Luận văn Quy trình phân tích Carbaryl, Dimethoate, Vitamin C trong cải bắp với thiết bị HPLC

LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP ii LÔØI CAÛM ÔN Hôn boán naêm ngoài treân gheá giaûng ñöôøng ñaïi hoïc, vaø ñaëc bieät laø khoaûng thôøi gian laøm luaän vaên toát nghieäp vöøa qua ñaõ giuùp cho em raát nhieàu trong vieäc phaùt trieån khaû naêng hoïc taäp nghieân cöùu cuõng nhö laø reøn luyeän nhaân caùch cuûa mình. Ñeå coù ñöôïc nhöõng ñieàu naøy, em xin göûi lôøi caûm ôn chaân thaønh nhaát ñeán taát caû caùc quyù thaày coâ trong tröôøng Ñaïi hoïc Baùch khoa, vaø ñaëc bieät laø caùc thaày coâ trong Boä moân Coâng ngheä thöïc phaåm, nhöõng ngöôøi ñaõ giaûng daïy vaø chæ baûo taän tình cho em trong suoát thôøi gian qua. Em cuõng xin göûi lôøi caûm ôn chaân thaønh vaø saâu saéc nhaát ñeán thaày Ngoâ Maïnh Thaéng vaø thaày Hoaøng Minh Nam ñaõ taän tình höôùng daãn vaø chæ baûo ñeå em coù theå hoaøn thaønh toát luaän vaên naøy. Traân troïng caûm ôn Ths.Ñoaøn Taán Vinh, giaùm ñoác coâng ty VIPESCO ñaõ hoã trôï hoaït chaát Dimethoate. Trung taâm noâng döôïc thuoäc coâng ty VIPESCO ñaõ phaân tích ñoái chöùng moät soá maãu Dimethoate töø dòch trích rau. Con xin caûm ôn boá meï ñaõ nuoâi döôõng chaêm lo, ñoäng vieân cho con ñeå con coù theå hoaøn thaønh toát nhieäm vuï cuûa mình. Toâi xin göûi lôøi caûm ôn ñeán taát caû baïn beø toâi, nhöõng ngöôøi luoân gaén boù, giuùp ñôõ toâi raát nhieàu trong hoïc taäp cuõng nhö trong cuoäc soáng. Tp HCM, ngaøy 05 thaùng 01 naêm 2008 Sinh vieân Ñinh Thò Thu Haèng LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP iii TOÙM TAÉT LUAÄN VAÊN Luaän vaên ñaõ nghieân cöùu quy trình phaân tích Carbaryl, Dimethoate, Vitamin C trong caûi baép vôùi thieát bò HPLC. Cuï theå: Ñoái vôùi Carbaryl, Dimethoate: Tieán haønh queùt phoå haáp thu böôùc soùng UV -VIS cuûa Carbaryl, Dimethoate trong dung dòch. Löïa choïn pha ñoäng vôùi tyû leä Axetonitril/nöôùc thích hôïp ñeå phaân tích Carbaryl, Dimethoate. Xaây döïng ñöôøng chuaån xaùc ñònh haøm löôïng Carbaryl, Dimethoate trong dung dòch vôùi böôùc soùng haáp thu cöïc ñaïi vaø tyû leä Axetonitril/nöôùc ñaõ choïn. Khaûo saùt, caûi thieän quy trình trích ly Carbaryl, Dimethoate trong caùc maãu rau caûi baép. ÖÙng duïng quy trình trích ly xöû lyù vaø phaân tích haøm löôïng Carbaryl, Dimethoate ñeå xaùc ñònh dö löôïng trong maãu rau mua ôû chôï vaø hieäu suaát phaân huyû Carbaryl trong caûi baép sau quaù trình chieáu xaï. Ñoái vôùi Vitamin C: Tieán haønh queùt phoå haáp thu UV cuûa Vitamin C trong dung dòch. Xaây döïng ñöôøng chuaån xaùc ñònh haøm löôïng Vitamin C trong dung dòch vôùi böôùc soùng haáp thu cöïc ñaïi ñaõ xaùc ñònh. Khaûo saùt ñoä thu hoài cuûa quy trình trích ly Vitamin C trong caûi baép. LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP iv MUÏC LUÏC Chöông 1: MÔÛ ÑAÀU................................................................................................................1 Chöông 2: TOÅNG QUAN......................................................................................................... 3 2.1. Thuoác baûo veä thöïc vaät: [1, 4, 7].................................................................................... 3 2.1.1. Ñònh nghóa: .............................................................................................................. 3 2.1.2. Phaân loaïi:................................................................................................................. 3 2.1.3. Caùch taùc ñoäng cuûa thuoác leân dòch haïi: .................................................................. 3 2.1.5. Dö löôïng thuoác treân caây troàng vaø noâng saûn: [7] .................................................. 4 2.1.6. Tình hình söû duïng thuoác BVTV: [9, 20] ................................................................ 4 2.1.7. Tình hình ngoä ñoäc thuoác BVTV: [20] .................................................................... 5 2.2. Thuoác tröø saâu Carbaryl: ............................................................................................. 5 2.2.1. Đặc tính sinh học. Ứng dụng. [1] ............................................................................ 5 2.2.2. Tính chaát lyù hoùa: [4] ............................................................................................... 5 2.2.3. Ñoäc tính: [4] ............................................................................................................ 6 2.3. Thuoác tröø saâu Dimethoate:........................................................................................... 7 2.3.1. Ñaëc tính sinh hoïc. ÖÙng duïng. [1] ........................................................................... 7 2.3.2. Tính chaát lyù hoùa: ..................................................................................................... 7 2.3.3. Ñoäc tính: [4] ............................................................................................................ 9 2.4. Caûi baép: .......................................................................................................................... 9 2.5. Vitamin C: [15, 18, 17, 19]........................................................................................... 11 2.5.1. Giôùi thieäu chung veà Vitamin C: [15] ................................................................... 11 2.5.2. Tính chaát vaät lyù: [18] ............................................................................................ 11 2.5.3. Tính chaát hoaù hoïc: [18] ........................................................................................ 12 2.5.4. Nguoàn goác: [15] ..................................................................................................... 12 2.5.4. Vai troø cuûa Vitamin C : [17] ................................................................................ 12 2.6. Phöông phaùp phaân tích HPLC: [8]............................................................................. 13 2.6.1. Phöông phaùp saéc kyù loûng cao aùp:......................................................................... 13 2.6.2. Heä thoáng thieát bò saéc kyù loûng cao aùp: .................................................................. 15 2.7. Caùc phöông phaùp phaân tích Vitamin C: [10, 11, 12] ................................................. 18 2.7.1. Phaân tích Vitamin C baèng phöông phaùp HPLC ................................................. 18 2.7.2. Phaân tích Vitamin C baèng phöông phaùp chuaån ñoä:............................................ 18 2.7.3. Phöông phaùp so maøu:............................................................................................ 19 LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP v 2.7.4. Phöông phaùp söû duïng enzim: ............................................................................... 20 2.8. Phöông phaùp phaân tích thuoác tröø saâu: [7]................................................................. 21 Chöông 3: MOÂ TAÛ THÖÏC NGHIEÄM .................................................................................. 22 3.1. Hoùa chaát vaø thieát bò söû duïng....................................................................................... 22 3.1.1. Hoùa chaát: ............................................................................................................... 22 3.1.2. Thieát bò: ................................................................................................................. 22 3.2. Khaûo saùt phoå haáp thu UV-VIS Carbaryl, Dimethoate, Vitamin C. ......................... 23 3.3. Thieát laäp caùc thoâng soá cho heä thoáng HPLC............................................................... 23 3.4. Khaûo saùt thaønh phaàn pha ñoäng phaân tích hai chaát Carbaryl vaø Dimethoate......... 24 3.5. Xaây döïng caùc ñöôøng chuaån cuûa caùc chaát phaân tích .................................................. 24 3.6. Xaùc ñònh ñoä thu hoài maãu qua coät cuûa moãi chaát öùng vôùi ñieàu kieän choïn phaân tích. 24 3.7. Khaûo saùt caùc baäc trích ly Carbaryl, Dimethoate vaø xaùc ñònh hieäu suaát thu hoài qua caùc baäc................................................................................................................................. 25 3.7.1. Löïa choïn quy trình trích ly ñoái vôùi Carbaryl vaø Dimethoate............................ 25 3.7.2. Khaûo saùt hieäu suaát trích ly dòch Carbaryl vaø Dimethoate trong nöôùc qua caùc baäc trích ly....................................................................................................................... 27 3.7.3 Khaûo saùt ñoä thu hoài maãu cuûa quy trình trích ly Carbaryl vaø Dimethoate treân maãu caûi baép ..................................................................................................................... 27 3.8. ÖÙng duïng quy trình phaân tích Carbaryl ñeå khaûo saùt söï phaân huûy Carbaryl trong caûi baép sau khi chieáu xaï lieàu thaáp. .................................................................................... 30 3.9. Khaûo saùt hieäu suaát thu hoài cuûa quy trình trích ly Vitamin C trong caûi baép. ........... 30 3.9.1. Quy trình trích ly Vitamin C trong caûi baép......................................................... 30 3.9.2. Khaûo saùt hieäu suaát trích ly ñoái vôùi quy trình trích ly Vitamin C trong caûi baép 30 Chöông 4: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN ............................................................................. 33 4.1. Kết quả khaûo saùt phoå haáp thu cuûa Carbaryl, Dimethoate, Vitamin C:................... 33 4.1.1. Phoå haáp thu UV cuûa Carbaryl trong nöôùc. ......................................................... 33 4.1.2. Phoå haáp thu UV cuûa Dimethoate trong nöôùc. .................................................... 33 4.1.3. Phoå haáp thu UV cuûa Vitamin C trong ñeäm:........................................................ 34 4.2. Keát quaû khaûo saùt pha ñoäng ñoái vôùi Carbaryl vaø Dimethoate .................................. 34 4.2.1. Keát quaû khaûo saùt pha ñoäng cuûa Carbaryl:.......................................................... 34 4.2.2. Keát quaû khaûo saùt aûnh höôûng thaønh phaàn pha ñoäng phaân tích Dimethoate ..... 35 4.3. Keát quaû xaây döïng ñöôøng chuaån Carbaryl, Dimethoate, Vitamin C ........................ 36 LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP vi 4.3.1. Ñöôøng chuaån cuûa carabryl trong dung dòch nöôùc: ............................................. 36 4.3.2. Ñöôøng chuaån Dimethoate trong dung dòch nöôùc: .............................................. 37 4.3.3. Ñöôøng chuaån dung dòch Vitamin C trong ñeäm:.................................................. 38 4.3. Keát quaû ñoä thu hoài maãu Carbaryl, Dimthoate vaø Vitamin C: ................................. 39 4.3.1. Ñoä thu hoài maãu Dimethoate qua coät: .................................................................. 39 4.3.2. Ñoä thu hoài qua coät cuûa Carbaryl: ........................................................................ 39 4.3.3.Ñoä thu hoài qua coät cuûa Vitamin C: ....................................................................... 40 4.4. Keát quaû khaûo saùt hieäu suaát trích ly dòch Carbaryl vaø Dimethoate trong nöôùc qua caùc baäc trích ly.................................................................................................................... 41 4.5. Keát quaû khaûo saùt ñoä thu hoài maãu cuûa quy trình trích ly Carbaryl vaø Dimethoate treân maãu caûi baép: ............................................................................................................... 42 4.5.1. Keát quaû ñoä thu hoài Carbaryl cuûa caûi baép ........................................................... 42 4.5.2. Keát quaû ñoä thu hoài Dimethoate cuûa caûi baép:...................................................... 44 4.6. Keát quaû khaûo saùt söï phaân huûy Carbaryl döôùi taùc duïng cuûa chieáu xaï: .................... 47 4.7. Keát quaû khaûo saùt ñoä thu hoài cuûa quy trình trích Vitamin C töø caûi baép: ................. 48 4.7.1. Ñoä thu hoài Vitamin C khi boå sung theâm chuaån vaøo rau: ................................... 48 4.7.2. Ñoä thu hoài Vitamin C khi boå sung vaøo dòch rau: ................................................ 50 Chöông 5: KEÁT LUAÄN VAØ KIEÁN NGHÒ ........................................................................... 52 5.1 Keát luaän: ....................................................................................................................... 52 5.2. Kieán nghò:..................................................................................................................... 52 TAØI LIEÄU THAM KHAÛO .................................................................................................... 53 PHUÏ LUÏC ............................................................................................................................... 55 LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP vii DANH MUÏC CAÙC BAÛNG Baûng 2.1: Moät soá tính chaát vaät lyù cuûa Carbaryl......................................................................... 6 Baûng 2.2: Ñoä tan cuûa Dimethoate trong moät soá dung moâi ôû 250C. ........................................... 8 Baûng 2.3: Ñoä tan trong nöôùc cuûa Dimethoate ôû 200C ............................................................... 9 Baûng 2.4: Thaønh phaàn caùc chaát dinh döôõng coù trong 100 g caûi baép: [20] .............................. 10 Baûng 2.5: Giôùi haïn dö löôïng thuoác tröø saâu trong caûi baép........................................................ 11 Baûng 2.6: Thaønh phaàn Vitamin C trong moät soá nguyeân lieäu thöïc phaåm................................. 12 Baûng 4.1: Dieän tích peak vaø thôøi gian löu cuûa Carbaryl ôû caùc pha ñoäng ................................ 35 Baûng 4.2: Dieän tích vaø thôøi gian löu cuûa Dimethoate ôû caùc pha ñoäng .................................... 35 Baûng 4.3: Ñoä thu hoài qua coät cuûa Dimethoate: ....................................................................... 39 Baûng 4.4: Ñoä thu hoài qua coät cuûa Carbaryl ............................................................................. 40 Baûng 4.5: Ñoä thu hoài qua coät cuûa Vitamin C........................................................................... 40 Baûng 4.6: Keát quaû khaûo saùt caùc baäc trích ly Dimethoate ........................................................ 41 Baûng 4.7: Keát quaû khaûo saùt caùc baäc trích ly Carbaryl ............................................................. 41 Baûng 4.8: Keát quaû ño maãu xaùc ñònh ñoä thu hoài cuûa Carbaryl ................................................. 42 Baûng 4.9: Keát quaû ño maãu xaùc ñònh ñoä thu hoài Carbaryl theâm vaøo dòch ................................ 44 Baûng 4.10: Keát quaû ño maãu xaùc ñònh ñoä thu hoài cuûa Dimethoate........................................... 45 Baûng 4.11: Keát quaû ño maãu Dimethoate boå sung vaøo dòch sau loïc......................................... 45 Baûng 4.12: Keát quaû ño maãu boå sung Vitamin C...................................................................... 49 Baûng 4.13: Keát quaû ño maãu boå sung Vitamin C vaøo dòch ....................................................... 50 LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP viii DANH MUÏC HÌNH VEÕ Hình 2.1: Coâng thöùc caáu taïo cuûa Carbaryl ................................................................................ 5 Hình 2.2: Coâng thöùc caáu taïo cuûa Dimethoate ........................................................................... 7 Hình 2.3: Caûi baép..................................................................................................................... 10 Hình 2.4: (a)-Acid Ascorbi, (b)-Acid Dehydroascorbic………………………………………....11 Hình 2.5: Coät saéc kyù ................................................................................................................ 16 Hình 2.6: Heä thoáng maùy saéc kyù loûng cao aùp ........................................................................... 17 Hình 2.7: OÁng daãn FIA söû duïng ñeå ñònh löôïng acid ascorbic baèng phöông phaùp quang phoå. 20 Hình 3.1: Sô ñoà quy trình trích ly Carbaryl vaø Dimethoate………………………………………………………………….26 Hình 3.2: Sô ñoà trích ly 3 baäc…………………………………………………………………………………………………………………………..28 Hình 3.3: Quy trình trích ly Vitamin C .................................................................................... 31 Hình 4.1: Phoå haáp thu UV cuûa dung dòch Carbaryl trong nöôùc ............................................... 33 Hình 4.2: Phoå haáp thu UV cuûa dung dòch chuaån Dimethoate trong Axetonitril: nöôùc............. 33 Hình 4.3: Phoå haáp thu UV cuûa Vitamin C trong dung dòch ñeäm………………………………………………………..34 Hình 4.4: Saéc kyù ñoà ño chuaån Carbaryl ôû noàng ñoä 10 ppm (a) vaø 5 ppm (b) .......................... 36 Hình 4.5: Ñöôøng chuaån phaân tích Carbaryl trong nöôùc ........................................................... 36 Hình 4.6: Saéc kyù ñoà ño chuaån Dimethoate ôû noàng ñoä 5 ppm (a) vaø 1 ppm (b) ....................... 37 Hình 4.7: Ñöôøng chuaån phaân tích Dimethoate trong dung dòch Axetonitril: nöôùc .................. 37 Hình 4.8: Saéc kyù ñoà ño chuaån Vitamin C 1ppm vaø 2 ppm....................................................... 38 Hình 4.9: Ñöôøng chuaån Vitamin C trong dung dòch ñeäm ........................................................ 38 Hình 4.10: Quy trình trích ly caûi baép……………………………………………………………………………………………………………..43 Hình 4.11: Hieäu suaát phaân huûy treân caûi baép ôû caùc lieàu chieáu khaùc nhau................................ 48 LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 1 Chöông 1: MÔÛ ÑAÀU Rau xanh laø nhu caàu khoâng theå thieáu trong cô caáu böõa aên haøng ngaøy cuûa con ngöôøi treân khaép haønh tinh. Ñaëc bieät khi löông thöïc vaø caùc thöùc aên giaøu ñaïm ñaõ ñöôïc ñaûm baûo thì yeâu caàu veà soá löôïng vaø chaát löôïng rau laïi caøng gia taêng. Rau khoâng chæ cung caáp moät löôïng chaát xô, caùc sinh toá A, B, C… maø coøn cung caáp caùc nguyeân toá vi löôïng vaø ña löôïng raát caàn thieát trong caáu taïo teá baøo. Coù nhieàu chuûng loaïi rau nhö rau aên laù (caûi baép, caûi xanh…), rau aên quaû (döa leo), rau aên cuû… [9]. Hieän nay, do muoán thu lôïi nhuaän cao neân ngöôøi noâng daân söû duïng raát nhieàu caùc loaïi thuoác tröø saâu, thuoác tröø beänh… goïi chung laø thuoác baûo veä thöïc vaät (BVTV) leân caùc loaïi rau ñeå taêng naêng suaát caây troàng. Caùc loaïi thuoác tröø saâu ñöôïc söû duïng roäng raõi trong noâng nghieäp nhaèm baûo veä muøa maøng khoûi söï phaù hoaïi cuûa coân truøng, trò caùc beänh treân thöïc vaät do coân truøng hoaëc caùc vaät kí sinh beân ngoaøi gaây ra. Tuy nhieân, vieäc söû duïng quaù lieàu vaø phun gaàn ngaøy thu hoaïch khieán cho löôïng thuoác toàn dö cao treân saûn phaåm sau khi thu hoaïch. Theo thoáng keâ, haøng naêm ôû mieàn Ñoâng – Nam nöôùc ta, toång löôïng thuoác baûo veä thöïc vaät söû duïng leân ñeán con soá 1000 taán, trong ñoù thuoác baûo veä thöïc vaät duøng treân rau raát lôùn chieám töø 50 – 80% toång löôïng thuoác duøng cho caùc loaïi caây troàng. Ñieàu ñoù gaây ra nhöõng moái nguy cho söùc khoûe con ngöôøi. Moät soá nôi ngöôøi söû duïng rau bò ngoä ñoäc xaûy ra ngaøy caøng nhieàu vaø phoå bieán. Vì vaäy ñeå ñaûm baûo an toaøn cho ngöôøi tieâu duøng rau, caàn thieát phaûi coù bieän phaùp quaûn lyù, kieåm soaùt caùc nguoàn rau cung caáp. Vaán ñeà xaùc ñònh dö löôïng thuoác tröø saâu coøn toàn ñoïng trong rau quaû coù chính xaùc thì môùi coù theå keát luaän ñuùng veà ñoä an toaøn cuûa rau ñem ñi kieåm tra. Nhö vaäy phöông phaùp phaân tích dö löôïng thuoác tröø saâu trong rau cuõng caàn nghieân cöùu ñeå coù theå phaân tích ñöôïc nhanh choùng vaø chính xaùc dö löôïng thuoác coù trong rau. Töø ñoù vaán ñeà kieåm soaùt nguoàn rau saïch cuõng ñôn giaûn vaø deã daøng hôn. Moãi phöông phaùp, qui trình phaân tích dö löôïng thuoác tröø saâu trong rau ñeàu bao goàm 2 phaàn chính: Taùch dö löôïng thuoác tröø saâu caàn phaân tích, vaø xaùc ñònh dö löôïng naøy vôùi thieát bò phaân tích phuø hôïp. Vôùi thieát bò saéc kyù loûng hieän coù ôû boä moân Coâng ngheä thöïc phaåm, böôùc ñaàu ñaõ coù moät vaøi nghieân cöùu khaû naêng öùng duïng ñeå phaân tích dö löôïng LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 2 Carbaryl, Dimethoat [5, 6] trong rau maø khoâng phaûi toán keùm nhieàu veà tieàn thueâ thieát bò phaân tích. Tuy nhieân, keát quaû ñaït ñöôïc coøn haïn cheá do ñoä thu hoài maãu cuûa giai ñoaïn trích ly töø rau vaø giai ñoaïn phaân tích qua coät HPLC coøn thaáp. Muïc tieâu cuûa luaän vaên naøy laø khaûo saùt khaû naêng caûi tieán qui trình trích ly Carbaryl, Dimethoat töø rau caûi baép baèng caùch naâng soá baäc trích ly nhaèm ñaït ñoä thu hoài caùc hoaït chaát ñoù töø rau cao hôn, töø ñoù laøm taêng ñoä chính xaùc, ñoä tin caäy cuûa keát quaû phaân tích dö löôïng hai chaát naøy trong rau. Beân caïnh ñoù caûi baép coù chöùa moät löôïng Vitamin C ñaùng keå neân cuõng caàn coù phöông phaùp ñònh löôïng chính xaùc haøm löôïng Vitamin C trong ñoù. LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 3 Chöông 2: TOÅNG QUAN 2.1. Thuoác baûo veä thöïc vaät: [1, 4, 7] 2.1.1. Ñònh nghóa: Thuoác baûo veä thöïc vaät (BVTV) coøn goïi laø thuoác tröø dòch haïi hoaëc saûn phaåm noâng döôïc, bao goàm nhöõng cheá phaåm duøng ñeå phoøng tröø caùc sinh vaät gaây haïi taøi nguyeân thöïc vaät, caùc cheá phaåm coù taùc duïng ñieàu hoøa sinh tröôûng thöïc vaät, caùc cheá phaåm coù taùc duïng xua ñuoåi hoaëc thu huùt caùc sinh vaät gaây haïi hoaëc taøi nguyeân thöïc vaät ñeán ñeå tieâu dieät. 2.1.2. Phaân loaïi: Theo ñoái töôïng phoøng tröø, ngöôøi ta phaân loaïi thuoác BVTV vaøo caùc nhoùm sau: - Thuoác tröø saâu - Thuoác tröø beänh - Thuoác tröø coû - Thuoác tröø chuoät - Thuoác tröø nheän - Thuoác tröø oác seân - Thuoác ñieàu tieát sinh tröôûng caây troàng 2.1.3. Caùch taùc ñoäng cuûa thuoác leân dòch haïi: Caùch taùc ñoäng laø ñöôøng xaâm nhaäp gaây haïi cuûa thuoác vaøo cô theå dòch haïi. Thuoác BVTV coù caùch taùc ñoäng chuû yeáu laø: - Tieáp xuùc: thuoác tröø saâu tieáp xuùc xaâm nhaäp vaøo cô theå saâu qua bieåu bì - Vò ñoäc: Laø taùc ñoäng cuûa thuoác khi xaâm nhaäp vaøo boä phaän tieâu hoùa cuûa ñoäng vaät (coân truøng, chuoät, chim). Chaát ñoäc aên qua ñöôøng mieäng vaøo trong ruoät, hoøa tan vaøo trong dòch vò ôû daï daøy vaø ruoät giöõa, thaám qua thaønh ruoät vaø di chuyeån ñeán caùc cô quan trong cô theå ñeå gaây haïi. - Xoâng hôi: thuoác coù theå sinh ra khí, khoùi, muø coù taùc duïng dieät coân truøng, naám, vi khuaån, chuoät. Thuoác coù taùc ñoäng xoâng hôi coù theå duøng phun leân caây, xoâng hôi trong nhaø ôû, nhaø kho, kho taøng, nhaø kính, haøng hoùa hoaëc trong ñaát ñeå tieâu dieät caùc vi sinh vaät gaây haïi. Hôi thuoác ñoäc xaâm nhaäp qua loã thôû hoaëc tröïc tieáp tieâu dieät dòch haïi. LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 4 - Noäi haáp (löu daãn): laø khaû naêng cuûa thuoác coù theå xaâm nhaäp vaø di chuyeån trong caây ñeå ñeå dieät dòch haïi baèng caùch tieáp xuùc hay vò ñoäc. - Thaám saâu: thuoác coù khaû naêng thaám qua caùc lôùp teá baøo bieåu bì caây ñeå gieát dòch haïi naèm döôùi lôùp bieåu bì, maø khoâng coù khaû naêng di chuyeån trong caây. 2.1.5. Dö löôïng thuoác treân caây troàng vaø noâng saûn: [7] Thuoác baûo veä thöïc vaät toàn taïi treân caây troàng vaø noâng saûn treân moät thôøi gian laø ñieàu caàn thieát ñeå baûo veä caây troàng vaø noâng saûn choáng laïi söï gaây haïi cuûa dòch haïi ôû treân ruoäng, trong quaù trình vaän chuyeån vaø baûo quaûn. Nhöng dö löôïng thuoác coù treân noâng saûn seõ laø nguoàn gaây haïi cho ngöôøi tieâu duøng. Dö löôïng thuoác coù theå goàm nhöõng chaát tan ñöôïc trong lipit, nhöng khoâng tan ñöôïc trong nöôùc, thöôøng toàn taïi ôû lôùp bieåu bì neân coù teân laø dö löôïng bieåu bì. Dö löôïng goàm nhöõng chaát tan trong nöôùc nhöng khoâng tan trong lipit, toàn taïi döôùi lôùp bieåu bì goïi laø dö löôïng noäi bì. Coøn dö löôïng laø nhöõng chaát khoâng tan caû trong lipit vaø nöôùc, naèm ôû phaàn ngoaøi bieåu bì mang teân dö löôïng ngoaïi bì. Dö löôïng thuoác thöôøng coù trong töïc phaåm vaø chuùng chæ gaây haïi khi vöôït ngöôõng cho pheùp. Dö löôïng thuoác BVTV ñöôïc tính baèng mg thuoác coù trong 1 kg noâng saûn. Dö löôïng toái ña cho pheùp (Maximum Residue Limit, vieát taét MRL): laø dö löôïng thuoác BVTV toái ña ñöôïc pheùp toàn taïi trong noâng saûn maø khoâng gaây ñoäc cho ngöôøi vaø vaät nuoâi khi söû duïng noâng saûn ñoù laøm thöùc aên. 2.1.6. Tình hình söû duïng thuoác BVTV: [9, 20] Vì muïc ñích baûo veä caây troàng, thuoác BVTV ñöôïc söû duïng ngaøy caøng roäng raõi vaø nhieàu. Theo moät soá ñieàu tra gaàn ñaây, ôû nöôùc ta noâng daân söû duïng khoaûng 28 loaïi thuoác tröø saâu, 19 loaïi thuoác tröø beänh khaùc nhau. Haàu heát noâng daân xem bieän phaùp hoaù hoïc laø caùch chuû yeáu ñeå phoøng tröø saâu beänh treân rau. Coù tôùi 43,8% noâng daân söû duïng thuoác coù ñoäc tính cao ñaõ caám söû duïng treân rau, 48,42% laïi khoâng ñaûm baûo thôøi gian caùch li an toaøn, coù khi chæ sau moät hoaëc hai ngaøy phun ñaõ mang ra chôï baùn. Keát quaû nghieân cöùu khaûo saùt veà dö löôïng thuoác baûo veä thöïc vaät vaø chaát baûo quaûn trong rau quaû naêm 2002 – 2003 cuûa TS Haø Thò Anh Ñaøo (Vieän Dinh döôõng quoác gia) vaø coäng söï [18] cho thaáy: Vôùi 240 maãu rau thu thaäp taïi caùc khu vöïc buoân baùn rau quaû lôùn ôû Haø Noäi vaø TP. Hoà Chí Minh, tæ leä rau quaû coù dö löôïng hoaù chaát laø 30,4%, vôùi caùc chaát Dimethoat, Diazinon, Cypermethin… Trong ñoù dö löôïng Dimethoat, Carbendazin, Cypermethin vuôït quaù giôùi haïn cho pheùp. LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 5 2.1.7. Tình hình ngoä ñoäc thuoác BVTV: [20] Treân theá giôùi, haøng naêm coù treân 40000 ngöôøi cheát vì ngoä ñoäc rau teân toång soá 2 trieäu ngöôøi bò ngoä ñoäc (döïa theo thoáng keâ cuûa toå chöùa Lao ñoäng Quoác teá ILO). Tuy chöa coù thoáng keâ chính thöùc veà soá ngöôøi ngoä ñoäc do thuoác tröø saâu ôû nöôùc ta, nhöng theo nhöõng thoâng baùo töø nhöõng naêm qua veà caùc tröôøng hôïp ngoä ñoäc leû teû hay haøng loaït ôû töøng beänh vieän, töøng ñòa phöông cho thaáy soá ngöôøi ngoä ñoäc laø con soá ñaùng keå. Töø naêm 2000 ñeán thaùng 6 naêm 2003, coù nhieàu thoâng baùo veà ngöôøi bò nhieãm ñoäc do aên phaûi rau quaû coøn dö löôïng thuoác tröø saâu, naëng nhaát vaãn laø caùc tænh ñoàng baèng soâng Cöûu Long. Naêm 2005, coù 13000 ngöôøi nhieãm ñoäc vaø trong ñoù coù ñeán 354 ngöôøi cheát. Nguyeân nhaân ngoä ñoäc chuû yeáu laø aên phaûi thöïc phaåm coù löôïng thuoác tröø saâu chöa phaân huûy heát hoaëc thöïc phaåm coù söû duïng chaát ñoäc ñeå baøo quaûn, laøm haáp daãn veà hình thöùc vaø muøi vò … 2.2. Thuoác tröø saâu Carbaryl: 2.2.1. Đặc tính sinh học. Ứng dụng. [1] Carbaryl laø thuoác tröø saâu tieáp xuùc, vò ñoäc vaø noäi haáp nheï, vôùi phoå taùc ñoäng dieät tröø saâu beänh khaù roäng. Noù laø moät trong nhöõng thuoác tröø saâu hoï Carbamat laâu ñôøi nhaát (baét ñaàu söû duïng töø naêm 1956) nhöng ñöôïc söû duïng nhieàu nhaát vaø thay theá thuoác tröø saâu clo höõu cô (Hieän nay thuoác tröø saâu nhoùm boâng cuùc söû duïng thay theá daàn nhoùm Carbamate). Thöôøng duøng ñeå tröø caùc loaøi saâu, raày haïi luùa, caây coâng nghieäp, caây aên quaû ..Noù ñöôïc ñaùnh giaù coù ñoä ñoäc trung bình, LD50 (caáp tính ñoái vôùi chuoät ñöïc) 850 mg/kg, LD50 (maõn tính) > 2000 mg/kg. Tuy nhieân, saûn phaåm gia coâng coù theå ñoäc hôn nhieàu, ví duï Tecyl 85 WP coù ñoä ñoäc loaïi I. Ñoäc vôùi ong. Khoâng tích luõy trong môõ. 2.2.2. Tính chaát lyù hoùa: [4] Coâng thöùc phaân töû: C12H11NO2. Coâng thöùc caáu taïo: Hình 2.1: Coâng thöùc caáu taïo cuûa Carbaryl Khoái löôïng phaân töû: 201,22. Teân hoaù hoïc: 1-naphtol-N-metyl carbamate hoaëc 1-naphtyl-N-metyl carbamine. Teân thöông maïi vaø caùc teân khaùc: Sevin, Atoxan, Caprotin, Gamonil, Panam, Sevidol. LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 6 Carbaryl 99% laø tinh theå maøu traéng coù ñieåm noùng chaûy 142oC, aùp löïc hôi 0,002 mmHg (40oC). Khoâng tan trong nöôùc, tan trong phaàn lôùn caùc dung moâi phaân cöïc nhö Axeton, Cyclohexanon. Baûn thaân beàn vôùi aùnh saùng vaø ñoä aåm, nhöng bò thuûy phaân trong moâi tröôøng kieàm maïnh thaønh α - naphtol vaø metylamin. Trong cô theå coân truøng, Carbaryl bò oxy hoùa thaønh 4-hydroxyCarbaryl, sau ñoù bò thaûi ra ngoaøi döôùi daïng lieân keát vôùi axít glucuronic. [4] Baûng 2.1: Moät soá tính chaát vaät lyù cuûa Carbaryl Phaân töû löôïng 201.2 ñvC Nhieät ñoä noùng chaûy 138 0C (ñoä tinh khieát 99.1%) Nhieät ñoä hoaù hôi 1930C Tæ troïng ôû 200C 1.232 Ñoä hoøa tan trong nöôùc 40 mg/l ôû 300C Hoøa tan trong caùc dung moâi höõu cô Acetone (200 - 300 g/kg), Methanol (79.6 g/kg), Dicloromethan (242.6 g/kg), Hexan (0.214g/kg). Ñoä oån ñònh - OÅn ñònh trong moâi tröôøng trung tính vaø acid yeáu nhöng deã daøng bò thuûy phaân trong moâi tröôøng kieàm taïo thaønh 1-naphthol - OÅn ñònh vôùi nhieät ñoä leân ñeán 700C vaø aùnh saùng. Khi bò gia nhieät ñeå phaân huûy noù taïo ra khoùi ñoäc NOx. 2.2.3. Ñoäc tính: [4] Thuoäc nhoùm ñoäc loaïi II, lieàu löôïng Carbaryl tieâu dieät 50% soá sinh vaät tieáp xuùc (LD50): LD50 qua mieäng 246-283 mg/kg, LD50 qua da > 2000 mg/kg; noàng ñoä Carbaryl tieâu dieät 50% soá sinh vaät tieáp xuùc (LC50): LC50 xoâng hôi > 6,08 mg/l. Carbaryl deã daøng ñöôïc haáp thuï qua ñöôøng hoâ haáp vaø ñöôøng mieäng, nhöng ít bò haáp thuï hôn qua tieáp xuùc vôùi da. Khi tieáp xuùc tröïc tieáp coù theå gaây boûng da hoaëc maét. Hít vaøo hay nuoát phaûi Carbaryl vôùi löôïng nhaát ñònh coù theå gaây ngoä ñoäc cho heä thaàn kinh, heä hoâ haáp, gaây ra caùc trieäu chöùng noân möûa, co thaét daï daøy, ñau ñaàu, hoân meâ, roái loaïn thaàn kinh, suy hoâ haáp, … Daáu hieäu nhieãm ñoäc taêng nhanh sau khi haáp thuï vaø cuõng LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 7 nhanh choùng keát thuùc sau khi khoâng coøn tieáp xuùc nöõa. Khi bò haáp thuï vaøo cô theå ngöôøi, noù seõ nhanh choùng ñöôïc baøi tieát ra theo nöôùc tieåu (baøi tieát khoaûng 91,5% trong voøng 24h). Carbaryl raát coù haïi cho con ngöôøi neáu vaøo mieäng (LD50 = 614 mg/kg theå troïng) vaø hít vaøo (LC50 = 2,43 mg/l). Carbaryl coù ñoä ñoäc qua da thaáp (LD50 > 5000 mg/kg theå troïng). 2.3. Thuoác tröø saâu Dimethoate: 2.3.1. Ñaëc tính sinh hoïc. ÖÙng duïng. [1] Dimethoate laø thuoác tröø saâu coù taùc duïng tieáp xuùc vaø löu daãn vôùi phoå taùc ñoäng roäng. Noù coøn coù taùc duïng tröø nheän. Ñoä ñoäc thaáp ñoái vôùi ñoäng vaät maùu noùng, LD50 185- 245 mg/kg, khoâng gaây chaùy laù. Do vaäy coù theå duøng Dimethoate trong nhieàu lónh vöïc: rau quaû, nguõ coác, chaên nuoâi…. Taïi Vieät Nam, Dimethoate vaãn ñöôïc söû duïng nhieàu. Thöôøng ôû daïng hoãn hôïp caùc thuoác BVTV khaùc. Tuy nhieân, thuoác coù muøi hoâi neân aûnh höôûng ñeán moâi tröôøng. 2.3.2. Tính chaát lyù hoùa: Dimethoat laø thuoác BVTV thuoäc nhoùm laân höõu cô, coù teân goïi theo danh phaùp quoác teá laø O,O-dimethyl S–methylcarbamoylmethyl – phosphorodithioate, soá CAS: 60-51-5. Coâng thöùc hoaù hoïc: C5H12NO3PS2, Khoái löôïng phaân töû: 229,2 Coâng thöùc caáu taïo: Hình 2.2: Coâng thöùc caáu taïo cuûa Dimethoate Dimethoate ôû daïng raén, ñieåm noùng chaûy 51-52oC; aùp löïc hôi 1,1 mPa (25oC). Tan trong nöôùc vaø caùc dung moâi höõu cô chuû yeáu, khoù tan trong hydrocacbon. Bò thuûy phaân trong moâi tröôøng kieàm, nhöng töông ñoái beàn trong moâi tröôøng trung tính (2< pH < 7). Bò phaân huûy khi ñun noùng, ñaàu tieân taïo daãn xuaát cuûa O,S-dimetyl. [4] LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 8 Baûng 2.2. Ñoä tan cuûa Dimethoate trong moät soá dung moâi ôû 250C. Dung moâi Ñoä hoaø tan (g/100mL) Aceton 140 Acetonitril 140 Cyclohexane 120 Dodecane 0.043 Etanol 150 Ethyl acetate 120 Hexane 0.03 2-propanol 120 Methanol 160 Dicloromethane 150 1-octanol 52 Toluene 100 Xylene 31 1,2-dicloroethane 120 n-heptane 0.024 Dimethoate phaân huyû nhanh khi gia nhieät ñeán nhieät ñoä >800C. Söï phaân huyû naøy taïo ra caùc khí ñoäc haïi dimethyl sulfic, carbon monoxide, methyl mercaptane, pentoxide phospho. LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 9 Baûng 2.3. Ñoä tan trong nöôùc cuûa Dimethoate ôû 200C pH Ñoä tan (g/L) 5 23,3 7 23,8 9 25,0 Dimethoate phaân huyû trong thôøi gian ngaén trong ñaát, nöôùc vaø caây troàng. Thôøi gian toàn taïi trong ñaát cuûa Dimethoate laø 4 – 16 ngaøy, ngaén hôn trong ñaát aåm. Trong nöôùc soâng, sau 18h – 8 tuaàn thì bò giaûm moät nöûa. Trong ñoäng vaät cuõng nhö trong thöïc vaät, cô cheá bieán ñoåi cuûa Dimethoate laø gioáng nhau. Noù bò oxi hoaù thaønh O,O-dimethyl- phosphorothioate vaø hydro hoùa thaønh O,O-dimethyl-phosphorodithioate, - phosphorothioate, -phosphat. Söï oxi hoaù Dimethoate taïo neân hôïp chaát omethoate, moät chaát ñoäc vaø laø chaát öùc cheá enzyme cholinesterase maïnh, noù cuõng phaân huyû trong moâi tröôøng nhanh nhö Dimethoate. [4] 2.3.3. Ñoäc tính: [4] Dimethoate thuoäc nhoùm ñoäc II. Ñoái vôùi nguôøi, LD50 qua mieäng laø 235mg/kg, qua da >400mg/kg. ADI: 0.02mg/kg theå troïng / ngaøy. Noàng ñoä cao nhaát ñöôïc chaáp nhaän cuûa Dimethoate trong nöôùc uoáng laø 0,02mg/L. Caùc nghieân cöùu môùi ñaây taïi Vieän nghieân cöùu haït nhaân Ñaø Laït ñaõ phaùt hieän baèng chöùng bieán loaïn nhieãm saéc theå treân teá baøo limpho ngöôøi ôû moät nhoùm daân cö saûn xuaát noâng nghieäp ôû Laâm Ñoàng gaây ra bôûi thuoác tröø saâu BAI 58. Thaønh phaàn chính cuûa BAI 58 laø Dimethoate 40EC vaø 60% chaát taïo nhuõ. Dimethoate laø ñoái töôïng nghieân cöùu ñoäc chaát moâi tröôøng cuûa theá giôùi töø nhöõng naêm 60. Maëc duø, BAI 58 laø loaïi thuoác tröø saâu laân höõu cô ñang ñöôïc xem xeùt laïi ôû nhieàu nöôùc treân theá giôùi, song ôû Vieät Nam vaãn ñang ñöôïc caáp pheùp söû duïng vaø ñang ñöôïc söû duïng phoå bieán trong noâng nghieäp Vieät Nam, nhaát laø nhöõng vuøng caây coâng nhieäp nhö caø pheâ, daâu taèm… 2.4. Caûi baép: Teân khoa hoïc: Brassica oleracea var. capitata. Hoï: Cruciferae. LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 10 Hình 2.3: Caûi baép Ñaëc ñieåm baép caûi traéng Laù ngoaøi coù nhieäm vuï quang hôïp neân coù maøu xanh. Laù trong khoâng tieáp xuùc tröïc tieáp vôùi aùnh saùng, coù maøu traéng ngaø. Chuùng coù nhieäm vuï döï tröõ chaát dinh döôõng vaø laø boä phaän duøng laøm thöïc phaåm. Haøm löôïng Vitamin ôû laù giaø cao hôn. Thu hoaïch vaø baûo quaûn: Caûi baép ñöôïc troàng töø thaùng 9 ñeán thaùng 10, vuï muoän töø thaùng 11 ñeán thaùng 12. Thôøi gian sinh tröôûng töø 80 – 90 ngaøy. Khi baép caûi cuoän chaët thì coù theå thu hoaïch. Ta duøng dao caét vaø ñeå laïi vaøi laù giaø beân ngoaøi. Nhieät ñoä thích hôïp ñeå baûo quaûn caûi baép laø 0 – 10C. Söû duïng caûi baép Caûi baép laø loaïi rau nhieàu chaát dinh döôõng, coù theå cheá bieán ñöôïc nhieàu moùn aên nhö: aên soáng, luoäc, xaøo vôùi thòt, muoái chua… Theo Ñoâng y, caûi baép vò ngoït, tính bình, coù coâng duïng boå coát tuyû, khoeû gaân coát. Noù coù taùc duïng caét côn ñau vaø thuùc cho mau laønh ñoái vôùi chöùng loeùt daï daøy. Baûng 2.4: Thaønh phaàn caùc chaát dinh döôõng coù trong 100 g caûi baép: [20] Nöôùc eùp töø caûi baép laø loaïi "maùy loïc" tuyeät vôøi vaø giuùp giaûm caân vì chöùa ít calo. Chaát sulfur vaø chlorine trong caûi baép giuùp taåy saïch maøng nhaày baùm ôû bao töû vaø ruoät. Ngoaøi ra, nöôùc caûi baép cuõng chöùa ñuû löôïng ioát caàn thieát cho cô theå ngöôøi, ñoàng thôøi raát toát cho vieäc chöõa vieâm daï daøy, ung loeùt daï daøy, vieâm mieäng vaø vieâm lôïi. Moät soá nghieân cöùu cho thaáy chaát isothiocyanates chöùa nhieàu trong caùc loaïi rau nhaø hoï caûi coù taùc duïng tieâu dieät caùc khoái u gaây ung thö phoåi. Protein Lipit Carbs Ca Fe Caroten Vit B1 Vit B2 Vit B3 Vit C 1.1 g 0.2 g 3.4 g 32mg 0.3mg 0.02mg 0.04mg 0.04mg 0.3mg 30mg LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 11 Baûng 2.5: Giôùi haïn dö löôïng thuoác tröø saâu trong caûi baép Thuoác tröø saâu Giôùi haïn dö löôïng MRL(ppm) Carbaryl 5 Dimethoate 2 2.5. Vitamin C: [15, 18, 17, 19] 2.5.1. Giôùi thieäu chung veà Vitamin C: [15] Vitamin C laø teân goïi thoâng duïng cuûa acid ascorbic. Caùc teân goïi hoaù hoïc laø L- Ascorbic acid, L-xyloascorbic acid, 3-oxo-L-gulofuranolactone (daïng enol), L-3- ketothreohexuronic acid lactone. Vôùi coâng thöùc phaân töû C6H8O6. Vitamin C coù khoái löôïng phaân töû 176,1. Hình 2.4 cho thaáy coâng thöùc caáu taïo vaø moâ hình caáu truùc phaân töû Vitamin C. 2.5.2. Tính chaát vaät lyù: [18] Acid ascorbic tinh khieát toàn taïi ôû daïng tinh theå, khoâng maøu hoaëc coù maøu traéng. Acid ascorbic thöôøng khoâng coù muøi, coù vò chua acid, tan voâ haïn trong nöôùc, ít tan trong ethanol, khoâng tan trong ether vaø chloroform. Nhieät ñoä noùng chaûy 190oC. Acid ascorbic bò hoaù ñen khi ñeå tröïc tieáp ngoaøi aùnh saùng maët trôøi, tuy nhieân söï bieán maøu nheï coù theå khoâng laøm maát hoaït tính chöõa beänh cuûa acid ascorbic. Thaäm chí khi khoâng coù maët aùnh saùng thì acid ascorbic vaãn deã daøng bò bieán tính khi tieáp xuùc vôùi ñoä aåm trong khoâng khí vaø söï phaân huyû naøy caøng nhanh khi nhieät ñoä moâi tröôøng caøng cao. (a) (b) Hình 2.4: (a)-Acid Ascorbic; (b)-Acid Dehydroascorbic LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 12 2.5.3. Tính chaát hoaù hoïc: [18] Acid ascorbic coù caùc giaù trò pKa laø 4,2 vaø 11,6. Trong dung moâi nöôùc, dung dòch acid ascorbic 5% coù pH = 2,2 – 2,5. Trong dung dòch, acid ascorbic nhanh choùng bò oxi hoaù khi coù maët khoâng khí vaø pH vuøng kieàm. Acid ascorbic beàn trong moâi tröôøng trung tính, acid, khoâng beàn trong moâi tröôøng coù caùc ion kim loaïi nhö Cu2+, Fe2+, Enzym ascorbatoxydase… 2.5.4. Nguoàn goác: [15] Acid ascorbic coù caû nguoàn goác töï nhieân vaø nhaân taïo. Trong töï nhieân, acid ascorbic ñöôïc tìm thaáy trong caùc loaïi rau quaû töôi. Nguoàn thöùc aên chöùa Vitamin C raát toát laø nhöõng traùi caây thuoäc hoï citrus hay nöôùc eùp töø traùi hoï citrus, quaû moïng, hoà tieâu xanh hay ñoû, caø chua, boâng caûi, rau caûi boù xoâi. Baûng 2.6: Thaønh phaàn Vitamin C trong moät soá nguyeân lieäu thöïc phaåm STT Nguyeân lieäu Vitamin C (mg/100g) 1 Döùa 17 2 Caûi baép 30 3 Me 75 4 Vaûi 167 5 Haït ñieàu 1 6 Döa leo 12 7 Nhaõn 8 8 Chanh 46 9 Caûi xanh 70 10 Ôùt 250 2.5.4. Vai troø cuûa Vitamin C : [17] Vitamin C ñöôïc Albert Szent-Gyorgyi phaân laäp naêm 1928. Gaàn 70 naêm sau, caùc nhaø nghieân cöùu ñaõ khaùm phaù ra nhieàu lôïi ích cuûa Vitamin C treân söùc khoeû. Ñaây laø loaïi LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 13 Vitamin maø cô theå caàn nhieàu nhaát. Ñoái vôùi ngöôøi bình thöôøng caàn khoaûng 80 ÷100mg Vitamin C trong 24 giôø. Tuyø thuoäc vaøo heä di truyeàn vaø caùc yeáu toá trong loái soáng, moät soá ngöôøi ñoøi hoûi löôïng Vitamin C nhieàu hôn löôïng trung bình cuûa moät ngöôøi bình thöôøng nhaèm ngaên chaën söï giaùn ñoaïn cuûa caùc phaûn öùng sinh hoaù quan troïng. Chaúng haïn nhö ngöôøi lôùn tuoåi, uoáng röôïu, ngöôøi bò beänh tieåu ñöôøng, ngöôøi huùt thuoác laù thöôøng bò thieáu Vitamin C. Khoâng nhö haàu heát caùc loaïi ñoäng vaät khaùc, cô theå ngöôøi khoâng theå töï saûn xuaát Vitamin C. Moät beänh do thieáu huït Vitamin C phoå bieán nhaát laø beänh scorbus (scurvy). 2.6. Phöông phaùp phaân tích HPLC: [8] 2.6.1. Phöông phaùp saéc kyù loûng cao aùp: Saéc kyù loûng cao aùp (High pressure liquid chromatography_HPLC) hay saéc kyù loûng hieäu naêng cao laø moät phöông phaùp phaân tích saéc kyù loûng hieän ñaïi, ñöôïc söû duïng roäng raõi trong kyõ thuaät phaân tích ñeå phaân tích caùc chaát coù haøm löôïng nhoû nhö: Vitamin, acid amin, ñoäc toá cuûa vi sinh vaät, dö löôïng thuoác tröø saâu trong thöïc phaåm...  Nguyeân taéc: Saéc kí loûng laø kyõ thuaät phaân tích saéc kyù duøng ñeå taùch caùc ion hoaëc caùc phaân töû hoøa tan trong dung dòch. Khi dung dòch maãu tieáp xuùc vôùi moät pha raén hay moät pha loûng thöù hai, caùc chaát hoøa tan khaùc nhau trong dung dòch maãu seõ töông taùc vôùi caùc pha ñoù vôùi moät möùc ñoä khaùc nhau döïa treân söï khaùc nhau veà khaû naêng haáp phuï, khaû naêng trao ñoåi ion, khaû naêng phaân boá hay döïa treân söï khaùc nhau veà caáu truùc phaân töû cuûa caùc chaát (saéc kí loïc gel). Söï khaùc nhau naøy seõ taùch caùc caáu töû ra khoûi hoãn hôïp. Caáu töû naøo coù aùi löïc vôùi pha ñoäng maïnh seõ ñi ra tröôùc, caáu töû naøo coù aùi löïc vôùi pha ñoäng yeáu hôn seõ ñi ra sau. Caùc caáu töû ñöôïc xaùc ñònh thoâng qua thôøi gian löu cuûa caáu töû trong coät saéc kí. Ñeå ñònh danh caùc caáu töû ñoùù, chuùng ta phaûi ñöôïc hoã trôï bôûi moät phöông phaùp khaùc, ví duï nhö söû duïng ñaàu doø hoàng ngoaïi IR, ñaàu doø töû ngoaïi UV…  Ñaëc ñieåm: - Söû duïng coät saéc kyù: kích thöôùc cuûa coät saéc kyù nhaèm muïc ñích phaân tích thöôøng beù (Chieàu daøi: 10-25cm, ñöôøng kính: 2-4mm). - Pha ñoäng laø chaát loûng. - Pha tónh ña daïng tuøy vaøo kieåu coät saéc kyù nhö saéc kyù haáp phuï, phaân boá, loïc gel, trao ñoåi ion. Do ñoù khaû naêng öùng duïng cuûa phöông phaùp naøy raát lôùn vaø ña daïng. - Haït vaät lieäu nhoài coù kích thöôùc raát beù, khoaûng 1 – 4 µm. Do ñoù, toác ñoä chaûy cuûa pha ñoäng seõ raát chaäm. Vì vaäy phaûi söû duïng aùp suaát cao (100 – 400 bar), toác ñoä doøng khi ñoù LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 14 ñaït khoaûng 0,1 ñeán 10 ml/phuùt. Thôøi gian phaân tích maãu thöôøng dao ñoäng trong khoaûng tôùi 30 phuùt.  Phaân loaïi: Coù theå chia phöông phaùp HPLC ra laøm 2 loaïi:  Saéc kyù pha thuaän (Normal-phase HPLC): laø phöông phaùp saéc kyù coù pha ñoäng laø dung moâi khoâng phaân cöïc nhö hexane, coøn pha tónh laø caùc haït chaát mang baèng silicagel treân ñoù coù gaén caùc goác phaân cöïc nhö _CN hoaëc _NH2.  Saéc kyù pha ñaûo (Reversed-phase HPLC): laø phöông phaùp saéc kyù coù pha ñoäng laø dung moâi phaân cöïc nhö nöôùc hoaëc nöôùc cuøng vôùi caùc dung moâi phaân cöïc khaùc nhö methanol hay Axetonitril, coøn pha tónh laø caùc haït chaát mang baèng silicagel treân ñoù coù gaén caùc goác khoâng phaân cöïc nhö octadecyl- hay octylsilane. Thöôøng söû duïng saéc kyù pha ñaûo cho saéc kyù loûng cao aùp:  pha ñoäng phaân cöïc  pha tónh keùm phaân cöïc Nguyeân nhaân laø do pha ñoäng phaân cöïc cho pheùp söû duïng nhieàu loaïi pha ñoäng ña daïng, ngoaøi ra coù theå boå sung theâm caùc thaønh phaàn khaùc nhau vaøo pha ñoäng ñeå taïo ra caùc ñoä phaân cöïc khaùc nhau. Thaønh phaàn chính cuûa pha ñoäng laø nöôùc, laø moät dung moâi reû, ít gaây oâ nhieãm moâi tröôøng vaø khoâng ñoäc haïi.  Phaïm vi öùng duïng cuûa phöông phaùp: Phaân tích caùc thaønh phaàn hoaù hoïc trong thöïc phaåm nhö caùc thaønh phaàn dinh döôõng, phuï gia, ñoäc toá, theo doõi söï bieán ñoåi cuûa thöïc phaåm trong quaù trình baûo quaûn vaø cheá bieán. Cuï theå:  Vitamin  Acid amin  Thuoác, khaùng sinh, döôïc lieäu.  Ñoäc toá (aflatoxin).  Thuoác tröø saâu.  Thuoác tröø coû.  Phuï gia coâng nghieäp vaø thöïc phaåm.  Acid höõu cô LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 15  Caùc loaïi ñöôøng  Chaát kích thích. 2.6.2. Heä thoáng thieát bò saéc kyù loûng cao aùp:  Nguyeân taéc hoaït ñoäng: Pha ñoäng sau khi ñöôïc baøi khí ñöôïc bôm ñöa vaøo heä thoáng saéc kyù. Heä thoáng töï ñoäng bôm maãu vaøo coät (hoaëc chuùng ta töï bôm maãu vaøo). Pha ñoäng khi ñi ngang qua seõ cuoán maãu caàn phaân tích ñi theo. Khi vaøo trong coät saéc kyù, chaát naøo coù aùi löïc maïnh vôùi pha ñoäng seõ theo pha ñoäng ñi ra tröôùc, chaát naøo coù aùi löïc yeáu hôn seõ ñi ra sau. Ñaàu doø phaùt hieän caùc caáu töû ñi ra khoûi coät, chuyeån tín hieäu cho maùy ghi keát quaû.  Caáu taïo:  Bôm :  Laø boä phaän coù tính quan troïng haøng ñaàu trong heä thoáng HPLC. Bôm aùp löïc cao ñöôïc söû duïng ñeå ñaåy dung moâi ñi xuyeân qua pha tónh. Kích thöôùc vaät lieäu chaát nhoài coät caøng nhoû thì aùp suaát phaûi caøng cao.  Yeâu caàu: taïo ñöôïc doøng pha lieân tuïc, oån ñònh vaø khoâng coù xung.  Bôm thöôøng söû duïng laø bôm pittong.  Caùc loaïi bôm hieän ñaïi co nhöõng thoâng soá sau:  Vaän toác doøng: 0,1 – 10 ml/phuùt.  Ñoä oån ñònh cuûa doøng löu löôïng: Dao ñoäng khoâng lôùn hôn 1%.  Aùp löïc lôùn nhaát: leân ñeán 5000psi.  (Heä thoáng HPLC trong phoøng thí nghieäm Hoùa sinh cuûa khoa söû duïng bôm LC- 10AS).  Boä phaän nhaäp maãu: Cho pheùp laáy chính xaùc löôïng maãu ñöa vaøo coät saéc kyù moät moät caùch töï ñoäng vaø ñöôïc chöông trình hoùa:  Theå tích maãu bôm vaøo.  Thôøi gian thay ñoåi maãu.  Thôøi gian röûa boä phaän nhaäp maãu.  Nhieät ñoä bôm maãu. LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 16  Aùp suaát bôm maãu (Chuù yù aùp suaát bôm maãu phaûi nhoû hôn 70bar thì maãu môùi taäp trung ñöôïc vaøo coät, khaû naêng phaân tích maãu môùi toát). Ngoaøi ra, ta coù theå bôm maãu thuû coâng baèng caùch duøng xilanh bôm maãu vaøo coät.  Coät saéc kyù : Hình 2.5: Coät saéc kyù Laø boä phaän chính cuûa heä thoáng thieát bò HPLC, ñoù chính laø nôi dieãn ra söï phaân taùch caùc caáu töû trong hoãn hôïp nhôø khaû naêng haáp phuïï hay phaân boá cuûa caùc caáu töû giöõa pha ñoäng vaø pha tónh. Phoå bieán nhaát laø coät ODS (Octadodecyl siloxane). Raát ngaén, khoaûng 10 – 25 cm, ñöôøng kính trong 2 – 4 mm. Vaät lieäu nhoài coät:  Ñoái vôùi saéc kyù haáp phuï: chaát mang raén thöôøng laø silicagel hay oxyt nhoâm.  Ñoái vôùi saéc kyù phaân boá: chaát mang raén laø daãn xuaát cuûa silicagel (caùc haït silicagel ñöôïc gaén vôùi caùc nhoùm chöùc khaùc nhau taïo ra caùc haït coù chöùc naêng phuø hôïp vôùi maãu caàn phaân tích). Ví duï nhö: Siloxanes (C18, C8…). Yeâu caàu ñoái vôùi chaát mang:  Coù tính choïn loïc caàn thieát ñoái vôùi thaønh phaàn maãu nghieân cöùu.  Beàn nhieät.  Beàn cô hoïc.  Beàn vaø trô veà maët hoùa hoïc vôùi caùc caáu töû khaùc trong maãu phaân tích.  Ñaàu doø:  Ngaøy nay caùc ñaàu doø quang hoïc ñöôïc söû duïng phoå bieán trong caùc heä thoáng saéc kyù loûng. Nhöõng ñaàu doø naøy ñöa moät tia saùng xuyeân qua doøng chaûy ra khoûi coät. Söï thay ñoåi veà cöôøng ñoä aùnh saùng do söï haáp thu tia UV, söï phaùt xaï huyønh quang töø caùc thaønh phaàn… seõ ñöôïc ghi nhaän laïi ôû daïng thay ñoåi cuûa ñieän theá ñaàu ra. Nhöõng ñieän theá naøy ñöôïc bieåu dieãn treân moät ñoà thò vaø ñöa vaøo maùy tính ñeå hieån thò thôøi gian löu vaø peak.  Ñaàu doø trong HPLC raát ña daïng:  Ñaàu doø UV.  Ñaàu doø UV – VIS. LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 17  Ñaàu doø huyønh quang.  Ñaàu doø daãn nhieät.  Ñaàu doø khuùc xaï keá vi sai (RI).  Heä thoáng HPLC trong phoøng thí nghieäm Hoaù sinh cuûa khoa söû duïng ñaàu doø quang phoå UV-VIS loaïi SPD - 6VA. Caùc ñaëc tröng quan troïng cuûa moät ñaàu doø laø:  Ñoä nhaïy.  Giôùi haïn doø tìm.  Quaùn tính vaø phaïm vi phuï thuoäc tuyeán tính giöõa cöôøng ñoä tín hieäu vôùi noàng ñoä.  Maùy ghi : Coù theå veõ saéc kyù ñoà, ghi laïi thôøi gian löu, tính dieän tích peak, ghi laïi phöông phaùp xaùc ñònh, ñoàng thôøi coù theå söû duïng maùy ghi ñeå ñieàu khieån, chöông trình hoùa quaù trình chaïy saéc kyù.  Heä thoáng HPLC trong phoøng thí nghieäm Hoùa sinh cuûa khoa söû duïng maùy ghi Chromatopac CR 6A.  Sô ñoà heä thoáng: Hình 2.6: Heä thoáng maùy saéc kyù loûng cao aùp Coät saéc kyù Ñaàu doø Maùy ghi Bôm Pha ñoäng Valve phun Maùy troän LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 18 2.7. Caùc phöông phaùp phaân tích Vitamin C: [10, 11, 12] Vitamin C coù theå ñöôïc phaân tích baèng nhieàu phöông phaùp, tuøy thuoäc vaøo ñaëc ñieåm cuûa maãu caàn phaân tích, thôøi gian phaân tích vaø thieát bò coù theå tieáp caän ñöôïc. Caùc phöông phaùp thöôøng ñöôïc söû duïng ñeå phaân tích Vitamin C laø: - Phöông phaùp saéc kyù loûng cao aùp (HPLC) - Phöông phaùp chuaån ñoä. - Phöông phaùp so maøu. - Phöông phaùp söû duïng enzim 2.7.1. Phaân tích Vitamin C baèng phöông phaùp HPLC Phöông phaùp naøy ñöôïc giôùi thieäu trong nhieàu taøi lieäu tham khaûo vaø ñaõ trôû thaønh moät baøi thí nghieäm trong PTN Hoùa sinh, B/m CN thöïc phaåm. Coät saéc kyù söû duïng laø coät pha ñaûo ODS C18. Pha ñoäng söû duïng laø dung dòch ñeäm phosphate pH = 2,8 troän vôùi methanol theo tyû leä theå tích 90/10, löu löôïng pha ñoäng qua coät 1 mL/phuùt. Söû duïng ñaàu doø UV ño ñoä haáp thuï ôû böôùc soùng 245 nm. Pha ñoäng ñöôïc ñaùnh sieâu aâm ñeå ñuoåi khí hoøa tan tröôùc khi söû duïng, vaø ñöôïc loïc lieân tuïc trong quaù trình chaïy saéc kyù baèng maøng loïc 450 nm. Xaây döïng ñöôøng chuaån vôùi caùc maãu acid ascorbic tinh khieát vôùi naêm noàng ñoä khaùc nhau. Maãu rau quaû ñöôïc nghieàn trong dung dòch ñeäm phosphate pH = 2,8 ñeå trích Vit.C ra, pha loaõng theo tyû leä thích hôïp roài phaân tích nhö vôùi caùc maãu chuaån. Haøm löôïng Vitamin C trong maãu ñöôïc xaùc ñònh baèng caùch noäi / ngoaïi suy tín hieäu cuûa maãu töø ñöôøng chuaån. [10] 2.7.2. Phaân tích Vitamin C baèng phöông phaùp chuaån ñoä:  Chuaån ñoä vôùi 2,6- dichloroindophenol (DCP) Ñaây laø moät phöông phaùp höõu duïng ñeå ñònh löôïng Vitamin C trong rau quaû. Cô sôû cuûa phöông phaùp naøy laø phaûn öùng oxi hoùa acid ascorbic trong dung dòch bôûi DCP thaønh daïng dehydroascorbic acid. Saûn phaåm cuûa phaûn öùng oxy hoùa khöû naøy ñeàu khoâng maøu. Phöông trình phaûn öùng: (pH=3) C6H8O6 (khoâng maøu) + C12H7O2NCl2(ñoû) C6H6O6 (khoâng maøu) + C12H9O2NCl2 (khoâng maøu) Söï chuaån ñoä naøy ñaëc bieät thuaän lôïi bôûi vì DCP cuõng ñoùng vai troø nhö chaát chæ thò maøu. Khi nhoû dung dòch DCP vaøo moät dung dòch coù chöùa Vitamin C, thì hoãn hôïp phaûn öùng khoâng maøu cho ñeán khi taát caû löôïng Vitamin C coù trong hoãn hôïp chuyeån heát thaønh LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 19 daïng dehydroascorbic acid. Gioït dung dòch DCP tieáp theo theâm vaøo neáu xuaát hieän maøu ñoû chöùng toû ñoù laø gioït DCP coøn dö vaø phaûn öùng ñaõ keát thuùc. Do ñoù, ñieåm töông ñöông ñöôïc xaùc ñònh (chæ thò) khi dung dòch chuaån ñoä töø khoâng maøu chuyeån sang maøu ñoû cuûa DCP. Yeáu ñieåm cuûa phöông phaùp naøy laø dung dòch DCP raát keùm beàn neân chuùng ta chæ pha dung dòch ngay tröôùc khi söû duïng chuùng. Tröôùc khi tieán haønh chuaån ñoä, caàn xöû lyù maãu thöïc phaåm vôùi metaphosphoric acid. Böôùc xöû lyù vôùi acid naøy nhaèm laøm bieán tính vaø keát tuûa protein trong maãu ñeå traùnh aûnh höôûng ñeán keát quaû phaân tích, ñoàng thôøi cuõng nhaèm giuùp oån ñònh acid ascorbic traùnh bò phaân huyû. Acid hoaù ñeán pH nhoû hôn 4 cuõng nhaèm laøm giaûm phaûn öùng cuûa DCP vôùi caùc hôïp chaát khaùc.  Chuaån ñoä baèng iode Ñaây laø qui trình chuaån ñoä ngöôïc, löôïng ion 3I dö trong dung dòch sau khi ñaõ phaûn öùng vôùi Vitamin C ñöôïc xaùc ñònh baèng caùch cho phaûn öùng vôùi dung dòch thiosulfate. Cô sôû cuûa phöông phaùp chuaån ñoä Vitamin C baèng Iod laø phaûn öùng oxi hoaù Vitamin C thaønh dehydroascorbic acid, C6H6O6 theo phöông trình sau :   HIOHCOHOHCI 2366626863 Löôïng ion 3I trong dung dòch sau khi Vitamin C ñaõ phaûn öùng heát seõ ñöôïc xaùc ñònh baèng pheùp chuaån ñoä vôùi dung dòch thiosulfate 232OS theo phöông trình sau:   2642323 32 OSIOSI Coù moät khoù khaên laø phaûi pha cheá dung dòch 3I töø dung dòch KIO3 vaø muoái raén KI trong ñieàu kieän acid nhö phöông trình sau: )(3)(3)(9)(8)()(6 233 lOHaqIaqKsKIaqKIOaqH   Löôïng 3I taïo thaønh coù theå ñöôïc tính toaùn thoâng qua löôïng KI vaø KIO3 ñaõ söû duïng. Löôïng naøy tröø ñi löôïng dö trong chuaån ñoä vôùi thiosulfate seõ thu ñöôïc löôïng 3I ñaõ phaûn öùng vôùi acid ascorbic. 2.7.3. Phöông phaùp so maøu:  Cô sôû cuûa phöông phaùp laø phaûn öùng khöû Fe(III) thaønh Fe(II) bôûi acid ascorbic. Saûn phaåm Fe(II) coù theå ñöôïc ño deã daøng sau khi keát hôïp vôùi taùc nhaân maøu nhö 1,10- phenanthroline hoaëc neocuproline. ÔÛ ñaây, mono (1,10-phenanthroline)-Fe(III) bò khöû LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 20 tröïc tieáp thaønh tri(1,10-phenanthroline)-Fe(II) bôûi acid ascorbic, saûn phaåm taïo thaønh haáp thu aùnh saùng ôû böôùc soùng 510 nm. Phöông phaùp naøy raát nhaïy, nhanh, vaø ñaõ ñöôïc nghieân cöùu töï ñoäng hoùa bôûi kyõ thuaät tieâm doøng (FIA), cho hieäu suaát phaân tích 200 maãu/giôø. Ñöôøng chuaån cuûa acid ascorbic treân daõy 0 - 50ppm trong ñieàu kieän lyù töôûng ñöôïc ghi nhaän. RSD = 0,5%( n=15). Mono(1,10-phenanthroline)-Fe(III) cuõng coù theå ñöôïc söû duïng ñeå ñònh löôïng adrenaline. Hình 2.7: OÁng daãn FIA söû duïng ñeå ñònh löôïng acid ascorbic baèng phöông phaùp quang phoå.  Cô sôû cuûa phöông phaùp laø phaûn öùng khöû muoái tetrazolium MTT [3-(4,5- dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] thaønh moät Formazan bôûi acid L-ascorbic (L-ascorbate) khi coù maët cuûa chaát mang ñieän töû PMS (5- methylphenazinium methosulfate) taïi pH = 3,5. MTT-Formazan ñöôïc xaùc ñònh thoâng qua ño ñoä haáp thuï aùnh saùng thaáy ñöôïc taïi böôùc soùng 578 nm. Trong thí nghieäm vôùi maãu thöû toång löôïng chaát khöû seõ ñöôïc tính toaùn theo: HFormazanMTTxorbateDehydroascMTHxAscorbateL )()2( Ñeå ñònh löôïng L-ascorbate, söû duïng ñoàng thôøi moät maãu traéng. Maãu traéng naøy ñöôïc cho phaûn öùng vôùi enzym ascorbate oxidase (AAO) vôùi söï coù maët cuûa O2 ñeå loaïi ñi söï coù maët cuûa L-Ascorbte (2.5). Daïng dehydroascorbate khoâng phaûn öùng vôùi MTT/PMS. OHorbateDehydroascOAscorbateL 222/1  Söï khaùc nhau veà ñoä haáp thu giöõa maãu thöû vaø maãu traéng seõ chính laø löôïng L- Ascorbate coù trong maãu. 2.7.4. Phöông phaùp söû duïng enzim: Phöông phaùp enzyme söû duïng ascorbate oxidase ñeå xuùc taùc phaûn öùng oxi hoaù acid L-ascorbic baèng O2 trong moâi tröôøng acid theo phaûn öùng sau: 2 L-ascorbate + O2 + 2H+   oxydaseAscrobate 2 dehydro-L-ascorbate + 2H2O LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 21 Noàng ñoä cuûa acid ascorbic ñöôïc xaùc ñònh giaùn tieáp thoâng qua möùc ñoä tieâu thuï O2, xaùc ñònh bôûi ñieän cöïc oxy. Ñöôøng chuaån cuûa phöông phaùp coù daïng ñöôøng thaúng trong khoaûng noàng ñoä 1,2.10-4 ñeán 1,0.10-3 mol/L acid ascorbic. 2.8. Phöông phaùp phaân tích thuoác tröø saâu: [7] Phaân tích dö löôïng thuoác BVTV laø moät lónh vöïc ñaëc bieät. Dö löôïng coù trong noâng saûn, ñaát ñai vaø moâi truôøng coù haøm löôïng raát thaáp (ppm hay ppb) thöôøng ñöôïc phaân tích baèng phöông phaùp saéc kyù loûng cao aùp hay saéc kyù khí hieän ñaïi vôùi caùc detector coäng keát ñieän töû. Quaù trình chuaån bò maãu taùch chieát phaûi laøm raát caån thaän vaø chính xaùc ñeå traùnh sai soá, phaûi löïa choïn dung moâi thích hôïp vôùi ñaëc tính lyù hoùa töøng loaïi thuoác BVTV ñeå coù theå taùch chieát ñöôïc dö löôïng toái ña vaø taùch ñöôïc dö löôïng naøy khoûi hôïp chaát khaùc trong caây nhö glucosit, clorophyl…  Phaân tích dö löôïng Carbaryl: Hieän nay coù nhieàu taøi lieäu tham khaûo moâ taû phöông phaùp ñeå phaân tích Carbary: saéc kyù khí, saéc kyù loûng, quang phoå so maøu. Tuy nhieân, caùc hôïp chaát thuoäc hoï Carbamate laø nhöõng chaát khoâng oån ñònh khi gia nhieät, deã bò phaân huûy khi nhieät ñoä cao neân ña soá söû duïng saéc kyù loûng HPLC ñeå phaân tích Carbaryl. [11]  Phaân tích dö löôïng Dimethoate: Caùc phöông phaùp phaân tích haøm löôïng Dimethoate sau ñöôïc tìm thaáy trong taøi lieäu tham khaûo: - Phöôùng phaùp saéc kí khí. - Phöông phaùp saéc kí loûng cao aùp. - Phöông phaùp saéc kí baûn moûng. - Phöông phaùp duøng boä KIT enzym LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 22 Chöông 3: MOÂ TAÛ THÖÏC NGHIEÄM 3.1. Hoùa chaát vaø thieát bò söû duïng 3.1.1. Hoùa chaát: - Carbaryl_ Ñoâ tinh khieát > 98% - Dimethoate_ Ñoä tinh khieát > 98% - Axeton_Trung Quoác - NaCl_Trung Quoác - Axetonitril_Merk_HPLC - Methanol_Merk_HPLC - H3PO4 - Acid ascorbic_Trung Quoác - KH2PO4 - Nöôùc caát 2 laàn Dung dòch chuaån goác Carbaryl, Dimethoate: Caân chính xaùc löôïng 0,1000 g moãi chaát, hoøa tan trong Axetonitril vaø ñònh möùc leân 100 ml baèng Axetonitril thu ñöôïc dung dòch chuaån goác noàng ñoä 1000 ppm, baûo quaûn trong tuû laïnh ñeå söû duïng cho caùc thí nghieäm. Dung dòch chuaån goác Vitamin C 1000 ppm moãi laàn thí nghieäm seõ ñöôïc pha môùi. Caân 0,1000 g Acid ascorbic ñònh möùc leân 100 ml baèng dung dòch ñeäm KH2PO4 pH= 2,8. 3.1.2. Thieát bò: - Maùy saéc kyù loûng_ haõng Shimazdu SPD – 6AV_ Ñaàu doø UV – VIS - Beå ñaùnh sieâu aâm_ Decon - Maùy coâ ñaëc chaân khoâng_ Heidolph WB 2000 - Maùy ño quang phoå vuøng UV – VIS. - Maùy xay sinh toá Gali - Maùy khuaáy töø - Heä thoáng loïc chaân khoâng LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 23 - Phieãu chieát 250 ml - Maøng loïc 0,45 µm, giaáy loïc 0,6 µm - Bình ñònh möùc 10, 25, 50, 100 ml - OÁng ñong 100, 500 ml 3.2. Khaûo saùt phoå haáp thu UV-VIS Carbaryl, Dimethoate, Vitamin C. Chuaån bò caùc dung dòch Carbaryl, Dimethoate trong nöôùc vaø dung dòch Vitamin C trong ñeäm pH = 2,8 vôùi noàng ñoä khoaûng 3ppm. Söû duïng cuvet thaïch anh ñeå ño. Tieán haønh queùt phoå baèng maùy queùt phoå töï ñoäng coù böôùc soùng töø 200 nm ñeán 350 nm. Ghi nhaän soá lieäu ño ñöôïc vaø veõ caùc ñoà thò bieåu dieãn phoå haáp thu vuøng UV cuûa 3 chaát treân. Döïa vaøo ñoà thò phoå thu ñöôïc choïn böôùc soùng haáp thu cöïc ñaïi cho moãi chaát. Sau ñoù ñaët böôùc soùng cho maùy HPLC töông öùng khi phaân tích töøng chaát treân. 3.3. Thieát laäp caùc thoâng soá cho heä thoáng HPLC Luaän vaên naøy söû duïng heä thoáng maùy saéc kyù loûng cuûa haõng Shimazdu: ñaàu doø UV- VIS SPD – 6AV, bôm LC – 10AS, maùy ghi saéc kyù ñoà C – R6A.Coät phaân tích Gemini pha ñaûo C18: 250 x 4,6 mm x 5 µm x 110 Ao. Caùc thoâng soá chính cuûa heä thoáng: - Ñaët giaù trò aùp suaát cöïc ñaïi (P.MAX): 300 kgf/cm2. Muïc ñích laø ñeå baûo veä coät vaø caùc heä thoáng khaùc, khi aùp suaát vöôït P.MAX bôm seõ töï ñoäng taét. - Ñaët giôùi haïn döôùi cuûa aùp suaát (P.MIN): thöôøng laø 0. Muïc ñích laø khoâng cho khoâng khí vaøo heä thoáng khi coù söï coá hôû treân heä thoáng vaø an toaøn khi ño. - Aùp suaát ñaït ñöôïc khi heä thoáng oån ñònh: 98 – 110kgf/cm2 - Toác ñoä doøng pha ñoäng 1ml/phuùt - Theå tích bôm maãu 20 µl. - Atten: coù giaù trò töø 0 ñeán 10, giaù trò caøng nhoû thì khoaûng bieåu dieãn treân saéc kyù ñoà caøng nhoû, duøng atten nhoû khi ño noàng ñoä thaáp maø khoâng aûnh höôûng tôùi dieän tích peak ño ñöôïc, thöôøng söû duïng atten =10. - Speed (toác ñoä giaáy): thöôøng duøng laø 5, muoán peak saéc nhoïn thì giaûm Speed - Böôùc soùng cuûa ñaàu doø: - Ñoái vôùi Carbaryl: 220 nm - Ñoái vôùi Dimethoate: 204 nm - Ñoái vôùi Vitamin C: 245 nm LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 24 3.4. Khaûo saùt thaønh phaàn pha ñoäng phaân tích hai chaát Carbaryl vaø Dimethoate. Töø dung dòch chuaån goác Carbaryl vaø Dimethoate 1000 ppm pha saün, tieán haønh pha loaõng baèng nöôùc ñöôïc dung dòch coù noàng ñoä10 ppm cuûa Carbaryl vaø Dimethoate trong nöôùc. Chuaån bò pha ñoäng khaûo saùt: ôû ñaây chuùng ta tieán haønh khaûo saùt khaû naêng taùch Carbaryl vaø Dimethoate cuûa caùc pha ñoäng coù thaønh phaàn Axetonitril vaø nöôùc theo nhöõng tæ leä 85/15, 70/30, 55/45, 40/60. Tieán haønh pha caùc pha ñoäng vôùi tæ leä veà theå tích Axetonitril: nöôùc = 85/15, 70/30, 55/45, 40/60. ÖÙng vôùi moãi pha ñoäng naøy ta thöïc hieän phaân tích cho caû Carbaryl vaø Dimethoate ôû noàng ñoä 10 ppm ñaõ pha ôû treân. Moãi pha ñoäng khi phaân tích vôùi töøng chaát seõ cho soá lieäu veà thôøi gian löu vaø dieän tích peak töông öùng. 3.5. Xaây döïng caùc ñöôøng chuaån cuûa caùc chaát phaân tích Chuaån bò caùc dung dòch chuaån Carbaryl, Dimethoate, Vitamin C vôùi caùc noàng ñoä 1, 2, 5, 10, 20 ppm baèng caùch pha loaõng ra töø dung dòch chuaån goác 1000 ppm. Pha ñoäng choïn ñeå xaây döïng ñöôøng chuaån döïa vaøo keát quaû cuûa thí nghieäm muïc 3.4. Ñoái vôùi Carbaryl vaø Dimethoate choïn pha ñoäng laø Axetonitril: nöôùc theo tæ leä theå tích 55: 45. Coøn ñoái vôùi pha ñoäng phaân tích Vitamin C söû duïng laø methanol: heä ñeäm KH2PO4 coù pH = 2,8 theo theå tích 10 : 90. Heä ñeäm ñöôïc pha baèng caùch hoaø tan 6,5g KH2PO4 trong 1l nöôùc caát 2 laàn, chænh pH veà 2,8 baèng H3PO4 roài loïc baèng maøng 0,45µm. Tieán haønh ño caùc dung dòch Carbaryl vaø Dimethoate treân maùy saéc kyù vôùi caùc thoâng soá nhö muïc 3.3 treân. Moãi maãu chuaån phaân tích 3 laàn, laáy giaù trò trung bình cuûa dieän tích peak. Thieát laäp ñöôøng chuaån phuï thuoäc cuûa dieän tích peak thu ñöôïc vaøo noàng ñoä chaát phaân tích trong dung dòch maãu chuaån. 3.6. Xaùc ñònh ñoä thu hoài maãu qua coät cuûa moãi chaát öùng vôùi ñieàu kieän choïn phaân tích. Ñeå xaùc ñònh ñoä thu hoài maãu cuøa caùc chaát qua coät phaân tích ta tieán haønh phaân tích ôù caùc noàng ñoä töø 1 ñeán 20 ppm. ÔÛ cheá ñoä coù ñi qua coät: moãi noàng ñoä phaân tích 3 laàn theo cheá ñoä öùng vôùi chaát ñaõ neâu ôû treân, tính dieän tích peak trung bình (Xc). ÔÛ cheá ñoä khoâng cho qua coät: cöù khoaûng 1 phuùt ta tieâm maãu vaøo coät moät laàn vôùi theå tích 20 µl, sau 5 -6 phuùt thì döøng (caùc laàn bôm töø laàn 2 trôû ñi khoâng nhaán phím START). Tính giaù trò trung bình cuûa dieän tích peak ôû moãi noàng ñoä (X0). LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 25 Giaù trò hieäu suaát thu hoài qua coät Hc (%) ñöôïc tính theo coâng thöùc: Hc (%) = X X c 0  100 [Coâng thöùc 1] 3.7. Khaûo saùt caùc baäc trích ly Carbaryl, Dimethoate vaø xaùc ñònh hieäu suaát thu hoài qua caùc baäc. 3.7.1. Löïa choïn quy trình trích ly ñoái vôùi Carbaryl vaø Dimethoate. Taøi lieäu tham khaûo töø AOAC vaø caùc luaän vaên toát nghieäp ñaïi hoïc naêm tröôùc cho thaáy, quy trình phaân tích döïa treân caùc böôùc cô baûn: trích ly, laøm saïch, phaân tích treân thieát bò. Trong quy trình trích ly caùc chaát Carbaryl vaø Dimethoate thì quan troïng nhaát phaûi choïn ñöôïc dung moâi trích ly toát nhaát. ÔÛ ñaây chuùng toâi choïn dung moâi trích ly laø Axeton. Caùc böôùc tieán haønh cuûa quùa trình trích ly Carbaryl vaø Dimethoate ñöôïc thöïc hieän nhö sau: - Böôùc 1: Caân 100g maãu rau cho vaøo maùy xay Magic bullet, theâm 200 ml Aceton vaøo, nghieàn trong thôøi gian 1 phuùt. - Böôùc 2: Chuyeån hoãn hôïp sau khi nghieàn vaøo trong bercher 500 ml, traùng saïch maùy xay baèng Axeton, sau ñoù ñem ñi khuaáy töø trong thôøi gian 15 phuùt - Böôùc 3: Tieán haønh loïc chaân khoâng qua giaáy loïc treân pheãu loïc Buchner, thu dòch loïc vaøo Bercher 500 ml. Baõ giöõ laïi ôû treân pheãu. Caân khoaûng 20g muoái NaCl (tuøy vaøo löôïng nöôùc coù trong maãu) cho vaøo dòch trích, khuaáy caù töø ñeå hoøa tan hoaøn toaøn muoái - Böôùc 4: Chuyeån dòch ñaõ boå sung muoái vaøo trong phieãu chieát, taùch pha höõu cô ra khoûi pha nöôùc. - Böôùc 5: Laáy pha höõu cô phía treân ñem ñi coâ quay chaân khoâng cho ñeán khi caïn vaø dòch khoâng coøn thay ñoåi theå tích nöõa thì döøng. - Böôùc 6: Chuyeån phaàn dòch sau coâ quay vaøo bình ñònh möùc 100 ml, traùng bình coâ quay baèng 25 ml Axetonitril vaøo bình ñònh möùc tieáp tuïc ñònh möùc ñeán vaïch. - Böôùc 7: Dòch sau khi ñònh möùc ñem ñi loïc vôùi maøng loïc 0,45 µm sau ñoù ñaùnh sieâu aâm loaïi boït khí vaø tieán haønh phaân tích treân maùy HPLC. Sau ñaây laø sô ñoà khoái cuûa quy trình treân: (xem hình 3.1, trang 26) LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 26 Hình 3.1: Sô ñoà quy trình trích ly Carbaryl vaø Dimethoate. Coâ quay chaân khoâng 120 v/p, 45oC Traùng bình Taùch pha Pha nöôùc 20 g NaCL 100g rau Xay200 ml Axeton Laéc Loïc chaân khoâng Baõ Sieâu loïc 0,45 µm Dòch phaân tích Ñònh möùc 100 ml LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 27 3.7.2. Khaûo saùt hieäu suaát trích ly dòch Carbaryl vaø Dimethoate trong nöôùc qua caùc baäc trích ly. Caùch tieán haønh nhö sau: cho 25 ml dung dòch moãi chaát Carbaryl vaø Dimethoate 20 ppm ñaõ pha saün trích ly trong 50 ml Axeton. Sau ñoù cuõng tieán haønh khuaáy töø ñeå hoøa tan Carbaryl vaø Dimethoate vaøo trong Axeton. Tieán haønh gioáng caùc böôùc töø 4 ñeán 7 nhö quy trình muïc 3.7.1 treân. Pha höõu cô taùch ra laàn thöù nhaát sau khi tieán haønh caùc böôùc tieáp theo ta ñöôïc dòch trích baäc 1 ñem ñi phaân tích, tieáp tuïc laáy pha nöôùc boå sung theâm Axeton vaø muoái ñem ñi khuaáy töø tieáp thu ñöôc pha höõu cô vaø nöôùc laàn 2. Pha höõu cô tieáp tuïc quy trình phía sau thu dòch trích baäc 2, pha nöôùc thu ñöôïc laàn 2 laïi cho theâm Axeton vaø muoái ñem khuaáy töø vaø taùch pha laàn 3. Pha höõu cô thu ñöôïc laàn 3 tieáp tuïc quaù trình ñeå coù dòch trích baäc 3. Chæ khaûo saùt 3 baäc vì vaäy pha nöôùc laàn 3 ñöôïc loaïi boû. Dòch trích ly baäc 1, 2, 3 ñöôïc ñem ño treân maùy HPLC ñeå xaùc ñònh dieän tích caùc peak. Moãi maãu tieán haønh ño 3 laàn, laáy dieän tích peak trung bình. Ñeå tính ñöôïc hieäu suaát thu hoài caùc chaát qua caùc baäc trích ly ta tieán haønh ñoàng thôøi ño dieän tích peak cuûa dung dòch Carbaryl, Dimethoate 20 ppm ñem ñi trích ñeå so saùnh. Sô ñoà quy trình trích ñöôïc theå hieän ôû hình 3.2: (trang 28) 3.7.3 Khaûo saùt ñoä thu hoài maãu cuûa quy trình trích ly Carbaryl vaø Dimethoate treân maãu caûi baép Sô ñoà quy trình trích döïa treân quy trình ôû sô ñoà hình 3.1 vaø keát quaû choïn soá baäc seõ ñöôïc trình baøy ôû phaàn keát quaû vaø baøn luaän. Tieán haønh khaûo saùt ñoä thu hoài Carbaryl vaø Dimethoate treân ñoái töôïng phaân tích laø caûi baép. Caûi baép ñöôïc mua ôû chôï ñem veà baûo quaûn trong ngaên maùt cuûa tuû laïnh. Ñeå ñaùnh giaù möùc ñoä hoaøn thieän cuûa moät quy trình phaân tích chuùng toâi döïa vaøo ñoä thu hoài maãu. Ñoä thu hoài maãu laø möùc ñoä thu hoài löôïng hoaït chaát ñaõ theâm vaøo trong maãu rau khi phaân tích. Vì vaäy ta phaûi bieát chính xaùc löôïng thuoác theâm vaøo treân rau. Vaø tính hieäu suaát thu hoài döïa treân löôïng thuoác theâm vaøo naøy. Ta tieán haønh khaûo saùt ñoä thu hoài maãu ôû caùc noàng ñoä boå sung töông öùng vôùi löôïng phun theâm 2,5 ; 5 ; 10 ml dung dòch 100 ppm Carbaryl, Dimethoate vaøo caûi baép vaø löôïng theâm cuõng 2,5 ; 5; 10 ml dung dòch chuaån Carbaryl, Dimethoate 100 ppm vaøo dòch trích ñaõ ñöôïc loïc chaân khoâng. LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 28 Nöôùc Dòch phaân tích 3 25mL Carbaryl , Dimethoate 20ppm 50mL Axeton Khuaáy töø 5 – 7g NaCl Taùch pha 2mL Axetonitril Ñònh möùc 10mL Dòch phaân tích 2 2nl Axetonitril Pha höõu cô Coâ quay chaân khoâng Traùng bình Ñònh möùc 50mL Dòch phaân tích 1 Pha nöôùc AxetonKhuaáy Taùch pha 2-3g NaCl Pha höõu cô Pha nöôùc Khuaáy töø Taùch pha Coâ quay chaân khoâng Traùng bình Hình 3.2: Sô ñoà trích ly 3 baäc Axeton 2-3g NaCl Pha höõu cô LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 29  Xaùc ñònh ñoä thu hoài cuûa Carbaryl, Dimethoate cuûa caûi baép khi boå sung tröïc tieáp dung dòch chuaån leân rau: Vôùi moãi chaát ta seõ chuaån bò 4 maãu rau 100g trong ñoù: - Maàu 1 khoâng boå sung gì caû - Maãu 2 boå sung 2,5 ml dung dòch chuaån 100 ppm - Maãu 3 boå sung 5 ml dung dòch chuaån 100 ppm - Maãu 4 boå sung 10 ml dung dòch chuaån 100 ppm Sau ñoù tieán haønh trích maãu theo quy trình ñaõ choïn. Phaân tích baèng HPLC nhö ñaõ moâ taû phaàn tröôùc. Xaùc ñònh dieän tích peak caùc maãu khoâng boå sung vaø coù boå sung Carbaryl, Dimethoate treân rau nhö treân, ñoàng thôøi ño maãu Carbaryl, Dimethoate trong nöôùc ôû noàng ñoä töông ñöông vôùi löôïng chaát chuaån boå sung sau khi ñaõ ñònh möùc ñeå ñem phaân tích treân maùy HPLC. Ñoä thu hoài maãu H(%) ôû moãi noàng ñoä boå sung ñöôïc tính: (Xb [Coâng thöùc 2] Vôùi Xb: dieän tích peak trung bình caùc laàn ño cuûa maãu coù boå sung theâm chaån X: dieän tích peak trung bình caùc laàn ño cuûa maãu khoâng boå sung Xchuan: dieän tích peak trung bình caùc laàn ño cuûa caùc chuaån töông öùng noàng ñoä ñaõ boå sung.  Xaùc ñònh ñoä thu hoài maãu Carbaryl, Dimethoate khi boå sung vaøo dòch caûi baép sau khi ñaõ loïc baõ: Ñoái vôùi moãi chaát khaûo saùt ta cuõng tieán haønh chuaån bò 4 maãu rau caûi baép, moãi maãu 100g. Moãi maãu cuõng ñöôïc trích ly 2 baäc cho caû baõ vaø taùch pha. Nhöng trong thí nghieäm naøy ta khoâng boå sung dung dòch chuaån Carbaryl, Dimethoate vaøo trong rau maø boå sung vaøo dòch qua loïc chaân khoâng sau khi ñaõ trích 2 laàn treân rau. Nhö vaäy ñoä thu hoà löôïng chaát chuaån theâm vaøo trong thí nghieäm naøy so saùnh vôùi ñoä thu hoài khi phun chaát chuaån tröïc tieáp leân rau trong thí nghieäm treân seõ cho ta thaáy söï maát maùt löôïng chaát vaãn coøn naèm trong baõ vaø söï toån thaát qua khaâu loïc chaân khoâng. Tieán haønh trích ly 8 maãu caûi baép, moãi maãu 100g thöïc hieän theo quy trình treân nhöng ôû khaâu dòch loïc tröôùc khi khuaáy töø 1 seõ coù 6 maãu ñöôïc boå sung caùc löôïng töông öùng 2,5; 5; 10 ml dung dòch chuaån 100 ppm cho moãi chaát Carbaryl, Dimethoate, 2 maãu H(%) = X XX chuan b )(  100 LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 30 coøn laïi khoâng boå sung gì theâm. Trong quaù trình laáy maãu, caùc maãu boå sung cuøng moät chaát vaø maãu traéng ñoái chöùng phaûi laáy cuøng moät traùi caûi baép ñeå traùnh sai soá. Phaân tích treân maùy HPLC moãi maãu 3 laàn, laáy keát quûa dieän tích peak trung bình ño ñöôïc. 3.8. ÖÙng duïng quy trình phaân tích Carbaryl ñeå khaûo saùt söï phaân huûy Carbaryl trong caûi baép sau khi chieáu xaï lieàu thaáp. Vôùi quy trình phaân tích Carbaryl ñaõ ñöôïc khaûo saùt vaø choïn nhö treân, chuùng toâi thöïc hieän trích ly caùc maãu caûi baép coù boå sung theâm 5 ppm Carbaryl ñaõ ñöôïc xöû lyù chieáu xaï ôû caùc lieàu chieáu 0,2 ; 0,4; 0,6; 0,8; 1 KGy. Ñeå xem xeùt söï aûnh höôûng cuûa chieáu xaï ñeán löôïng Carbaryl trong caûi baép laø nhö theá naøo. Xöû lyù maãu rau ñem ñi chieáu xaï: ÖÙng vôùi moãi lieàu chieáu xaï chuùng toâi duøng nguyeân traùi caûi baép taåm vaøo moät löôïng dung dòch chuaån Carbaryl vôùi haøm löôïng 5 ppm töông öùng vôùi boå sung löôïng 5 mg Carbaryl vaøo 1kg caûi baép. Sau khi taåm theâm Carbaryl vaøo maãu caûi baép ñöôïc ñeå qua ñeâm trong ngaên maùt cuûa tuû laïnh. Chuaån bò theâm moät maãu caûi baép ñoái chöùng nghóa laø maãu naøy cuõng ñöôïc taåm theâm 5 ppm Carbaryl baûo quaûn trong ñieàu kieän gioáng caùc maãu treân nhöng khoâng ñem ñi chieáu xaï. Sau ñoù maãu ñöôïc gôûi ñi chieáu xaï ôû Vieän coâng ngheä haït nhaân Ñaø Laït. Maãu sau khi chieáu xaï xong tieán haønh laáy moãi maãu 100g ñem ñi trích ly Carbaryl vaø phaân tích treân HPLC. 3.9. Khaûo saùt hieäu suaát thu hoài cuûa quy trình trích ly Vitamin C trong caûi baép. 3.9.1. Quy trình trích ly Vitamin C trong caûi baép Döïa vaøo taøi lieäu tham khaûo “Giaùo trình phaân tích thöïc phaåm” [10], chuùng toâi xaây döïng quy trình trích ly Vitamin C nhö sau: Laáy maãu rau khoaûng 25g ñem xay trong trong dung dòch ñeäm KH2PO4 pH = 2,8 ñeå trích ly Vitamin C coù trong caûi baép. Sau ñoù tieán haønh loïc baèng heä thoáng loïc chaân khoâng. Dòch loïc thu ñöôïc ñöôïc ñònh möùc leân 100 ml, sau ñoù tieáp tuïc loïc qua maøng loïc 0,45 µm thu ñöôïc dòch chieát Vitamin C cho phaân tích. Dòch thu ñöôïc tieáp tuïc pha loaõng 10 laàn baèng dung dòch ñeäm. Sau ñoù tieán haønh phaân tích vôùi dòch ñaõ pha loaõng naøy treân maùy HPLC. Sô ñoà quy trình trích ly Vitamin C töø caûi baép nhö hình 3.3 (trang 31). 3.9.2. Khaûo saùt hieäu suaát trích ly ñoái vôùi quy trình trích ly Vitamin C trong caûi baép Ñeå coù theå tính ñöôïc hieäu suaát thu hoài ta phaûi theâm löôïng chaát chuaån bieát tröôùc haøm löôïng vaøo maãu caàn phaân tích vaø coù maãu traéng ñoái chöùng ñeå so saùnh. LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 31 Caùch thöùc tieán haønh: ÔÛ ñaây chuùng toâi khaûo saùt hieäu suaát thu hoài chung cuûa caû quy trình trích vaø khaûo saùt söï maát maùt rieâng cuûa khaâu loïc baõ vaø cuûa baõ soùt laïi.  Khaûo saùt ñoä thu hoài cuûa caû quy trình trích ly Vitamin C trong caûi baép Chuaån bò maãu trích ly: laáy 4 maãu caûi baép cuøng töø moät traùi, moãi maãu caân 25g. Sau ñoù tieán haønh xöû lyù maãu nhö sau: - Maãu 1: khoâng boå theâm chuaån Vitamin C - Maåu 2: boå sung theâm 5ml dung dòch chuaån 1000 ppm Vitamin C vaøo rau - Maãu 3: boå sung theâm 10 ml dung dòch chuaån 1000 ppm Vitamin C vaøo rau - Maãu 4: boå sung theâm 15 ml dung dòch chuaån 1000 ppm Vitamin C vaøo rau. Hình 3.3: Quy trình trích ly Vitamin C 25g rau Xay Loïc chaân khoâng Ñònh möùc 100mL Sieâu loïc Dòch chieát Vitamin C 75 mL dd ñeäm LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 32 Tieán haønh trích ly caùc maãu ñaõ xöû lyù treân theo quy trình trích ly nhö muïc 3.9.1 thu ñöôïc dòch loïc chuaån bò cho phaân tích HPLC. Ñoàng thôøi cuõng pha loaõng töø dung dòch goác 1000 ppm thaønh caùc dung dòch coù noàng ñoä 5 ppm, 10 ppm, 15 ppm. Dòch loïc thu ñöôïc cuûa caùc maãu tieán haønh pha loaõng leân 10 laàn baèng caùch laáy moãi maãu dòch 1ml cho vaøo bình ñònh möùc 10 ml vaø ñònh möùc tôùi vaïch baèng dung dòch ñeäm pH =2,8. Ñaùnh sieâu aâm caùc maãu tröôùc khi phaân tích treân maùy. Ño maãu treân maùy HPLC. Moãi maãu ño laëp laïi 3 laàn, laáy giaù trò trung bình dieän tích peak ño ñöôïc.  Khaûo saùt söï maát maùt Vitamin C trong baõ vaø quaù trình loïc. Laáy 4 maãu caûi baép moãi maãu 50g töø cuøng moät traùi. Sau ñoù tieán haønh quy trình trích ly nhö muïc 3.9.1. Dòch loïc thu ñöôïc sau khi loïc chaân khoâng tieán haønh xöû lyù nhö sau: - Dòch loïc maãu 1: khoâng boå sung chuaån Vitamin C - Dòch loïc maãu 2: boå sung theâm 5 ml dung dòch chuaån Vitamin C - Dòch loïc maãu 3: boå sung theâm 10 ml dung dòch chuaån Vitamin C - Dòch loïc maãu 4: boå sung theâm 15 ml dung dòch chuaån Vitamin C. Tieáp tuïc quy trình trích vaø thu ñöôïc dòch trích sau sieâu loïc qua maøng 0,45 µm. Pha loaõng dòch trích moãi maãu leân 10 laàn, ñaùnh sieâu aâm taát caû caùc maãu vaø tieán haønh phaân tích treân maùy HPLC. Moãi maãu ño laëp laïi 3 laàn, laáy giaù trò trung bình dieän tích peak ño ñöôïc. LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 33 Chöông 4: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN 4.1. Kết quả khaûo saùt phoå haáp thu cuûa Carbaryl, Dimethoate, Vitamin C: 4.1.1. Phoå haáp thu UV cuûa Carbaryl trong nöôùc. Hình 4.1: Phoå haáp thu UV cuûa dung dòch Carbaryl trong nöôùc Döïa vaøo ñoà thò phoå haáp thu UV cuûa Carbabyl ôû hình 4.1 ta thaáy Carbaryl coù 2 ñænh haáp phuï ôû böôùc soùng 220 vaø 280 nm. Nhöng ôû böôùc soùng 220 ñoä haáp thu ñaït ñöôïc cao hôn. So saùnh vôùi keát quaû cuûa naêm tröôùc keát quaû naøy hoaøn toaøn gioáng. Nhö vaäy coù theå choïn böôùc soùng 220 nm ñeå ñaët cheá ñoä cho daàu doø UV khi ño Carbabryl cuûa maùy HPLC. 4.1.2. Phoå haáp thu UV cuûa Dimethoate trong nöôùc. Hình 4.2: Phoå haáp thu UV cuûa dung dòch chuaån Dimethoate trong Axetonitril: nöôùc Phổ hấp thu của Dimethoat -0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 200 220 240 260 280 Bước sóng (nm) Đ ộ h ấ p th u Phổ hấp thu của carbaryl 0 0.4 0.8 1.2 1.6 200 220 240 260 280 300 320 340 Bước sóng (nm) Đ ộ h ấ p th u LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 34 Phoå haáp thu cuûa Dimethoate ôû hình 4.2 thu được khi chỉnh pH của dung dịch Dimethoate ở pH = 6. Ñoà thò coù moät ñænh haáp thu ôû böôùc soùng 204 nm cho keát quaû phuø hôïp vôùi naêm tröôùc. Ñoàng thôøi chuùng toâi nhaän thaáy trong quaù trình ño quang phoå cuûa Dimethoate trong nöôùc coù söï aûnh höôûng lôùn cuûa pH dung dòch. Khi chænh pH cuûa dung dòch Dimethoate ôû giaù trò 9 – 10, chuùng toâi thaáy phoå haáp thu khoâng coù ñænh haáp thu cöïc ñaïi vaø hình daïng ñöôøng phoå dao ñoäng zích zaéc. Ñieàu naøy coù theå giaûi thích laø ôû moäi tröôøng pH = 9 -10 mang tính kieàm thì Dimethoate khoâng oån ñònh vaø bò phaân huûy nhanh laøm cho giaù trò ñoä haáp thu khi ño dao ñoäng nhieàu. 4.1.3. Phoå haáp thu UV cuûa Vitamin C trong ñeäm: Phoå queùt ñöôïc cho thaáy ñænh haáp thu cöc ñaïi cuûa Vitamin C ôû 245 nm, keát quaû naøy hoaøn toaøn phuø hôïp vôùi taøi lieäu phaân tích Vitamin C cuûa boä moân. Nhö vaäy luaän vaên naøy cuõng ñaët giaù trò böôùc soùng ñaàu doø UV cuûa maùy HPLC laø 245 nm khi ño viamin C trong suoát luaän vaên. 4.2. Keát quaû khaûo saùt pha ñoäng ñoái vôùi Carbaryl vaø Dimethoate 4.2.1. Keát quaû khaûo saùt pha ñoäng cuûa Carbaryl: Keát quaû veà dieän tích peak vaø thôøi gian löu khi khaûo saùt caùc pha ñoäng khaùc nhau cho thaáy khi taêng daàn löôïng Axetonitril leân thì dieän tích peak taêng theo vaø thôøi gian löu giaûm daàn.Ñieàu ñoù chöùng toû tæ leä Axetonitril caøng lôùn thì khaû naêng röûa giaûi cuûa pha ñoäng caøng cao.Vì Axetonitril laø dung moâi phaân cöïc duøng ñeå röûa giaûi coät pha ñaûo trong phaân tích caùc chaát coù ñoä phaân cöïc trung bình ñeán maïnh. Luaän vaên naøy khaûo saùt khaû naêng röûa giaûi cuûa caùc pha ñoäng vaø töø ñoù choïn ra pha ñoäng phuø hôïp ñeå tieáp tuïc khaûo saùt Carbaryl trong caùc phaàn sau luaän vaên. Phổ Vitamin C trong dung dịch đệm -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 210 240 270 300 330 360 390 Bước sóng (nm) Đ ộ hấ p th u Hình 4.3: Phoà haáp thu UV dung dòch Vitamin C trong ñeäm LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 35 Baûng 4.1: Dieän tích peak vaø thôøi gian löu cuûa Carbaryl ôû caùc pha ñoäng Heä pha ñoäng Thôøi gian löu trung bình, phuùt Dieän tích peak trung bình 40/60 11,374 ± 0.038 1270426 ± 60726 55/45 6,291 ± 0.084 1507740,7 ± 7791 70/30 5,502 ± 0,166 1775789,7 ±18823 85/15 3,359 ± 0.806 2016552 ± 52632 Ñeå choïn ñöôïc moät pha ñoäng chaïy HPLC ta khoâng chæ döïa vaøo khaû naêng röûa giaûi cao maø coøn phaûi xem xeùt veà thôøi gian löu phuø hôïp.Vaø coøn tính ñeán vieäc tieát kieäm dung moâi söû duïng vì dung moâi chaïy HPLC laø dung moâi coù chí phí ñaét. Thôøi gian löu choïn phaûi laøm sao khoâng quaù daøi ñeå ruùt ngaén thôøi gian phaân tích cuõng nhö khoâng quaù ngaén vì thôøi gian löu ngaén deã truøng vôùi peak dung moâi ra, luùc ñoù dieän tích peak ño ñöôïc seõ khoâng chính xaùc. Döïa treân Baûng 4.1 ôû treân ta thaáy pha ñoäng vôùi tæ leä Axetonitril : nöôùc laø 55/45 laø coù theå chaáp nhaän ñöôïc. Neáu taêng tæ leä naøy leân 70/30 thì thôøi gian löu giaûm xuoáng khoâng ñaùng keå maø laïi taêng leân moät löôïng khoâng ít dung moâi neân choïn pha ñoäng naøy khoâng kinh teá laém. 4.2.2. Keát quaû khaûo saùt aûnh höôûng thaønh phaàn pha ñoäng phaân tích Dimethoate Baûng 4.2: Dieän tích vaø thôøi gian löu cuûa Dimethoate ôû caùc pha ñoäng Heä pha ñoäng Thôøi gian löu trung bình, phuùt Dieän tích peak trung bình 40/60 6,549 ± 0,100 184982,3 ± 961,9 55/45 3,973 ± 0,063 219896 ± 7476 70/30 3,654 ± 0,048 342067,7 ± 15324 85/15 2,971 ± 0,004 364542 ± 17498 Töông töï khaûo saùt pha ñoäng cuûa Carbaryl, ñoái vôùi Dimethoate ta cuõng tieán haønh khaûo saùt ñeå choïn ra pha ñoäng phuø hôïp nhaát. Döïa treân Baûng 4.2 ta thaáy Dimethoate cuõng vaäy khi taêng tæ leä cuûa Axetonitril thì thôøi gian löu giaûm ñoàng thôøi dieän tích peak LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 36 taêng leân. ÔÛ pha ñoäng tæ leä 70/30 vaø 85/15 dieän tích peak khaù cao so vôùi tæ leä 55/45 vaø 40/60. Nhöng ôû pha ñoäng 55/45 cho saéc kyù ñoà coù hình daïng caân ñoái hôn so vôùi caùc pha ñoäng khaùc. Chuùng toâi thaáy pha ñoäng 55/45 cho thôøi gian löu vaø dieän tích peak töông ñoái trung bình giöõa caùc pha ñoäng. Vì luaän vaên naøy ñoàng thôøi khaûo saùt ñoái vôùi hai chaát neân chuùng toâi choïn pha ñoäng chaïy Dimethoate cuõng laø 55/45 ñeå tieän vieäc phaân tích ñoàng thôøi cho hai chaát. Muïc ñích laø tieát kieäm thôøi gian khi chuyeån töø phaân tích chaát naøy sang chaát kia vì thôøi gian thay pha ñoäng ñeå phaân tích moät chaát raát laâu môùi coù theå phaân tích oån ñònh. 4.3. Keát quaû xaây döïng ñöôøng chuaån Carbaryl, Dimethoate, Vitamin C 4.3.1. Ñöôøng chuaån cuûa carabryl trong dung dòch nöôùc: Pha ñoäng cho phaân tích Carbaryl vaø Dimethoate duøng laø Axetonitril: nöôùc theo tæ leä 55/45. Hình 4.4: Saéc kyù ñoà ño chuaån Carbaryl ôû noàng ñoä 10 ppm (a) vaø 5 ppm (b) Hình 4.5: Đường chuẩn phaân tích Carbaryl trong nước y = 185795x R2 = 0,9932 0 1000000 2000000 3000000 4000000 0 5 10 15 20 25 Noàng ñoä Carbaryl, ppm 6.297 6,198 ( a) (b) Dieän tích peak LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 37 Keát quaû ño caùc maãu chuaån cuûa Carbaryl ôû caùc noàng ñoä cho dieän tích peak vaø thôøi gian löu coù ñoä laëp laïi toát, vôùi ñoä leäch chuaån chaáp nhaän ñöôïc cho sai soá thöïc nghieäm < 5%. Ñöôøng chuaån xaây döïng cho khoaûng noàng ñoä töø 1 ppm ñeán 20 ppm coù ñoä tuyeán tính cao vôùi heä soá töông quan R = 0,996. 4.3.2. Ñöôøng chuaån Dimethoate trong dung dòch nöôùc: Töông töï Carbaryl, ñoái vôùi Dimthoate keát quaû thu ñöôïc cuõng coù ñoä laëp laïi cao giöõa caùc laàn ño. Ñöôøng chuaån trong khoaûng noàng ñoä ño töø 1ppm ñeán 20 ppm coù ñoä tuyeán tính cao R = 0,997. ÔÛ ñaây ta thaáy thôøi gian löu cuûa Dimethoate khoaûng gaàn 4 phuùt ngaén hôn so vôùi thôøi gian löu cuûa Carbaryl laø hôn 6 phuùt coù theå giaûi thích ñöôïc laø do ñoä phaân cöïc cuûa Dimethoate lôùn hôn so vôùi ñoä phaân cöïc cuûa Carbaryl. Vì vaäy pha ñoäng seõ loâi keùo Dimthoate ra nhanh hôn so vôùi Carbaryl. Hình 4.6: Saéc kyù ñoà ño chuaån Dimethoate ôû noàng ñoä 5 ppm (a) vaø 1 ppm (b) Hình 4.7: Ñöôøng chuaån phaân tích Dimethoate trong dung dòch Axetonitril: nöôùc y = 16006x R2 = 0,995 0 100000 200000 300000 400000 0 5 10 15 20 25 Noàng ñoä Dimethoat, ppm 3,937 3,968 (a) (b) Dieän tích peak LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 38 4.3.3. Ñöôøng chuaån dung dòch Vitamin C trong ñeäm: Keát quaû ñöôøng chuaån cuûa Vitamin C trong khoaûng noàng ñoä ño töø 1 ppm ñeán 20 ppm nhö hình 4.7. Sai soá giöõa caùc laàn ño < 5 % laø chaáp nhaän ñöôïc, heä soá tuyeán tính cuûa ñöôøng chuaån cao R = 0,997. Hình 4.8: Saéc kyù ñoà ño chuaån Vitamin C 1ppm vaø 2 ppm Hình 4.9: Ñöôøng chuaån Vitamin C trong dung dòch ñeäm  Ngöôõng ñònh löôïng cuûa maùy HPLC Do haïn cheá cuûa phaàn meàm öùng duïng ghi vaø xöû lyù soá lieäu neân khoâng theå tính ñöôïc giaù trò lyù thuyeát cuûa ngöôõng phaùt hieän (LOD) vaø ngöôõng ñònh löôïng (LOQ). Giôùi haïn ñònh löôïng (LOQ) cuûa qui trình phaân tích cho ba chaát treân ñöôïc xaùc ñònh qua thöïc nghieäm baèng caùch ño caùc maãu chuaån coù noàng ñoä thaáp. Thöïc nghieäm cho thaáy keát quaû ño oån ñònh vaø coù ñoä laëp laïi toát (caû dieän tích peak laãn thôøi gian löu) ôû noàng ñoä 0,1ppm ñoái vôùi Dimethoate. Coù theå laáy ñaây laø ngöôõng ñònh löôïng cuûa Dimethoate. Döïa vaøo heä soá goùc cuûa ñöôøng chuaån cuûa 3 chaát, chuùng toâi thaáy ñoä nhaïy cuûa maùy ñoái vôùi Carbaryl laø lôùn nhaát roài tôùi Vitamin C vaø Dimethoate. Nhö vaäy döïa vaøo tæ soá heä soá goùc ñöôøng y = 29352x R 2 = 0,9957 0 100000 200000 300000 400000 500000 0 5 10 15 20 25 Noàng ñoä Vitamin C, ppm Dieän tích peak 2,397 2,397 LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 39 chuaån vaø ngöôõng ñònh löôïng cuûa Dimethoate laø 0,1 ppm, chuùng toâi suy ra ñöôïc ngöôõng ñònh löôïng cuûa Vitamin C laø 0,05 ppm vaø Carbaryl laø 0,008 ppm. 4.3. Keát quaû ñoä thu hoài maãu Carbaryl, Dimthoate vaø Vitamin C: 4.3.1. Ñoä thu hoài maãu Dimethoate qua coät: Phaân tích caùc maãu Dimethoate coù noàng ñoä 1 – 20ppm laëp laïi 3 laàn, laáy giaù trò trung bình cuûa dieän tích peak vaø thôøi gian löu. Sau ñoù cuõng tieáp tuïc phaân tích caùc maãu naøy nhöng ñeå doøng pha ñoäng daãn maãu thaúng tôùí ñaàu doø, khoâng qua coät phaân tích. Laáy giaù trò trung bình cuûa dieän tích peak maãu khoâng qua coät. Tæ soá giöõa dieän tích peak cuûa maãu qua coät vaø maãu khoâng qua coät noàng ñoä töông öùng laø ñoä thu hoài maãu qua coät. Ta coù baûng sau: Baûng 4.3: Ñoä thu hoài qua coät cuûa Dimethoate: Maãu qua coät Maãu khoâng qua coät Ñoä thu hoài maãu qua coät, % Noàng ñoä maãu, ppm Dieän tích peak RSD% Dieän tích peak RSD% 1 34538,3 2,48 107228 4,31 32,21 ± 1,57 2 61590,5 3,68 151350 3,24 40,69 ± 1,99 5 163449,5 4,12 253129,8 4,2 64,57 ± 3,74 10 211424,5 3,84 323055,3 3,09 65,45 ± 3,2 20 463938,3 1,51 584562 3,4 79,36 ± 2,93 Tính ñoä thu hoài theo coâng thöùc 1 muïc 3.6, ta thaáy ñoä thu hoài maãu qua coät cuûa Dimethoate taêng leân khi taêng noàng ñoä maãu. Ñieàu naøy coù theå giaûi thích laø do ôû noàng ñoä thaáp moät löôïng nhoû Dimethoate bò giöõ laïi cuõng laøm aûnh höôûng ñaùng keå ñeán keát quaû. Nhìn chung thì keát quaû ñoä thu hoài maãu cuõng töông ñoái cao, chöùng toû heä pha ñoäng röûa giaûi Dimethoate khaù toát. 4.3.2. Ñoä thu hoài qua coät cuûa Carbaryl: Tieán haønh töông töï nhö ñoái vôùi Dimethoate ta coù baûng sau: LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 40 Baûng 4.4: Ñoä thu hoài qua coät cuûa Carbaryl Maãu qua coät Maãu khoâng qua coät Ñoä thu hoài maãu qua coät, % Noàng ñoä maãu, ppm Dieän tích peak RSD% Dieän tích peak RSD% 1 195813,5 4,69 236675 1,55 82,74 ± 4,07 2 313848,8 1,44 372470,8 1,27 84,26 ± 1,61 5 750989,5 3,9 788714,8 1,42 95,22 ± 3,95 10 1512305 0,74 1543244 0,72 98,00 ± 1,00 Ñoä thu hoài maãu qua coät cuûa Carbaryl cao hôn raát nhieàu so vôùi caùc maãu Dimethoate, ñieàu naøy chöùng toû heä pha ñoäng Axetonitril/ nöôùc vôùi thaønh phaàn 55/45 röûa giaûi Carbaryl ra khoûi coät toát hôn nhieàu so vôùi röûa giaûi Dimethoate. Tuy nhieân ñeå thuaän tieän trong quaù trình thí nghieäm, taïo söï oån ñònh cho coät phaân tích, trong luaän vaên naøy chæ duøng moät heä pha ñoäng 55/45 ñeå phaân tích caû 2 chaát. 4.3.3.Ñoä thu hoài qua coät cuûa Vitamin C: Döïa vaøo keát quaû treân baûng 4.5 ta thaáy ñoä thu hoài qua coät cuûa Vitamin C khaù cao, taêng daàn khi noàng ñoä maãu taêng. Baûng 4.5: Ñoä thu hoài qua coät cuûa Vitamin C Maãu qua coät Maãu khoâng qua coät Ñoä thu hoài maãu qua coät, % Noàng ñoä maãu, ppm Dieän tích peak RSD% Dieän tích peak RSD% 1 30427 1,56 35170 2,34 86,51 ± 2,43 2 57752 4,78 65252 4,17 88,51 ± 5,57 5 143544 5,01 157669 1,34 91,04 ± 4,71 10 281456 4,3 302972 2,45 92,9 ± 4,58 20 559646 1,45 598297 4,3 93,54 ± 4,23 LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 41 4.4. Keát quaû khaûo saùt hieäu suaát trích ly dòch Carbaryl vaø Dimethoate trong nöôùc qua caùc baäc trích ly. Theo taøi lieäu luaän vaên naêm tröôùc quaù trình trích ly chæ tieán haønh moät baäc vaø löôïng maãu xöû lyù nhoû neân hieäu suaát thu hoài töø rau caûi baép cuûa quaù chæ ñaït 70,38% ñoái vôùi Carbaryl vaø 82% ñoái vôùi Dimethoate. Vì vaäy chuùng toâi tieán haønh khaûo saùt theâm soá baäc trích ly ñeå ñaït ñöôïc hieäu suaát thu hoài maãu cao hôn. Tröôùc heát chuùng toâi khaûo saùt treân dung dòch chuaån trong nöôùc cuûa hai chaát Carbaryl vaø Dimethoate ñeå xem soá baäc trích ly thöïc söï yù nghóa laø bao nhieâu. Sau khi taùch pha ta thu ñöôïc pha höõu cô vaø pha nöôùc. Pha höõu cô tieáp tuïc ñöôïc xöû lyù nhö laàn 1, thu ñöôïc dòch 1 ñem ñi phaân tích. Coøn pha nöôùc laïi tieáp tuïc cho Axeton vaøo, qua caùc quaù trình nhö tröôùc ta thu ñöôïc dòch 2 ñem ñi phaân tích. Tieáp tuïc taùch pha ôû laàn 2 vaø laøm nhö laàn 1 ñöôïc dòch 3. ÔÛ 2 laàn xöû lyù sau, dòch ñöôïc ñònh möùc 10mL. moãi maãu phaân tích 3 laàn, laáy giaù trò trung bình cuûa dieän tích peak vaø thôøi gian löu, ta thu ñöôïc baûng sau: Baûng 4.6: Keát quaû khaûo saùt caùc baäc trích ly Dimethoate Baäc trích ly Dieän tích peak RSD% Soá baäc trích ly Ñoä thu hoài maãu (%) 1 (ñònh möùc 25mL) 2 (ñònh möùc 10mL) 3 (ñònh möùc 10mL) 290692,6 11318,3 1248 1,08 3,93 4,52 1 2 3 90,81 ± 1,98 92,22 ± 4,14 92,38 ± 5,81 Töø keát quaû dieän tích peak caùc maãu ño ñöôïc naøy ta tính ñöôïc ñoä thu hoài maãu qua caùc baäc trích ly töông öùng. Ñoái vôùi trích ly moät baäc thì ñoä thu hoài maãu ñaït ñöôïc khaù cao, khoaûng 90,81%. khi taêng theâm moät baäc trích ly thì ñoä thu hoài taêng leân laø 92,22%, coøn khi taêng leân 3 baäc thì ñoä thu hoài taêng leân khoâng ñaùng keå. Do ñoù ñeå tieát kieäm thôøi gian vaø dung moâi, ta seõ tieán haønh trích ly 2 baäc. Töông töï ta coù keát quaû ñoái vôùi Carbaryl nhö baûng 4.7 sau: Baûng 4.7: Keát quaû khaûo saùt caùc baäc trích ly Carbaryl Baäc trích ly Dieän tích peak RSD (%) Soá baäc trích Ñoä thu hoài maãu (%) 1 (ñònh möùc 25 ml) 2 (ñònh möùc 10 ml) 3 (ñònh möùc 10 ml) 3383912 280926 138435 0,18 2,09 1,18 1 2 3 90,05 ± 3,22 94,09 ± 3,89 95,58 ± 4,11 LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 42 Ñoái vôùi carabryl chuùng toâi cuõng choïn 2 baäc trích ly vì keát quaû cho thaáy ôû baäc thöù 3 ñoä thu hoài maãu taêng leân khoâng ñaùng keå maø laïi toán theâm thôøi gian vaø dung moâi ñeå thöïc hieän. Töø keát quaû naøy chuùng toâi ñöa ra ñöôïc quy trình trích ly 2 baäc cho Carbaryl vaø Dimethoate trong caûi baép nhö hình 4.10 sau: (trang 43) 4.5. Keát quaû khaûo saùt ñoä thu hoài maãu cuûa quy trình trích ly Carbaryl vaø Dimethoate treân maãu caûi baép: 4.5.1. Keát quaû ñoä thu hoài Carbaryl cuûa caûi baép  Ñoä thu hoài maãu cuûa Carbaryl boå sung leân rau vaø ñeå qua ñeâm: Caùc maãu sau khi ñöôïc trích ly ñem ñi phaân tích moãi maãu ít nhaát 3 laàn, keát quaû thu ñöôïc ôû baûng sau: Baûng 4.8: Keát quaû ño maãu xaùc ñònh ñoä thu hoài cuûa Carbaryl Maãu Dieän tích peak RSD (%) Maãu traéng 40 706 2,78 Boå sung 2,5 ml 381443 5.03 Boå sung 5 ml 865077 4,89 Boå sung 10 ml 1702964 5,01 Chuaån 2,5 ml 398339 2,07 Chuaån 5 ml 897271 1,96 Chuaån 10 ml 1759452 1,50 Töø keát quaû naøy chuùng toâi tieán haønh tính ñoä thu hoài maãu cuûa quy trình phaân tích theo coâng thöùc 2 ôû muïc 3.7.3 ñöôïc keát quaû sau: Maãu Ñoä thu hoài (%) Boå sung 2,5 ml 85,53 Boå sung 5 ml 91,87 Boå sung 10 ml 94,6 LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 43 Khuaáy töø 125 – 27g NaCl 100g Caûi baép Xay200mL Axeton Taùch pha 1 50ml Axeton Laéc 50mL Axeton Dòch phaân tích Ñònh möùc 100mL 25mL Axetonitril Traùng bình Pha höõu cô Pha nöôùc Coâ quay chaân khoâng Sieâu aâm Sieâu loïc Pha nöôùc Khuaáy töø 2 Taùch pha 2 Pha höõu cô Hình 4.10: Quy trình trích ly caûi baép Loïc 1 Laéc Loïc 2 Baõ LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 44  Ñoä thu hoài maãu carabryl khi boå sung theâm carabryl vaøo dòch trích rau: Khaùc vôùi vieäc boå sung theâm carabryl vaøo rau nhö ôû treân, thí nghieäm naøy chuùng toâi boå sung theâm Carbaryl vaøo ngay dòch trích sau qua trình loïc baõ ñeå khaûo saùt xem löïong Carbaryl bò maát maùt trong giai ñoaïn loïc vaø coøn soùt trong baõ laø bao nhieâu. Baûng 4.9: Keát quaû ño maãu xaùc ñònh ñoä thu hoài Carbaryl theâm vaøo dòch Maãu Dieän tích peak RSD (%) Maãu traéng 43134 1,08 Boå sung 2,5 ml 399139 4,60 Boå sung 5 ml 900240 3,67 Boå sung 10 ml 1765974 5,10 Chuaån 2,5 ml 398339 2,07 Chuaån 5 ml 897271 1,96 Chuaån 10 ml 1759452 1,50 Keát quaû töø baûng treân chuùng toâi tính ñöôïc ñoä thu hoài maãu ra keát quaû nhö sau: Maãu Ñoä thu hoài (%) Boå sung 2,5 ml 89,17 ± 4,5 Boå sung 5 ml 92,2 ± 3,87 Boå sung 10 ml 95,5 ± 5,15 4.5.2. Keát quaû ñoä thu hoài Dimethoate cuûa caûi baép:  Ñoä thu hoài maãu cuûa Dimethoate boå sung leân rau vaø ñeå qua ñeâm Caùc maãu caûi baép ñöôïc boå sung theâm löôïng dung dòch chuaån sau khi tieán haønh trích ly, tieán haønh ñem phaân tích moãi maãu ít nhaát 3 laàn, keát quaû thu ñöôïc ôû baûng sau 4.10: (trang 45) LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 45 Baûng 4.10: Keát quaû ño maãu xaùc ñònh ñoä thu hoài cuûa Dimethoate Maãu Dieän tích peak RSD (%) Maãu traéng 26518 3,01 Boå sung 2,5 ml 99846 4,01 Boå sung 5 ml 128588 3,90 Boå sung 10 ml 220272 4,10 Chuaån 2,5 ml 51205 1,04 Chuaån 5 ml 84256 1,17 Chuaån 10 ml 186593 1,50 Ñoä thu hoài tính töø keát quaû thu ñöôïc ôû treân nhö sau: Maãu Ñoä thu hoài (%) Boå sung 2,5 ml 84,61 ± 4,31 Boå sung 5 ml 85,65 ± 4,28 Boå sung 10 ml 87,76 ± 4,65  Ñoä thu hoài maãu carabryl khi boå sung theâm Dimethoate vaøo dòch trích rau Caùc maãu ñem ño treân maùy HPLC thu ñöôïc keát quaû: Baûng 4.11: Keát quaû ño maãu Dimethoate boå sung vaøo dòch sau loïc Maãu Dieän tích peak RSD(%) Maãu traéng 24991 3.12 Boå sung 2,5 ml 68754 4,12 Boå sung 5 ml 101639 2.56 Boå sung 10 ml 195660 3,56 Chuaån 2,5 ml 51205 1,04 Chuaån 5 ml 84256 1,17 Chuaån 10 ml 186593 1,50 LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 46 Ñoä thu hoài tính theo coâng thöùc 2 ôû muïc 3.7.3, töø soá lieäu cuûa baûng treân cho keát quaû sau: Maãu Ñoä thu hoài(%) Boå sung 2,5 ml 85 ± 4,42 Boå sung 5 ml 90,9 ± 3,72 Boå sung 10 ml 91,46 ± 4,48 Nhö vaäy keát quaû ñoä thu hoài maãu cuûa quy trình trích ly töông ñoái cao, ñoái vôùi Carbaryl töø 85,53% ñeán 94,6% vaø ñoái vôùi Dimethoate töø 84,61% ñeán 87,76%. So vôùi keát quaû cuûa naêm tröôùc thì keát quaû naøy töông ñoái cao. Ñoä thu hoài cuûa Carabryl cao hôn cuûa Dimethoate nhöng khoâng quaù lôùn. Ñieàu ñoù cho thaáy quy trình phaân tích löïa choïn coù khaû naêng phaân tích khaù toát haøm löôïng Carbaryl cuõng nhö Dimethoate trong caûi baép. Ngoaøi ra keát quaû ñoä thu hoài cuûa maãu boå sung theâm vaøo dòch coøn cho chuùng ta thaáy raèng giai ñoaïn loïc baõ laøm maát maùt moät löôïng ñeán khoaûng 3,64 % ñoái vôùi Carbaryl vaø khoaûng 5,25 % ñoái vôùi Dimethoate. Töø soá lieäu ño ñöôïc cuûa maãu traéng caûi baép ñoái vôùi Carbaryl vaø Dimethoate ta coù theå tính ra ñöôïc haøm löôïng thaät söï cuûa Carabryl vaø Dimethoate coù trong maåu rau ñaõ mua ngoaøi thò tröôøng.  Thieát laäp coâng thöùc tính haøm löôïng Carbaryl vaø Dimethoate coù trong rau: Ñoái vôùi quy trình phaân tích Carbaryl vaø Dimethoate ñaõ choïn, chuùng toâi ñaõ xaùc ñònh ñöôïc ñoä thu hoài maãu qua khaâu ño treân maùy HPLC vaø trong quaù trình trích ly Carbaryl vaø Dimethoate nhö ôû treân. Nhö vaäy khi coù moät maãu rau caûi baép, chuùng toâi tieán haønh trích nhö quy trình trích treân vaø phaân tích treân maùy HPLC keát quaû ra dieän tích peak cuûa chaát caàn ño. Töø soá lieäu dieän tích peak naøy, döïa vaøo ñöôøng chuaån moãi chaát vaø ñoä thu hoài qua töøng khaâu, chuùng toâi coù theå xaùc ñònh ñöôïc haøm löôïng chaát caàn phaân tích. Töø keát quaû ñoä thu hoài maãu qua coät baûng 4.3, 4.4 vaø ñoä thu hoài cuûa quy trình trích ly baûng 4.8, 4.10, keát quaû ñöôøng chuaån hình 4.4, 4.5, thieát laäp ñöôïc coâng thöùc sau: Ñoái vôùi Dimethoate: F m ppmX Smau  86 100 45,56 100 16006 100)( [Coâng thöùc 3] Ñoái vôùi Carbaryl: F m ppmX Smau  67,90 100 05,90 100 185795 100)( [Coâng thöùc 4] LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 47 Vôùi m: khoái löôïng maãu ñem phaân tích (g) F: Heä soá pha loaõng maãu tröôùc khi phaân tích treân maùy HPLC Smau: Dieän tích peak ño ñöôïc bôûi maùy HPLC Caùc giaù trò 56,45; 90,05 vaø 86; 90,67 laàn löôït laø ñoä thu hoài qua coät trung bình vaø ñoä thu hoài quy trình trích trung bình cuûa Dimethoate vaø Carbaryl. Caùc giaù trò 16006 vaø 185795 laàn löôït laø heä soá goùc ñöôøng chuaån cuûa dung dòch Dimethoate vaø Carbaryl.  Xaùc ñònh dö löôïng Carbaryl vaø Dimethoate coù trong caûi baép: Maãu caûi baép ño haøm löôïng Carbaryl coù dieän tích peak 43134 aùp duïng coâng thöùc 4 treân tính ñöôïc haøm löôïng laø 0,28 ppm. Nhö vaäy haøm löôïng naøy laø beù hôn so vôùi giaù trò giôùi haïn cho pheùp cuûa Carbaryl treân rau caûi baép laø 5 ppm. Töông töï ñoái vôùi dö löôïng cuûa Dimethoate, maãu ño coù dieän tích peak 36518 aùp duïng coâng thöùc 3 tính ñöôïc haøm löôïng Dimethoate coù tron caûi baép laø 4,7 ppm. Dö löôïng naøy vöôït möùc giôùi haïn cho pheùp cuûa Dimethoate treân caûi baép laø 2 ppm. Theo thoâng tin chuùng toâi bieát ñöôïc töø Trung taâm nghieân cöùu vaø phaùt trieån noâng döôïc VIPESCO thì hieän nay thuoác tröø saâu Carbaryl löôïng söû duïng ñaõ ít haún ñi. Nhöng Dimethoate thì vaãn coøn söû duïng phoå bieán. Nhö vaäy keát quaû phaân tích treân ñoái vôùi caûi baép laø phuø hôïp vôùi thoâng tin nhaän ñöôïc. 4.6. Keát quaû khaûo saùt söï phaân huûy Carbaryl döôùi taùc duïng cuûa chieáu xaï: ÖÙng duïng quy trình trích ly Carbaryl töø caûi baép vaøo phaân tích maãu caûi baép coù boå sung theâm 5 ppm Carbaryl ñem ñi chieáu xaï ôû caùc lieàu chieáu khaùc nhau ñeå xem xeùt khaû naêng phaân huûy carabryl trong dòch rau cuûa tia böùc xaï. Caùc maãu sau khi trích ly ñöôïc ñem phaân tích moãi maãu ít nhaát 3 laàn, laáy keát quaû dieän tích peak ño ñöôïc so saùnh vôùi dieän tích peak cuûa maãu caûi baép boå sung theâm 5 ppm laøm ñoái chöùng chuùng toâi ra ñöôïc hieäu suaát phaân huûy Carbaryl ôû caùc lieàu chieáu khaùc nhau. Keát quaû hieäu suaát phaân huûy Carbaryl theo caùc lieàu chieáu khaùc nhau ñöôïc theå hieän treân hình 4.11: (trang 48) LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 48 Hiệu suất phân hủy Carbaryl trên cải bắp 85.73 75.63 61.45 44.0837.75 0 20 40 60 80 100 1Liều chiếu (KGy) H iệ u su ất (% ) 1 KGy 0,8 KGy 0,6 Kgy 0,4 KGy 0,2 KGy Hình 4.11: Hieäu suaát phaân huûy treân caûi baép ôû caùc lieàu chieáu khaùc nhau Keát quaû treân cho thaáy khi taêng lieàu chieáu daàn töø 0,2 KGy leân tôùi 1 KGy thì khaû naêng phaân huûy cuûa carabryl caøng taêng,ñieàu naøy cuõng hôïp lyù vì khi taêng lieàu chieáu thì naêng löôïng cung caáp caøng taêng daãn ñeán möùc ñoä laøm phaân huûy Carbaryl cuõng taêng theo.Theo keát quaû ñoä thu hoài maãu cuûa Carbaryl qua quy trình trích ly laø töông ñoái cao nhö vaäy soá lieäu ño ñöôïc cuûa maãu rau caûi baép sau khi chieáu xaï coù theå tin caäy cao hôn.Nhö vaäy töø keát quaû naøy chuùng toâi thaáy vôùi lieàu chieáu ñeán 1KGy cuõng coù theå laøm giaûm löôïng Carbaryl ñeán 85,73 %, keát quaû naøy cho khaû naêng coù theå öùng duïng chieáu xaï ñeå laøm giaûm dö löôïng thuoác tröø saâu treân rau ñaûm baûo an toaøn veä sinh cho rau quaû tröôùc khi söû duïng. 4.7. Keát quaû khaûo saùt ñoä thu hoài cuûa quy trình trích Vitamin C töø caûi baép: 4.7.1. Ñoä thu hoài Vitamin C khi boå sung theâm chuaån vaøo rau: Vôùi quy trình trích nhö phaàn treân ñaõ giôùi thieäu, chuùng toâi tieán haønh trích ly caùc maãu caûi baép coù boå sung theâm chuaån Vitamin C, sau khi pha loaõng maãu ñem ño treân maùy saéc kyù thu ñöôïc keát quaû ôû baûng 4.12 sau: (trang 49) LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 49 Baûng 4.12: Keát quaû ño maãu boå sung Vitamin C Maãu Dieän tích peak RSD(%) Maãu traéng 71938 2,78 Boå sung 5 ml 189076 3,56 Boå sung 10 ml 312040 5.23 Boå sung 15 ml 453275 2,67 Chuaån 5 ml 141236 1,23 Chuaån 10 ml 282400 2,34 Chuaån 15 ml 423679 1,23 Töø baûng treân ta coù theå tính ñöôïc ñoä thu hoài cuûa Vitamin C cho keát quaû sau: Maãu Ñoä thu hoài(%) Boå sung 5 ml 82 ± 3,38 Boå sung 10ml 84,41 ± 5,31 Boå sung 15 ml 86,5 ± 3,49 Keát quaû ñoä thu hoài cuûa Vitamin C ñaït ñöôïc töø 82% ñeán 86,5% töông ñoái cao. So saùnh vôùi keát quaû ñaït ñöôïc cuûa naêm ngoaùi laø 89,5% thì keát quaû ño ñöôïc cuûa naêm nay coù thaáp hôn moät ít nhöng khoâng ñaùng keå. Coù theå laø do thao thaùc thí nghieäm, sai soá chuû quan do ngöôøi thöïc hieän. Vì Vitamin C laø moät chaát deã phaân huûy döôùi aùnh saùng neân thôøi gian sau khi trích ly xong ñeán khi phaân tích cuõng laøm aûnh höôûng lôùn ñeán haøm löôïng Vitamin C ño ñöôïc. Thôøi ñieåm tieán haønh trích ly vaø phaân tích cuõng aûnh höôûng ñeán keát quaû thu ñöôïc, thí nghieäm tieán haønh vaøo buoåi toái nhieät ñoä thaáp vaø ít aùnh saùng gaét thì Vitamin C cuõng ít phaân huûy hôn so vôùi tieán haønh thí nghieäm vaøo buoåi ban ngaøy nhaát laø buoåi tröa. Nhìn chung vôùi ñoä thu hoài maãu ñaït ñöôïc qua ñeà taøi nhö vaäy cho thaáy quy trình trích ly vaø phaân tích Vitamin C ñaõ choïn coù theå aùp duïng toát ñeå phaân tích Vitamin C trong rau vôùi ñoä tin vaäy cao. LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 50 4.7.2. Ñoä thu hoài Vitamin C khi boå sung vaøo dòch rau: Ñoä thu hoài cuûa Vitamin C khi boå sung vaøo tröïc tieáp vaøo dòch rau so saùnh vôùi ñoä thu hoài cuûa Vitamin C khi boå sung treân rau seõ cho thaáy söï maát maùt vaø löôïng Vitamin C coøn soùt laïi trong baõ, caùc maãu rau sau khi boå sung Vitamin C vaøo dòch tieán haønh caùc giai ñoaïn tieáp theo thu ñöôïc dòch phaân tích, tieán haønh ño moãi maãu ít nhaát 3 laàn thu ñöôïc baûng: Baûng 4.13: Keát quaû ño maãu boå sung Vitamin C vaøo dòch Maãu Dieän tích peak RSD(%) Maãu traéng 72370 2,56 Boå sung 5 ml 190567 5,1 Boå sung 10 ml 317688 3,45 Boå sung 15 ml 460137 4,57 Chuaån 5 ml 141236 1,23 Chuaån 10 ml 282400 2,34 Chuaån 15 ml 423679 1,23 Ñoä thu hoài tính ñöôïc nhö sau: Maãu Ñoä thu hoài (%) Boå sung 5 ml 83,99 ± 4,87 Boå sung 10ml 86 ± 4,20 Boå sung 15 ml 88 ± 4,66 So saùnh 2 ñoä thu hoài ta thaáy giai ñoaïn loïc maãu vaø baõ cuõng laøm maát maùt moät löôïng Vitamin C khoaûng 1,5%. Töø keát quaû ño ñöôïc ôû maãu khoâng boå sung theâm Vitamin C ta coù theå tính ñöôïc haøm löôïng Vitamin C thöïc coù trong caûi baép trong maãu rau mua ngoaøi chôï ñeå phaân tích. LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 51 Töông töï nhö thieát laäp coâng thöùc tính haøm löôïng Carbaryl vaø Dimethoate trong caûi baép, chuùng toâi cuõng laäp coâng thöùc tính haøm löôïng Vitamin C trong caûi baép nhö sau: F m ppmX Smau  3,84 100 5,90 100 29352 100)( [Coâng thöùc 5] Trong coâng thöùc giaù trò 90,5 vaø 84,3 laø giaù trò ñoä thu hoài qua coät trung bình vaø ñoä thu hoài quy trình trích Vitamin C trung bình. Vôùi dieän tích peak 72 370 ñoái vôùi maãu traéng caûi baép ño haøm löôïng Vitamin C, aùp duïng coâng thöùc 5 tr