Luận văn Polyphenol và hoạt độ ức chế một số serine proteinase từ thân, hạt gỗ vang (caesalpinia sappan l.) và một số cây thuốc khác

Đại học quốc gia hà nội Trường đại học khoa học tự nhiên --------------------------- Nguyễn Minh Thắng Polyphenol và hoạt độ ức chế một số serine proteinase từ thân, hạt gỗ vang (caesalpinia sappan L.) và một số cây thuốc khác Luận văn thạc sĩ khoa học Hà Nội – Năm 2009 Đại học quốc gia hà nội Trường đại học khoa học tự nhiên --------------------------- Nguyễn Minh Thắng Polyphenol và hoạt độ ức chế một số serine proteinase từ thân, hạt gỗ vang (caesalpinia sappan L.) và một số cây thuốc khác Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 Luận văn thạc sĩ khoa học Người hướng dẫn GS. TSKH. Phạm Thị Trân Châu Hà Nội - 2009 Lời cảm ơn Để có thể hoàn thành luận văn này, trước tiên, tôi muốn bày tỏ lỏng biết ơn sâu sắc tới GS. TSKH. Phạm Thị Trân Châu, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã định hướng nghiên cứu, trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu. Tôi cũng mong muốn được gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Ban lãnh đạo và cán bộ Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi về trang thiết bị và cơ sở vật chất giúp tôi hoàn thành nghiên cứu này. Qua đây, tôi muốn được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô giáo Bộ môn Sinh lý thực vật và Hoá sinh đã giúp đỡ và trang bị những kiến thức hữu ích cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. Tôi cũng xin được cảm ơn các thầy cô giáo và cán bộ Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội Đề tài luận văn được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài NCCB 621306. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, những người đã luôn cổ vũ, động viên tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày tháng năm 2009 Học viên Nguyễn Minh Thắng Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt ChIA Hoạt độ ức chế chymotrypsin DC Dịch chiết E Enzyme EDTA Ethylenediaminetetraacetate EtOH Ethanol IU Đơn vị ức chế PA Hoạt độ thuỷ phân protein PIA Hoạt độ ức chế proteinase PMSF Phenylmethylsulphonyl fluoride PPI Các chất kìm hãm proteinase có bản chất protein PsA Hoạt độ phân giải proteinase của Pseudomonase aeruginosa PsIA Hoạt độ ức chế PsA SDS Sodium dodecyl sulphate StA Hoạt độ phân giải protein của Staphylococcus aureus TCA Acid trichloroacetic TEAF Toluene: Ethyl acetate: Acetone: acid Formic TEMED Tetramethyl ethylene diamine TI Chất ức chế trypsin TIA Hoạt độ ức chế trypsin UV ánh sáng tử ngoại Vis ánh sáng nhìn thấy Mục lục Mở đầu 1 Mở đầu Các enzyme thủy phân protein có vai trò vô cùng quan trọng trong toàn bộ sinh giới, hiện nay số chuỗi polypeptide có hoạt tính thuỷ phân protein đã biết lên hơn 140.000 [50]. Tuy nhiên các enzyme này cũng có liên quan đến rất nhiều bệnh ở người như các bệnh viêm nhiễm, ung thư, tim mạch … Theo thống kê, có tới 80 bệnh di truyền khác nhau ở người có nguyên nhân là do đột biến các gene mã hóa các protease [72], sự di căn của ung thư cũng có sự tham gia của các protease [51]. Các enzyme thuỷ phân cũng tham gia tích cực trong quá trình viêm và sự hình thành mụn nhọt ở người. Khả năng phân giải protein của các proteinase rất lớn nên cần có những cơ chế điều hòa chặt chẽ, trải qua quá trình tiến hóa lâu dài đã xuất hiện nhiều cơ chế kiểm soát proteinase bao gồm điều hòa biểu hiện, quá trình tiết ra ngoài tế bào, hoạt hóa, phân hủy proteinase hoặc kìm hãm hoạt độ thủy phân protein của chúng. Nói đến các chất kìm hãm proteinase, các nhà khoa học thường đề cập đến các PPI là các chất ức chế proteinase có bản chất protein, có các cấu trúc đặc trưng. Các PPI có mặt rộng rãi trong sinh giới từ virus, vi khuẩn cho tới động vật [49]. Thực vật tạo ra PPI khi bị côn trùng tấn công, khi bị tổn thương hay dưới các điều kiện stress [19, 49]. Tuy nhiên thực vật còn có một cơ chế khác chống lại các tác nhân gây hại trên là hệ thống các chất trao đổi thứ sinh, trong đó có các hợp chất phenol. Các phenol này không những có hoạt tính kháng sinh mạnh mà còn có khả năng ức chế nhiều loại enzyme. Các chất thực vật thứ sinh có hoạt tính sinh học là thành phần chính có mặt trong các vị thuốc cổ truyền. Nhằm tìm hiểu mối liên hệ giữa các hợp chất phenol từ thực vật và khả năng ức chế proteinase của một số cây thuốc chữa mụn nhọt, mẩn ngứa, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Polyphenol và hoạt độ ức chế serine-proteinase từ thân, hạt cây gỗ Vang (Caesalpinia sappan L.) và một số cây thuốc khác. Chương 1 Tổng quan tài liệu 1.1 Các hợp chất thực vật thứ sinh Các con đường biến đổi và tổng hợp các chất dinh dưỡng chủ yếu: carbohydrate, protein, chất béo và acid nucleic là thiết yếu và giống nhau ở mọi sinh vật ngoại trừ một số thay đổi rất nhỏ. Quá trình thống nhất, và là nền tảng của mọi sinh vật sống này được gọi là các quá trình trao đổi sơ cấp. Trên thực tế thực vật còn tổng hợp một lượng lớn các hợp chất hữu cơ không có vai trò trực tiếp trong sinh trưởng và phát triển của chúng, các hợp chất này được gọi là hợp chất thứ sinh. Các hợp chất thứ sinh được phát hiện riêng lẻ ở từng nhóm, từng loài nhất định, thậm chí khác nhau ở từng cá thể, hàm lượng cũng thay đổi từng loài, từng cơ quan, bộ phận và điều kiện sinh thái của cây. Chức năng và lợi ích của các hợp chất này đối với thực vật phần lớn đã được chỉ ra như: tham gia bảo vệ cây, điều hòa sinh trưởng, hấp dẫn côn trùng, thụ phấn, phát tán hạt... tuy nhiên cũng còn có nhiều chức năng khác chưa được biết đến [60]. Quá trình trao đổi thứ cấp này cung cấp phần lớn sản phẩm có giá trị trong y dược bởi vì các hợp chất thứ sinh thường có hoạt tính sinh học như: kích thích hoặc ức chế sinh trưởng, kháng khuẩn, chống oxy hóa, kìm hãm sự phát triển của các khối u... Trước đây các hợp chất thứ sinh đã từng bị xem là những chất thải đơn giản trong trao đổi chất ở thực vật, ngày nay với những nghiên cứu mới người ta đã xác định được khoảng 140.000 các hợp chất này, tìm ra con đường trao đổi chất có liên quan cũng như các enzyme sản xuất và điều hòa các con đường này. Tuy nhiên cho đến nay chỉ khoảng 20 - 30% tổng số các loài thực vật được được nghiên cứu về các hợp chất hóa sinh thực vật, do đó thực tế có thể có tới hơn 200.000 hợp chất như vậy [62]. Hợp chất thứ sinh có có 3 con đường trao đổi chính [18]: Acid shikimic: phenol, lignin, alkaloid. Acid mevalonic: terpen, steroid, alkaloid. Deoxyxylulose: terpen, steroid, alkaloid. 1.1.1 Các hợp chất phenol [11, 47] Đây là nhóm hợp chất lớn nhất trong các hợp chất thứ sinh thực vật. Các nhà khoa học đã phát hiện ra hơn 8.000 hợp chất phenol tự nhiên [24]. Đặc điểm cấu trúc chung của nhóm này là trong phân tử có vòng thơm (vòng benzene) gắn trực tiếp với một hay nhiều nhóm hydroxyl (OH). Vì vậy chúng là những rượu bậc bốn và được đặc trưng bằng tính acid yếu. 1.1.1.1 Phân loại Dựa vào thành phần và cấu trúc của phenol, người ta chia chúng thành 3 nhóm là phenol đơn giản, phenol phức tạp và nhóm polyphenol. Phân loại này dựa trên bộ khung carbon của các hợp chất trong đó C6 là nhóm phenyl, C1 là nhóm methyl, C2 là nhóm acetyl,  C3 là nhóm thế có 3 carbon, C4 là nhóm thế có 4 carbon. C6 (phenol đơn giản, benzoquinone), C6-C1 (acid phenolic), C6-C2 (acetophenone, phenylacetic acid), C6-C3 (acid hydroxycinnamic, coumarin, phenylpropene, chromone), C6-C4 (naphthoquinone), C6-C1-C6 (xanthone), C6-C2-C6 (stilbene, anthraquinone), C6-C3-C6 (flavonoid, isoflavonoid), (C6-C1)2 (tannin thủy phân), (C6-C3)2 (lignan, neolignan), (C6-C3-C6)2 (biflavonoid), (C6-C3)n (lignin), (C6)n (catechol melanin), (C6-C3-C6)n (tannin ngưng tụ) [23, 25, 30]. Nhóm hợp chất polyphenol là nhóm đa dạng nhất trong các hợp chất phenol, có cấu trúc phức tạp do sự liên kết hoặc trùng hợp của các đơn phân. Ngoài gốc phenol còn có các nhóm phụ dị vòng mạch nhánh hoặc đa vòng. Hình 1.1. Một số hợp chất phenol 1.1.1.2 Tính chất hoá học Các hợp chất phenol có cấu tạo và tính chất đa dạng nhưng do có những thành phần cấu trúc chung nên chúng có một số tính chất chung: Phản ứng của nhóm hydroxyl. Phản ứng phá vòng benzene. Phản ứng tạo phức với kim loại. Phản ứng este hoá. 1.1.1.3 Vai trò của các hợp chất phenol trong thực vật Thực vật tổng hợp rất nhiều các chất thứ sinh so với động vật vì chúng không thể lẩn trốn được kẻ thù mà phải dựa vào hệ thống phòng thủ hóa học này. Nhìn chung vai trò bảo vệ của các hợp chất phenol dựa trên đặc tính kháng khuẩn, kháng dinh dưỡng của chúng. Các phenol còn có vai trò then chốt trong hình thành các sắc tố của hoa như đỏ, xanh, tím…; đặc tính chống oxy hóa (antioxidant) hay tạo phức với kim loại; tạo ra các tín hiệu thông tin giữa phần ở trên cũng như dưới mặt đất, giữa các cây với các sinh vật khác; phenol còn là các tác nhân che chắn tia tử ngoại (UV) từ mặt trời. Khả năng che chắn tia UV giúp cho thực vật có thể chuyển từ sống dưới nước lên cạn hoàn toàn. Các nghiên cứu còn cho thấy trao đổi các hợp chất phenol không chỉ là bảo vệ chống lại các yếu tố sinh học, vô sinh mà còn có tham gia quá trình điều hoà ở cấp độ phân tử giúp cây sinh trưởng và phát triển bình thường [25, 30]. Các flavonoid như flavonol và anthoxyane có vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh sự phân bố năng lượng ánh sáng ở lá cây, làm tăng hiệu quả quang hợp. Một số hợp chất polyphenol tham gia tạo màu sắc tự nhiên của hoa, quả, hấp dẫn côn trùng thụ phấn cho hoa. 1.1.2 Flavonoid [8, 11, 47] Flavonoid là sản phẩm của con đường acid shikimic, chúng có khung carbon chung là C6 - C3 - C6. Flavonoid gồm hai vòng benzene A, B và vòng pyran C, trong đó A kết hợp với C tạo thành khung chroman. Cấu trúc flavonoid Flavonoid là một trong các nhóm polyphenol thường gặp ở thực vật, với hơn 4.500 hợp chất, phần lớn dễ tan trong nước và có màu vàng nên được gọi là “flavonoid” (flavus - tiếng Latin, có nghĩa là màu vàng). Tuy nhiên không phải các flavonoid đều có màu vàng, một số sắc tố xanh, đỏ, tím hoặc không màu cũng được xếp vào nhóm flavonoid nếu chúng có chung đặc điểm cấu tạo hoá học. 1.1.2.1 Phân loại Trong tự nhiên, flavonoid tồn tại ở hai dạng: dạng tự do và dạng liên kết với đường (glycoside). Các glycoside khi thuỷ phân bằng acid hay enzyme sẽ giải phóng ra đường và aglycone. Flavonoid được chia thành các nhóm phụ dựa theo mức độ oxy hoá của khung chroman hay sự có mặt của các nối đôi giữa C2, C3 và nhóm carbonyl ở C4 của vòng C như: flavone, flavonol, catechin, leucoanthocyanidin, anthocyanidin, chalcone và aurone... Công thức cấu tạo của một số aglycone flavonoid: Flavone 1.1.2.2 Tính chất vật lý và hóa học Tính chất vật lý Tính chất vật lý là cơ sở để lựa chọn những phương pháp phân lập, phân tích và xác định các hợp chất flavonoid. Các dẫn chất flavon có màu vàng rất nhạt, flavol vàng nhạt đến vàng, chalcone và auro vàng đậm đến đỏ cam. Các chất thuộc nhóm isoflavone, flavanol, isoflavanone, flavanone, leucoantoxyanidin, catechin không màu. Các dẫn chất anthocyanidin có màu thay đổi tùy theo pH môi trường. Tính tan trong dung môi: khả năng hòa tan của flavonoid không giống nhau, tùy thuộc vào số nhóm OH và các nhóm thế khác của chúng. Flavonoid glycoside không tan trong ether, tan được trong nước nóng, tốt nhất là cồn nóng. Các dẫn xuất 7-hydroxy thường dễ tan trong kiềm loãng. Một đặc điểm quan trọng của flavonoid là có khả năng hấp thụ tia tử ngoại. Nguyên nhân của sự hấp thụ này là do hệ thống nối đôi liên hợp tạo ra bởi hai vòng benzene A, B và vòng pyran C. Flavonoid có hai dải hấp thụ cực đại, giải 1 ở bước sóng > 290nm, giải 2 ở bước sóng 220 - 280nm. Tính chất hoá học Flavonoid đa dạng về cấu trúc hóa học, vì vậy khả năng phản ứng hóa học của chúng là rất lớn và phụ thuộc vào nhiều yếu tố: vị trí các nhóm OH, hệ thống nối đôi liên hợp và các nhóm thế. Dưới đây là các phản ứng hoá học cơ bản của flavonoid. Phản ứng của nhóm OH: gồm phản ứng oxy hoá, phản ứng tạo thành liên kết hydrogen, phản ứng este hoá. Phản ứng của vòng thơm: phản ứng diazo hoá. Phản ứng của nhóm carbonyl: phản ứng Shinoda, phản ứng tạo phức với kim loại. Đây là phản ứng khử, có sự tham gia của kim loại như Fe, Zn, Mg và HCl. Sản phẩm có màu da cam, hồng hoặc đỏ. Phản ứng này đặc trưng cho các flavonoid có nhóm C=O ở vị trí C4 và nối đôi giữa C2 và C3. Điển hình là flavonol, flavanone, flavanonol. 1.1.2.3 Tác dụng sinh học của flavonoid Tác dụng sinh học của các flavonoid rất đa dạng và phong phú. Các cơ chế hóa học của chúng có nhiều điểm còn chưa sáng tỏ, tuy nhiên cơ chế đóng vai trò quyết định là tác dụng chống oxy hóa. Nhờ đó flavonoid có thể triệt tiêu gốc tự do có hại trong cơ thể, giúp cơ thể động vật và con người phòng chống bệnh tật. Tác dụng chống oxy hoá Flavonoid có khả năng kìm hãm các quá trình oxy hoá dây chuyền sinh ra bởi gốc tự do hoạt động. Tuy nhiên hoạt tính này thể hiện mạnh hay yếu phụ thuộc vào đặc điểm cấu tạo hoá học của từng chất flavonoid cụ thể. Do bản chất cấu tạo polyphenol nên flavonoid ở trong tế bào thực vật hoặc trong cơ thể động vật chịu tác động của các biến đổi oxy hoá khử, bị oxy hoá từng bước và tồn tại ở dạng hydroxyl, semiquinone, quinone. Semiquinone hoặc quinone là những gốc tự do bền vững, gọi là gốc phenoxyl, kí hiệu là ArO*. Chúng có thể nhận điện tử và hydrogen từ chất cho khác nhau để trở lại dạng hydroquinone. Các chất này có khả năng phản ứng với các gốc tự do hoạt động sinh ra trong quá trình sinh lý và bệnh lý để triệt tiêu chúng. Sự có mặt của các nhóm hydroxyl nhân thơm của các flavonoid cũng như các polyphenol làm cho chúng có khả năng tương tác với các protein. Tương tác này có thể làm hoạt hoá hay ức chế hoạt động của enzyme. Tác dụng của flavonoid lên các enzyme là một trong những cơ sở hoá sinh để định hướng cho việc sử dụng các chất flavonoid để chữa bệnh. Tác dụng chống ung thư Các công trình nghiên cứu trên thế giới đã khẳng định flavonoid có khả năng chống ung thư. Các flavonoid có tác dụng kìm hãm các enzyme oxy hóa, kìm hãm quá trình đường phân, quá trình hô hấp, kìm hãm quá trình giảm phân, hạn chế sự phá vỡ cân bằng các quá trình trao đổi chất bình thường trong tế bào. Tác dụng làm bền thành mạch Nhiều flavonoid có hoạt tính của vitamin P có tác dụng làm tăng sức bền và tính đàn hồi của thành mao mạch. Củng cố và làm giảm tính thấm thành mạch, bảo vệ thành mạch trong các bệnh làm tăng tính thấm thành mạch như đái đường, trĩ, giãn tĩnh mạch... Tannin [21] Từ tannin được dùng đầu tiên vào năm 1796 để chỉ những chất có khả năng kết hợp với protein của da sống làm, cho da thuộc không bị phân hủy. Về mặt hóa học, tannin được cấu tạo từ acid tannic và acid gallic, phổ biến trong cây ở dạng tự do hoặc ở dạng kết hợp với đường (glycoside). Tannin tan nhiều trong nước nhất là nước nóng, tan trong các dung môi hữu cơ phân cực như ethanol, hầu như không tan trong các dung môi phân cực kém. 1.1.3.1 Phân loại tannin Về phân loại có thể chia tannin thành 2 nhóm là tannin thủy phân được (pyrogallic tannin) và tannin ngưng tụ (condensed tannin). Tannin thủy phân là dẫn xuất của acid gallic và acid protocatechic. Hai acid gallic kết hợp với nhau tạo thành acid digallic. Acid này có vai trò trong việc tạo thành tannin. Khi thủy phân bằng acid hoặc bằng tannase thì giải phóng ra phần đường, thường là glucose, đôi khi gặp đường hamamelose. Phần không phải đường là các acid trên. Tannin ngưng tụ được tạo thành do sự ngưng tụ của các đơn vị flavan-3ol hoặc flavan 3,4-diol. Tannin loại này còn được gọi là proanthocyanidin. Dưới tác dụng của acid hoặc enzyme dễ tạo thành chất đỏ tannin hay phlobaphen. Phlobaphen rất ít tan trong nước, là sản phẩm của sự trùng hợp kèm theo oxy hóa, do đó tannin pyrocatechic còn được gọi là phlobatannin. Phlobaphen là đặc trưng của một số dược liệu như vỏ canh ki na, vỏ quế. Tannin ngưng tụ khó tan trong nước hơn tannin thủy phân. (a) (b) Hình 1.2 Tanin thủy phân (a) và tannin ngưng tụ (b) 1.1.3.2 Tính chất và tác dụng sinh học Tannin có tính chất làm se, các chất này hoặc liên kết và làm tủa protein, hoặc làm co protein. Tính chất làm se của tannin là cảm giác khô và chát trong miệng sau khi uống rượu vang đỏ hoặc các trái cây chưa chín. Tannin có ảnh hưởng đa dạng đến các hệ thống sinh học. Chúng là các yếu tố tạo phức với ion kim loại, các chất làm tủa protein và chất chống oxy hóa sinh học tiềm năng. Do tannin có thể giữ các vai trò sinh học khác nhau, và do sự biến đổi lớn về cấu trúc giữa các tannin, nên rất khó để phát triển các mô hình cho phép dự đoán chính xác ảnh hưởng của tannin trong bất kỳ hệ nào. Các loại tannin có khả năng kháng nhiều loại vi khuẩn. Các tannin monomer có khả năng kháng khuẩn khác nhau, giảm dần theo thứ tự: catechin > ellagetannin > tannic acid > epi-catechin > gallotannin [39]. Nhiều tác giả cho thấy tannin ngưng tụ có khả năng tương tác làm giảm khả năng sống sót của giun sán ký sinh trong dạ dày động vật ăn cỏ. Ngoài ra tannin còn gắn với protein trong thức ăn làm giảm bớt sự phân hủy bởi vi khuẩn trong dạ cỏ [40, 44]. 1.2 Proteinase và các chất ức chế proteinase 1.2.1 Sơ lược về proteinase Protease là các enzyme xúc tác cho các quá trình thủy phân các liên kết peptide của phân tử protein hay chuỗi polypeptide. Các protease thủy phân các liên kết peptide bên trong chuỗi polypeptide được gọi là các endoprotease (hay còn gọi là các proteinase) và được chia thành 5 loại trên cơ sở các nhóm hóa học tham gia vào quá trình xúc tác: proteinase serine (EC3.4.21), proteinase cystein (EC3.4.22), proteinase aspartic (EC3.4.23), proteinase kim loại (EC3.4.24) và endopeptidase threonine (EC3.4.25). Trong cơ thể, các proteinase đảm nhiệm nhiều chức năng sinh lý như: hoạt hóa zymogen, đông máu và phân hủy sợi fibrin của cục máu đông, giải phóng hormone và các peptide có hoạt tính sinh học từ các tiền chất, vận chuyển protein qua màng... Ngoài ra, các proteinase có thể hoạt động như các yếu tố phát triển của cả tế bào ác tính và tế bào bình thường, tăng sự phân chia tế bào, sinh tổng hợp ADN... Ví dụ như điều khiển quá trình appotosis là một loạt các cystein proteinase quan trọng có tên là caspase. Caspase được Yuan và tập thể tìm ra năm 1993 [66], hiện nay đã phát hiện được 12 loại caspase ở người [31]. ức chế quá trình appotosis giúp các tế bào ung thư thoát khỏi sự kiểm soát của cơ thể, tuy nhiên thúc đẩy appotosis góp phần vào sự bất thường của các tế bào gan, tim, phổi, thần kinh trong các bệnh có liên quan. Do đó ức chế caspase có thể là phương pháp trị liệu cho nhiều bệnh hiểm nghèo. Proteinase serine: là những proteinase có nhóm OH của gốc amino acid serine trong trung tâm hoạt động, và có vai trò xúc tác trong phản ứng thuỷ phân protein. Nhóm này có các enzyme quan trọng như trypsin, chymotrypsin, subtilisin, proteinase của P. aeruginosa và nhiều loài vi khuẩn khác. Các proteinase serine thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm và có tính đặc hiệu tương đối rộng. Tính đặc hiệu của chúng thể hiện về phía gốc amino acid chứa nhóm -CO- của liên kết bị phân giải. Ví dụ như trypsin thuỷ phân các liên kết peptide chứa nhóm -CO- của các amino acid kiềm (Lys, Arg), chymotrypsin thuỷ phân các liên kết peptide có nhóm -CO- của các amino acid thơm. Proteinase cystein: Các proteinase của nhóm này có nhóm -SH trong trung tâm hoạt động. Nhóm -SH có vị trí đặc biệt trong chức năng của phân tử enzyme vì nó có khả năng phản ứng cao, tham gia nhiều loạt biến đổi hoá học như acid hoá, phosphoryl hoá, oxy hoá, ankyl hoá. Vai trò của nhóm -SH trong phân tử enzyme thể hiện ở nhiều mặt: tạo thành phức chất enzyme-cơ chất, sự kết hợp với cơ chất và cofactor, duy trì các cấu dạng hoạt động của enzyme. Thuộc nhóm này có các enzyme như papain, chymopapain, bromelain, calpain... Các proteinase cystein thường hoạt động ở pH trung tính, có tính đặc hiệu rộng. Enzyme chỉ hoạt động khi nhóm -SH trong trung tâm hoạt động của nó không bị bao vây. Proteinase aspartic: là những proteinase có chứa gốc aspartic trong trung tâm hoạt động. Các proteinase aspartic thường hoạt động mạnh ở pH acid. Chúng có tính đặc hiệu đối với các amino acid ở gần và xa vị trí cắt trên phân tử protein cơ chất. Các amino acid này thường là các amino acid thơm hoặc amino acid kị nước. Proteinase kim loại: là những proteinase cần có kim loại cho hoạt động xúc tác của chúng. Hầu hết các proteinase kim loại có chứa kẽm trong trung tâm hoạt động, một số sử dụng coban. Các enzyme này thường bị bất hoạt bởi EDTA do EDTA tạo phức với kim loại. Các proteinase kim loại thường hoạt đông mạnh nhất ở vùng pH trung tính và có tính đặt hiệu về phía gốc amino acid chứa nhóm -NH- của liên kết peptide. 1.2.2 Proteinase serine 1.2.2.1 Proteinase serine Proteinase serine là proteinase đã được nghiên cứu kĩ nhất trong 5 loại proteinase, cho đến nay đã biết đến hơn 50.000 chuỗi polypeptide có hoạt tính thuỷ phân protein thuộc loại peptidase serine và được xếp vào 40 họ (family) trong 12 phân nhánh (clan) [50]. Hầu hết các peptidase serine là các endopeptidase tuy nhiên cũng có vài họ là các exopeptidase. Nhóm serine của các peptidase có đặc điểm chung là có gốc amino acid serine ái nhân trong trung tâm hoạt động của phân tử enzyme, gốc serine này sẽ tấn công nhóm carboxyl trong liên kết peptide của cơ chất để tạo thành dạng trung gian acyl-enzyme. Tính ái nhân mạnh của gốc serine được hỗ trợ bởi nhóm bộ ba tạo thành từ gốc serine với aspartic và histidine trong trung tâm hoạt động. Nhóm bộ ba các gốc tương tự tạo thành khu vực ái nhân mạnh cũng có trong trung tâm hoạt động của nhiều nhóm enzyme khác như asparaginase, esterase, acylase, và b-lactamase. Một vài nhóm peptidase serine khác chỉ có serine cùng với lysine hoặc histidine, số khác lại có nhóm bộ ba mới là hai gốc histidine và serine. Tuy nhiên trong mọi trường hợp, gốc serine hầu hết bị bất hoạt bởi propylfluorophosphate và phenylmethanesulfonyl fluorid [49]. Subtilisin, một proteinase serine được sử dụng trong công nghiệp tẩy rửa, được sản xuất hàng tấn trên năm và chiếm tới 40% lượng enzyme bán ra trên toàn thế giới. Ngoài ra, các protease còn có các ứng dụng khác như thực phẩm, giày da, dược phẩm, phân tích, quản lý chất thải, công nghiệp thu hồi bạc [73]. 1.2.2.2 Protease của Pseudomonas aeruginosa Chi Pseudomonas là thủ phạm gây nên các bệnh viêm nhiễm có mủ xanh ở các vết thương đặc biệt là vết thương do bỏng, nó có thể gây ra viêm đường hô hấp, viêm tai, viêm giác mạc, viêm tiết niệu, viêm ruột, và có thể gây nhiễm trùng huyết dẫn tới tử vong. Một khả năng nổi bật của loài vi khuẩn này là chúng có khả năng sinh trưởng mạnh trong các môi trường khác nhau, vi khuẩn này dễ dàng xâm nhập vào cơ thể người có bị các bệnh suy nhược và các bệnh thiếu hụt miễn dịch. Nghiên cứu các chủng vi khuẩn phân lập từ các bệnh nhân xơ nang (cystic fibrosis), bệnh di truyền khởi phát ở trẻ em và được biết dưới tên gọi "sinh chất nhầy", cho thấy có những sự tái tổ hợp gene lớn bên cạnh những thành phần bảo thủ trong hệ gene Pseudomonas aeruginosa [37]. Các loài thuộc chi Pseudomonas có khả năng sản xuất mạnh các enzyme thuỷ phân trong đó có các proteinase. Proteinase của Pseudomonase lần đầu tiên được Zant phát hiện vào năm 1957 [13]. So với các vi khuẩn khác thì P. aeruginosa là một trong những nguồn vi khuẩn giàu proteinase ngoại bào. Theo Morihara, P. aeruginosa có ít nhất 3 loại proteinase khác nhau: proteinase trung tính, elastase và proteinase kiềm. Các proteinase kiềm của P. aeruginosa đã được nghiên cứu khá nhiều. Enzyme này được tổng hợp khi nuôi P. aeruginosa trên môi trường có Ca, Ca có thể thay thế bằng St. Một protease của P. aeruginosa được nghiên cứu khá kĩ là protease IV (thuộc nhóm serine protease), protease này được cho là góp phần rất lớn trong các nhiễm khuẩn màng sừng, nhiễm khuẩn ở các bệnh nhân xơ nang [20, 54]. Protease IV cũng có khả năng phân hủy nhiều protein quan trọng như: các kháng thể, bổ thể, fibrinogen, plasminogen ở các động vật có vú cũng như các protein ở côn trùng [12]. Nghiên cứu in vitro, elastase của P. aeruginosa có thể phân cắt dạng proenzyme của các proteinase kim loại trong chất nền (matrix metalloproteinase, MMP-2) trong nguyên bào sợi màng sừng để trở thành dạng hoạt động phân hủy nhiều loại collagen, do đó có thể thấy vai trò của elastase trong sự phát sinh các nhiễm khuẩn màng sừng, viêm và sự hình thành ung nhọt [38]. Tuy nhiên các nghiên cứu mới trên động vật cho thấy elastase và cả proteinase kiềm không thực sự cần thiết cho sự hình thành và duy trì các nhiễm khuẩn màng sừng [27]. ở Việt Nam nghiên cứu cũng cho thấy dịch nuôi cấy Pseudomonas có ít nhất 5 protein (polypeptide) có hoạt tính phân giải protein ở pH kiềm, trong đó có 4 băng PA bị ức chế bởi các chất ức chế proteinase serine như PMSF, McoTI (chất ức chế trypsin từ hạt gấc), TI đậu tương [5]. 1.2.2.3 Các chất ức chế proteinase Các chất ức chế enzyme là các chất làm giảm tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác. Các chất này có thể tác dụng theo nhiều cách khác nhau, đặc hiệu hay không đặc hiệu, có thể kìm hãm thuận nghịch hay không thuận nghịch. Các chất kìm hãm có bản chất rất khác nhau, tuy nhiên có thể phân thành hai loại là các chất kìm hãm có bản chất là protein và các chất phân tử nhỏ tự nhiên hay nhân tạo. Các chất kìm hãm có bản chất protein (PPI) đã được nghiên cứu từ rất lâu, nghiên cứu về PPI xuất hiện đồng thời với các nghiên cứu về proteinase. Hiện nay đã xác định được hàng nghìn PPI và được nghiên cứu rộng rãi trên toàn thế giới. Theo định nghĩa, PPI là những protein có tác dụng làm giảm thuận nghịch hoạt độ của các proteinase [1]. Theo cơ sở dữ liệu MEROPS, hiện nay có hơn 1.600 PPI thuộc 67 họ trong 34 phân nhánh [50]. Các PPI rất phổ biến trong tự nhiên, chúng phân bố rất rộng trong hạt thực vật, sự có mặt của chúng trong hạt là các tác nhân chống tiêu hoá đối với nhiều loại động vật đặc biệt là đối với côn trùng (ức chế các proteinase ở ruột giữa). Rất nhiều loài vi khuẩn cũng tạo ra các chất ức chế proteinase giúp chúng tồn tại trong ống tiêu hoá ví dụ như ecotin của E. coli có thể ức chế một vài loại proteinase tuyến tuỵ. Các PPI có ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Trong nông nghiệp, đã có nhiều nghiên cứu chuyển gene mã hoá PPI vào thực vật nhằm nâng cao sức đề kháng của cây trồng với các loài côn trùng và sâu hại. PPI cũng góp phần vào khả năng chống nấm và virus. ở Việt Nam, công trình nghiên cứu của GS. TSKH. Phạm Thị Trân Châu và tập thể đã cho ra đời chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học Momorsetatin từ hạt gấc (đề tài cấp nhà nước KHCN-02-08B). Một ứng dụng quan trọng và có nhiều triển vọng của PPI là trong lĩnh vực y học. Hoạt tính protease không bình thường có liên quan tới rất nhiều bệnh hiểm nghèo như tim mạch, ung thư, AIDS, do đó PPI là một hướng nghiên cứu mới có nhiều triển vọng. Các chất ức chế protease phân tử nhỏ là hợp chất hoá học nhân tạo hoặc có trong tự nhiên. Các chất này cũng được chia thành hai loại là các chất kìm hãm thuận nghịch và chất kìm hãm không thuận nghịch. Các chất kìm hãm không thuận nghịch thường được sử dụng để nghiên cứu trung tâm hoạt động của enzyme, ví dụ như sử dụng DFP (di-isopropyl phosphofluoridate) và TPCK (tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone) đã xác định được Ser-195 và His-57 của chymotrypsin [2]. Các hợp chất polyphenol nói chung cũng có các tương tác với protein, đặc biệt là các enzyme, trong đó có các proteinase, chúng có khả năng ức chế các enzyme theo nhiều cách khác nhau. 1.3 Tương tác của flavonoid với các protein enzyme [11] Ngoài vai trò sinh hóa ở thực vật, tương tác của thực vật với côn trùng, flavonoid đã được nghiên cứu trong suốt các thập kỷ qua vì chúng có thể có các tác động tới sức khỏe của con người qua bữa ăn. Flavonoid, đặc biệt là các flavanol, flavonol, anthocyanin, những chất dồi dào trong bữa ăn rất có giá trị sinh học, và là một cơ chế chống ung thư, các bệnh tim mạch, thoái hóa thần kinh mà chưa hoàn toàn được hiểu rõ. Tuy nhiên tất cả các cơ chế đều có liên quan đến một trong hai đặt tính cơ bản của flavonoid là khả năng khử (tính chống oxy hóa bởi sự cho điện tử hoặc proton) và khả năng tương tác với protein. Tương tác flavonoid-protein rất quan trọng trong thực vật như quá trình tổng hợp flavonoid, cơ chế bảo vệ qua trung gian hóa học là flavonoid, tuy nhiên phần này chủ yếu đề cập tới tương tác flavonoid-protein ở động vật và người liên quan đến khả năng chữa trị bệnh. Các nghiên cứu hóa sinh tập trung theo hai hướng là giá trị dinh dưỡng nhằm ngăn ngừa các bệnh lão hóa và khả năng chữa bệnh để phát triển các loại thuốc mới. Tương tác flavonoid-protein có liên quan đến tác dụng sinh học của các flavonoid, ngoài ra còn có tương tác xảy ra trước khi được hấp thụ ở ruột. Tuy nhiên cho đến nay, các nghiên cứu sự vận chuyển của flavonoid tới các mô còn rất sơ lược. 1.3.1 Các lực tương tác phân tử trong phức chất protein-flavonoid Nhân phenol là cấu trúc cơ bản tương tác với protein (liên kết không cộng hóa trị). Các tương tác này có thể chia thành hai nhóm: tương tác van der Waals, tương tác tĩnh điện. Thêm vào các liên kết không cộng hóa trị và các liên kết thuận nghịch còn có các liên kết tạo thành do các phản ứng oxy hóa khử giữa protein và flavonoid. Các điện tử oxy hóa của flavonoid có thể được tạo ra do sự tự oxy hóa (sự oxy hóa do các dioxygen được xúc tác bởi các ion kim loại ở nồng độ rất thấp, dạng vết), sự hấp thụ (quét dọn) các dạng gốc tự do (hoạt tính chống oxy hóa) và sự oxy hóa do enzyme. Với khả năng ưa điện tử và khả năng oxy hóa, các sản phẩm của sự oxy hóa flavonoid (các gốc aryloxyl, các quinone và các hợp chất quinonoid) có thể phản ứng với các gốc amino acid có tính ái nhân và có khả năng oxy hóa, do đó biến đổi protein không thuận nghịch bởi các liên kết cộng hóa trị hay sự oxy hóa. Hình 1.3 Sơ đồ tương tác phân tử của flavonoid với protein Hinh 1.4 Mạng lưới các liên kết hydrogen trong phức chất của (S)-4’,7-dihydroxyflavanone và enzyme chalcone isomerase 1.3.2 Tính đặc hiệu của tương tác protein-flavonoid Khả năng tương tác của flavonoid là do tính chất của nhân phenol, phức hợp protein-polyphenol được tìm thấy rất nhiều, tuy nhiên tính đặc hiệu cần được tập trung nghiên cứu. Các protein cuộn tự do có nhiều vị trí tương tác với polyphenol, ví dụ như các protein tuyến nước bọt giàu gốc proline, khả năng tương tác với các polyphenol nhỏ (gallate, catechin) khá yếu nhưng tăng lên rất nhanh khi số lượng nhân phenol tăng lên (flavanol-3-O-gallate, oligomeric procyanidin, polygalloylglucose), do có nhiều tương tác phân tử dọc theo chuỗi protein có các gốc kị nước là proline. Tương tự như vậy, các catechin polymer hoá oxy hoá hay các aldehyde ngưng tụ tạo nên ái lực cao hơn với xanthine oxidase. Xu hướng này phản ánh tính chất của các liên kết hydrogen và các tương tác van der Waal, đây là các tương tác không đặc hiệu dọc theo phân tử protein hay trên bề mặt các phân tử protein hình cầu. Ngược lại, các tương tác với các protein có hoạt tính (enzyme, receptor) là các tương tác đặc hiệu của một số flavonoid (flavone, isoflavone, flavonol dạng aglycone). Nguồn gốc của các tương tác đặc hiệu flavonoid-protein là do cấu trúc tương tự của chúng với các hợp chất có hoạt tính sinh học như coenzyme, hormone dạng steroid hay các chất dẫn truyền thần kinh (neurotransmitter). 1.3.3 ảnh hưởng của các flavonoid đối với sự thuỷ phân protein Sự hình thành các phức chất không hoà tan của tannin với protein và sự ức chế các enzyme tiêu hoá của tannin đã được nghiên cứu từ lâu, tuy nhiên nghiên cứu về cấu trúc và tính bền vững của phức chất này còn hiếm... Tương tác của các flavonoid khác không phải là tannin với các protein trong thực phẩm cũng rất hiếm. Với các enzyme tiêu hoá, một số flavone hydroxyl hoá và các flavonol dạng aglycone (ví dụ như quercetin) có khả năng ức chế trypsin với IC50 trong khoảng 10 tới 60 mM. Nghiên cứu mới đây cho thấy một isoflavonoid là 7-hydroxy-3-(4-hydroxybenzyl)chroman và broussonin A từ cây Tri mẫu (Anemarrhena asphodeloides) có khả năng ức chế khá tốt protease tương tự chymotrypsin (chymotrypsin-like protease) của proteasome [57]. Proteasome là phức hệ protease đa xúc tác được tìm thấy trong các tế bào prokaryote cũng như trong nhân và bào tương của tất cả các sinh vật eukaryote, proteasome cũng có mặt ở cổ khuẩn, là hệ thống phân hủy protein của con đường ubiquitine hóa phụ thuộc vào ATP (ATP-dependent ubiquitine conjugate pathway). Proteasome tham gia vào việc phân hủy các protein nội bào cuộn gập sai, các protein không còn cần thiết, có đời sống ngắn ví dụ như các cyclin điều hòa chu trình tế bào. Các rối loạn của proteasome có thể dẫn tới nhiều bệnh tật, sự suy yếu hệ thống hệ thống proteasome xuất hiện ở các bệnh nhân Huntington, Alzheimer...[58]. Các chất ức chế proteasome được sử dụng trong điều trị nhiều loại ung thư đa u (multiple myeloma cancer), ung thư bạch cầu… Bortezomib là một chất ức chế proteasome tìm ra năm 1995 và được chứng nhận bởi Cơ quan kiểm soát thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) trong chữa trị đa u tuỷ (multiple myeloma) vào năm 2003 và điều trị một loại ung thư bạch cầu (mantle cell lymphoma) vào năm 2006 [71]. Tuy nhiên cũng có nhiều tác dụng phụ nguy hiểm đã được ghi nhận [16, 48]. Vì vậy các hợp chất flavonoid có khả năng ức chế proteasome là một hướng mới có nhiều tiềm năng nhằm điều trị các bệnh ung thư [14, 15]. 1.4 Cây thuốc việt nam và khả năng chữa các bệnh viêm nhiễm, mụn nhọt, mẩn ngứa 1.4.1 Sơ lược về các bệnh viêm nhiễm, mụn nhọt, mẩn ngứa Viêm là một đáp ứng bảo vệ cơ thể của hệ miễn dịch trước sự tấn công của một tác nhân bên ngoài (vi sinh vật, tác nhân hóa, lý) hoặc của tác nhân bên trong (hoại tử do thiếu máu cục bộ, bệnh tự miễn). Đây là một đáp ứng miễn dịch tự nhiên (innate immune). Quá trình viêm thường kèm theo các triệu chứng sưng, nóng, đỏ và đau, do các mạch máu giãn nở, đưa nhiều máu đến nơi tổn thương. Các bạch cầu cũng theo mạch máu xâm nhập vào mô, tiết các chất prostaglandin, cytokine nhằm tiêu diệt hoặc trung hòa các tác nhân gây tổn thương. Phản ứng viêm điển hình thường thấy là các bệnh mụn nhọt ngoài da. Khi viêm không lành sẽ có thể trở thành viêm mạn tính. Phản ứng viêm chia thành nhiều giai đoạn tuy nhiên không thể phân biệt một các rõ ràng, chúng xen kẽ nhau và chuyển biến rất từ từ. Tham gia vào phản ứng viêm có nhiều loại tế bào như các đại thực bào, bạch cầu; các chất môi giới (mediator) như histamine, serotonin, các kinin, prostaglandins (PG)… và hệ thống các enzyme đặc biệt là các enzyme thủy phân protein như collagenase, elastase, hyaluronidase, chymotrypsin... Đối với các quá trình viêm do nhiễm khuẩn như trong các bệnh mụn nhọt, viêm da…vai trò của các enzyme phân hủy protein là rất quan trọng, đặc biệt là các proteinase ngoại bào do các vi khuẩn tiết ra. Proteinase ngoại bào của Staphylococcuss aureus, một loài vi khuẩn là thủ phạm gây ra mụn nhọt ở người, nhất là trẻ em, bao gồm các proteinase serine, proteinase cystein không những có vai giúp vi khuẩn thâm nhập vào cơ thể mà còn có vai trò giúp nó thoát khỏi các cơ chế đáp ứng miễn dịch trong phản ứng viêm [52, 53]. Theo Đông y, điều trị các bệnh viêm nhiễm, mụn nhọt, mẩn ngứa thường sử dụng các vị thuốc thanh nhiệt, giải độc như Đơn tướng quân, Cam thảo, Rau má ... Trong dân gian, các loại cây thuốc có tác dụng kháng khuẩn mạnh cũng được sử dụng chữa các bệnh này như Tô mộc, Sắn thuyền… [3, 9]. Ngày nay, các nghiên cứu cho thấy rất nhiều các hợp chất polyphenol từ thực vật cũng khả năng chống viêm, chúng cũng có khả năng ức chế các enzyme trong phản ứng viêm [65]. Nhằm tìm hiểu mối liên hệ giữa khả năng ức chế proteinase và khả năng chữa trị các bệnh viêm nhiễm, mụn nhọt, mẩn ngứa, chúng tôi đã thu thập và chọn lọc các mẫu nghiên cứu là những cây thuốc nam thường dùng chữa các bệnh này được ghi trong nhiều tài liệu [3, 9]. 1.4.2 Cây gỗ Vang (Tô mộc) 1.4.2.1 Đặc điểm phân loại, phân bố, thành phần hóa học và công dụng Hình 1.5. Tô mộc Hạt xanh Gỗ Vang (Caesalpinia sappan L.) là cây mọc hoang hay được trồng nhiều nơi ở Việt Nam, Trung Quốc cũng như nhiều nước Đông Nam á, và được dùng làm thuốc với tên gọi Tô mộc… Theo Đỗ Tất Lợi, nước sắc Tô mộc có tác dụng kháng sinh mạnh đối với nhiều vi sinh vật: Staphylococcus 209P, Samonella typhi, Shiga flexneri, Shigella sonnei, Shigella dyseteria Shiga, Bacillus subtilis. Theo Đông y, Tô mộc có tác dụng hành huyết, thông lạc, khử ứ, chỉ thống, tán phong, hòa huyết, kinh nguyệt bế. Nhân dân ta còn dùng Tô mộc làm thuốc săn da và cầm máu, chữa lị ra máu, chảy máu trong ruột, ho... Tô mộc cũng được dùng kết hợp trong các bài thuốc Đông y. Các công trình nghiên cứu trên thế giới cho thấy hợp chất brazilin và brazilein có trong Tô mộc có tác dụng kháng histamin, tác dụng làm mạnh và kéo dài tác dụng của hormone tuyến thượng thận, ức chế histidine carboxyl-lyase, và nhiều tác dụng sinh lý khác [9]. Tài liệu cho thấy gỗ vang có các loại polyphenol như tannin, acid gallic, saponin, brazilin, ngoài ra còn có tinh dầu. Brazilin là chất có tinh thể màu vàng, trong môi trường kiềm chuyển màu đỏ, khi bị oxy hóa cho brazilein [9]. 1.4.2.2 Các nghiên cứu về gỗ Vang trên thế giới Các hợp chất hóa học trong Tô mộc đã được nghiên cứu khá kĩ trên thế giới. Năm 1985, hai hợp chất vòng thơm là dẫn xuất của brazilin đã được các nhà khoa học Nhật Bản chiết xuất từ gỗ Vang [17]. Năm 1986, các nhà khoa học Nhật Bản khác đã phát hiện được protosappanin, một hợp chất biphenyl từ lõi gỗ Tô mộc [41]. Năm 1987 một số homoisoflavonoid mới cũng được tìm thấy trong cây gỗ Vang [42, 43]. Năm 2008, các nhà khoa học Trung Quốc cũng phát hiện được một homoisoflavonoid mới trong cây Tô mộc thu thập tại tỉnh Vân Nam, Trung Quốc [67]. Gần đây các nghiên cứu đã tập trung vào các hoạt tính sinh học, đặc biệt là khả năng chống oxy hóa, khả năng ức chế tế bào ung thư, chức năng bảo vệ…Các nghiên cứu tập trung vào khả năng chống oxy hóa, chống viêm, tác động tới cơ tim của brazilein và các chất khác trong gỗ Vang [64, 68]. Các nhà nghiên cứu Trung Quốc cho thấy dịch chiết ethanol từ gỗ Vang có thể có tác dụng ức chế miễn dịch, ức chế tế bào lympho T, brazilein cảm ức apoptosis các lympho lách chuột [63]. Brazilin và caesalpine J từ cây Tô mộc còn có khả năng kích thích phân cắt sợi DNA, một quá trình có thể chống ung thư [36]. Năm 2008, nhóm các nhà nghiên cứu Trung Quốc đã thực hiện các thí nghiệm về khả năng chống oxy hóa, quét dọn các gốc tự do của dịch chiết cồn và các chất chiết xuất từ gỗ Vang như protosappanin A, protosappanin B và brazilein. Thí nghiệm cho thấy các chất này đều có khả năng chống oxy hoá nhưng ở mức độ khác nhau [29]. Năm 2004, nghiên cứu tại Hàn Quốc cho thấy dịch chiết n-butanol, methanol, nước, chloroform gỗ Vang có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều chủng Staphylococcus aureus kháng kháng sinh [33]. Các nghiên cứu khác cũng cho thấy dịch chiết gỗ Vang cũng như các chất được chiết xuất từ gỗ Vang có khả năng ức chế nhiều vi sinh vật khác [34]. Brazilin cũng có khả năng ức chế cảm ứng caspase-3, một proteinase có vai trọng quan trọng trong hệ thống miễn dịch và quá trình apoptosis [32]. Nghiên cứu cũng cho thấy dịch chiết nước và dịch chiết cồn cây gỗ Vang cũng như một số loài thực vật khác trong họ Caesalpiniaceae đều có khả năng ức chế HIV-1 protease. Đây là một protease thuộc về nhóm protease aspartic có vai trò quan trọng trong sự nhân lên của HIV [55]. 1.4.2.3 Các nghiên cứu tại Việt Nam Cũng như các nghiên cứu ngoài nước, các nghiên cứu ở Việt nam cũng tập trung vào khả năng chống oxy hóa của gỗ Vang. Nghiên cứu của các tác giả Việt Nam cho thấy dịch chiết gỗ Vang có khả năng ức chế mạnh xanthine oxidase là một enzyme có liên quan đến hình thành bệnh gout trong đó sappanchalcone có khả năng ức chế mạnh nhất. Các tác giả cũng tìm được 3 hợp chất mới trong cây gỗ Vang và đặt tên là neoprotosappanin, neosappanone A và protosappanin A dimethyl acetal [45]. Các nghiên cứu khác cũng đã xác định được nhiều hợp chất có mặt trong cây gỗ Vang tại Việt Nam [4]. Nhìn chung, những nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các thành phần hóa học trong Tô mộc đã được tiến hành rộng rãi trên thế giới, tuy nhiên những nghiên cứu về khả năng ức chế proteinase (PIA) vẫn còn rất sơ lược. Công trình nghiên cứu gần đây đã phát hiện được dịch chiết từ gỗ, vỏ thân, vỏ hạt cây Tô mộc có tác dụng ức chế trypsin (TIA), chymotrypsin (ChIA), proteinase của Pseudomonas aeruginosa (PsIA) và cho rằng hoạt tính ức chế này có thể do các chất không phải protein mà có thể là do các hợp chất có khối lượng phân tử nhỏ [6]. Polyphenol là các hợp chất có khối lượng phân tử thấp hơn protein và có nhiều hoạt tính sinh học, chúng có thể tương tác với các protein nói chung và các proteinase nói riêng, vì vậy công trình này chủ yếu nhằm làm sáng tỏ khả năng ức chế một số proteinase serine (trypsin, chymotrypsin, proteinase tách từ P. aeruginosa và Stalphylococcus aureus) của polyphenol và flavonoid trong các bộ phận cây gỗ Vang. Mục tiêu của đề tài luận văn Nghiên cứu điều tra hoạt tính ức chế proteinase, polyphenol của một số cây thuốc chữa các bệnh viêm nhiễm, mụn nhọt, mẩn ngứa. Xác định hàm lượng polyphenol, flavonoid và hoạt độ ức chế của dịch chiết một số cây thuốc giàu các chất ức chế proteinase. Định tính các thành phần flavonoid và PIA trên bản mỏng và đi sâu nghiên cứu PIA của flavonoid một số cây thuốc. Nghiên cứu flavonoid các bộ phận cây Tô mộc và khả năng ức chế proteinase serine của chúng. Chương 2 NGUYÊN LIệU Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 2.1 Nguyên liệu Các mẫu nghiên cứu là các bộ phận cây thuốc nam do Trung tâm Trồng và chế biến cây thuốc, Viện Dược liệu cung cấp. 2.2 Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm 2.2.1 Dụng cụ Máy cô quay chân không Kaki (Đức) Bản mỏng Silicagel DC alufolien 20x20 cm silicagel 60 F254 của Merck. Hệ thống điện di Hoefer SE 260 Máy quang phổ HeλIOS α Spectronic Unicam (Anh) Tủ ấm WTB Bunder (Đức) Máy ổn nhiệt DT1 (Đan Mạch) Máy li tâm Sigma Và các thiết bị thông dụng khác Hóa chất Thuốc thử Folin-Ciocalteau, trypsin, chymotrypsin, casein của hãng Sigma Proteinase tách từ vi khuẩn P. aeruginosa và S. aureus Các hóa chất điện di của Fluka, A.G (Thụy Sĩ) Các hóa chất khác đạt độ tinh sạch phân tích 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Xử lý mẫu và chuẩn bị dịch nghiên cứu Mẫu tươi: cây thuốc được thu hái, rửa sạch, tách riêng các bộ phận, nghiền nhỏ, chiết trong nước, li tâm thu dịch trong. Mẫu khô: cây thuốc được thu hái, rửa sạch, tách riêng các bộ phận, xử lý nhiệt 110oC trong 10 phút để bất hoạt enzyme, sấy đến khô trong tủ sấy ở 60oC, ngâm trong ethanol 96% ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày, thu phần dịch chiết, lại thêm ethanol, quá trình ngâm chiết lặp lại 3 lần, trộn dịch chiết của 3 lần, cô đặc bằng máy cô quay chân không ở 50oC đến thể tích nhất định. Mẫu nghiờn cứu 2.3.2 Tách chiết flavonoid toàn phần các mẫu nghiên cứu theo phương pháp B. C. Talli [trích theo tài liệu 10] (theo sơ đồ dưới) Xử lý mẫu, Ngõm chiết trong EtOH 96oC Dịch chiết EtOH Đuổi dung mụi, hũa tan vào nước Cặn khụng tan DC1 Pha nước Chỉnh pH 3-4 bằng HCl 1% Chiết với ethyl acetate (3 lần) Pha ethyl acetate DC2 DN Cụ cạn, hoà tan vào ethanol 96% Flavonoid toàn phần Hình 2.1 Sơ đồ tách chiết flavonoid toàn phần 2.3.3 Định lượng polyphenol theo phương pháp Folin-Ciocalteau [61] Nguyên tắc dựa vào phản ứng oxy hoá của các polyphenol với thuốc thử Folin-Ciocalteau, tạo ra sản phẩm có màu xanh lam. So màu ở bước sóng 765 nm. Hàm lượng polyphenol được tính toán theo đường chuẩn acid gallic. Hóa chất: Thuốc thử Folin-Ciocalteau Dung dịch Na2CO3 20%: Hòa tan 200g Na2CO3 vào 800 ml nước cất rồi đun sôi. Sau khi dung dịch nguội, thêm một vài tinh thể Na2CO3, sau 24 giờ, lọc thu dịch trong, dẫn nước cất tới 1000 ml. Đường chuẩn acid gallic: Chuẩn bị các dung dịch acid gallic có các nồng độ khác nhau: 0, 0,05, 0,1, 0,15, 0,25, 0,5 mg/ml. Cho 20 ml mỗi nồng độ vào ống nghiệm sạch đã có 1,58 ml nước cất, sau đó cho 100 ml thuốc thử Folin-Ciocalteau vào, trộn đều. Sau khoảng 30 giây đến 8 phút cho vào 300 ml dung dịch Na2CO3 20%, lắc đều. Hỗn hợp phản ứng được giữ ở 40oC trong vòng 30 phút. So màu ở bước sóng 765 nm. 0 0,2 0,4 0,6 0,8 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 OD 765 mg/mL Hình 2.2 Đường chuẩn acid gallic Đối với mẫu nghiên cứu, pha loãng tới nồng độ thích hợp (nồng độ chất nghiên cứu có phản ứng màu nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn) rồi làm thí nghiệm như trên, hàm lượng polyphenol được tính toán dựa theo đường chuẩn acid gallic trên. Sắc ký phân chia các thành phần polyphenol, trên bản mỏng silicagel [theo tài liệu 22] Sắc ký là phương pháp phân tích khi một pha di động triển khai trên một pha tĩnh mà từ đó một hỗn hợp các chất khác nhau được phân tách thành từng thành phần. Sắc ký lớp mỏng (TLC - Thin Layer Chromatography), là một phương pháp được biết đến từ lâu, được E. Stahl giới thiệu vào năm 1957. Tuy nhiên hiện nay vẫn được sử dụng do có nhiều ưu điểm như thời gian khai triển ngắn (20 đến 30 phút), đường khai triển ngắn, khả năng phân tách cao, có thể dùng các thuốc hiện màu mạnh như acid, kiềm mạnh, nhiệt độ cao. Chủ yếu phương pháp này dựa trên phương pháp sắc ký hấp phụ nhưng có tính chất riêng biệt để tách một lượng nhỏ các chất. Sắc ký lớp mỏng có thể vừa là sắc ký hấp thụ vừa là sắc ký phân tách. Nguyên tắc của sắc ký lớp mỏng dựa trên sự phân chia của hai pha: một pha tĩnh (có thể là silicagel, aluminum oxide, cellulose, Kieselguhr ...), được trải trên bản kính, thủy tinh hay nhựa, một pha động là hệ dung môi khai triển đựng trong bình có nắp kín, bản mỏng có lớp hấp phụ được nhúng và lớp dung môi, dung môi di chuyển lên trên làm chuyển dịch hỗn hợp mẫu từ vị trí chấm lên trên bản mỏng. ở đây có mối liên quan chặt chẽ giữa chất hấp phụ, hệ dung môi triển khai và chất để phân tích. Để phát hiện các vết dịch chuyển có thể soi dưới ánh sáng tử ngoại, hiện màu bằng các thuốc thử thích hợp. Có thể cạo các vết, rửa giải, tinh chế để tiếp tục nghiên cứu. Trong công trình này, chúng tôi sử dụng bản mỏng Silicagel 25 DC alufolien 20x20 cm silicagel 60 F254 của Merck để phân chia, xác định các thành phần polyphenol trong các cây mẫu nghiên cứu. Các hệ dung môi triển khai sắc ký đã dùng: TEAF (Toluene: Ethyl acetate: Acetone : acid Formic): (5:2:2:1) TEAF: (5:3:1:1) Chloroform:methanol: (9:1) Chloroform:ethyacetate: acid formic: (5:3:0,4) Hiện màu: H2SO4 10%, 800C Hơi Amoniac bão hòa 2.3.5 Xác hoạt độ ức chế proteinase: dịch chiết mẫu được pha loãng nhiều lần để đạt nồng độ ethanol khi tiếp xúc với enzyme nhỏ hơn 5% (v/v) là nồng độ không ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme. Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch (điều tra sơ bộ PIA) với cơ chất casein 0,1% giữ ở 37oC trong 4 giờ nhuộm bằng Amido Black 10B 0,1% trong acid acetic 7%, hoạt độ enzyme tỷ lệ thuận với đường kính và độ sáng của vòng phân giải trên đĩa thạch [70]. Phương pháp Anson cải tiến [69] Nguyên tắc dựa vào sự thủy phân cơ chất protein (casein) bởi enzyme. Sau đó diệt enzyme và kết tủa protein chưa bị thủy phân bằng acid tricloroaxetic (TCA). Định lượng sản phẩm tạo thành sau phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteau, khả năng ức chế proteinase của mẫu nghiên cứu tỉ lệ với hiệu số giữa sản phẩm tạo thành của ống thí nghiệm không có mẫu nghiên cứu và ống nghiệm có chất nghiên cứu. Một đơn vị ức chế (IU) là lượng chất ức chế làm giảm 50% hoạt độ của 2 mg enzyme. Hóa chất thí nghiệm Thuốc thử Folin-Ciocalteau Đệm Sorensen pH 7,6 nồng độ 1/15M Cơ chất casein 1% trong đệm Sorensen pH 7,6 nồng độ 1/15M Proteinase: trypsin, chymotrypsin, Pa tách từ Pseudomonas aeruginosa TCA 5% Na2CO3 6% Tiến hành thí nghiệm ống thí nghiệm: lấy hai ống nghiệm, một ống cho vào 400 ml đệm, ống còn lại cho vào 300 ml đệm cùng với 100 ml mẫu nghiên cứu có độ pha loãng thích hợp. Sau đó cho vào mỗi ống 100 ml enzyme, trộn đều, để ở 35,50C trong 10 phút, thêm 1 ml casein 1% và giữ ở 35,50C trong 20 phút. Tiếp theo cho vào mỗi ống 2,5 ml TCA 5%, lắc đều, lọc lấy dịch trong làm phản ứng màu với thuốc thử Folin-Ciocalteau. ống kiểm tra: làm tương tự với ống thí nghiệm, nhưng sau khi ủ 10 phút ở 35,50C cho ngay TCA trước rồi để 20 phút, sau đó mới cho cơ chất casein. Phản ứng màu: cho 250 ml dịch lọc vào 1ml Na2CO3 6%, trộn đều rồi cho tiếp vào 250 ml thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần. Sau 30 phút so màu ở bước sóng 750 nm. Hoạt độ ức chế được tính như sau: DEI = E - EI E = Etn - Ekt EI = EItn - EIkt I (mIU/ml) = DEI/E.n.x Etn : Độ hấp thụ ống thí nghiệm không có chất ức chế. Ekt : Độ hấp thụ ống kiểm tra không có chất ức chế. EItn: Độ hấp thụ ống thí nghiệm có chất ức chế. EIkt: Độ hấp thụ ống kiểm tra có chất ức chế. n: độ pha loãng mẫu nghiên cứu x: hàm lượng enzyme (mg/ml) tương ứng với hoạt độ E I : hoạt độ ức chế Thí nghiệm xác định PIA được tiến hành với nhiều độ pha loãng mẫu nghiên cứu khác nhau đến khi tìm được độ pha loãng thích hợp. Độ pha loãng thích hợp là độ pha loãng mẫu nghiên cứu mà ở đó hoạt độ enzyme khi có chất kìm hãm (dung dịch mẫu nghiên cứu) bằng khoảng một nửa so với hoạt độ enzyme khi có đối chứng là nước. Xác định hoạt độ phân giải protein theo phương pháp Anson cải tiến Đơn vị hoạt độ phân giải protein là lượng enzyme mà trong 1 phút ở 35,5 0C có khả năng phân giải protein tạo thành các sản phẩm hòa tan trong TCA cho phản ứng màu với thuốc thử Folin-Ciocalteau tương đương với phản ứng màu của 1 mmol tyrosine với thuốc thử Folin-Ciocalteau. OD750 μmol/ml Hình 2.3 Đường chuẩn tyrosine Hoạt độ phân giải protein (HP/ml) của 1 ml dung dịch enzyme được tính theo công thức: HP/ml = (mmol tyrosine x a x b)/t a: Toàn bộ thể tích hỗn hợp sau phản ứng (4 ml) b: Tính trên 1 ml enzyme xác định (nhân với 10 nếu lượng enzyme xác định là 100 ml) t: Thời gian ủ enzyme với cơ chất (20 phút) 2.3.6 Điện di PA trên gel polyacryamide theo phương pháp của Heussen và Dowdle [26] Các bước thực hiện kỹ thuật điện di phát hiện proteinase trên gel polyacrylamide có SDS như sau: * Chuẩn bị dung dịch a. Dung dịch acryamide 30%: Cân 29,2 g acrylamide, 0,8 g bisacrylamide hòa tan thành 100 ml bằng nước cất 2 lần. Dung dịch đệm Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 Cân 18,15g Tris, pha trong 50 ml nước cất, điều chỉnh bằng HCl 2N đến pH 8,8 sau đó thêm nước cất đến 100 ml. Dung dịch đệm Tris-HCl 0,5 M pH 6,8 Cân 3 g Tris, pha trong 40 ml nước cất, điều chỉnh bằng HCl 2N đến pH 6,8 sau đó thêm nước cất đến 50ml Đệm mẫu Gồm 2,5ml Tris-HCl pH 6,8, 2 ml glycerol, 2 mg bromophenol xanh và 1,5 ml nước cất. * Đổ gel a. Gel tách 12,5 % 2,31 ml acrylamide 30% 0,55 ml casein 1% 0,85 ML đệm Tris-HCl pH 8,8 55 mL SDS 10% 1,76 ml H20 27,5 ml pesunphate amon 2,5 ml TEMED Gel cô 5% 0,3 ml acryamide 30% 0,5 ml Tris-HCl pH 6,8 1,2 ml H2O 10 ml SDS 10% 10 ml Amonium persulfate 4 ml TEMED * Tiến hành điện di Lượng mẫu đạt ~40 mg protein trên mỗi giếng. Điện di theo chiều từ âm sang dương với dòng điện 8mA/1 giếng Sau khi điện di, loại bỏ SDS bằng Triton X-100 2,5% để. Rửa sạch bằng nước cất. Sau đó ủ trong đệm Sorensen pH 7,6 có hoặc không có chất ức chế trong 4 giờ ở 37oC. Nhuộm gel bằng dung dịch Amido Black 10B hoặc Coomassie Brilliant Blue. Các băng proteinase là các băng trắng không bắt màu thuốc nhuộm. 2.3.7 Sắc ký cột silicagel Sắc ký cột được sử dụng để tách các hợp chất hữu cơ dựa trên nguyên tắc tương tự như sắc ký lớp mỏng, chất hấp phụ thường được sử dụng là silicagel hoặc alumina. Dung dịch các chất hữu cơ được đưa lên cột và rửa chiết (eluent) bằng một dung môi hữu hoặc hệ dung môi thích hợp. Các phân tử có tính phân cực khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau qua cột. Các phân đoạn khi đó được thu lại và kiểm tra khả năng phân tách trên bản mỏng. Chúng tôi sử dụng silicagel pha thường có kích thước hạt là 0,040-0,063 mm làm chất hấp phụ và rửa chiết bằng hệ dung môi chloroform:ethyacetate:acid formic (5:3:0,4) và chloroform : ethylacetate (5:3). Các phân đoạn được kiểm tra trên bản mỏng với hệ dung môi chloroform:ethyacetate:acid formic (5:3:0,4). 2.3.8 Quang phổ hấp thụ tử ngoại [8, trích theo tài liệu 10] Các phân đoạn sắc ký được hoà tan trong cồn tuyệt đối và xác định phổ tử ngoại trên máy quang phổ HeλIOS α Spectronic Unicam. Các nhóm flavonoid khác nhau sẽ có phổ hấp thụ tử ngoại đặc trưng khác nhau trong hai dải hấp thụ của các hợp chất flavonoid. Chương 3 Kết quả nghiên cứu và thảo luận 3.1 Hàm lượng polyphenol tổng số và hoạt tính ức chế proteinase ở một số cây thuốc 3.1.1 Điều tra sơ bộ PIA các mẫu nghiên cứu Để thăm dò sơ bộ khả năng ức chế proteinase (PIA) của các mẫu nghiên cứu chúng tôi sử dụng phương pháp khuếch tán là phương pháp tương đối nhanh và nhạy. Kết quả điều tra khả năng ức chế 3 loại proteinase serine là trypsin, chymotrypsin và proteinase tách từ vi khuẩn P. aeruginosa (PsA) được chỉ ra ở hình 3.1 và bảng 3.1. Các mẫu có PIA cao sẽ được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. 12 4 3 18 11 (b) (a) 1 7 8 16 15 (c) Hình 3.1a. Khả năng ức chế proteinase của một số mẫu (a) trypsin; (b) chymotrypsin; (c) PsA 1-3: E (Enzyme)+H2O; 4-6: E+cây Muối; 7-9: E+Sắn thuyền; 10-12: E+Trâm bầu; 13-15: E+Vỏ thân Tô mộc; 16-18: E+Gỗ Tô mộc 4 3 12 6 7 10 9 1 (b) (a) Hình 3.1b. Khả năng ức chế proteinase của một số mẫu (a) trypsin; (b) chymotrypsin; (c) PsA 1-3: E +H2O; 4-6: E+Vỏ hạt Tô mộc chín; 7-9: E+Đơn tướng quân; 10-12: E+Đại hoàng (c) Bảng 3.1. Điều tra sơ bộ PIA (bằng phương pháp khuếch tán) STT Mẫu Bộ phận sử dụng TIA KIA PsIA 1 Muỗng truổng Zanthoxylum avicennae (Lamk.) Họ Cam (Rutaceae) Rễ +++ +++ ++ 2 Dầu giun Chenopodium ambrosioides L. Họ Rau muối (Chenopodiaceae) Lá - - - 3 Tế tân Asarum sieboldii Miq. Họ Mộc thông (Aristolochiaceae) Lá - - - 4 Trâm bầu Combretum quadrangulare Kurz. Họ Trâm bầu (Combretaceae) Lá +++++ +++++ +++++ 5 Khoai nưa Amorphophallus rivieri Dur. Họ Ráy (Araceae) Lá - - - 6 Cây hoa phấn Mirabilis jalapa L. Họ Hoa giấy (Nyctaginaceae) Lá - - - 7 Xoan Melia azedarach Họ Xoan (Meliaceae) Vỏ thân ++ +++ ++ 8 Sử quân tử Quisqualis indica L.Họ Bàng (Combretaceae) Vỏ thân +++ ++ + 9 Cây muối Bischofia Javanica) Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) Vỏ thân ++ ++ - 10 Lộc mại Mercuriadis indica Lour. Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) Lá + + + 11 Sắn thuyền Syzygium resinosum Gagnep. Họ Sim (Myrtaceae) Lá +++++ +++++ +++++ Cành +++ +++ +++ 12 Đơn tướng quân Syzygium formosum var. Họ Sim (Myrtaceae) Lá ++++ +++ ++++ 13 Đại hoàng (sapa) Rheum sp. Họ Rau răm (Polygonaceae) Củ ++++ ++++ ++++ 14 Đậu cọc rào Cajanus indicus Spreng. Họ Đậu (Fabaceae) Vỏ quả - - - Lá +++ +++ ++ 15 Xoài Mangifera indica L. Họ Đào lộn hột (Anacadiaceae) Vỏ thân +++ +++ ++ 16 Cây gỗ Vang (Tô mộc) Caesalpinia sappan L. Họ Vang (Caesalpiniaceae) Gỗ ++++ +++++ +++ Vỏ thân ++++ +++++ +++++ Vỏ hạt xanh +++ +++ ++ Vỏ hạt chín +++++ +++++ +++++ 17 Cây me Tamarindus indica L. Họ Vang (Caesalpiniaceae) Vỏ thân + + - 18 Đại Plumeria rubra Họ Trúc đào (Apocynaceae) Lá +++ - - 19 Hạ khô thảo Brunella vulgaris L. Họ Bạc hà (Lamiaceae) Lá ++ +++ ++ Hoa ++ +++ +++ 20 Ngưu bàng Artium lappa L. Họ Cúc (Asteraceae) Rễ + ++ + Ghi chú: + : ức chế < 25% ; + + : ức chế từ 25% đến 50%; + + + : ức chế từ 50% đến 75% ; + + + + : ức chế >75%; + + + + + : ức chế 100% Kết quả điều tra 26 mẫu của 20 cây thuốc thường được sử dụng chữa các bệnh viêm nhiễm, mụn nhọt, mẩn ngứa thuộc 17 họ thực vật khác nhau cho thấy có 21 mẫu của 16 cây có hoạt tính ức chế proteinase, chiếm 80% những cây điều tra. Tỉ lệ trên cho thấy có thể có mối quan hệ giữa khả năng ức chế proteinase của dịch chiết các cây thuốc với khả năng chữa bệnh của chúng. Các mẫu có PIA cao tiếp tục được xác định PIA theo phương pháp Anson cải tiến, kết quả được trình bày ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Hoạt độ ức chế proteinase của dịch chiết nước (xác định theo phương pháp Anson cải tiến) STT Mẫu % chất khô TIA ChIA PsIA mIU/g tươi mIU/g khô mIU/g tươi mIU/g khô mIU/g tươi mIU/g khô 1 Trâm bầu 44,6 7.651 17.155 11.960 26.816 1.789 4.011 2 Cây xoan 43,1 1.375 3.190 2.763 6.411 260 603 3 Sử quân tử 42,5 263 619 1.154 2.715 184 433 4 Lộc mại 20,5 222 1.083 171 834 179 873 5 Sắn thuyền 31,7 11.631 36.691 33.332 105.148 8.195 25.852 6 Đơn tướng quân 33,3 2.465 7.402 3.694 11.093 1.518 4.559 7 Đại hoàng 29,7 759 2.556 2.021 6.805 274 923 8 Đậu cọc rào 27,6 632 2.290 805 2.917 372 1.348 9 Cây xoài 34,7 287 827 1.033 2.977 63 182 10 Thân gỗ tô mộc 57,2 14 24 29 51 22 38 11 Vỏ thân tô mộc 47,8 7 15 19 40 13 27 12 Vỏ hạt tô mộc chín 79,1 2.861 3.617 11.454 14.480 5.183 6.552 13 Vỏ hạt tô mộc xanh 33,6 255 759 3.463 10.307 1.271 3783 Từ bảng 3.2 có thể thấy các dịch chiết đều có khả năng ức chế chymotrypsin (ChIA) tốt hơn khả năng ức chế trypsin (TIA), khả năng ức chế proteinase tách từ P. aeruginosa (PsIA) là kém nhất. Khả năng ức chế PsA kém có thể do proteinase tách từ dịch nuôi cấy P. aeruginosa còn có một số loại proteinase khác, các dịch chiết nghiên cứu chỉ có thể ức chế một loại proteinase nào đó (có thể là các proteinase serine) hoặc cũng có thể do trong dịch nuôi cấy còn có các chất khác ảnh hưởng tới hoạt tính của các chất ức chế. Bảng 3.2 cũng cho thấy có sự khác nhau rất lớn về hoạt độ ức chế proteinase của các mẫu. Chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng polyphenol của 13 mẫu này và nhận thấy các mẫu có hàm lượng polyphenol cao thường có PIA cao như: các mẫu Trâm bầu, Sắn thuyền, tuy nhiên cũng có mẫu có hàm lượng polyphenol thấp nhưng cũng có PIA cao như vỏ hạt Tô mộc chín (bảng 3.3). Bảng 3.3. Hàm lượng polyphenol dịch chiết nước và hoạt độ riêng (mIU/mg polyphenol) STT Mẫu Hàm lượng polyphenol (mg/g tươi) TIA (mIU/mg polyphenol) ChIA (mIU/mg polyphenol) PsIA (mIU/mg polyphenol) 1 Trâm bầu 20,1 380,6 5950.0 89,0 2 Cây Xoan 3,3 416,7 837,3 78,8 3 Sử quân tử 5,5 47,8 209,8 33,5 4 Lộc mại 5,7 38,9 30,0 31,4 5 Sắn thuyền 12,3 945,6 2709,9 666,3 6 Đơn tướng quân 8,2 300,6 450,5 185,1 7 Đại hoàng 8,7 87,2 23,2 11,8 8 Đậu cọc rào 3,9 162,0 206,4 95,4 9 Cây Xoài 1,9 151,1 543,7 33,2 10 Gỗ Tô mộc 5,5 2,6 5,3 4,0 11 Vỏ thân Tô mộc 7,5 0,9 2,5 1,7 12 Vỏ hạt Tô mộc chín 2,1 1362,4 5454,3 2468,1 13 Vỏ hạt Tô mộc xanh 1,4 182,1 2473,6 907,9 Bảng 3.3 cũng cho thấy sự khác biệt rất lớn giữa các mẫu Tô mộc, các mẫu gỗ và vỏ thân có hàm lượng polyphenol cao hơn các mẫu vỏ hạt khoảng 2 đến 5 lần nhưng hoạt độ riêng (mIU/mg polyphenol) lại thấp hơn rất nhiều. Do đó có thể thấy có sự khác nhau về thành phần polyphenol của các mẫu Tô mộc. 3.1.2 Hàm lượng polyphenol tổng số và flavonoid trong dịch chiết ethanol Ethanol được sử dụng để chiết rút polyphenol tổng số vì là một dung môi phân cực tốt, có khả năng chiết rút tốt các hợp chất tự nhiên, hơn nữa, ở nồng độ cao có thể loại bỏ một số tạp chất và các chất ức chế có bản chất là protein (có thể có). Quá trình chiết rút được thực hiện theo quy trình đã mô tả trong chương 2, dịch chiết này được gọi là dịch chiết polyphenol tổng số. Từ các dịch chiết polyphenol tổng số, flavonoid toàn phần được tách ra theo sơ đồ hình 2.1, các dịch chiết sau đó được định lượng polyphenol và xác định PIA. Bảng 3.4. Hàm lượng polyphenol tổng số và flavonoid toàn phần STT Mẫu Hàm lượng (mg/g bột khô) Hàm lượng (mg/g tươi) Polyphenol Flavonoid Polyphenol Flavonoid 1 Sắn thuyền 46,13 6,52 15,91 2,25 2 Đơn tướng quân 62,41 16,11 21,51 5,55 3 Đại hoàng 53,57 20,21 5,58 5,58 4 Đậu cọc rào 13,43 1,78 3,71 0,49 5 Cây Xoài 14,35 5,18 4,98 1,8 6 Gỗ Tô mộc 59,00 44,49 33,75 25,45 7 Vỏ thân Tô mộc 96,84 25,27 46,25 12,07 8 Vỏ hạt Tô mộc chín 51,93 1,55 41,08 1,23 9 Vỏ hạt Tô mộc xanh 21,39 1,99 7,19 0,67 Bảng 3.4 cho thấy khi chiết bằng ethanol 96%, lượng polyphenol tổng số thu được cao hơn khi chiết bằng nước, mẫu vỏ thân Tô mộc có hàm lượng polyphenol tổng số cao nhất (96,84 mg/g bột khô). Flavonoid Polyphenol tổng số mg/g bột khô Hình 3.2. Hàm lượng polyphenol của dịch chiết nước và dịch chiết EtOH của các mẫu Từ hình 3.2 có thể thấy khả năng chiết rút của ethanol tốt hơn nước nhiều lần, đặc biệt là các mẫu tô mộc, khả năng chiết rút tăng lên từ 5 đến 20 lần. Hàm lượng flavonoid toàn phần trong các mẫu chiếm tỉ lệ tương đối thấp từ khoảng 3% (vỏ hạt Tô mộc chín) tới gần 40% (Đại hoàng). Riêng mẫu thân gỗ Tô mộc tỉ lệ này vào khoảng 75%, cao nhất trong các mẫu điều tra. 3.1.3 Hoạt độ ức chế proteinase của dịch chiết polyphenol tổng số và flavonoid Bảng 3.5. Hoạt độ ức chế proteinase dịch chiết polyphenol tổng số STT Mẫu TIA (mIU/g bột khô) ChIA (mIU/g bột khô) PsIA (mIU/g bột khô) 1 Sắn thuyền 25.553 73.544 28.923 2 Đơn tướng quân 12.528 37.707 10.053 3 Đại hoàng 416 1.388 454 4 Đậu cọc rào 4.056 11.957 4.615 5 Cây xoài 3.763 11.549 2.099 6 Gỗ Tô mộc 1.976 16.729 4.925 7 Vỏ thân Tô mộc 13.264 44.311 17.320 8 Vỏ hạt Tô mộc chín 74.016 530.681 99.025 9 Vỏ hạt Tô mộc xanh 18.733 126.556 25.416 Cũng giống như dịch chiết nước, khả năng ức chế các proteinase của polyphenol tổng số giảm dần theo thứ tự chymotrypsin, trypsin, PsA, trong đó dịch chiết polyphenol tổng số mẫu vỏ hạt Tô mộc chín ức chế mạnh nhất cả ba loại enzyme, cũng là mẫu có hàm lượng polyphenol thuộc nhóm cao trong các mẫu nghiên cứu. PIA tính trên 1 gam bột mẫu khô của dịch chiết polyphenol tổng số các mẫu cũng cao hơn nhiều so với dịch chiết nước đặc biệt là các mẫu Tô mộc. Tuy nhiên các mẫu Sắn thuyền và Đại hoàng lại có PIA thấp hơn, phải chăng polyphenol hai mẫu này không phải là thành phần đóng góp chính vào hoạt độ ức chế proteinase. Nghiên cứu ở Việt Nam đã tinh sạch được acid asiatic từ cây Sắn thuyền và cho thấy acid asiatic có thể ức chế nhiều enzyme khác nhau của vi khuẩn Steptococcus mutans [7]. Acid asiatic là một triterpene đã được sử dụng trong nhiều loại thuốc điều trị các bệnh da và được cho là có vai trò trong việc hình thành collagen, một số dẫn xuất triterpene cũng được cho là có khả năng ức chế proteinse serine (trypsin, chymotrypsin), proteinase kim loại (collagenase) [28]. Do vậy acid asiatic có thể giữ vai trò nào đó đối với hoạt độ ức chế proteinase của dịch chiết Sắn thuyền. Flavonoid toàn phần các mẫu đều có PIA nhưng yếu hơn dịch chiết polyphenol tổng số nhiều lần (trừ mẫu Đại hoàng, phân đoạn flavonoid có khả năng ức chế proteinase tốt hơn dịch chiết tổng số của mẫu này). Bảng 3.3 cho thấy trong 4 mẫu của cây Tô mộc, mẫu vỏ thân có hàm lượng polyphenol tổng số trong dịch chiết ethanol cao nhất sau đó đến gỗ, vỏ hạt già cuối cùng là vỏ hạt xanh. Tuy vậy, bảng 3.5 lại cho thấy mẫu vỏ hạt già lại có khả năng ức chế proteinase cao nhất rồi đến hạt non, vỏ thân, gỗ. Do đó có thể thấy PIA các mẫu này phụ thuộc vào thành phần các polyphenol hơn là hàm lượng polyphenol tổng số. Hình 3.3 cũng cho thấy sự khác biệt rất rõ về hoạt độ riêng tính trên mg polyphenol. Hình 3.3 cho thấy sự khác nhau rất lớn về hoạt độ riêng (mIU/mg polyphenol) của các mẫu Tô mộc, hoạt độ riêng mẫu vỏ hạt chín rất cao trong khi hoạt độ riêng mẫu gỗ lại thấp nhất trong các mẫu. Có thể đây là một cơ chế chống lại các yếu tố gây hại như sâu bọ, động vật ăn hạt. Nghiên cứu mới đây đã phát hiện ra trong nhân hạt Tô mộc chín có ít nhất 7 băng protein có khả năng ức chế trypsin, chymotrypsin và proteinase của P. aeruginosa bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide, tuy nhiên không pháp hiện ra băng protein có PIA nào ở dịch chiết vỏ hạt trong khi PIA vỏ hạt cao hơn PIA nhân hạt. Do đó các tác giả cho rằng PIA vỏ hạt chủ yếu là do các chất phân tử thấp, không phải protein [6]. Khi so sánh hoạt độ riêng tính theo polyphenol tổng số (mIU/mg polyphenol) và độ riêng tính theo protein (mIU/ mg protein) theo công trình nghiên cứu trên của các mẫu này chúng tôi nhận thấy hoạt độ riêng tính theo polyphenol tổng số lớn hơn nhiều, có thể thấy kết quả này đã chứng minh cho nhận định trên. mIU/mg polyphenol TIA mIU/mg polyphenol ChIA mIU/mg polyphenol PsIA Hình 3.3. Biểu đồ so sánh hoạt độ riêng PIA (mIU/mg polyphenol) của dịch chiết polyphenol tổng số (ts) và flavonoid các mẫu nghiên cứu 3.2 Định tính các thành phần polyphenol và flavonoid trong một số cây thuốc trên bản mỏng Sau khi xác định hàm lượng polyphenol tổng số và flavonoid toàn phần, chúng tôi tiến hành sắc ký định tính các thành phần này trên bản mỏng silicagel một số cây thuốc có PIA cao với các hệ dung môi khác nhau như: Chloroform:Methanol (9:1); TEAF (5:2:1:1); TEAF (5:2:2:1). Kết quả cho thấy hệ dung môi TEAF (5:2:2:1) có khả năng phân tách rõ nhất. Sau đó bản mỏng được sấy khô và nhuộm màu bằng H2SO4 10% và sấy ở 1100C trong 10 phút hoặc hơi NH3 bão hòa. 3.2.1 Sắc ký dịch chiết flavonoid các mẫu nghiên cứu Kết quả cho thấy thành phần flavonoid trong các cây thuốc rất đa dạng, khác nhau ở từng loại cây thuốc cũng như các bộ phận của một cây. Hình 3.4. Sắc ký đồ dịch chiết flavonoid toàn phần một số mẫu (hệ dung môi TEAF (5:2:2:1), nhuộm H2SO4 10%) Gỗ Vang 6. Đơn tướng quân Vỏ thân gỗ Vang 7. Đại hoàng Vỏ hạt Vang già 8. Đậu cọc rào Vỏ hạt Vang non 9. Xoài Sắn thuyền 3.2.2 Sắc ký các thành phần polyphenol mẫu Tô mộc trên bản mỏng Từ các thí nghiệm trên, chúng tôi nhận thấy các bộ phận mẫu Tô mộc có sự khác nhau rất lớn về PIA, hàm lượng polyphenol tổng số và flavonoid, hình 3.4 cũng cho thấy các thành phần polyphenol rất khác nhau, vì vậy đã tập trung nghiên cứu các mẫu này. Các dịch chiết qua các giai đoạn tách chiết của các mẫu Tô mộc tiếp tục được sắc ký trên bản mỏng và được nhuộm bằng hơn amoniac bão hòa, kết quả chỉ ra ở hình 3.5. Hình 3.5. Sắc ký đồ các thành phần polyphenol trong cây tô mộc với hệ dung môi TEAF (5:2:2:1) (nhuộm hơi Amoniac bão hoà) 1. Acid gallic 2. DC EtOH gỗ Vang 3. Flavonoid gỗ Vang 4. Cặn không tan gỗ Vang 5. DC EtOH vỏ thân 6. Flavonoid vỏ thân 7. Cặn không tan vỏ thân 8. DC EtOH vỏ hạt chín 9. Flavonoid vỏ hạt chín 10. Cặn không tan vỏ hạt chín 11. DC EtOH vỏ hạt xanh 12. Flavonoid vỏ hạt xanh 13. Cặn không tan vỏ hạt xanh Để so sánh thành phần polyphenol của các mẫu nghiên cứu, đã tiến hành sắc ký dịch chiết các mẫu trên bản mỏng silicagel (lượng polyphenol chấm trên bảng sắc ký giống nhau). Hình 3.5 cho thấy sắc ký đồ polyphenol tổng số và flavonoid của gỗ Tô mộc tương tự nhau và có nhiều băng nhất (vị trí thứ 2 và 3 trên sắc ký đồ), khoảng 11 băng; polyphenol hay flavonoid vỏ thân có ít nhất là 7 băng, các băng chính tương ứng với các băng di động chậm của mẫu gỗ. Sắc ký đồ flavonoid của vỏ hạt chín và vỏ hạt xanh khá giống nhau, đều có 4 băng chính, băng đậm nhất có màu sắc và độ di động tương ứng với acid gallic chuẩn (băng này không rõ lắm ở mẫu gỗ). Kết quả trên chứng tỏ polyphenol cũng như flavonoid trong phần gỗ Tô mộc là đa dạng nhất, và có thành phần flavonoid khác nhiều so với vỏ hạt. Phần gỗ cây Tô mộc đã được sử dụng làm dược liệu ở Việt Nam và nhiều nước khác, có thể sự phong phú về thành phần flavonoid góp phần chính tạo nên tác dụng dược lí của cây Tô mộc. Khi xác định PIA các dịch chiết polyphenol tổng số và flavonoid, chúng tôi nhận thấy PIA của flavonoid các mẫu đều thấp hơn dịch chiết polyphenol tổng số nhiều lần nên các chất có thể PIA nằm lại ở phần không tan của dịch chiết polyphenol tổng số nên đã tiến hành hòa tan phần cặn này trong ethanol, sắc ký bản mỏng và nhận thấy phần lớn các chất này không di chuyển trên bản sắc ký. Phải chăng đây là các chất polymer hoá của các hợp chất phenolic và có khối lượng phân tử lớn như các hợp chất tannin. 3.3 Thăm dò PIA của các băng polyphenol sau khi sắc ký bản mỏng Các mẫu Đại hoàng, gỗ Tô mộc, vỏ thân Tô mộc, vỏ hạt Tô mộc xanh, vỏ hạt Tô mộc chín được sử dụng trong thí nghiệm này. Sau khi sắc ký, cắt một dải bản mỏng, nhuộm để xác định vị trí các băng, từ các băng này dóng hàng để cắt riêng các băng/vùng băng, tách rửa polyphenol từ mỗi băng bằng dung dịch ethanol, ly tâm loại bỏ silicagel, thu dịch trong, cho bay hơi dung môi, hoà tan cặn trong dung dịch đệm, xác định PIA. Kết quả cho thấy, trong các mẫu nghiên cứu, PIA tập trung ở các băng có độ di động thấp, đặc biệt là vùng không di động trên bản mỏng. 3.3.1 PIA các băng flavonoid mẫu Đại hoàng ChIA PPsIA TIA 4 1 3 7 11 8 15 12 16 1 2 4 5 6 3 ĐC Hình 3.6. PIA của các băng flavonoid khi sắc ký trên bản mỏng silicagel của mẫu Đại hoàng Các băng được đánh số theo thứ tự từ vết chấm mẫu 1 , 2, 3... ĐC: đối chứng 1,2: E+nước; 3,4: E+DC; 5,6 E+1; 7,8 E+2; 9,10 E+3; 11,12 E+4; 13,14 E+5; 15,16 E+6 Mẫu đại hoàng có hai băng ức chế chính là băng 1 và 4, trong đó băng 1 ức chế tốt hơn. Các tài liệu cho thấy trong Đại hoàng có chrysophanol, emodin là các Hình 3.7a. PIA của các băng flavonoid khi sắc ký trên bản mỏng silicagel của gỗ Các băng được đánh số theo thứ tự từ vết chấm mẫu (1) , 2, 3 …DC: đối chứng 1,2: E+nước; 3,4: E+DC; 5,6 E+1; 7,8 E+2; 9,10 E+3; 11,12 E+4; 13,14 E+5 dẫn xuất của, đã có những nghiên cứu cho thấy các dẫn Hình 3.7a. PIA của các băng flavonoid khi sắc ký trên bản mỏng silicagel của gỗ, vỏ thân. Các băng được đánh số theo thứ tự từ vết chấm mẫu (1) , 2, 3 …DC: đối chứng 1,2: E+nước; 3,4: E+DC; 5,6 E+1; 7,8 E+2; 9,10 E+3; 11,12 E+4; 13,14 E+5, ở vỏ thân có thêm băng 6, giếng 15, 16: E +6 xuất anthroquinone có khả năng ức chế nhiều loại protease [35, 56]. Vì vậy chúng tôi không đi sâu nghiên cứu vào Đại hoàng. 3.3.2 PIA các băng flavonoid mẫu Tô mộc TIA 4 1 3 7 11 8 15 12 16 1 2 3 4 5 ĐC STT Băng/ vựng băng mg polyphenol 1,68 2,99 3,55 0,49 0,73 ChIA PPsIA Gỗ TIA 1 2 3 5 6 ĐC 4 8,07 1,65 2,04 0,05 0,03 0,06 STT Băng/ vựng băng mg polyphenol ChIA PPsIA Vỏ thõn Hình 3.7a. PIA của các băng flavonoid khi sắc ký trên bản mỏng silicagel mẫu gỗ Tô mộc, vỏ thân Tô mộc Các băng được đánh số theo thứ tự từ vết chấm mẫu: 1 , 2, 3... ĐC: đối chứng 1,2: E+nước; 3,4: E+ĐC; 5,6 E+1; 7,8 E+2; 9,10 E+3; 11,12 E+4; 13,14 E+5; Mẫu vỏ thân có thêm băng 6: 15,16: E+6 Hình 3.7b. PIA của các băng flavonoid khi sắc ký trên bản mỏng silicagel vỏ hạt chín Các băng được đánh số theo thứ tự từ vết chấm mẫu: 1 , 2, 3... DC: đối chứng 1,2: E+nước; 3,4: E+DC; 5,6 E+1; 7,8 E+2; 9,10 E+3; 11,12 E+4; 13,14 E+5; 15,16: E+6 15, 16: E +6 4 1 3 7 11 8 15 12 16 TIA ChIA PPsIA Hình 3.7b. PIA của các băng flavonoid khi sắc ký trên bản mỏng silicagel vỏ hạt chín Các băng được đánh số theo thứ tự từ vết chấm mẫu: 1 , 2, 3... DC: đối chứng 1,2: E+nước; 3,4: E+DC; 5,6 E+1; 7,8 E+2; 9,10 E+3; 11,12 E+4; 13,14 E+5; 15,16: E+6 15, 16: E +6 STT Băng/ vựng băng 1 2 3 4 5 6 mg polyphenol DC 0,09 0,13 0,03 0,31 0,51 2,84 Vỏ hạt chớn Kết quả cho thấy cả 4 băng/vùng băng của mẫu gỗ (1, 2, 3, 4) ít nhiều đều có TIA, ChIA, PsIA, trong đó vùng băng 2 có hoạt độ mạnh nhất. Mẫu vỏ thân: chỉ có băng/vùng băng 1 và vùng băng (2+3) tương ứng với vùng băng 2 của gỗ có TIA, ChIA, PsIA; đối với vỏ hạt chỉ có vùng băng 1 có các hoạt tính trên. Sự sai khác này cũng có thể do sai khác về lượng polyphenol trong mỗi băng nhưng cũng có thể do sai khác về thành phần có PIA của mỗi mẫu. Qua các thí nhiệm với các mẫu cây gỗ Vang, PIA của các mẫu nghiên cứu tập trung chủ yếu ở vị trí không di động trên bản sắc ký, do vậy có thể có khả năng vùng này là các hợp chất tannin. 3.4 Hàm lượng tannin của các mẫu Tô mộc Tannin có thể kết tủa không đặc hiệu với protein, làm bất hoạt nhiều enzyme. Vì vậy đã tiến hành định lượng tannin trong các bộ phận của cây Tô mộc bằng phương pháp kết tủa tannin cùng với gelatin theo phương pháp cải tiến mới được công bố năm 2009 [59]. Hàm lượng tannin được tính bằng hiệu số hàm lượng polyphenol trước và sau khi kết tủa với gelatin. Bảng 3.6. Hàm lượng tannin các bộ phận cây gỗ Vang Mẫu Tannin (mg/g chất khô) % tannin so với polyphenol tổng số Gỗ 9,0 15,5 Vỏ thân 19,3 19,9 Vỏ hạt chín 13,8 26,6 Vỏ hạt xanh 2,5 11,8 Mẫu vỏ thân có hàm lượng tannin cao nhất: 19,3 mg/g chất khô, khoảng 19,9 % lượng polyphenol tổng số có trong vỏ thân. Tannin có trong vỏ hạt già là 13,8 mg/g chất khô, 26,6% lượng polyphenol tổng số, cao nhất trong các mẫu. Mẫu vỏ hạt Tô mộc chín có tỉ lệ tannin cao nhất, hàm lượng flavonoid thấp nhất, lại là có PIA cao nhất, phải chăng tannin có vai trò quan trọng đến hoạt tính ức chế proteinase vỏ hạt chín. 3.5 Thăm dò hoạt độ ức chế proteinase bằng phương pháp điện di Proteinase trên gel polyacryamide Khả năng ức chế PsA không cao bằng khả năng ức chế trypsin và chymotrypsin tinh sạch, do đó chúng tôi sử dụng phương pháp điện di PA trên gel có cơ chất casein 1% để nghiên cứu sâu hơn các proteinase và PIA. 3.5.1 Hoạt độ phân giải proteinase của P. aeruginosa và S. aureus Vi khuẩn P. aeruginosa và S. aureus là hai loại vi khuẩn sinh proteinase ngoại bào điển hình. Proteinase của chúng rất đa dạng và tham gia vào nhiều quá trình bệnh học. Vì vậy, đã tiến hành điện di các PA dịch nuôi cấy hai loài trên và nghiên cứu khả năng ức chế của dịch chiết polyphenol tổng số của các mẫu vỏ hạt già và gỗ Tô mộc đối với proteinase của mỗi loài. Trước khi tiến hành thí nghiệm này, chúng tôi thu nhận chế phẩm protease từ dịch môi trường nuôi cấy bằng cách kết tủa với acetone ở nhiệt độ thấp và xác định hoạt độ phân giải protein (PA) của dịch nuôi cấy hai loài vi khuẩn này. Kết quả cho thấy hoạt độ proteinase của P. aeruginosa là 1,27 HP/ml và của S. aureus là 0,06 HP/ml; hoạt độ thủy phân của S. aureus yếu hơn P. aeruginosa rất nhiều do đó đã không phát hiện được khả năng ức chế ở các thí nghiệm trên. Vì vậy đã nghiên cứu tác dụng ức chế proteinase của S. aureus bằng phương pháp điện di. Bước đầu tìm hiểu các loại proteinase trong dịch nuôi cấy P. aeruginosa và S. aureus đã tiến hành ủ bản gel ở các pH khác nhau: 4,5; 6,5 và 8, độ sáng các băng PA không thay đổi nhiều nhưng có xu hướng sáng rõ hơn ở pH kiềm. Kết quả này phù hợp với đặc tính sinh proteinase kiềm của hai loài vi khuẩn này [52, 54]. (1) (2) Hình 3.8. Điện di đồ PsA (1), StA (2) Kết quả điện di cho thấy proteinase của hai loài rất khác nhau, PsA có ít nhất 3 băng và có độ di động tương đối chậm (P1, P2, P3). StA cũng có ba băng như có độ di động cao hơn nhiều (P4, P5, P6). 3.5.2 Nghiên cứu PIA bằng phương pháp điện di Để tìm hiểu khả năng ức chế protease, chúng tôi tiến hành theo các cách khác nhau: ủ enzyme với dịch nghiên cứu 20 phút trước khi điện di. Trộn dịch nghiên cứu vào bản gel cùng với cơ chất. Sau khi điện di PA, ủ bản gel trong đệm Sorrensen pH 7,6 cùng với dịch nghiên cứu. Kết hợp cả 3 cách trên. Bản điện di sau đó được nhuộm bằng 2 thuốc nhuộm là Amido Black 10B và Coomassie Brilliant Blue R250. (1) ( 2) Hình 3.9. Điện di đồ PsA (1), StA (2) (trên gel có dịch chiết vỏ hạt Tô mộc chín với nồng độ polyphenol là 0,4 mg/ml) Bản gel không chứa mẫu nghiên cứu Bản gel có chứa mẫu nghiên cứu Nghiên cứu cho thấy khi nhuộm bản gel với Amido Black 10B cho kết quả tốt hơn, do đó các băng PA sáng rõ, ít bị ảnh hưởng bởi màu của dịch nghiên cứu. Trong các cách trên, khi trộn dịch nghiên cứu trong bản gel cùng với cơ chất thì khả năng ức chế proteinase rõ ràng nhất. Khi kết hợp cả 3 cách, bản gel bắt màu với thuốc nhuộm khá đậm, vì vậy cách thứ 2 là cách tốt nhất cho thí nghiệm này. Các mẫu nghiên cứu đều làm giảm hoạt độ của các băng PA, thậm chí còn có thể ức chế hoàn toàn các băng yếu. 3.6 Hoạt tính kháng khuẩn các mẫu Tô mộc Thăm dò khả năng kháng khuẩn của mẫu gỗ lên hai loài vi khuẩn S. aureus và P. aeruginosa, kết quả cho thấy dịch chiết mẫu vỏ hạt chín có khả năng khánh mạnh hai loài này. Các dịch chiết mẫu gỗ ở nồng độ cao cũng kháng cả hai loài. Hình 3.10. Hoạt tính kháng khuẩn DC polyphenol tổng số gỗ Tô mộc tác dụng lên S. aureus DC flavonoid gỗ Tô mộc tác dụng lên S. aureus DC polyphenol tổng số gỗ Tô mộc tác dụng lên P. aeruginosa DC polyphenol tổng số vỏ hạt chín tác dụng lên S. aureus DC flavonoid vỏ hạt chín tác dụng lên S. aureus DC polyphenol tổng số vỏ hạt chín tác dụng lên P. aeruginosa 3.7 Phân chia các thành phần flavonoid trên cột silicagel Để tìm hiểu sâu hơn flavonoid toàn phần của dịch chiết gỗ Tô mộc, chúng tôi tiến hành sắc ký lớp mỏng đồng thời với một số chất chuẩn flavonoid hay gặp như catechin, rutin, quercetin và nhận thấy có một băng sắc ký có độ di động tương đương với chất chuẩn quercetin, do đó đã tiến hành phân chia trên cột silicagel pha thường để tìm hiểu rõ hơn các thành phần có hoạt tính PIA của dịch chiết gỗ Vang. Qua thăm dò trên bản sắc ký, đã chọn được hệ dung môi chloroform : ethylacetate : acid formic (5:3:0,4) là hệ dung môi đơn giản và có khả năng phân tách tốt. Các phân đoạn thu được sau khi sắc ký được kiểm tra sự phân chia trên bản mỏng cũng như hoạt tính PIA bằng phương pháp khuếch tán. Hình 3.11. Sắc ký bản mỏng các thành phần polyphenol sau khi qua cột silicagel (dung môi sắc ký bản mỏng là hệ dung môi chạy cột) I, II, III, IV, V: các phân đoạn 7: quercetin 12: flavonoid toàn phần (dịch lên cột) Dựa vào sắc ký đồ, đã thu riêng các phân đoạn có phổ sắc ký tương đương được 5 phần chín (I, II, III, IV, V) để kiểm tra hoạt tính ức chế proteinase bằng phương pháp khuếch tán, kết quả thể hiện ở hình 3.12. Hình 3.12 cho thấy các phần I, III, IV, V thu được khi sắc ký cột đều có PIA trong đó phần I và III có khả năng ức chế rõ ràng hơn cả. Từ các kết quả trên cho thấy có nhiều thành phần flavonoid của cây gỗ Vang tham gia vào khả năng ức chế proteinase. 1 4 3 12 11 7 8 (a) (b) (c) Hình 3.12. PIA các phân đoạn sắc ký (a) trypsin (b) chymotrypsin (c) PsA 1-2: E + H2O ; 3-4: E + I 5-6: E + II ; 7-8: E + III 9-10: E + IV ; 11-12: E + V Để tìm hiểu sơ bộ bản chất của các băng này, phần I có một băng di động trùng với quercetin là một flavonoid được cho là có khả năng tương tác và ức chế trypsin [11], do vậy đã tiếp tục tái sắc ký trên cột silicagel với hệ dung môi chloroform : ethylacetate (5:3), kết quả chúng tôi đã tách riêng được băng này với độ tinh sạch khá cao kí hiệu là GV1 và GV2. GV1 có độ di động tương đương với quercetin. Hình 3.13. Sắc ký đồ các phân đoạn thu được sau khi tái sắc ký phân đoạn I Chất chuẩn quecertin GV1 GV2 GV1 và GV2 sau đó được thử PIA, kết quả là GV1 có hoạt độ ức chế proteinase rõ rệt. 16 1 7 8 15 18 12 3 Hình 3.14 PIA của các phân đoạn GV1 và GV2 1-2: T(trypsin) + H2O, 3-4: T+ GV2 5-6: T+GV1; 7-8 C(chymotrypsin) + H2O; 9-10: C+GV2; 11-12: C+GV1; 13-14: PsA+H2O; 15-16: PsA+GV2; 17+18: PsA+GV1 11 4 Quecertin GV1 GV2 Hình 3.15 Phổ hấp thụ UV-Vis của GV1 và GV2 Hình 3.13 cho thấy mặc dù GV1 có độ di động tương tự với quercetin nhưng phổ UV-Vis hình 3.15) lại cho thấy GV1 chỉ có hai đỉnh hấp thụ ở vùng tử ngoại 290nm giống như quercetin (đăc trưng của nhóm flavonol) [8], vì vậy cần có những nghiên cứu sâu hơn về hai phân đoạn này. Nhiều tài liệu cho thấy trong gỗ Tô mộc có chứa nhiều dẫn xuất homoisoflavonoid [42,43], homoisoflavonoid cũng có khả năng ức chế protease [57], phải chăng GV1 là một homoisoflavonoid. Chúng tôi đã gửi mẫu GV1 đi phân tích để xác định cấu trúc của chất có mặt trong phân đoạn này. Kết luận 1. Đã thăm dò được 26 mẫu của 20 cây thuốc thuộc 17 họ khác nhau trong đó có 21 mẫu của 16 cây (80% các cây nghiên cứu) có khả năng ức chế một số proteinase serine (trypsin, chymotrypsin, proteinase tách từ P. aeruginosa), khả năng ức chế chymotrypsin là cao nhất. Các mẫu có PIA cao là vỏ hạt Tô mộc chín, Đại hoàng, Đơn tướng quân, Trâm bầu, Sắn thuyền, trong đó TIA, PsIA, ChIA theo thứ tự đều cao hơn 3.500, 4.000 10.000 (mIU/g bột khô). Mẫu Sắn thuyền có PIA cao nhất, TIA, PsIA, ChIA, lần lượt vào khoảng: 36.691, 25.852, 105.148 mIU/g bột khô. 2. Dịch chiết ethanol của các mẫu có PIA cao cũng có hàm lượng polyphenol cao: từ 46 đến 62 mg/g bột khô. PIA của dịch chiết ethanol cao hơn nhiều lần dịch chiết nước, đặc biệt dịch chiết polyphenol tổng số vỏ hạt Tô mộc chín là mẫu có PIA cao nhất trong các mẫu nghiên cứu, TIA, PsIA, ChIA lần lượt là 74.016, 99.025, 530.681 mIU/g bột khô. Hoạt độ riêng (mIU/g polyphenol) của các mẫu rất khác nhau. Dịch chiết flavonoid của các mẫu cũng ức chế các proteinase nhưng tương đối thấp. 3. Với các mẫu Tô mộc, polyphenol của gỗ, vỏ thân, vỏ hạt chín và vỏ hạt xanh lần lượt là: 59, 96,84, 51,93 và 21,39 mg/g khô. Hàm lượng tannin hạt Tô mộc chín cao nhất trong 4 mẫu, đạt 26,6% polyphenol tổng số. Hàm lượng flavonoid của các mẫu này chiếm tỉ lệ tương đối thấp từ 3% - 9% polyphenol tổng số. Riêng mẫu gỗ Tô mộc tỉ lệ flavonoid/polyphenol tổng số là 75,4%, cao nhất trong các mẫu điều tra. 4. PIA của các băng flavonoid tách được sau khi sắc ký trên bản mỏng các mẫu Tô mộc cho thấy: hầu hết các băng/vùng băng của mẫu gỗ đều ức chế các proteinase nghiên cứu ở mức độ khác nhau; mẫu vỏ thân: chỉ có vùng băng di động chậm nhất và băng không di động có hoạt độ ức chế; mẫu vỏ hạt: PIA chỉ được phát hiện ở vùng polyphenol không di chuyển trên bản sắc ký. 5. Nghiên cứu ảnh hưởng của các dịch chiết polyphenol tổng số của mẫu vỏ hạt Tô mộc chín và gỗ Tô mộc lên PA của P. aeruginosa và S. aureus bằng phương pháp điện di cho thấy chúng ức chế cả 3 băng PA của hai loài vi khuẩn này. 6. Dịch chiết các mẫu Tô mộc đều có khả năng ức chế sự phát triển của hai loài P. aeruginosa và S. aureus. 7. Đã tiến hành sắc ký cột silicagel flavonoid mẫu gỗ Tô mộc và thu được 5 phân đoạn có PIA. Phân đoạn I được tiếp tục được tái sắc ký thu được 2 phân đoạn kí hiệu là GV1 và GV2 có phổ hấp thụ UV-Vis đặc trưng cho nhóm chất flavonoid, trong đó GV1 có PIA rõ ràng hơn cả. Kiến nghị 1. Tiếp tục điều tra nghiên cứu các cây thuốc chữa mụn nhọt, mẩn ngứa để làm rõ hơn mối liên hệ giữa khả năng ức chế proteinase và tác dụng dược lý cũng như mối liên hệ với hàm lượng và thành phần polyphenol của các cây. Nghiên cứu sâu hơn các mẫu có PIA và polyphenol cao. 2. Tìm hiểu thêm hoạt tính ức chế của các mẫu lên các proteinase khác, đặc biệt là các proteinase ngoại bào của các vi khuẩn khác có vai trò hình thành các bệnh viêm nhiễm, mụn nhọt, mẩn ngứa. Xác định ảnh hưởng của các mẫu tới từng loại proteinase của hai loài vi khuẩn đã khảo sát. 3. Tiếp tục tinh sạch và xác định các flavonoid trong gỗ Tô mộc có vai trò ức chế proteinase. Xác định công thức cấu tạo GV1, GV2 và nghiên cứu hoạt độ ức chế các proteinase khác. Danh mục các công trình khoa học đã công bố liên quan đến luận văn Nguyễn Minh Thắng, Phạm Thị Trân Châu (2008), “Hoạt tính ức chế proteinaza của dịch chiết polyphenol trong cây gỗ Vang (Tô mộc) Caesalpinia sappan L.” Tạp Chí Sinh học, Tập 30, Số 3: 114-120. (có đăng tóm tắt báo cáo ở Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV, Hoá sinh và sinh học phân tử phục vụ nông, sinh, y học và công nghiệp thực phẩm, Hà nội 15-17/10/2008, trang 648) Pham Thi Tran Chau, Nguyen Minh Thang, Hoang Thu Ha (2008), "Proteinase inhibitory activity in an aqueous extracts and polyphenol fractions of Caesalpinia sappan wood and seed" , 20th FAOBMB Conference "Frontier in Life Sciences" October 23-25th, 2008, Taipei, Taiwan, Abtracts Book p.158. Tài Liệu Tham Khảo Tiếng Việt Phạm Thị Trân Châu (1992), “Đại cương về các PPI”, Tạp chí Di truyền và ứng dụng, 1, tr. 22-24. Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa (2005), Công nghệ sinh học, tập 3: Enzyme và ứng dụng, NXB Giáo Dục, pp. 81-86. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nxb Y Học. Đào Hùng Cường, Giang Kim Liên (2008), “Nghiên cứu xác định thành phần hóa học của dịch chiết từ gỗ Vang ở Quảng Nam”, Tạp chí khoa học Đại học Đà Nẵng, 24, tr. 63-68. Phan Thị Hà (2000), Nghiên cứu proteinase của Pseudomonas N01 phân lập từ mủ bỏng, tác dụng của Momoseratin đến proteinase của chúng, Luận văn thạc sĩ khoa học, mã số 1.05.12, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học quốc gia Hà Nội. Hoàng Thu Hà, Phạm Thị Trõn Chõu (2008), “Nghiờn cứu điều tra cỏc chất ức chế proteinaza của thõn và hạt Caesapinia sappan L.” Tạp chớ Khoa học ĐHQG Hà nội, KH TN &CN, 24(4), tr. 261 -270. Nguyễn Quang Huy (2008), Nghiên cứu tác dụng của một số chất thứ cấp từ thực vật lên vi khuẩn sâu răng Streptococcus mutans, Luận án Tiến sĩ sinh học, mã số 62. 42. 30. 15, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học quốc gia Hà Nội. Phạm Thanh Kỳ, Nguyễn Thị Tâm, Trần Văn Thanh (2004), Bài giảng dược liệu, Tập 1, Đại học Dược Hà Nội, Bộ môn Dược liệu, tr. 259-290. Đỗ Tất Lợi (2005), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học kĩ thuật. Đào Thị Kim Nhung (1996), Một số đặc tính hóa học và tác dụng sinh học của flavonoid trong cây thuốc thanh nhiệt Smilax glabra Roxb, Lactuca indica Linn, Lonicera japonica Thunb, Luận án phó tiến sĩ khoa học, mã số 01.05.10., Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học quốc gia Hà Nội. Tiếng Anh Andersen O. M., Markham K. R. (2006), Flavonoids: Chemistry, biochemistry and Applications, Taylor & Francis Group, pp. 433-471. Andrejko M., Cytryńka M., Jakubowicz T., 2005, “Apolipophorin III is a substrate for protease IV from Pseudomonas aeruginosa”, FEMS Microbiology Letters, 243, pp. 331-337. Camp B. J., Zant W. C. (1957), “Proteolytic enzyme from Pseudomonase putrefaciens”, Food Research, 22, pp. 158. Chang T.L. (2009), “Inhibitory effect of flavonoids on 26s proteasome activity”, Journal of Agricuture and Food Chemistry., 57 (20), pp. 9706-9715. Chen D., Landis-Piwowar KR., Chen MS., Dou QP. 2007), “Inhibition of proteasome activity by the dietary flavonoid apigenin is associated with growth inhibition in cultured breast cancer cells and xenografts”, Breast Cancer Research, 9(6), pp. 80. Fang B, Song Y, Ma J, Zhao RC. (2007), “Severe epidermal necrolysis after bortezomib treatment for multiple myeloma”, Acta Haematologica, 118, pp. 65-67. Fuke C., Yamahara J., Shimokawa T., Kinjo J., Tomimatsu T., Nohara T. (1985), “Two aromatic compounds related to brazilin from Caesalpinia sappan”, Phytochemistry, 24(10), pp. 2403-2405. Dewich P. M. (2002), Medicinal natural products, John Wiley & Son, pp. 8-9. Domash V. I. , Sharpio T. P. , Zabreiko S. A.  and Sosnovskaya T. F. (2008), “Proteolytic enzymes and trypsin inhibitors of higher plants under stress conditions”, Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 34(3), pp. 318-322. Engel L. S., Hill J. M., Caballero A. R., Green L. C. and O’Callaghan R. J., (1998), “Protease IV, a unique extracellular protease and virulence factor from Pseudomonas aeruginosa”, The Journal of Biological Chemistry, 273(27), pp. 16792-16797. Hagerman E. A. (2002), Tannin chemistry, Department of Chemistry and Biochemistry, Miami University, Oxford, USA. Hahn-Deinstrop E. (2007), Applied Thin-Layer Chromatography, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim. Harborne, J.B. (1980), “Plant Phenolics. In: Secondary Plant Products” (eds E.A. Bell & B.W.Charlwood), Encyclopedia of Plant Physiology, New Series, 8, pp. 329-402. Harborne J.B. (1994), The flavonoids advances in research since 1986, Chapman & Hall Ltd, London. Họttenschwiler, S. & Vitousek, P.M. (2000), “The role of polyphenols in terrestrial ecosystem nutrient cycling”, Tree, 15, pp. 238–243. Heussen C., Dowdle E. B. (1980), “Electrophoretic analysis of plasminogen ativators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and co-polymerized substrate”, Analytical Biochemistry., 102, pp. 196-202. Hobden J. A. (2002), “Pseudomonas aeruginosa proteases and corneal virulence”, DNA and Cell Biology, 21(5-6) pp. 391-396. Hodges L. D., George Kweifio-Okai and Macrides T. A., (2003), “Antiprotease effect of anti-inflammatory lupeol esters”, Molecular and Cellular Biochemistry, 252(1-2), pp. 97-101. Hu J., Yan X., Wang W., Wu H., Hua L., Du L., (2008), “Antioxidant Activity In Vitro of three Constituents from Caesalpinia sappan L”, Tsinghua Science & Technology, 13(4), pp. 474-479. Iwashina T. (2000), “The structure and distribution of the flavonoids in plants”, Journal of Plant Research, 113, pp. 287-299. John Smith H. and Simons C. (2009) Design of Caspase Inhibitors as Potential Clinical Agents, CRC Press, Taylor & Francis Group, LLC. Kim J.H., Kim H.A, Baek S.H., Kho Y.H., Kim M.R., Lee C.H., (2003), “A caspase inducing inhibitor isolate from Caesalpinia sappan”, Korean medical database, 35(4) pp. 680-683. Kim K.J., Yu H.H., Jeong S.I., Cha J.D., Kim S.M., You Y.O. (2004), “Inhibitory effects of Caesalpinia sappan on growth and invasion of methicillin-resistant Staphylococcus aureus”, Journal of Ethnopharmacology, 91, pp. 81-87. Lim M.Y., Jeon J.H., Jeong E.Y., Lee C.H., Lee H.S. (2007), “Antimicrobial activity of 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone isolated from Caesalpinia sappan toward intestinal bacteria”, Food chemistry, 100(3), pp. 1254-1258. Lin CW., Tsai FJ., Tsai CH., Lai CC., Wan L., Ho TY., Hsieh CC, Chao PD., (2005), “Anti-SARS coronavirus 3C-like protease effects of Isatis indigotica root and plant-derived phenolic compounds”, Antiviral Research, 68(1), pp. 36-42. Mar W., Lee H.T., Je K.H., Choi H.Y., Seo E.K. (2003), “A DNA strand-nicking principle of a higher plant, Caesalpinia sappan”, Arch Pharm Res, 26(2), pp. 147-150. Mathee K., Narasimhan G., Valdes C.,Qiu X., Matewish J. M., Koehrsen M., Rokas A., Yandava C., N. Engels R., Zeng E., Olavarietta R., Doud M.,Smith R., S. Montgomery P., White J., R. Godfrey P., A. Kodira C., Birren B., Galagan J. E., Lory, (2008), “Dynamics of Pseudomonas aeruginosa genome evolution”, PNAS, 105(8), pp. 3100-3105. Matsumoto K., Shams NB., Hanninen LA,. Kenyon KR., (1992), “Proteolytic activation of corneal matrix metalloproteinase by Pseudomonas aeruginosa elastase”, Curr Eye Res,11(11) pp.1105-1109. Min, B. R., Pinchak, W. E., Merkel, R., Walker, S., Tomita, G. Anderson, R. C. (2008), “Comparative antimicrobial activity of tannin extracts from perennial plants on mastitis pathogens”, Scientific Research and Essay, 3(2), pp. 66-73. Min B. R., Hart S. P., (2003), “Tannins for suppression of internal parasites”, Journal of Animal Science, 81(2) pp. E102-E109. Nagai M., Nagumo S., Lee S.M., Eguchi I., Kawai Ken-ichi, (1986), “Protosappanin A, a novel biphenyl compound from Sappan Ligum”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 34 (1) pp. 1-6. Namikoshi M., Nakata H., Saitoh T., (1987), “Homoisoflavonoids from Caesalpinia sappan”, Phytochemistry, 26(6), pp. 1831-1833. Namikoshi M., Saitoh T. (1987), “Homoisoflavonoid and related compounds, IV. Absolute configuration of homoisoflavonoids from Caesalpinia sappan L.”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 35(9) pp. 3597-3602. Nguyen T. M., Dinh V. B. , ặrskove. R. (2005), “Effect of foliages containing condensed tannins and on gastrointestinal parasites”, Animal feed science and technology, 121(1-2), pp. 77-87. Nguyen T. M. T., Awale S., Tezuka Y., Tran Q. L., Kadota S., (2004), “Neosappanone A, a xanthine oxidase (XO) inhibitory dimeric methanodibenzoxocinone with a new carbon skeleton from Caesalpinia sappan”, Tetrahedron Letters, 45(46), pp. 8519-8522. Page M. J. and Di Cera E., (2008), “Serine peptidases: Classification, structure and function”, Cellular and Molecular of Life Sciences, (65), pp. 1220-1236. Pengelly A. (2004), The constituents of medicinal plants, Sunflower Herbals, 2nd Edition, 109 p. Ravaglia S, Corso A, Piccolo G, Lozza A, Alfonsi E, Mangiacavalli S, Varettoni M, Zappasodi P, Moglia A, Lazzarino M, Costa A. (2008), “Immune-mediated neuropathies in myeloma patients treated with bortezomib”, Cinical Neurophysiology, 119(11), pp. 2507-2512. Rawlings N. D., Tolle D. P., Barrett A. J., (2004), “Evolutionary families of peptidase inhibitors”, Biochemical Journal, 378, pp. 705-716. Rawlings, N.D., Morton, F.R., Kok, C.Y., Kong, J. & Barrett, A.J. (2008) “MEROPS: the peptidase database”. Nucleic Acids Ressearch, 36, pp. D320-D325. Sabeh F., Ryoko Shimizu-Hirota, and Weiss S. J., (2009), “Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited”, The Journal of Cell Biology, 185(1), pp.11-19. Shaw L., Golonka, E. Potempa J., Foster S. J. (2004), “The role and regulation of the extracellular proteases of Staphylococcus aureus”, Microbiology, 150, pp. 217-228. Smagur J., Guzik K., Bzowska M., Kuzak M., Zarebski M., Kantyka T., Walski M., Gajkowska B,  Potempa J., (2009), “Staphylococcal cysteine protease staphopain B (SspB) induces rapid engulfment of human neutrophils and monocytes by macrophages”, Biological Chemistry, 390(4), pp. 361-371. Smith L., Rose B., Tingpej P., Zhu H., Conibear T., Manos J., Bye P., Elkins M., Willcox M., Bell S., Wainwrigh C., and Harbour C., (2006), “Protease IV production in Pseudomonas aeruginosa from the lungs of adults with cystic fibrosis”, Journal of Medical Microbiology, 55, pp. 1641-1644. Tewtrakul, S., Subhadhirasakul, S., and Rattanasuwan, P., (2003), “HIV-1 protease inhibitory effects of some selected plants in Caesalpiniaceae and Papilionaceae families”, Songklanakarin Journal of Science and Technology, 2003, 25(4), pp. 509-514 Tewtrakul, S., Subhadhirasakul, S., Rattanasuwan, P and Puripattanavong, J, 2007, “HIV-1 protease inhibitory substances from Cassia garrettiana”, Songklanakarin Journal of Science and Technology, 29(1), pp. 145-149. Tsukamoto S., Wakana T., Koimaru K., Yoshida T., Sato M. and Ohta T., (2005), “7-hydroxy-3-(4-hydroxybenzyl)chroman and Broussonin B: neurotrophic compounds, isolated from Anemarrhena asphodeloides BUNGE, function as proteasome inhibitors”, Biological and Pharmaceutical Bulletin 28(9), pp. 1798-1800. Valera A. G., Dớaz-Hernỏndez M., Hernỏndez F., Ortega Z, Lucas J. J. (2005), “The ubiquitin-proteasome system in Huntington's disease”, Neuroscientist, 11, pp. 583-594. Vu N. K. P., Phan V. H. N., Vo T. B. H. (2008), “Determination of tannin contents in plants by improved Folin-Ciocalteu method”, Conference proceeding Analytica Vietnam 2009, pp. 175-180. Waterman W. P., (1992), Secondary metabolites: their function and evolution, Chapter: Roles for secondary metabolites in plants, JohnWiley & Sons, pp. 255-275. Waterhouse, A.L., 2001, “Determination of total phenolics, in current protocols in food” Analytical Chemistry, pp. I1.1.1-I1.1.8. Wink M. (2008), Evolution of Secondary Plant Metabolism. In: Encyclopedia of Life Sciences (ELS), JohnWiley&Sons. Ye M., Xie W.D., Lei F., Meng Z., Zhao Y., Su H. and Du L.J (2006) “Brazilein, an important immunosuppressive component from Caesalpinia sappan L.” International Immunopharmacology, 6(3), pp. 426-432. Yohei S., Tomokazu H., Masahiro N. and Seiji N., (2007), “In Vitro Study for Inhibition of NO Production about Constituents of Sappan Lignum”, Biologial and Pharmaceutical Bulletin, 30(1) pp. 193-196. Yoon J.H., Baek S.J. (2008), “Molecular targets of dietary polyphenols with anti-inflammatory properties”, Yonsei Med, 46(5), pp. 585-596. Yuan, J., Shaham, S., Ledoux, S., Ellis, H. M. & Horvitz, H. R. (1993), “The C. elegans cell death gene ced-3 encodes a protein similar to mammalian Interleukin-1b-converting enzyme”, Cell, 75, pp. 641-652 Zhao H., Bai H., Wang Y., Li W., Koike K. (2008), “A new homoisoflavan from Caesalpinia sappan”, Jounal of Natural Medicines, 62, pp. 325–327. Zhao Y. N., Pan Y., Tao J. L., Xing D. M., Du L. J. (2006) “Study on cardioactive effects of brazilein”, Pharmacology, 76, pp. 76-83. Tiếng Nga Pietrova J. S., M. M. Wincjunajte (1966), “Opredelenie proteoliticheskoi aktivnosti fermentnykh preparatov mikrobiologichskovo proiskhozhdenia”, Priklad. Biochim. I Microbiol., 2, pp. 232. Tiếng Ba lan Leluk J., Pham T.C, Kieleczawa J. (1985), “Zastosawanie edestyny do badania aktywnosci proteinaz ich inhibitorow”, XXI meet.Pol.Biochem.Soc., Krakow, Abstract, pp.139. Các trang wed