nguyên liệu ban đầu, tăng giá trị cảm quan. Cơ sở Phương pháp mô tả mùi - vị (flavor profile) có nguồn gốc từ nhóm tư vấn Arthur D. Little vào cuối những năm 1940. Vào thời điểm đó, nhóm này cung cấp một công cụ chung để đánh giá tính chất đặc trưng hương - vị của một thực phẩm và thay thế phương pháp sử dụng chuyên gia thử nếm bằng một hội đồng gồm các thành viên được huấn luyện. Không giống các phương pháp thực nghiệm hiện đại, phương pháp luận của flavor profile sử dụng một quá trình “đồng thuận”. Những đánh giá riêng biệt của nhóm bắt đầu bằng làm việc độc lập với nhau nhưng sau đó lại tập hợp lại trong một nhóm để kết thúc flavor profile. Cách tiến hành - Tổ chức 3 nhóm, mỗi nhóm 5 người. - Chuẩn bị sản phẩm + Đánh giá hương (hương phomai): chuẩn bị các mẫu thử với nồng độ hương khác nhau, được kí hiệu như bảng 2.2. Bảng 2.2. Kí hiệu mẫu thử hương Tỉ lệ hương 0/00 (v/w) 10/00 2 0/00 3 0/00 4 0/00 Kí kiệu mẫu A B C D + Đánh giá vị (đường aspartam): chuẩn bị các mẫu thử với nồng độ đường khác nhau, được kí hiệu như bảng 2.3. Bảng 2.3. Kí hiệu mẫu thử vị Tỉ lệ đường 0/00 (mg/g) 0.350/00 (1 gói) 0.70/00 (2 gói) 1.050/00 (3 gói) 1.400/00 (4 gói) Kí kiệu mẫu A B C D - Thử sản phẩm, mỗi thành viên làm việc độc lập, ghi lại cảm nhận của từng sản phẩm và chọn ra sản phẩm vừa miệng. 2.2.8.2. Phương pháp phép thử cho điểm thị hiếu [22] Mục đích Tìm hiểu mức độ hài lòng, ưa thích của người sử dụng đối với sản phẩm thức uống chức năng từ đậu hũ thủy phân lên men lactic. Nguyên tắc Người thử được mời thử sản phẩm nhưng thay vào việc đánh giá cường độ của một tính chất cảm quan nào đó họ sẽ “đo” mức độ ưa thích, hài lòng của mình đối với sản phẩm bằng thang điểm 9 đã được định nghĩa trước thông qua các thuật ngữ mô tả cấp độ hài lòng, ưa thích: 1. Cực kỳ không thích 2. Rất không thích 3. Không thích 4. Tương đối không thích 5. Không thích cũng không ghét 6. Tương đối thích 7. Thích 8. Rất thích 9. Cực kỳ thích Cách tiến hành - Chuẩn bị mẫu thử. - Chọn đối tượng thử: 100 người ở khu phố 1 - P.Hiệp Bình Phước - Q. Thủ Đức - Tp.HCM với đầy đủ các lứa tuổi, giới tính và mức thu nhập. - Thử và cho điểm sản phẩm theo thang 9 diểm với mức đánh giá như trên. 2.2.9. Phương pháp xử lý số liệu 2.2.9.1. Phương pháp xử lý số liệu quy hoạch thực nghiệm Mục đích - Xây dựng phương trình hồi quy. - Kiểm tra phương trình hồi quy có tương thích với thực nghiệm hay không. Cách tiến hành Phương trình hồi quy có dạng: Y = b0 + b1X1 + b2X2 + b3X3 + b12X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3 + b123X1X2X3. Để kiểm định tính ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy và sự tương thích của phương trình hồi quy với thực nghiệm, ta tìm phương sai tái hiện ở thí nghiệm tại tâm. - Giá trị trung bình của 3 thí nghiệm tại tâm: y = yu 3 u= 1 3 - Phương sai tái hiện sth 2 =  3 u = 1 (yu - y ) 2 n0 - 1  sth - Phương sai các hệ số: sbj = sth N - Các hệ số trong phương trình hồi quy được xác định như sau: bj = 1 N  N i = 1 xịyi - Đánh giá mức ý nghĩa của các hệ số theo tiêu chuẩn Student. + Tra bảng tp(f) = t0.05(2) = 4.3 khi chọn p=0.05 + Tính các giá trị t theo công thức sau: tj = | |bj sbj So sánh các giá trị t với tp(f) để xác định phương trình hồi quy tương ứng. - Đánh giá mức độ tương thích của phương trình theo tiêu chuẩn Fisher. + Tính các giá trị của y theo phương trình hồi quy đã xác định ^ y s2tt =  i = n i = 1 (yi - ^ yi ) /n-l + Tính F F = s 2 tt s2th + Giá trị ở bảng của tiêu chuẩn Fisher với mức ý nghĩa p = 0.05, các bậc tự do f1 = 3; f2 = 2 là F1- p(f1, f2) = 19.2. Nếu Ftính < F1-p(f1, f2) thì phương trình hồi quy tương quan với thực nghiệm, còn ngược lại thì không. 2.2.9.2. Phương pháp xử lý số liệu đánh giá cảm quan bằng toán học thống kê Trong thí nghiệm đánh giá cảm quan, tiến hành trên mẫu gồm 100 người thử. Mục đích - Xác định mức đánh giá sản phẩm theo thang điểm được xây dựng. - Kiểm tra kết quả thu được có tin cậy không. Cách tiến hành - Lập bảng phân phối thí nghiệm Điểm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Số người - Tính các tham số + Trung bình cộng - X = 1 f  i = 9 i = 1 Xifi Với Xi : điểm số; fi là số người cho điểm Xi. + Sai số trung bình cộng m = S/ f Với S là mức độ phân tán quanh giá trị trung bình S = ± f 1  i = 9 i = 1 fi(Xi - - X) + Hệ số biến thiên Cv%: phản ánh mức độ biến thiên trong nhiều tập hợp có X khác nhau. Cv% = S - X *100% Cv% = 0%-10% : dao động nhỏ, đáng tin cậy. Cv% = 10%-30%: dao động trung bình, tin cậy. Cv% = 30%-100%: dao động lớn, ít tin cậy. - Vẽ đồ thị. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG TRONG ĐỀ TÀI 3.1.1. Bacillus subtilis sp. (BsTC) và Bacillus natto sp. (Bn) 3.1.1.1. Đặc điểm hình thái Hình 3.1. Khuẩn lạc của BsTC (trái) và Bn (phải) Hình 3.2. Tế bào và bào tử của BsTC (trái) và Bn (phải) Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái vi khuẩn BsTC và Bn Đặc điểm BsTC Bn Hình dạng khuẩn lạc Khuẩn lạc to; màu trắng đục, bám vào mặt thạch; bề mặt khuẩn lạc hơi nhăn, nhớt. Khuẩn lạc to; trắng đục, bám vào mặt thạch; bề mặt có thể nhăn hoặc trơn. Hình dạng tế bào Hình que, đứng riêng rẽ hay kết chuỗi. Tế bào có mang bào tử hình trứng; bào tử nằm ở giữa tế bào sinh dưỡng. Hình que, đứng riêng rẽ hay kết chuỗi. Tế bào có mang bào tử hình trứng; bào tử nằm ở giữa tế bào sinh dưỡng. Kích thước tế bào 1 - 1,5 µm 1 - 1,5 µm Bào tử Nhuộm Gram Gram dương Gram dương Nhận xét Như vậy, về mặt hình thái thì Bacillus subtilis sp. không khác gì so với Bacillus natto sp., do đó nếu dựa vào tiêu chí này thì không phân biệt hai chủng vi khuẩn trên. 3.1.1.2. Đặc điểm sinh lý  Đường cong sinh trưởng của BsTC và Bn trên môi trường CP Bảng 3.2. Kết quả mật độ tế bào theo thời gian Thời gian (giờ) BsTC (logCFU/ml) Bn (logCFU/ml) 0 3.64 2.85 4 4.71 3.42 8 5.98 5.16 12 7.46 6.23 16 8.15 6.77 20 8.27 7.19 24 8.33 7.78 28 8.39 7.96 32 8.28 8.19 36 7.92 8 40 7.47 6.92 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 Thời gian (giờ) lo g C F U /m l Đồ thị 3.1. Đường cong sinh trưởng của BsTC và Bn trên môi trường CP Nhận xét Từ đường cong sinh trưởng của vi khuẩn BsTC và Bn trên môi trường CP, chúng tôi nhận thấy: - Pha lag của cả hai đường cong đều kéo dài trong khoảng từ 0-2 giờ đầu, số lượng tế bào tăng lên không đáng kể. Độ dài pha lag tương đối ngắn, chứng tỏ các tế bào vi khuẩn còn trẻ, nhanh chóng thích nghi với môi trường CP. Sau đó, vi khuẩn bắt đầu sinh trưởng và phát triển theo lũy thừa do vi khuẩn đã thích nghi với môi trường và trong môi trường giàu chất dinh dưỡng. Mật độ tế bào đạt cực đại ở 28 giờ ở BsTC khoảng 2,43.10 8 và 32 giờ ở Bn khoảng 1,56.108. - Pha ổn định kéo dài từ 20-32 giờ, trong giai đọan này sinh sản vẫn tiếp tục diễn ra ở một số tế bào trong môi trường nuôi cấy. - Sau 32 giờ, mật độ tế bào giảm dần do môi trường ngày càng cạn kiệt chất dinh dưỡng, đồng thời các sản phẩm trao đổi chất của chúng sinh ra cũng ức chế lại sự phát triển của vi khuẩn. Kết luận Mật độ tế bào đạt cực đại ở BsTC cao và sớm hơn Bn: 28 giờ ở BsTC khoảng 2,43.10 8 và 32 giờ ở Bn khoảng 1,56.108.  Đường cong sinh trưởng của BsTC và Bn trên môi trường sữa đậu nành Bảng 3.3. Kết quả mật độ tế bào theo thời gian Thời gian (giờ) BsTC (logCFU/ml) Bn (logCFU/ml) 0 7.84 7.63 4 7.86 7.78 8 8.00 7.94 12 8.56 8.02 16 8.78 8.23 20 8.98 8.63 24 9.23 9.01 28 9.45 9.24 32 9.40 9.31 36 9.34 9.29 40 9.06 8.87 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 Thời gian (giờ) lo g C F U /m l Đồ thị 3.2. Đường cong sinh trưởng BsTC và Bn trên môi trường sữa đậu nành Nhận xét: - Pha lag của BsTC khoảng từ 0-8 giờ ngắn hơn của Bn khoảng từ 0-16 giờ. - Mật độ tế bào cực đại của BsTC ở 28 giờ, của Bn là 32 giờ. Kết luận: Chúng tôi kết thúc quá trình tăng sinh vi khuẩn trong môi trường sữa đậu nành sau 24 giờ nuôi cấy (đối với BsTC ) và 28 giờ (đối với Bn). 3.1.1.3. Đặc điểm sinh hóa  Phản ứng nitratase dương tính (1): (-) H2O (2): (+) Pseudomonas aeruginosa (3): (+) BsTC (4): (+) Bn Hình 3.3. Thử nghiệm nitratase  Khả năng thủy phân casein Hình 3.4. Phản ứng thủy phân casein của BsTC (trái) và Bn (phải) 1 2 3 4  Khả năng thủy phân fibrin Hình 3.5. Phản ứng thủy phân fibrin của BsTC (trái) và Bn (phải)  Khả năng thủy phân tinh bột Hình 3.6. Phản ứng thủy phân tinh bột của BsTC (trái) và Bn (phải) Nhận xét Kết quả cho thấy cả BsTC và Bn đều có khả năng thủy phân protein, tinh bột. Đây là đặc điểm quan trọng để ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, cụ thể là thủy phân đậu hũ làm thức uống chức năng. Thêm vào, chúng có khả năng thủy phân fibrin làm tăng thêm giá trị probiotic vì có tác dụng tốt trong các bệnh tim mạch. 3.1.2. Lactobacillus sp. 3.1.2.1. Đặc điểm hình thái Hình 3.7. Khuẩn lạc Lactobacillus sp. Hình 3.8. Tế bào Lactobacillus sp. Bảng 3.4. Đặc điểm hình thái Lactobacillus sp. Hình dạng khuẩn lạc Khuẩn lạc nhỏ tròn, màu trắng đục Hình dạng tế bào Hình que, đứng riêng rẽ Kích thước tế bào 0,5-1 µm Nhuộm Gram Gram dương 3.1.2.2. Đặc điểm sinh lý  Khả năng làm đông tụ sữa (+): đông tụ sữa sau cấy Lactobacillus sp. vào sữa đậu nành 24 giờ. (ĐC): sữa đậu nành đã được hấp tiệt trùng, không cấy giống vi khuẩn. Hình 3.9. Khả năng làm đông tụ sữa của Lactobacillus sp.  Kết quả định tính acid lactic Ống 1: 3 ml dịch môi trường, 3 ml thuốc thử Ufermen. Ống 2: 3 ml dịch lên men, 3 ml thuốc thử Ufermen. Ống 3: 3 ml acid lactic 98 %, 3 ml thuốc thử Ufermen. Hình 3.10. Kết quả định tính acid lactic 3.1.2.3. Đặc điểm sinh hóa * Oxydase âm tính 1: Lactobacillus sp.(-) 2: (-) E.coli 3: (+) Pseudomonas 4: H2O Hình 3.11. Thử nghiệm oxydase * Catalase âm tính, không có hiện tượng sủi bọt Staphylococcus aureus dương tính Vi khuẩn lactic âm tính Hình 3.12. Thử nghiệm catalase * 1 2 3 1 2 3 4 + Thử nghiệm nitratase: Nitratase âm tính 1: (-) H2O 2: (+) Pseudomonas. 3: (-) Lactobacillus acidophilus 4: Lactobacillus sp. Hình 3.13. Thử nghiệm nitratase * Khả năng lên men glucose (1): ĐC (-): môi trường phenol red broth (2): ĐC (+): E.coli (3): Lactobacillus sp. Hình 3.14. Thử nghiệm khả năng lên men glucose 3.2. KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG HỆ ENZYME CỦA BsTC và Bn 3.2.1. Kết quả khảo sát hoạt tính chung enzyme amylase của BsTC và Bn 3.2.1.1. Kết quả khảo sát hoạt tính amylase của BsTC và Bn theo thời gian Bảng 3.5. Sự biến thiên hoạt tính amylase của BsTC và Bn theo thời gian Thời gian (giờ) BsTC Bn OD ĐVHT/gMT OD ĐVHT/gMT 0 1.044 0.0126 1.05 0.0123 4 1.019 0.0139 1.012 0.0143 8 1.000 0.0149 0.911 0.0195 12 0.988 0.0155 0.902 0.02 16 0.848 0.0228 0.875 0.0214 20 0.771 0.0267 0.848 0.0228 24 0.623 0.0344 0.723 0.0292 28 0.495 0.041 0.761 0.0273 32 0.595 0.0357 0.605 0.0354 36 0.732 0.0288 0.677 0.0316 40 0.835 0.0235 0.932 0.0184 1 2 3 4 1 2 3 00.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.04 0.045 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 Thời gian (giờ) H o ạ t tí n h ( Đ V H T /g M T ) Đồ thị 3.3. Sự biến thiên hoạt tính amylase của BsTC và Bn theo thời gian Nhận xét - Hoạt tính enzyme amylase của cả hai chủng tăng không đáng kể trong thời gian đầu, tăng rõ ở 16 - 32 giờ và đạt cực đại ở 28 giờ (BsTC ) và 32 giờ (Bn), sau đó giảm dần. - Nhìn chung, hoạt tính enzyme amylase của Bn thấp hơn, biến động hơn và thời gian đạt cực đại lâu hơn so với BsTC. 3.2.1.2. Kết quả khảo sát hoạt tính amylase của BsTC và Bn theo nhiệt độ Bảng 3.6. Sự biến thiên hoạt tính enzyme amylase của BsTC và Bn theo nhiệt độ 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.04 0.045 15 20 25 30 35 40 45 Nhiệt độ H oạ t t ín h (Đ V H T/ gM T) Nhiệt độ (0C) BsTC Bn OD ĐVHT/gMT OD ĐVHT/gMT 15 0.066 0.0194 0.109 0.0261 20 0.051 0.0301 0.105 0.0276 25 0.041 0.0373 0.086 0.0346 30 0.037 0.0401 0.074 0.0391 35 0.04 0.038 0.076 0.0384 40 0.043 0.0358 0.081 0.0365 45 0.053 0.0287 0.123 0.0209 Đồ thị 3.4. Sự biến thiên hoạt tính amylase của BsTC và Bn theo nhiệt độ Nhận xét Nhìn vào đồ thị, ta thấy hoạt tính enzyme amylase của hai chủng giống theo nhiệt độ tương đương nhau, chúng có hoạt tính cao nhất vào khoảng 300C, tuy nhiên hoạt tính của Bn thấp hơn BsTC nhưng không đáng kể. 3.2.1.3. Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme amylase của BsTC và Bn theo pH Bảng 3.7. Sự biến thiên hoạt tính enzyme amylase của BsTC và Bn theo pH pH BsTC Bn OD ĐVHT/gMT OD ĐVHT/gMT 2 0.722 0.014 0.844 0.0051 3 0.722 0.014 0.69 0.0163 4 0.721 0.0141 0.622 0.0213 5 0.631 0.0206 0.576 0.0247 6 0.41 0.0346 0.54 0.0273 7 0.498 0.0303 0.553 0.0263 8 0.692 0.0162 0.594 0.0233 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.04 2 3 4 5 6 7 8 pH H o ạ t tí n h ( Đ V H T /g M T ) Đồ thị 3.5. Sự biến thiên hoạt tính enzyme amylase của BsTC và Bn theo pH Nhận xét Trong điều kiện pH = 2 (dịch vị dạ dày), cả hai chủng giống đều có khả năng phân giải tinh bột của đậu hũ nhưng không cao, chúng đạt cực đại khi pH = 6. 3.2.1.4. Tối ưu điều kiện ảnh hưởng đến hoạt tính chung enzyme amylase của BsTC và Bn Từ kết quả trên, chúng tôi tiến hành làm quy hoạch thực nghiệm, chọn các yếu tố ảnh hưởng với các giới hạn và miền khảo sát như ở bảng 3.8. Bảng 3.8. Điều kiện thí nghiệm được chọn Yếu tố Các mức Khoảng Hàm mục tiêu Y là hoạt tính enzyme amylase thu được sau đo OD595. Phương trình biểu diễn mối quan hệ có dạng Y = f (X1, X2, X3) Thiết lập ma trận thí nghiệm và thu được kết quả như bảng 3.9. Bảng 3.9. Ma trận và kết quả quy hoạch thực nghiệm các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính chung enzyme amylase của BsTC và Bn Mẫu thí nghiệm X1 X2 X3 Y BsTC Bn 1 + + + 0.0421 0.024 2 + + - 0.0392 0.02 3 + - + 0.0343 0.016 4 + - - 0.0352 0.018 5 - + + 0.0278 0.018 6 - + - 0.0322 0.015 7 - - + 0.029 0.013 8 - - - 0.0325 0.014 9 0 0 0 0.0427 0.027 10 0 0 0 0.0438 0.029 11 0 0 0 0.0431 0.03 Y = 0.034 + 0.0037 X1+ 0.0013X2 - 0.00074X3 + 0.0017X1X2 + 0.001238X1X3 (1) Y = 0.01725 + 0.00225X1 + 0.002X2 (2) Ghi chú: (-): mức dưới; (0): tâm; (+): mức trên. Sau khi giải bài toán quy hoạch thực nghiệm và tính các hệ số phương trình hồi quy, ý nghĩa của các hệ số được kiểm tra theo tiêu chuẩn Student với p = 0.05, số bậc tự do f = 3-1 = 2, chúng tôi thu được phương trình hồi quy (1) của chủng BsTC và phương trình hồi quy (2) của Bn.. Kiểm tra sự tương thích phương trình hồi quy với thực nghiệm theo tiêu chuẩn Fisher với Ftính = 6.0516 (BsTC) , Ftính = 5.128 (Bn); F0.95(5.2) = 19.296. Do Ftính của cả hai phương trình hồi quy về hoạt tính chung amylase ở BsTC và Bn đều bé hơn F0.95(5.2) nên cả hai phương trình hồi quy đó đều tương thích với thực nghiệm. Mức dưới (-) Tâm (0) Mức trên (+) biến thiên BsTC Bn BsTC Bn BsTC Bn X1 : thời gian 24 28 28 32 32 36 4 X2 : nhiệt độ 25 25 30 30 35 35 5 X3 : pH 5 5 6 6 7 7 1 3.2.2. Kết quả khảo sát hoạt tính chung enzyme protease của BsTC và Bn 3.2.1.1. Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme protease của BsTC, Bn theo thời gian Bảng 3.10. Sự biến thiên hoạt tính protease của BsTC và Bn theo thời gian Thời gian (giờ) BsTC Bn OD ĐVHT/gMT OD ĐVHT/gMT 0 0,081 2.236 0.079 2.116 4 0,092 2.957 0.093 3.028 8 0,11 4.35 0.099 3.467 12 0,135 6.724 0.122 5.426 16 0,148 8.159 0.133 6.515 20 0,168 10.638 0.139 7.151 24 0,183 14.502 0.14 7.259 28 0,203 15.761 0.149 8.276 32 0,176 11.86 0.176 11.721 36 0,132 8.99 0.159 9.482 40 0,109 4.963 0.143 7.591 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 Thời gian (giờ) H o ạ t tí n h ( Đ V H T /g M T ) Đồ thị 3.6. Sự biến thiên hoạt tính protease của BsTC và Bn theo thời gian Nhận xét Hoạt tính protease của cả hai chủng giống đều tăng dần trong khoảng từ 12-32 giờ, sau đó giảm dần. Với BsTC, hoạt tính protease đạt cực đại ở 28 giờ còn Bn thì ở 32 giờ. Nhìn chung, hoạt tính protease của BsTC cao hơn của Bn. 3.2.1.2. Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme protease của BsTC, Bn theo nhiệt độ Bảng 3.11. Sự biến thiên hoạt tính protease của BsTC và Bn theo nhiệt độ Nhiệt độ (0C) BsTC Bn OD ĐVHT/gMT OD ĐVHT/gMT 15 0.548 25.036 0.556 27.229 20 0.580 34.122 0.629 49.654 25 0.685 69.805 0.636 52.033 30 0.733 89.114 0.655 58.691 35 0.731 88.272 0.634 51.349 40 0.675 66.018 0.619 46.324 45 0.647 55.852 0.525 19.022 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 15 20 25 30 35 40 45 Nhiệt độ H o ạ t tí n h ( Đ V H T /g M T ) Đồ thị 3.7. Sự biến thiên hoạt tính protease của BsTC và Bn theo nhiệt độ Nhận xét Cả hai chủng giống đều cho hoạt tính protease cao nhất ở 300C nhưng hoạt tính chung protease của BsTC cao hơn đáng kể so với Bn. 3.2.1.2. Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme protease của BsTC và Bn theo pH Bảng 3.12. Sự biến thiên hoạt tính enzyme protease của BsTC và Bn theo pH pH BsTC Bn OD ĐVHT/gMT OD ĐVHT/gMT 2 0.028 0.04 0.031 0.087 3 0.029 0.055 0.032 0.105 4 0.061 0.964 0.032 0.105 5 0.07 1.37 0.06 0.923 6 0.081 1.957 0.068 1.274 7 0.079 1.843 0.072 1.47 8 0.071 1.419 0.057 0.805 0 0.5 1 1.5 2 2.5 2 3 4 5 6 7 8 pH H o ạ t tí n h ( Đ V H T /g M T ) Đồ thị 3.8. Sự biến thiên hoạt tính enzyme protease của BsTC và Bn theo pH Nhận xét Trong điều kiện pH thay đổi thì hoạt tính protease cũng thay đổi theo, đạt giá trị cực đại ở pH = 6 đối với BsTC và ở pH = 7 đối với Bn. 3.2.1.4. Tối ưu điều kiện ảnh hưởng đến hoạt tính chung enzyme protease của BsTC và Bn Từ kết quả khảo sát từng yếu tố, chúng tôi tiến hành làm quy hoạch thực nghiệm khảo sát hoạt tính protease chung các yếu tố. Các giới hạn và miền khảo sát của các yếu tố như ở bảng 3.13. Bảng 3.13. Điều kiện thí nghiệm được chọn Hàm mục tiêu Y là hoạt tính enzyme protease thu được sau đo OD660. Phương trình biểu diễn mối quan hệ có dạng Y = f (X1, X2, X3) Thiết lập ma trận thí nghiệm và thu được kết quả như bảng 3.14. Bảng 3.14. Ma trận và kết quả quy hoạch thực nghiệm các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính chung enzyme protease của BsTC và Bn Mẫu thí nghiệm X1 X2 X3 Y BsTC Bn 1 + + + 1.19 2.01 2 + + - 2.72 2.07 3 + - + 1.92 2.12 4 + - - 3.78 2.141 5 - + + 1.95 1.058 6 - + - 2.206 1.534 7 - - + 1.95 1.649 8 - - - 2.272 1.708 9 0 0 0 4.579 2.206 10 0 0 0 4.461 2.344 11 0 0 0 4.45 2.549 Y = 2.2485 + 0.154X1 - 0.232X2 - 0.496X3 - 0.2155X1X2 - 0.3515X1X3 (3) Yếu tố Các mức Khoảng biến thiên Mức dưới (-) Tâm (0) Mức trên (+) BsTC Bn BsTC Bn BsTC Bn X1 : thời gian 24 28 28 32 32 36 4 X2 : nhiệt độ 25 25 30 30 35 35 5 X3 : pH 5 6 6 7 7 8 1 Y = 1.78625 + 0.299X1 (4) Ghi chú: (-): mức dưới; (0): tâm; (+): mức trên. Sau khi giải bài toán quy hoạch thực nghiệm và tính các hệ số phương trình hồi quy, ý nghĩa của các hệ số được kiểm tra theo tiêu chuẩn Student với p = 0.05, số bậc tự do f = 3-1 = 2, chúng tôi thu được phương trình hồi quy (3) của chủng BsTC , (4) của Bn.. Kiểm tra sự tương thích phương trình hồi quy với thực nghiệm theo tiêu chuẩn Fisher với Ftính = 2.768 (BsTC) , Ftính = 4.558 (Bn); F0.95(5.2) = 19.296. Do Ftính < F0.95(5.2) nên cả hai phương trình hồi quy đều tương thích với thực nghiệm. Kết luận chung Qua kết quả khảo sát hoạt tính hệ enzyme của hai chủng BsTC và Bn, chúng tôi nhận thấy gần như cả hai hoạt tính amylase và protease của BsTC có phần trội hơn so với Bn trong điều kiện xét riêng từng yếu tố cũng như khi thiết lập ma trận quy hoạch thực nghiệm các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hệ enzyme của hai chủng vi khuẩn trên. Điều này được giải thích, có lẽ BsTC là chủng giống được phân lập từ chao Việt Nam nên có khả năng thích nghi với điều kiện môi trường thí nghiệm tại Việt Nam cao hơn so với chủng Bn được phân lập từ sản phẩm nattospes của Nhật Bản. Do vậy, chúng tôi chọn BsTC để thủy phân đậu hũ tạo sản phẩm thức uống chức năng. 3.3. KẾT QUẢ CHẾ BIẾN SẢN PHẨM 3.3.1. Kết quả khảo sát tỉ lệ giống và thời gian thủy phân đậu hũ hợp lý Bảng 3.15. Kết quả khảo sát tỉ lệ giống BsTC và thời gian thủy phân đậu hũ Thời gian Đặc điểm Tỷ lệ giống 0.5% 1% 2% 15 giờ - Cơ chất - BsTC (logCFU/g) Chưa nhuyễn 7.826 Chưa nhuyễn 9.127 Hơi nhuyễn 9.428 18 giờ - Cơ chất - BsTC (logCFU/g) Chưa nhuyễn Nhiễm Nhuyễn, béo, thơm 9.505 Nhuyễn, béo, hơi đắng 9.790 21 giờ - Cơ chất - BsTC (logCFU/g) Nhuyễn Nhiễm Nhuyễn, hơi đắng, nồng 9.77 Nhão, chát, nồng 10.04 24 giờ - Cơ chất - BsTC (logCFU/g) Hơi nhão, đắng, nồng Hỏng Nhão, đắng, nồng 10.11 Rất nhão, rất đắng, nồng 27 giờ - Cơ chất - BsTC (logCFU/g) Hôi, tạo khí, màu đen Rất đắng, nồng Rất đắng, nồng Kết luận Theo kết quả ghi nhận được, chúng tôi thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các tỉ lệ BsTC theo thời gian thủy phân khác nhau, cụ thể: - Với tỉ lệ BsTC 0.5%: + Mật độ tế bào chưa cao. + Quá trình thủy phân lâu, đến 21 giờ cơ chất mới nhuyễn. + Dễ hư do tạp nhiễm. - Với tỉ lệ BsTC 1%: + Mật độ tế bào thay đổi tăng dần trong khoảng 18-24 giờ. + Quá trình thủy phân nhanh hơn, ít nhiễm. + Đến 21 giờ cơ chất bắt đầu bị đắng. Vậy, chúng ta nên ngừng thủy phân ở 18 giờ. - Với tỉ lệ BsTC 2%: + Số lượng tế bào cũng tăng đáng kể từ 15-21 giờ. + Quá trình thủy phân nhanh hơn so với tỉ lệ BsTC 1%, mùi đậu hũ thủy phân nhanh nồng hơn và vị đắng hơn. Như vậy, để đảm bảo giá trị cảm quan, đảm bảo sản phẩm thức uống chức năng không bị đắng do đậu hũ thủy phân quá mức, chúng tôi ngừng thủy phân đậu hũ ở 18 giờ với tỉ lệ giống BsTC 1%. 3.3.2. Kết quả khảo sát khả năng bảo quản của Lactobacillus sp. Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng vi khuẩn lactic để bảo quản sản phẩm, vừa đảm bảo sản phẩm không có chất bảo quản hóa học, vừa tăng yếu tố probiotic. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát khả năng bảo quản sản phẩm thức uống chức năng từ đậu hũ thủy phân với các tỉ lệ Lactibacillus sp. khác nhau cùng các tỉ lệ đường saccharose khác nhau và thu được kết quả như bảng 3.16. Bảng 3.16. Kết quả khảo sát khả năng bảo quản của Lactobacillus sp. đối với cơ chất đậu hũ thủy phân bởi BsTC Tỉ lệ saccharose (%) Đặc điểm Bảo quản ở nhiệt độ phòng Bảo quản trong tủ lạnh Tỉ lệ Lactobacillus sp. (%) 0% 1% 2% 0% 1% 2% 0% - Số ngày bảo quản - Tình trạng cơ chất 1 Lỏng, đắng, hôi. 7 Hơi chua, vị đắng. 10 Sệt, chua. 2 Lỏng, hơi đắng. 15 Hơi chua, chát. 30 Chua, nồng, bọt khí. 1% -Thời gian bảo quản - Tình trạng cơ chất 1 Lỏng, đắng, nồng. > 30 Sánh, chua nhẹ, chát. > 90 Sệt, chua nhẹ, thơm. 2 Lỏng, chát. > 60 Sánh, chua, hơi nồng. > 180 Sệt, chua nhẹ, thơm. 2% -Thời gian bảo quản - Tình trạng cơ chất 1 Lỏng, đắng, nồng. > 30 Sánh, chua nồng, đắng. > 90 Sệt, bọt khí, phân lớp. 2 Lỏng, đắng, hơi nồng. > 60 Sánh, chua nồng, chát. > 180 Sệt, chua, phân lớp Kết luận - Đậu hũ thủy phân bởi 1% BsTC có thể không bị tạp nhiễm trong vòng 24-30 giờ ở nhiệt độ phòng nhưng sau khoảng hơn 36 giờ thì dễ bị tạo khí, mùi hôi. - Thời gian bảo quản sản phẩm sẽ tăng lên nhiều nếu ta kết hợp bổ sung Lactobacillus sp. (để tạo acid lactic, làm môi trường acid hơn kìm hãm hoạt động của BsTC), đường saccharose (cơ chất cho Lactobacillus sp.) và bảo quản trong điều kiện lạnh (nhiệt độ tủ lạnh). - Như vậy, theo kết quả ở bảng 3.16 điều kiện nên chọn để vừa đảm bảo thời gian bảo quản lâu, vừa đảm bảo giá trị cảm quan của sản phẩm: + Tỉ lệ Lactobacillus sp. 2%. + Tỉ lệ đường saccharose 1%. + Bảo quản trong tủ lạnh. 3.3.3. Kết quả khảo sát nồng độ phụ gia 3.3.3.1. Hương phomai Bảng 3.17 . Kết quả khảo sát nồng độ hương phomai Tỉ lệ hương 0/00 (v/w) 10/00 (Mẫu A) 20/00 (Mẫu B) 30/00 (Mẫu C) 40/00 (Mẫu D) Đặc điểm được mô tả Không át được mùi đậu hũ lên men Mùi thơm nhẹ hương phomai, dễ chịu. Mùi phomai hơi gắt. Mùi nồng khó chịu. Số người chọn 0 14/15 1/15 0 Vậy, kết quả “đồng thuận” chung của 3 nhóm là chọn mẫu B, tương đương tỉ lệ hương phomai bổ sung vào sản phẩm là 20/00, sản phẩm sẽ có mùi thơm nhẹ của hương phomai, dễ chịu. 3.3.3.2. Đường aspartam Bảng 3.18. Kết quả khảo sát nồng độ đường aspartam Tỉ lệ đường aspartam 0/00 (mg/g) 0,350/00 (1 gói) (Mẫu A) 0,70/00 (2 gói) (Mẫu B) 1,050/00 (3 gói) (Mẫu C) 1,40/00 (4 gói) (Mẫu D) Đặc điểm được mô tả Ít ngọt Ngọt vừa Ngọt Quá ngọt Số người chọn 0 13/15 2/15 1/15 Kết quả “đồng thuận” chung của 3 nhóm chọn mẫu B, tương đương tỉ lệ đường aspartam bổ sung là 0,70/00 (2 gói) thì sản phẩm sẽ có vị ngọt vừa, dễ sử dụng. 3.4. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU DINH DƯỠNG SẢN PHẨM Ký hiệu mẫu phân tích: M0: nguyên liệu M1: sau khi xử lý với B.subtilis 18 giờ M2: sản phẩm sau 3 ngày M3: sản phẩm sau 10 ngày M4: sản phẩm sau 20 ngày M5: sản phẩm sau 30 ngày 3.4.1. Độ ẩm (%) Bảng 3.19. Chỉ tiêu độ ẩm Mẫu M0 M1 M2 M3 M4 M5 Độ ẩm 84 86.2 89 83.32 80.53 80 74 76 78 80 82 84 86 88 90 M0 M1 M2 M3 M4 M5 Mẫu Đ ộ ẩ m ( % ) Đồ thị 3.9. Sự biến đổi độ ẩm theo thời gian Nhận xét Độ ẩm tăng cao hơn sau khi xử lý giống vì khi cấy giống vào ở dạng dung dịch (dung dịch BsTC và dung dịch lactic). Sau đó, hàm lượng ẩm giảm dần theo thời gian do hoạt động sống của vi sinh vật cần nước nên làm hao hụt nước trong sản phẩm, đồng thời một phần nước của sản phẩm bốc hơi theo thời gian. 3.4.2. Đạm tổng (%) Bảng 3.20. Chỉ tiêu đạm tổng Mẫu M0 M1 M2 M3 M4 M5 Đạm tổng (%) 6.47 5.64 5.17 4.72 3.07 2.43 0 1 2 3 4 5 6 7 M0 M1 M2 M3 M4 M5 Mẫu Đ ạ m t ổ n g ( % ) Đồ thị 3.10. Sự biến đổi đạm tổng số của sản phẩm theo thời gian Nhận xét Hàm lượng đạm tổng số của các sản phẩm giảm dần theo thời gian do các vi sinh vật sử dụng đạm cho hoạt động sống của chúng. 3.4.3. Đạm formol (%) Bảng 3.21. Chỉ số đạm formol Mẫu M0 M1 M2 M3 M4 M5 Đạm formol (%) 0.21 0.28 0.43 0.64 0.85 0.96 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 M0 M1 M2 M3 M4 M5 Mẫu Đ ạ m f o rm o l (% ) Đồ thị 3.11. Sự biến đổi đạm formol của sản phẩm theo thời gian Nhận xét Hàm lượng đạm formol trong mẫu tăng dần theo thời gian do các hoạt động thủy phân protein của BsTC. Ta thấy, hàm lượng protein thủy phân chưa cao (Nformol/NTS <0,5). 3.4.4. Đạm amoniac (%) Bảng 3.22. Chỉ số đạm amoniac Mẫu M0 M1 M2 M3 M4 M5 Đạm amoniac 0.077 0.081 0.132 0.256 0.418 0.425 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 M0 M1 M2 M3 M4 M5 Mẫu Đ ạ m a m o n ia c ( % ) Đồ thị 3.12. Sự biến đổi đạm amoniac của sản phẩm theo thời gian Nhận xét Hàm lượng đạm amoniac tăng dần do các vi sinh vật chuyển hóa protein thành các acid amin và giải phóng một phần NH3. Tuy nhiên, tỉ lệ Namoniac/Nformol rất thấp (<0,5), vẫn còn trong mức cho phép, không ảnh hưởng chất lượng sản phẩm. 3.4.5. Đường tổng (%) Bảng 3.23. Chỉ số đường tổng 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 M0 M1 M2 M3 M4 M5 Mẫu Đ ư ờ n g t ổ n g ( % ) Đồ thị 3.13. Sự biến đổi đường tổng của sản phẩm theo thời gian Nhận xét Hàm lượng đường tổng giảm hơn ½ sau 30 ngày và giảm dần theo thời gian do các vi sinh vật sử dụng lượng đường này cho các hoạt động sống củ