Luận văn Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn lactic và khảo sát khả năng sinh tổng hợp bacteriocin

Phân lập chủng vi khuẩn lactic và khảo sát khả năng sinh tổng hợp bacteriocin SVTH: Lê Thị Hồng VânCBHD: ThS. Nguyễn Vũ Tuân Luận văn tốt nghiệp đại học NỘI DUNG TỔNG QUAN MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP KẾT QUẢ KẾT LUẬN Vi khuẩn lactic Các vi khuẩn G+, chịu acid, không hình thành bào tử, hình que hoặc hình cầu. Nhu cầu dinh dưỡng phức tạp (amino acid, carbonhydrate, khoáng, vitamin...) Sản phẩm chuyển hóa: acid lactic, diacetyl, ethanol, CO2, bacteriocin… Được sử dụng rất nhiều trong thực phẩm Tổng quan Bacteriocin Là các peptide do vi khuẩn tổng hợp, ức chế mạnh mẽ sự sinh trưởng của một số vi khuẩn khác Bacteriocin điển hình: nisin, diplococin, (từ Lactococcus), pediocin (từ Pediococcus), lactocidin, acidolin, lactocin, (từ Lactobacillus)… Ứng dụng: chất kháng sinh, chất phụ gia thực phẩm Và trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu phân lập các chủng có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin Tổng quan L.G. Stoyanova et al. (2005) phân lập được Lc. lactis từ sữa tươi tách béo tự lên men Phân lập từ kim chi của Sang Hee Park et al., 2003 Nghiên cứu trên giá đỗ của M. Nomura et al., 2007 Phân lập từ thức uống, rau quả lên men truyền thống Malaysia của Ahmad Faris Mohd Adnan và Irene K.P. Tan, 2006 Phân lập từ thức uống lên men truyền thống Uganda – bushera của C.M.B.K. Muyanja et al., 2003 L. Aquilanti et al., 2006 phân lập từ fromage Canestrato Pugliese Mục tiêu nghiên cứu Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp bacteriocin từ các nguồn tự nhiên (sữa tươi lên men, rau quả muối chua, kim chi và giá đỗ). Khảo sát sự ảnh hưởng của pH, nhiệt độ lên sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng phân lập được. Nguyên liệu Chủng vi sinh vật Listeria monocytogenes Chủng vi khuẩn lactic phân lập Môi trường phân lập và nuôi cấy MRS TSA Nguồn phân lập Sữa tươi tự lên men Rau quả muối chua (cải muối chua, cà pháo muối chua, dưa giá, kim chi) Giá đỗ Phương pháp: Phân lập Phương pháp: Khảo sát Dịch nuôi cấy Ly tâm lạnh(4oC, 4000 v/ph, 20ph) Dịch lỏng Sinh khối vi khuẩn Pha loãng, ly tâm lạnh lại(2 lần) Thử hoạt tính bacteriocin (pp Agar Well Diffusion) Đo quang (O.D600 nm) Kết quả phân lập: Từ nguồn sữa tươi tự lên men Có 3 loại khuẩn lạc - (1a) lớn, trắng đục, bóng mịn - (1b) hơi lớn, trắng hơi trong, bóng mịn - (1c) nhỏ, màu trắng đục, bề mặt nhám, mép xung quanh có răng cưa Quan sát hình thái - (1a) Tế bào lớn, tròn, đơn hoặc kết đôi, có nhân - (1b) Tế bào nhỏ, tròn, đơn, đôi hoặc kết chuỗi ngắn - (1c) Tế bào nhỏ, hình tròn, xếp thành chuỗi dài, không chuyển động Kết quả phân lập: Từ nguồn rau quả muối chua Có 4 loại khuẩn lạc - (2a) trắng, đục, kích thước nhỏ. - (2b) trắng, trong, kích thước hơi lớn. - (2c) màu trắng đục, kích thước lớn. - (2d) (kim chi) trắng, trong, bề mặt hơi mờ, rất nhỏ. Quan sát hình thái - (2a) Tế bào nhỏ, tròn, kết chuỗi ngắn - (2b) Tế bào nhỏ, que dài - (2c) Tế bào lớn, tròn, riêng rẽ hoặc kết đôi, có nhân. - (2d) Tế bào nhỏ, tròn, riêng rẽ hoặc kết chuỗi ngắn Kết quả phân lập: Từ nguồn giá đỗ Chỉ có 1 loại khuẩn lạc (3a) trắng sữa, nhỏ, bề mặt bóng mịn, mép không có răng cưa Quan sát hình thái Tế bào nhỏ, tròn, xếp riêng rẽ hay thành từng đôi Kết quả Kết quả Kết quả khảo sát: Sự sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin Kết quả khảo sát:Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin Ở 25oC (pH ban đầu = 6.0) Ở 37oC (pH ban đầu = 6.0) to = 30oC to = 37oC to = 25oC Kết quả khảo sát:Ảnh hưởng của pH ban đầu của môi trường đến sự sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin pHban đầu = 5.0 (ở nhiệt độ 30oC) pHban đầu = 7.0 (ở nhiệt độ 30oC) pH = 6.0 pH = 7.0 pH = 5.0 Kết luận Phân lập được chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Thời gian, pH và nhiệt độ ảnh hưởng mạnh mẽ đến sự sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin của chủng. Điều kiện nuôi cấy thích hợp trong MRS: Nuôi cấy 20 giờ ở 30oC pH ban đầu = 6.0 Công thức Nisin Cơ chế kháng khuẩn Cơ chế sinh tổng hợp 1 Cơ chế sinh tổng hợp 2 Phân loại Bacteriocin Sản phẩm chuyển hóa của LAB Bacteriocin và chủng VSV Bacteriocin và chủng VSV Các yếu tố ảnh hưởng Môi trường nuôi cấy Nguồn C, N, khoáng, chất tăng độ nhớt cho môi trường (agar, dextran, glycerol, hay tinh bột) Điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, thời gian, oxy, pH) Sự sinh tổng hợp bacteriocin Chất ức chế bacteriocin và chất làm bất hoạt (các enzyme, acid teichoic) Tinh sạch bacteriocin Cô đặc Dịch thô Tiền xử lý Dịch nuôi cấy Lắng tủa phân đoạn với acid, muối, ethanol, hoặc các hỗn hợp khác nhau Phá vỡ tế bào, ly tâm/ trích ly bằng acid hay nước nóng Tinh chế dựa vào kích cỡ (sắc ký lọc gel, lọc qua máy siêu lọc, ly tâm) Dựa vào điện tích (sắc ký trao đổi ion, điện chuyển) Bacteriocin Trong bảo vệ sức khoẻ con người Trong bảo quản thực phẩm Phụ gia thực phẩm: giảm khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn (để cải thiện hiệu quả thanh trùng ngay ở chế độ thanh trùng ôn hoà hơn) và kìm hãm, ngăn ngừa quá trình thối rữa (trong trường hợp nếu còn bào tử sót) nisin-nitrite Ứng dụng bacteriocin Môi trường nuôi cấy Môi trường MRS: Công thức đề nghị cho 1000ml dịch Peptone 10g Glucose 20g Cao thịt 5g Cao nấm men 5g Natri acetate 2g Diamonicitrate 2g Tween 80 1ml MgSO4.7H2O 0.2g MnSO4.4H2O 0.2g KH2PO4 2g Agar (2%) 20g Nước cất vừa đủ 1000ml pH= 6,2-6,5 H.J. Choi, C.I. Cheigh, 2000 : Nghiên cứu sự sinh tổng hợp Nisin của chủng Lc. lactis phân lập từ kim chi L. G. Stoyanova, T. D. Sul’timova, 2006 Nghiên cứu phân lập và định danh Lc. lactis phân lập từ sữa R. Yang and B.Ray, 1994 Nghiên cứu về các yếu tố ảnh hưởng lên sự sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin của chủng vi khuẩn lactic Svetoslav D. Todorov and Leon M. T. Dicks, 2004 nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sự sinh tổng hợp bacteriocin của chủng Lc. Lactis phân lập từ sữa lên men Môi trường M17 Công thức đề nghị cho 1000ml dịch Pepton 10g Cao nấm men 5g Cao thịt 5g Lactose (glucose 1%) 5g Natri glycerophosphate 19g MgSO4.7H2O 0,25g Acid ascorbic (Natri ascorbate) 0,5g Agar 15g Nước cất vừa đủ 1000ml pH= 6,9-7,3 Phương pháp Agar Well Diffusion 30 mins Tryptone Soya Agara (TSA)-500C 20 ml Listeria monocytogenes 106 CFU/ml 100 l Petri dish