Luận văn Phát triển hệ thống tái sinh ở cây đậu xanh (vigna radiata (l.) wilczek) phục vụ chọn dòng chịu hạn và chuyển gen

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN THỊ LUYỆN PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG TÁI SINH Ở CÂY ĐẬU XANH (VIGNA RADIATA (L.) WILCZEK) PHỤC VỤ CHỌN DÒNG CHỊU HẠN VÀ CHUYỂN GEN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Chu Hoàng Mậu THÁI NGUYÊN – 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN THỊ LUYỆN PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG TÁI SINH Ở CÂY ĐẬU XANH (VIGNA RADIATA (L.) WILCZEK) PHỤC VỤ CHỌN DÒNG CHỊU HẠN VÀ CHUYỂN GEN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN – 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên THAI NGUYEN UNIVESSITY THE COLLEGE OF EDUCATION --------------------------- SUMMARY OF MASTER ESSAY FOR EDUCATION SCIENCE NGUYEN THI LUYEN DEVELOPMENT OF REGENERATION ON MUNG BEAN TOCHOOSE THE DROUGHT – RESISTANT STRAIN AND TRANSGENATION Specialyty: GENETICS Code: 60.42.70 Teacher: Prof.PhD. CHU HOANG MAU THAI NGUYEN – 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Công trình được hoàn thành tại: TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM - ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS CHU HOÀNG MẬU Phản biện 1................................................................... …………………………………………… Phản biện 2................................................................... …………………………………………... Luận văn sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận văn Họp tại: Trường Đại học Sư phạm - ĐHTN Ngày tháng năm 2009 Có thể tìm hiểu luận văn tại thư viện Đại học Thái Nguyên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ------------------------------ NGUYỄN THỊ LUYỆN PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG TÁI SINH Ở CÂY ĐẬU XANH (VIGNA RADIATA (L.) WILCZEK) PHỤC VỤ CHỌN DÒNG CHỊU HẠN VÀ CHUYỂN GEN Chuyên ngành: Di truyền học Mã số : 60.42.70 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái nguyên - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên i Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố. Tác giả luận văn Nguyễn Thị Luyện Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ii Lời cảm ơn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn PGS.TS. Chu Hoàng Mậu đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sinh – Kỹ thuật Nông nghiệp và các thầy cô giáo, cán bộ của Khoa đã quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Tôi xin cảm ơn TS. Nguyễn Thị Tâm, và các chị Vi Kiều Liên và Nguyễn Thị Thủy (Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào), xin cảm ơn Bộ môn hệ thống canh tác - Viện Ngô Trung ương đã cung cấp các giống đậu xanh làm vật liệu cho các thí nghiệm của đề tài. Tác giả luận văn Nguyễn Thị Luyện Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên iii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan.................................................................................................. i Lời cảm ơn.................................................................................................... ii Mục lục........................................................................................................... iii Những chữ viết tắt.......................................................................................... vi Danh mục các bảng......................................................................................... vii Danh mục các hình......................................................................................... viii Mở đầu.............................................................................................................. 1 Chương 1. Tổng quan tài liệu........................................................................... 3 1.1. Sơ lược về cây đậu xanh............................................................................. 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại........................................................................ 1.1.2. Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới và ở Việt Nam……………. 3 3 4 1.2. Ứng dụng công nghệ tế bào thực vật trong cải tiến giống cây trồng.......... 7 1.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật.................................... 1.2.1.1. Cơ sở tế bào học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật………... 1.2.1.2. Ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật……………………………………………………………. 7 7 8 1.2.2. Hệ thống nuôi cấy để chọn dòng………………………………………. 10 1.2.3. Phương thức chọn dòng………………………………………………. . 12 1.2.4. Tái sinh cây……………………………………………………………. 13 1.3. Nghiên cứu chọn giống cây trồng bằng kỹ thuật chọn dòng soma và hệ thống tái sinh ở thực vật và cây đậu xanh........................................................ 1.3.1. Nghiên cứu chọn giống cây trồng bằng kỹ thuật chọn dòng tế bào soma…….. 1.3.2. Nghiên cứu hệ thống tái sinh ở thực vật và ở cây đậu xanh ……………… 15 15 16 Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu………………………….. 18 2.1. Vật liệu nghiên cứu……………………………………………………….. 18 2.1.1.Vật liệu thực vật…………………………………………………………. 18 2.1.2. Hoá chất và thiết bị…………………………………………………….. 19 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên iv 2.2. Phương pháp nghiên cứu............................................................................ 19 2.2.1. Nhóm phương pháp nuôi cấy in vitro...................................................... 20 2.2.2. Phương pháp đánh giá khả năng chịu mất nước của mô sẹo.................... 2.2.2.1. Phương pháp xử lý mô sẹo bằng thổi khô ........................................... 2.2.2.2. Chọn lọc mô sẹo sống sót sau khi xử lý bằng thổi khô và tái sinh cây............. 2.2.2.3. Tạo cây hoàn chỉnh từ mô sẹo chọn lọc……………………………… 2.2.2.4. Phương pháp ra cây…………………………………………………… 22 22 22 23 23 2.2.3. Phương pháp tạo đa chồi từ mắt lá mầm……………………………….. 24 2.2.4. Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu....................................... 24 Chương 3. Kết quả và thảo luận…………………………………………….. 26 3.1. Hệ thống tái sinh cây đậu xanh từ mô sẹo……………………………….. 26 3.1.1. Ảnh hưởng nồng độ các chất đến kết quả khử trùng hạt……………….. 26 3.1.2. Ảnh hưởng của các chất 2.4D, BAP,GA3, NAA đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây từ mô sẹo..................................................................... 3.1.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ 2,4 D đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi đậu xanh.............. 3.1.2.2. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh cây từ mô sẹo phôi đậu xanh............. 3.1.2.3. Ảnh hưởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi của đậu xanh............. 3.1.2.4. Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh................... 26 26 31 34 35 3.1.3. Nhận xét về môi trường nuôi cấy mô cây đậu xanh…………………… 37 3.2. Độ mất nước và khả năng chịu mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh các giống nghiên cứu ………………………………………………………… 37 3.2.1.Mức độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh của các giống nghiên cứu... 37 3.2.2. Khả năng chịu mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau khi xử lý bằng thổi khô………………………………………………………………………. 39 3.2.3. Nhận xét về khả năng chịu mất nước của mô sẹo sau khi xử lý bằng thổi khô của các giống đậu xanh nghiên cứu………………………………… 42 3.3. Kết quả tái sinh cây đậu xanh từ mắt lá mầm.................................................... 43 3.3.1.Môi trường nảy mầm của hạt…………………………………………….. 43 3.3.2. Môi trường tạo đa chồi………………………………………………… 43 3.3.3. Môi trường kéo dài chồi............................................................................ 45 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên v 3.3.4. Môi trường ra rễ ......................................................................................... 46 3.3.5. Ra cây và chế độ chăm sóc ...................................................................... 46 3.3.6. Nhận xét về môi trường tái sinh từ mắt lá mầm........................................ 47 Kết luận và đề nghị............................................................................................. 48 Công trình công bố liên quan đến luận văn………………………………... 49 Tài liệu tham khảo............................................................................................ 50 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên vi NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT 2,4D 2,4-Dichlorphenoxyacetic acid (Axit 2,4-Dichlorphenoxyacetic) ADN Axit deoxyribonucleic (Deoxiribonucleic acid) ASTT áp suất thẩm thấu BAP 6 - Benzyl Amino Purin cs Cộng sự đvms đơn vị mô sẹo MS Murashige – Skoog α-NAA Naphthyl acetic acid (Axit naphthyl acetic) IAA Axit ß – indol axetic Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 2.1 Đặc điểm các giống đậu xanh nghiên cứu 18 3.1 Khả năng tạo mô sẹo của các giống đậu xanh (%) 27 3.2 Hình dạng mô sẹo của các giống đậu xanh 28 3.3 Tốc độ sinh trưởng mô sẹo của các giống đậu xanh 29 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tái sinh cây từ mô sẹo phôi đậu xanh (%) 32 3.5 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo chồi ở đậu xanh 33 3.6 Ảnh hưởng củ α-NAA tới khả năng ra rễ của cây tái sinh từ mô sẹo phôi đậu xanh 36 3.7 Độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau khi xử lý bằng thổi khô (%) 38 3.8 Tỷ lệ sống sót (%) của mô sẹo phôi đậu xanh sau thổi khô 1 tuần nuôi phục hồi 39 3.9 Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo phôi đậu xanh sống sót sau khi xử lý bằng thổi khô 41 3.10 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo đa chồi ở đậu xanh 44 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 19 3.1 Ảnh mô sẹo phôi đậu xanh nuôi cấy trên môi trường có bổ sung 2,4D 31 3.2 Hình ảnh tái sinh đậu xanh trên môi trường bổ sung 3mg/l BAP 34 3.3 Hình ảnh kéo dài chồi đậu xanh trên môi trường bổ sung GA3 35 3.4 Hình ảnh cây đậu xanh ra rễ trên môi trường bổ sung 0,3mg/l α-NAA 36 3.5 Độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau xử lý bằng thổi khô 38 3.6 Tỷ lệ sống sót (%) của mô sẹo phôi đậu xanh sau thổi khô và nuôi phục hồi trên môi trường tái sinh 40 3.7 Khả năng tái sinh cây của các mô sẹo phôi đậu xanh sống sót sau khi xử lý bằng thổi khô 41 3.8 Tái sinh mô sẹo sau khi xử lý bằng thổi khô 42 3.9 Hạt đậu xanh nảy mầm sau 3 ngày (A, B), hạt đậu xanh được tách ra để tạo đa chồi (C, D) 43 3.10 Hình ảnh tạo đa chồi từ mắt lá mầm 45 3.11 Hình ảnh kéo dài chồi đậu xanh trên môi trường bổ sung GA3 46 3.12 Hình ảnh cây đậu xanh ra rễ trên môi trường bổ sung 0,3mg/l α- NAA 46 3.13 Cây đậu xanh tái sinh được trồng trong chậu. 47 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỞ ĐẦU 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Cây đậu xanh Vigna radiata (L.) Wilczek là một loại cây đậu đỗ quan trọng của nền nông nghiệp châu Á. Cây đậu xanh chủ yếu được trồng lấy hạt để chế biến thức ăn như giá đỗ, chè đậu xanh, dịch cốt đậu xanh, bánh đậu xanh…Không chỉ được coi như nguồn thức ăn mà hạt đậu xanh còn được coi như một thứ dược liệu có tác dụng giải độc thanh nhiệt, bớt sưng phù, điều hoà ngũ tạng chữa bệnh… cho con người. Hạt đậu xanh là một mặt hàng nông sản xuất khẩu có giá trị. Ngoài ra, sản phẩm phụ của cây đậu xanh còn được dùng làm thức ăn cho gia súc. Trồng cây đậu xanh còn có tác dụng chống xói mòn và cải tạo đất. Hạt đậu xanh chứa khoảng 25,98% protein, 1,3% lipit, 4,79% chất xơ, 62,12% hydratcacbon (trong đó có 51,8% tinh bột), các loại vitamin A, B1, B2, C và một số nguyên tố khoáng như: K, Na, Mg, P, Fe, Ca… Trên thế giới đậu xanh được trồng nhiều ở Ấn Độ, Thái Lan, Philippin, Myanma, Bangladesh, Srilanca… với năng suất từ 18 – 20 tạ/ha. Ở Việt Nam do nhiều nguyên nhân khác nhau nên từ trước tới nay đậu xanh được trồng chưa nhiều, chủ yếu là xen canh, luân canh tăng vụ. Chỉ trong thời gian gần đây đậu xanh mới được quan tâm phát triển. Chương trình chọn tạo giống đậu xanh ở nước ta hiện nay là hướng tới mục tiêu tạo giống đậu xanh có tiềm năng năng suất cao và ổn định, sinh trưởng mạnh, thời gian sinh trưởng ngắn, chín tập trung, chất lượng hạt cao, có khả năng chống chịu hạn, úng, sâu bệnh tốt và chịu thâm canh. Trong công tác chọn giống cây trồng nói chung và chọn giống đậu xanh nói riêng các nhà khoa học đã sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm (Chu Hoàng Mậu, 2001) [10] hoặc lai giống (Trần Đình Long và Lê Khả Tường, 1998) [8] để tạo nguồn biến dị làm nguyên liệu cho quá trình chọn lọc. Một trong các kỹ thuật được quan tâm ứng dụng vào chọn giống đậu xanh là sử dụng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 công nghệ tế bào thực vật và xây dựng hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen nhằm cải tiến, nâng cao khả năng chống chịu của cây đậu xanh (Jayanti Sen và Spra Guha Mukherjee (1998) [31], Ignacimuthu và Franklin (1999) [30], Renato và cs (1999, 2001) [41], [42], Mai Trường và cs (2001) [15], Sita và cs (2006) [43], Kaviraj và cs (2006) [33], Sonia và cs (2007) [44]. Những lý do trên đây là cơ sở để chúng tôi xây dựng đề tài cho luận văn thạc sĩ là: “Phát triển hệ thống tái sinh ở cây đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) phục vụ chọn dòng chịu hạn và chuyển gen” 2. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU - Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật vào việc chọn dòng tế bào chịu mất nước ở đậu xanh. - Xác định hệ thống tái sinh ở đậu xanh phục vụ chuyển gen. 3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Nghiên cứu điều kiện khử trùng hạt sử dụng trong tái sinh cây từ mô sẹo và tạo đa chồi từ mắt lá mầm. - Phân tích ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo mô sẹo, tái sinh cây từ mô sẹo, kéo dài chồi, ra rễ và tạo cây đậu xanh. - Đánh giá khả năng chịu mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh dưới tác dụng của thổi khô. - Khảo sát môi trường tạo đa chồi từ mắt lá mầm, môi trường kéo dài chồi, ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. SƠ LƢỢC VỀ CÂY ĐẬU XANH 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại Cây đậu xanh là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao, có nguồn gốc từ Ấn Độ và được phân bố rộng rãi ở các nước châu Á. Cây đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) thuộc ngành Magnoliopyta, lớp Magnoliopsida bộ Fabales, họ đậu (Fabaceae), chi Vigna. Chi Vigna là một trong những chi lớn của họ đậu, bao gồm 7 chi phụ là: Vigna, Haydonia, Plectropic, Macrohynchus, Ceratotropic, Lasionspron, Sigmoidotrotopis. Đậu xanh theo quan điểm lấy hạt bao gồm các loại thuộc hai chi phụ là Vigna và Ceratotropic. Chi phụ Ceratotropic còn được gọi là nhóm đậu châu Á mang những đặc điểm điển hình thể hiện ở mức độ cao nhất cho Vigna. Năm 1970, Vercourt đã công bố 5 trong số 16 loài của Ceratotropic đã được thuần hoá là: Đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek), Đậu gạo (Vigna Umbellata(thumb), đậu adzukia (Vigna anguilaris (Willd), đậu ván (Vigna aconiti folia (Jacq)), Vigna trilobata (L) Wildzek. Thân đậu xanh thuộc loại thân thảo, mọc thẳng đứng hoặc hơi nghiêng, thân yếu có lớp lông mịn màu nâu sáng, chiều cao trung bình khoảng 40 – 70 cm, đường kính trung bình từ 8 – 12 mm. Thân cây gồm 7 – 8 đốt. Thân phân cành muộn và có trung bình từ 10 -12 cành, một số giống có từ 9 – 10 cành. Lá thuộc loại lá kép mọc cách, lá chét có ba thuỳ với các hình dạng như ovan, thuôn dài, lưỡi mác, chẻ thuỳ. Trên thân chính của cây có từ 7 – 8 lá. Số lá, hình dạng lá có thể thay đổi tuỳ theo giống, đất trồng và thời vụ. Diện tích của các lá tăng từ các lá ở phía dưới lên các lá ở giữa thân rồi giảm dần lên các lá phía ngọn. Hoa đậu xanh là hoa lưỡng tính mọc thành chùm trên các trục hoa. Mỗi trục hoa có thể phát triển thành hai hàng hoa mọc đối nhau, các hoa trên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 hàng xếp liên tục với nhau tạo cho hoa có hình dạng co rút. Hoa đậu xanh có màu tím hoặc màu vàng nhạt với công thức hoa là K5C5A10G1. Đậu xanh là loài thực vật tự thụ phấn, tỷ lệ hoa hình thành quả từ 10 – 25%.Thụ phấn xong tràng hoa rụng, quả hình thành và phát triển. Quả đậu xanh thuộc loại quả giáp, hình trụ, dạng tròn, hơi dẹp, dài từ 8 – 10 cm, đường kính từ 4 – 6 mm, có hai gân nổi rõ dọc theo hai bên cạnh quả. Quả chín có màu vàng, nâu hoặc đen. Cũng như các bộ phận khác trên cây đậu xanh (thân, cành, cuống, lá) trên vỏ quả đậu xanh thường bao phủ một lớp lông dài khoảng 0,3 – 0,4 mm. Những giống thuộc nhóm kháng virus gây bệnh khảm vàng và bệnh sâu đục quả thì mật độ lông khá dầy, mầu trắng. Mỗi cây có từ 8 – 35 quả, mỗi quả có từ 8 – 15 hạt. Hạt đậu xanh có hình dạng khá phong phú như hình trụ, hình trụ hơi cạnh, ovan, tròn, thoi, tam giác... Màu vỏ hạt có thể là xanh lục, xanh mỡ (xanh sáng), xanh tối (nâu), vàng rơm... Ruột hạt có màu trắng, vàng hay xanh nhạt khối lượng 1000 hạt có thể dao động từ 25 – 70g. Rễ đậu xanh thuộc loại rễ cọc bao gồm rễ cái và rễ con, rễ cái sâu khoảng 20 – 30 cm, có khi sâu tới 70 – 100 cm. Đặc biệt do rễ đậu xanh có khả năng sống cộng sinh với vi khuẩn cố định đạm Rhizobium nên từ các kẽ nhánh rễ, nhất là sát rễ cái hình thành các nốt sần. Các nốt sần có khả năng cố định Nitơ thường có kích thước 4 – 5 mm, có màu đỏ, hồng hay nâu. Nốt sần bé hơn, dạng que, ruột màu xanh hay đen đều không có hoạt tính. Hạn chế của bộ rễ cây đậu xanh là dễ bị thối khi gặp úng. 1.1.2. Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới và ở Việt Nam Theo kết quả điều tra củatrung tâm nghiên cứu và phát triển rau quả châu Á (AVRCD), hàng năm trên thế giới có khoảng 20 nước sản xuất đậu xanh, trong đó Thái Lan, Ấn Độ, Trung Quốc, Pakistan, Philippin, Srilanca... được coi là những trọng điểm về diện tích, năng suất và sản lượng đậu xanh. Trong những Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 năm 1950 Trung Quốc là nước sản xuất đậu xanh, với diện tích gieo trồng là 1,64 triệu ha và sản lượng là 800.000 tấn, tuy nhiên năng suất còn thấp và chỉ đạt khoảng 488 kg/ ha. Sự sản xuất đậu xanh của Trung Quốc suy giảm qua những năm 1960 và những năm 1970. Sau đó chính phủ Trung Quốc đã có những thay đổi về chính sách nông nghiệp liên quan đến sản xuất đậu xanh, áp dụng khoa học kỹ thuật tiên tiến vào trong sản xuất nên sản xuất đậu xanh lại được phục hồi vào những năm 1980 và đến năm 2000, diện tích trồng là 772000 triệu ha, sản lượng đạt 891000 triệu tấn và năng suất bình quân đạt 1154 kg / ha. Trong đó năm 1995 giá trị xuất khẩu đậu xanh đạt ở mức 104 triệu USD (72% tổng giá trị xuất khẩu nông nghiệp) và năm 1999 đạt ở mức rất cao tới 109 triệu USD (93%). Ở Srilanca, tình hình sản xuất đậu xanh từ năm 1997 đến năm 2001 có xu hướng giảm: về diện tích trồng từ 16.636 ha (1997) xuống 10.976 ha (2001), sản lượng từ 15.000 triệu tấn (1997) xuống 10.072 triệu tấn (2001), và tăng nhập khẩu từ 2091 triệu tấn (1997) lên 8916 triệu tấn (2001). Mặc dù diện tích gieo trồng và sản lượng đậu xanh hàng năm ở Srilanca khá lớn song vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu tiêu thụ lớn ở trong nước. Do đó lượng đậu xanh nhập khẩu có xu thế tăng nhanh từ năm 2000, 2001. Các giống đậu xanh được gieo trồng phổ biến như Harsha năng suất trung bình 1200 kg/ha, MI-5 năng suất trung bình 1500 kg/ha, Ari năng suất trung bình 1700 kg/ha. Ở Việt Nam, cây đậu xanhđược gieo trồng ở nhiều địa phương trên cả nước. Căn cứ vào đặc điểm địa hình, điều kiện khí hậu...có thể phân chia các vùng trồng cây đậu xanh như sau: - Vùng núi phía Bắc bao gồm các tỉnh Sơn La, Lai Châu, Hoà Bình, Cao Bằng, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Tuyên Quang và Quảng Ninh. Thời vụ gieo trồng từ tháng 4,5 thu hoạch tháng 7,8 là thời điểm có khí hậu nómg ẩm thuận lợi cho Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 sinh trưởng của cây. Tập quán canh tác ở đây đơn giản, ít thâm canh, năng suất thấp. - Vùng Đồng bằng, Trung du Bắc bộ bao gồm các tỉnh Hà Tây, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hà Nội, Hải Dương, Hưng Yên, Hải Phòng, Hà Nam, Ninh Bình, Thái Bình và Thanh Hoá. Đậu xanh ở vùng này được gieo trồng từ tháng 2 đến tháng 9 hàng năm, tập trung ở 3 thời vụ: vụ xuân, vụ hè, vụ thu đông. Hàng năm do xu hướng thâm canh tăng vụ, tăng năng suất vì có hệ thống tưới tiêu khá hoàn chỉnh và đầu tư khá nên năng suất đậu xanh vùng này cao, việc tiếp nhận mô hình đậu xanh cao sản khả thi hơn. Đây là những điều kiện cơ bản trong phát triển sản xuất. - Vùng Duyên hải Trung Bộ và Tây Nguyên. Đây là vùng có diện tích và sản lượng gieo trồng đậu xanh lớn. Do không chịu ảnh hưởng của khí hậu mùa đông lạnh, mùa mưa, mùa khô phân bố rõ rệt nên thuận lợi để trồng quanh năm. Hàng năm đậu xanh được gieo trồng từ 2 – 3 vụ, với phương thức trồng thuần là chủ yếu. Hạn chế lớn nhất ở đây là thời điểm thu hoạch vụ hè thu thường gặp mưa bão nên thất thoát nhiều về năng suất và sản lượng. - Vùng Đông Nam bộ. Đây là vùng sản xuất đậu đỗ có quy mô lớn chiếm 26% diện tích gieo trồng cả nước. Tuy nhiên, do không có thâm canh và việc sử dụng các giống đậu xanh năng suất thấp nên năng suất trung bình của vùng này còn thấp. Một số giống đậu xanh được trồng phổ biến hiện nay như: ĐX044, VC2768A năng suất vụ hè thu khoảng 2000 kg/ha, có thể trồng 3 vụ/ năm, cây thấp,cứng, chịu mưa và chống đổ tốt. ĐX044 đang được trồng nhiều ở vùng đồng bằng và trung du Bắc bộ; V123 năng suất đạt 1800 – 2000 kg/ha, thâm canh có thể đạt 2000 - 7000 kg/ha, có thể trồng 3 vụ /năm; T135 năng suất đạt 2900 kg/ha trồng ở các tỉnh phía Bắc; V91-15 năng suất từ 1200 – 1400 kg/ha cây cứng, ít đổ, ít nhiễm bệnh vàng lá, trồng được trên nhiều loại đất ở các tỉnh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 phía Nam; HL-115 năng suất từ 1000 – 1300 kg/ha trồng vụ hè và 1400 – 2200 kg/ha trong vụ thu đông tại các tỉnh phía nam, cây cứng, ít đổ... 1.2. ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG CẢI TIẾN GIỐNG CÂY TRỒNG 1.2.1. Cơ sở khoa học của công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.1.1. Cơ sở tế bào học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Năm 1838, hai nhà sinh học người Đức là Schleiden và Schwann đã đề xướng ra học thuyết tế bào và nêu rõ: Mọi cơ thể sinh vật đều bao gồm các đơn vị nhỏ tồn tại độc lập, riêng rẽ và tách biệt đó là các tế bào. Tất cả các tế bào của một cơ thể đều mang bộ máy thông tin di truyền giống nhau. Do đó chúng có tiềm năng tổng hợp nên các protein giống nhau. Bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật các nhà khoa học đã đạt được những thành công chứng minh cho khả năng tồn tại và phát triển độc lập của tế bào. Các tế bào lấy từ bất kỳ mô sống nào của cơ thể thực vật (bao phấn, đỉnh sinh trưởng, lá mầm, đoạn thân, rễ…) nếu được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy thích hợp đều có thể phát triển thành cây hoàn chỉnh đặc trưng cho loài và ra hoa kết quả bình thường. Các loại mô đã phân hoá tách từ cơ thể thực vật có khả năng tái sinh trực tiếp thành cây hoàn chỉnh, ngoài ra chúng còn có khả năng phát triển thành tế bào mô sẹo (callus). Đó là loại tế bào không phân hoá, phân chia liên tục và có khả năng phân hoá thành phôi, chồi và cây hoàn chỉnh. Như vậy mỗi một tế bào bất kỳ lấy từ cơ thể thực vật đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Khả năng đó gọi là tính toàn năng của tế bào. Tính toàn năng là cơ sở của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, là cơ sở của công nghệ tế bào thực vật đang ngày càng phát triển và hoàn thiện. Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào nhanh chóng trở thành công cụ hữu hiệu trong nhiều lĩnh vực của công tác giống cây trồng, đưa nghề trồng trọt vào thế kỷ của công nghệ hiện đại. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 1.2.1.2. Ảnh hƣởng của các chất điều tiết sinh trƣởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật Hiện nay người ta đã phát hiện thấy 5 nhóm chất điều tiết sinh trưởng ở thực vật đó là auxin, cytokinin, ethylen, giberelin, axit absixic. Những chất này được phân thành các nhóm dựa vào tính tương đồng về cấu trúc và chức năng sinh lý, tuy nhiên về chức năng nhiều khi chúng có tác động chồng chéo và hỗ trợ nhau. Còn một số nhóm khác điều khiển từng giai đoạn sinh trưởng nhất định. Trong nuôi cấy mô tế bào người ta thường sử dụng ba nhóm chất điều tiết sinh trưởng là dẫn xuất của auxin, cytokinin và giberelin. - Nhóm auxin là nhóm kích thích sinh trưởng chính được các nhà sinh lý học thực vật phát hiện và quan tâm sớm nhất. Auxin là những hoocmon thực vật có tác dụng kích thích sinh trưởng, kéo dài tế bào và phân hoá cơ quan, kiểu tác động của nó liên quan đến làm chuyển đổi và mềm hoá màng tế bào. Chính chức năng này đã được người ta sử dụng và đánh giá hoạt tính của nó, ví dụ bằng cách đo phần kéo dài lá mầm cây yến mạch trồng trong điều kiện tối sẽ biết được hoạt tính của auxin. Nhóm auxin bao gồm các chất sau: 2,4 Diclorophenoxy axetic axit (2,4D), α – naphtylaxetic axit (α – NAA), Indolaxetic axit (IAA), trong đó 2,4D dễ gây độc nhưng có tác dụng kích quá trình phân chia tế bào thường được sử dụng nhiều nhất, α – NAA có tác dụng tạo rễ cho cây con. Tuy nhiên, tầm quan trọng của bất kỳ chất điều tiết sinh trưởng nào đều có thể được đánh giá thông qua số cấc công trình nghiên cứu chúng. Ramakishnan và cs đã sử dụng 2,4D bổ sung vào môi trường tạo mô sẹo từ mắt lá mầm của cây đậu đen, sau 5 ngày nuôi cấy xuất hiện mô sẹo với tỷ lệ 60,8% [32]. Kaviraj và cs cũng sử dụng 2,4D để tạo mô sẹo từ lá sơ cấp của đậu xanh và kết quả là khi sử dụng 2,4D với nồng độ 10mg/l tỷ lệ tạo mô sẹo là 100%. Ngoài sử dụng 2,4D bổ sung vào môi trường tạo mô sẹo, Kaviraj và cs sử Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 dụng α – NAA kết hợp với kinetin và BAP để tái sinh cây và tạo cây hoàn chỉnh ở đậu xanh …[34]. - Nhóm giberelin là nhóm được phát hiện qua nghiên cứu bệnh nấm lúa von. Nó tác động làm tế bào dãn ra và phân chia, làm cây lùn có thể cao lên được, như ngô lùn thành ngô cao, đậu dạng bụi thành dạng đứng. Đại diện cho nhóm này là axit giberilic (GA3), được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp [15]. - Nhóm cytokinin là nhóm chất hoá học có ảnh hưởng quyết định đến kích thích phân chia tế bào. Đại diện cho nhóm cytokinin gồm: Kinetin; 6 – Benzyl amino purine (BAP); 6- Dimethylalylamino purine (2iP); Zeatin. Rất nhiều cytokinin được phát hiện trong những nghiên cứu liên quan đến nuôi cấy mô, nó kích thích phân hoá cơ quan của những tế bào không phân chia. Ignaccimuthu và cs sử dụng BAP và α – NAA để tạo chồi từ cuống tử điệp của đậu xanh sau 15 ngày nuôi cấy. Chỉ sử dụng BAP, Mai Trường và cs(2001) đã xây dựng được hệ thống tái sinh cây đậu xanh từ cuống tử điệp…[31]. - Ethylen là nhóm có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển của cây nhưng gần đây nó mới được coi là một hoocmon thực vật. Ethylen thường được sử dụng để làm chín quả ở chuối, ra hoa đồng loạt ở dứa, nó cũng ảnh hưởng đến quá trình phân bào. Đối với cà chua trong điều kiện ethylen nồng độ cao sẽ kéo dài khoảng ra rễ của thân…[15]. - Axit absixic là hợp chất ức chế sinh trưởng thực vật tự nhiên ảnh hưởng đến tính ngủ nghỉ của hạt, mầm và rụng lá, tăng cường ra hoa cho một số cây ngắn ngày thông qua hiệu quả tổng hợp ARN và protein [15]. Trong nuôi cấy tuỳ theo cây trồng, bộ phận và kiểu gen nuôi cấy, môi trường và giai đoạn phát triển cụ thể trong quá trình nuôi cấy mà thành phần, chủng loại và nồng độ các chất điều tiết sinh trưởng có khác nhau. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 1.2.2. Hệ thống nuôi cấy để chọn dòng Cơ sở khoa học của kỹ thuật chọn dòng tế bào soma là hiện tượng các tế bào thực vật khi được nuôi cấy ở dạng mô sẹo trong điều kiện in vitro thường có những biến đổi di truyền tự phát, được gọi chung là biến dị soma. Thông qua phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể chọn ra được những dòng tế bào thích hợp theo định hướng của người thực nghiệm. Tuy vậy, đối với mỗi loại thực vật cần thiết phải có nghiên cứu tối ưu kỹ thuật nuôi cấy thích hợp cho việc chọn dòng. Sau đây là một số hệ thống nuôi cấy đã được thực hiện: Nuôi cấy mô sẹo: Mô sẹo là khối các tế bào mô mềm có mức độ cấu trúc thấp, chưa phân hoá, phân chia một cách hỗn loạn và có tính biến động di truyền cao. Mô sẹo thu được bằng nuôi cấy in vitro từ các cơ quan của thực vật như thân, lá, rễ, hoa…trong môi trường chứa chất điều hoà sinh trưởng nhóm auxin và điều kiện nuôi cấy thích hợp. Mô sẹo có thể được duy trì trên môi trường nuôi cấy bằng cách cấy chuyển có định kì, tuy nhiên trong thực nghiệm thấy rằng: i) mô sẹo qua cấy chuyển nhiều lần có ảnh hưởng không tốt đến khả năng tái sinh của cây; ii) tăng tính biến động di truyền của mô. Các tế bào di truyền có tính ổn định khá thấp. Nhiều tác giả đã thông báo nhận được cây tái sinh từ mô sẹo qua nhiều lần cấy chuyển có sự thay đổi nhiễm sắc thể (dị bội, đa bội) và những biến đổi di truyền khác. Vì vậy việc nhân nhanh và duy trì tính đồng nhất di truyền thông qua nuôi cấy mô sẹo cần thận trọng đối với nhiều loại thực vật và nhất định chỉ sử dụng mô sẹo sơ cấp để tái sinh cây hoàn chỉnh thông qua con đường tạo phôi vô tính. Mặt khác những cây tái sinh từ mô sẹo với những biến đổi di truyền phong phú lại rất có ý nghĩa trong việc chọn giống và như vậy vật liệu di truyền của cây đó trở nên phong phú hơn (Lê Trần Bình và cs 1997,1998) [1], [2]. Bằng cách này nhiều tác giả đã thông báo thu được kết quả ở những giống cây trồng mới (Bertin và cs, 1995, 1997) [22], [23]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 Nuôi cấy tế bào huyền phù: Nuôi cấy tế bào huyền phù là nuôi cấy tế bào đơn (single cell) hoặc cụm nhỏ tế bào (cell agregate) trong môi trường lỏng. Các tế bào này cũng được tạo ra từ mô sẹo có nguồn gốc thân, lá, rễ, hoa, phôi…. Muốn thu được tế bào huyền phù nhỏ, mịn cần phải sàng lọc liên tục qua các loại sàng có mắt lọc nhỏ (<0,5 mm). Để đạt được dạng nuôi cấy huyền phù tương đối đều nhau cần phải sàng lọc ít nhất hàng chục lần, như vậy thời gian cần thiết để thiết lập được môi trường nuôi cấy huyền phù ít nhất là 2 – 3 tháng. Đây là điều trở ngại trong nghiên cứu với thực vật vì thời gian nuôi cấy dài các tế bào huyền phù sẽ mất khả năng tái sinh cây. Lúc đó việc chọn dòng sẽ gặp khó khăn để ứng dụng cho thực tiễn tạo giống. Vì vậy chỉ trong trường hợp nhất định, khi tác nhân chọn lọc bắt buộc phải tác động lên toàn bộ bề mặt tế bào thì hệ thống nuôi cấy huyền phù mới được áp dụng. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn có ưu điểm trong chọn dòng vì các tế bào có kích cỡ tương đối đều nhau dưới tác động của điều kiện chọn lọc các dòng tế bào sẽ được chọn lọc một cách tương đối triệt để. Điều đáng quan tâm là khả năng tái sinh cây của các tế bào đơn là rất thấp. Nhiều nhà nghiên cứu thực nghiệm chỉ thu được các dòng tế bào chọn lọc, nhưng rất tiếc là không thu được cây tái sinh (Dix và cs,1990) [28]. Mặc dù vậy cũng đã có một số cây tái sinh từ nuôi cấy tế bào huyền phù đã được công bố như ở cây lúa, cây thuốc lá…(Collin và cs, 1990) [24]. Nuôi cấy tế bào trần: Tế bào thực vật bị phá bỏ toàn bộ lớp vỏ bao bọc (cell wall) chỉ còn lại khối nguyên sinh chất được bao bọc bởi màng nguyên sinh được gọi là tế bào trần (protoplast). Tế bào trần có thể được tách từ nhiều bộ phận khác nhau của cây nhưng chủ yếu là từ lá, mô sẹo, tế bào đơn và phôi. Các protoplast sau khi tách được nuôi cấy trong môi trường thích hợp thì tái tạo lại thành tế bào, phát triển thành mô sẹo và tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Vì trong giai đoạn chưa có thành tế bào các protoplast rất mẫn cảm với nồng độ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 các chất trong môi trường dinh dưỡng vì vậy trong môi trường nuôi cấy cần giảm bớt các chất vô cơ. Nhìn chung hạn chế lớn nhất trong nuôi cấy tế bào trần là khả năng tái sinh cây thấp đặc biệt là ở cây họ thuộc thảo. Cho đến nay đã có khoảng 70 loại cây trồng đã tách và nuôi cấy tế bào trần nhưng việc tái sinh cây chưa được nhiều. Tuy nhiên nhiều tác giả tiếp tục công bố những thành công trong việc nuôi cấy tế bào trần, đặc biệt là ở lúa. Abdul và cs (1991) đã tách và tái sinh cây hoàn chỉnh từ tế bào protoplast từ mô phôi non ở lúa dại (Oryza rufipogon Criff) [18]. Biswas và Zapata (1990) đã tái sinh thành cây hoàn chỉnh qua con đường nuôi cấy protoplast từ tế bào mô phôi lúa (Oryza sativa L.) [24]. Ứng dụng có ý nghĩa nhất của nuôi cấy protoplast là tạo cây soma, tạo cây lai tế bào chất thông qua dung hợp tế bào trần và hiện nay ứng dụng nhiều là để biến nạp gen. Việc chọn dòng chống chịu sử dụng phương pháp nuôi cấy protoplast còn ít được sử dụng và hầu như chưa có công bố thành công nào đề cập về vấn đề này. 1.2.3. Phƣơng thức chọn dòng Chọn lọc trực tiếp: Do mô sẹo có tính biến động di truyền cao trong nuôi cấy in vitro nên thường được các nhà thực nghiệm sử dụng để chọn dòng chống chịu, đây là một kỹ thuật thông dụng và có hiệu quả cao. Mô sẹo được chọn lọc trực tiếp trên môi trường có chứa nồng độ thích hợp của tác nhân chọn lọc như PEG (polyethylene glycol), sorbitol, NaCl…hoặc bị xử lý bằng tác nhân vật lý (tia UV, gamma…). Các tế bào sống sót sẽ được nhận biết trên môi trường chọn lọc thông qua quá trình sinh trưởng hay sự khác biệt về màu sắc từ quần thể tế bào, sau đó tế bào sống sót sẽ được chọn lọc và nhân thành một số lượng lớn. Mô hình này được sử dụng nhiều trong chọn dòng chịu muối (Chandler và Vasil, 1984) [25]. Trong chọn dòng trực tiếp người ta cũng có thể tiến hành chọn lọc theo kiểu bậc thang, các mô sẹo sống sót trong môi trường chọn lọc có Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 nồng độ tác nhân chọn lọc thấp sẽ được chuyển lên môi trường có tác nhân chọn lọc nồng độ cao. Tuy nhiên, chọn lọc theo kiểu bậc thang cũng có mặt hạn chế của nó, bởi vì các mô sẹo sống sót sau chọn lọc được nhiều khi đó chỉ là các mô sẹo được trải qua quá trình huấn luyện. Hệ thống tế bào được sử dụng là các tế bào nuôi dịch lỏng hoặc trộn tế bào vào môi trường thạch chứa chất chọn lọc hoặc cấy trực tiếp lên môi trường chọn lọc. Điều kiện chọn lọc ở đây là sự có mặt của tác nhân chọn lọc với nồng độ hay mức độ khác nhau gây tác động trực tiếp lên sinh trưởng của tế bào. Những tế bào sống sót phân chia thành cụm mô sẹo mới. Dòng chống chịu thường xuất hiện từ một phần của khối tế bào nuôi cấy này. Điểm hạn chế lớn nhất trong chọn dòng bằng nuôi cấy mô sẹo là chọn lọc không triệt để do kích thước lớn và không đồng nhất của khối mô. Vì vậy để đạt được hiệu quả cao người ta phải sử dụng các khối mô có kích thước nhỏ và đều nhau [25]. Chọn lọc gián tiếp: Chọn lọc gián tiếp đôi khi là chọn lọc mô sẹo có khả năng sống sót nhờ một khuyết tật nào đó của tế bào trên môi trường có chứa tác nhân chọn lọc. Chọn lọc tổng thể: Các tế bào dị dưỡng thường được chọn theo phương pháp xử lý đột biến và nuôi trên môi trường có chứa yếu tố dinh dưỡng cần thiết. 1.2.4. Tái sinh cây Tái sinh cây được xem là khâu mấu chốt quyết định thành công trong chọn dòng tế bào, nhiều nhà nghiên cứu thực nghiệm thu được các tế bào sống sót nhưng lại không tái sinh được cây hoàn chỉnh. Nguyên nhân là chưa xác định một cách đầy đủ đặc điểm quá trình phân hoá hình thái của sự tái sinh cây. Hoàn thiện kỹ thuật nuôi cấy mô và tái sinh cây là khâu quan trọng đầu tiên khi bắt tay vào công việc chọn dòng biến dị soma. Theo Raghava và Nabors (1985) [32] cần phải chú ý đến các yếu tố sau: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 (1) Nguồn mẫu vật nuôi cấy có tế bào sinh trưởng với tốc độ nhanh (mô phân sinh, phôi non…). (2) Môi trường và điều kiện nuôi cấy: pH, chiếu sáng, nhiệt độ… (3) Nồng độ và tỷ lệ thích hợp của auxin và cytokinin. (4) Số lần cấy chuyển. (5) Tỷ lệ giữa khối lượng mô sẹo và điều kiện chọn lọc. (6) Sự có mặt của các yếu tố bắt buộc ở môi trường chọn lọc. Tái sinh cây được xem là khâu quyết định thành công trong chọn dòng tế bào. Nhiều tác giả sau khi chọn được dòng tế bào đột biến từ nuôi cấy mô sẹo đã không tái sinh được cây hoàn chỉnh. Nguồn gốc mô sẹo là một yếu tố ảnh hưởng lớn đến khả năng tái sinh [12]. Mức bội thể của mô sẹo cũng là nguyên nhân gây nên sự khác nhau trong quá trình tái sinh cây. Mô sẹo đơn bội từ đoạn thân hay mảnh lá của Dautura innoxia tái sinh chồi nhanh hơn mô sẹo cùng loài của cây lưỡng bội. Ở cây khoai lang tỷ lệ tái sinh cây từ mô sẹo có nguồn gốc từ lá, thân, rễ, cuống lá là rất thấp. Mô sẹo có nguồn gốc từ củ khoai lang bị lục hoá mạnh, tạo nhiều rễ và hầu như không có khả năng tái sinh cây [4]. Khả năng tái sinh cây chịu ảnh hưởng lớn bởi thành phần và nồng độ các chất kích thích sinh trưởng thực vật được bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo có hiệu quả cao ở nhiều đối tượng cây trồng khi bổ sung các chất sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin. Theo nghiên cứu của Dix (1990), mô sẹo có khả năng phân hoá tốt trên môi trường MS cơ bản có bổ sung α – NAA (0,4mg/l) BAP (10mg/l). Sau đó chuyển sang nuôi cấy ở môi trường MS cơ bản không có chất kích thích sinh trưởng các mô này vẫn có khả năng tái sinh cao [28]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 Khả năng tái sinh cũng chịu ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy. Nghiên cứu của Poddar (1998) cho thấy, hàm lượng amonium nitrat có ảnh hưởng đến khả năng tái sinh cây ở cây Eleusine coracana [39]. Bổ sung Spemidine trong quá trình nuôi cấy mô sẹo lúa với thời gian dài 12 tháng đã làm tăng khả năng tái sinh cây [9], Abdul và cs (1999) đã phát hiện sự gia tăng hàm lượng α – amylase ở những mô có khả năng tái sinh cao ở lúa [18]. Khả năng sinh trưởng và tái sinh cây tăng lên ở các mô sau khi xử lý các điều kiện cực đoan đã được nhiều tác giả đề cập (Nabors và cs, 1983) [37]. Nguyễn Hoàng Lộc, 1992 cũng thu được kết quả tương tự khi tái sinh cây ở các mô chịu muối và mất nước ở thuốc lá [9]. Nguyên nhân của hiện tượng này có thể là dưới tác động của các điều kiện cực đoan ở một mức độ và thời gian nhất định những mô hay tế bào “yếu” thường chết, chỉ còn những tế bào có sức sống cao mới sống sót và cho hiệu quả tái sinh cao. 1.3. NGHIÊN CỨU CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG BẰNG KỸ THUẬT CHỌN DÒNG TẾ BÀO SOMA VÀ HỆ THỐNG TÁI SINH Ở THỰC VẬT VÀ CÂY ĐẬU XANH 1.3.1. Nghiên cứu chọn giống cây trồng bằng kỹ thuật chọn dòng tế bào soma Cho đến nay kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực chọn dòng tế bào, đặc biệt là chọn dòng chống chịu stress môi trường như chịu hạn, chịu lạnh, chịu muối NaCl, chịu nhôm [2]. Mundy và cs (1988) đã tiến hành gây mất nước mô sẹo lúa và đã nhận thấy ABA là chất tăng khả năng giữ nước và chịu mất nước của mô sẹo lúa [35]. Bằng việc bổ sung PEG8000 vào môi trường nuôi cấy mô sẹo giống lúa Khao Dawk Mali 105, Adkins và cs (1995) đã chọn được dòng lúa chịu hạn có những tính trạng nông học quan trọng và khả năng chịu hạn được duy trì và ổn định ở thế hệ R2 [19]. Bằng phương pháp thổi khô mô sẹo lúa, Đinh Thị Phòng và cs (1998, 2001) đã Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 chọn tạo được 3 giống lúa DR1, DR2, DR3 cho năng suất cao, ổn định, có khả năng chịu hạn, chịu lạnh hơn hẳn giống gốc [12]. Lê Trần Bình và cs (1998) đã chọn được hai dòng có khả năng chịu muối là C0 và C8. Bằng phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù từ mô sẹo lúa trong môi trường có bổ sung AlCl3 ở nồng độ từ 0 – 600ppm có pH tương ứng từ 5,8 – 2,71, tác giả cũng chọn được một số giống địa phương như pokaly, cườm, chiêm bầu và một cố giống lúa lai như tép lai, CR203 có khả năng chống chịu [2]. Ngoài ra khi xử lý nhiệt độ thấp tác giả cũng chọn được một số dòng lúa từ các loài phụ Japonica, Javanica và Indica có khả năng chịu lạnh (10C). Xử lý nhiệt độ cao ở giai đoạn mô sẹo của một số giống lúa, Nguyễn Thị Tâm (2004), đã tạo được 197 dòng mô có khả năng chịu nóng ở 400C, 420C và 520 dòng cây xanh [14]. Bằng kỹ thuật nuôi cấy mô sẹo thuốc lá kết hợp với việc tiền xử lý bằng ABA, manitol và saccharose, Nguyễn Hoàng Lộc (1993) [9] cũng thu được 3 dòng thuốc lá SC1, SC2, SC3 (của các giống BV23-5, BG, NTH tương ứng) có khả năng chịu được sự mất nước cực đoan (mô mất nước trên 90% so với khối lượng tươi). Kết quả phân tích về các đặc điểm sinh lý – sinh hoá ở các dòng thuốc lá này cho thấy tính chịu mất nước được điều khiển bởi một nhóm gen. 1.3.2. Nghiên cứu hệ thống tái sinh ở thực vật và ở cây đậu xanh Trong thực tế đậu xanh được sản xuất dễ dàng và hoàn toàn không có nhu cầu nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô, tuy nhiên việc nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu xanh khó có thể thực hiện và thành công được nếu trước hết không tiến hành việc tái sinh cây đậu xanh. Rudrabhatla Sairam và cs (2005) đã tổng hợp các kết quả nghiên cứu phát triển kỹ thuật tái sinh ở cây một lá mầm và cây hai lá mầm. Sự tái sinh cây được thực hiện bằng nuôi cấy in vitro từ phôi soma hoặc từ một bộ phận khác độc lập trên cơ thể và điều đó còn phụ thuộc vào genotype của giống [41]. Đối với cây ngô, sự tái sinh cây có thể thực hiện từ mô sẹo hoặc tạo đa chồi; tạo đa chồi từ hạt nảy mầm ở cây Sorghum; tạo Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 mô sẹo từ hạt nảy mầm, tạo phôi soma từ mô sẹo và tái sinh chồi từ mô sẹo ở cây Lolium; tạo đa chồi từ cuống lá của cây Begonia; tạo mô sẹo và tái sinh từ lá hay cuống lá ở cây Geranium, nuôi cấy in vitro phôi soma từ tế bào nuôi cấy huyền phù ở cây đậu đũa (Vigna unguiculata) được thực hiện bởi Ramakrishnan và cs (2005) [33] và bằng phương pháp này đã thu tần số tái sinh cây cao (Prem và cs, 2001) [38] … Đối với cây đậu tương sự tái sinh cây tạo đa chồi từ mắt lá mầm đã được nghiên cứu, tuy nhiên đậu tương là đối tượng thực vật rất khó thực hiện nuôi cấy in vitro từ khâu khử trùng, tạo mô sẹo, tái sinh cây, tạo rễ và ra cây [6]. Nghiên cứu khả năng tái sinh của 27 giống thuộc loài Vigna có nguồn gốc từ Phillipine, Madagascar, Pakistan, India, Australia, China, Japan Renato và cs (1999, 2001) đã cho thấy kỹ thuật tái sinh cây từ mắt lá mầm của hạt nảy mầm 4 ngày tuổi đạt hiệu quả tái sinh 80% - 100% và tái sinh chồi trực tiếp từ mắt lá mầm như là chỉ thị cho hệ gen của loài đậu Vigna châu Á (subgenus Ceratotropis) [42], [43]. Các kết quả nghiên cứu tái sinh cây ở đậu xanh từ phôi soma và từ mắt lá mầm phục vụ chuyển gen cũng đã được công bố bởi Jayanti Sen và Spra Guha Mukherjee (1998) [32], Ignacimuthu và Franklin (1999) [31], Renato và cs (1999, 2001) [41], [42], Mai Trường và cs (2001) [16], Sita và cs (2006) [44], Kaviraj và cs (2006) [34]. Sonia và cs (2007) [45] nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein ức chế enzyme α-amylase vào cây đậu xanh nhờ vi khuẩn Agrobacterium được thực hiện nhờ tái sinh đa chồi từ mắt lá mầm. Đánh giá hiệu quả chuyển gen ở cây Vigna mungo khi sử dụng kỹ thuật cấy mô từ mắt lá mầm của Muruganantham và của Amutha và cs (2006) cũng đã khẳng định hiệu quả của phương pháp này [36]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 Chƣơng 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU 2.1.1. Nguyên liệu thực vật Tám giống đậu xanh do bộ môn hệ thống canh tác của Viện nghiên cứu ngô cung cấp được sử dụng làm nguyên liệu nghiên cứu là: VN93-1; VN99-1; VC1973A; VC3902A; VC6148; VC6372; VC2768A; ĐX06. Đặc điểm của các giống đậu xanh trên được thể hiện ở bảng 2.1. Bảng 2.1. Đặc điểm của các giống đậu xanh nghiên cứu STT Tên giống Nguồn gốc Màu sắc hạt Hình dạng hạt Khả năng chịu hạn 1 VN93 - 1 Giống lai trong nước (Viện Nghiên cứu Ngô lai tạo) Xanh - không bóng Tròn Khá 2 VN99- 3 Giống lai khác loài trong nước (Viện Viện Nghiên cứu Ngô lai tạo -VN93-1 x Vigna mungo) Xanh nâu – không bóng Tròn Trung bình 3 VC1973A Nhập nội từ Trung tâm Cải tiến Rau màu Quốc tế Xanh nâu – bóng Tròn Trung bình 4 ĐX06 Nhập nội từ Trung tâm Cải tiến Rau màu Quốc tế Xanh nâu – không bóng Tròn Trung bình 5 VC3902A Nhập nội từ Trung tâm Cải tiến Rau màu Quốc tế Xanh nâu – bóng Tròn Trung bình 6 VC6148 Nhập nội từ Trung tâm Cải tiến Rau màu Quốc tế Xanh nâu – bóng Tròn Trung bình 7 VC 6372 Nhập nội từ Trung tâm Cải tiến Rau màu Quốc tế Xanh nâu –bóng Tròn Trung bình 8 VC 2768A Nhập nội từ Trung tâm Cải tiến Rau màu Quốc tế Xanh nâu – bóng Tròn Trung bình Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 2.1.2. Hoá chất và thiết bị - Sử dụng các loại hoá chất thông dụng như 2,4D (Diclorphenoxyacetic acid), α- NAA (acid α – naphthylacetic), BAP (6 – Benzyl amino Purin), các chất khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin, nước dừa, agarose, glucose và nhiều hoá chất thông dụng khác. - Sử dụng các thiết bị như: Cân điện tử (Đức), buồng cấy vô trùng (Nuare, Mỹ), nồi khử trùng (Tomy,Nhật), máy đo pH … 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 8 năm 2008 đến tháng 8 năm 2009 tại Phòng công nghệ tế bào thực vật thuộc khoa Sinh - Kỹ thuật nông nghiệp, trường Đại học sư phạm - Đại học Thái Nguyên. Các bước nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ tổng quát sau: Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát Tạo đa chồi từ mắt lá mầm Thăm dò môi trường nuôi cấy in vitro HẠT ĐẬU XANH Tạo mô sẹo Xử lý thổi khô Tái sinh cây Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 2.2.1. Nhóm phƣơng pháp nuôi cấy in vitro * Tạo mô sẹo từ hạt đậu xanh Khử trùng hạt Mẫu vật ở ngoài môi trường nuôi cấy có thể có nấm mốc và vi khuẩn vì vậy cần phải khử trùng để loại bỏ. - Khử trùng hạt ngoài buồng cấy: Hạt đậu xanh được rửa bằng nước máy, sau đó rửa sạch bằng xà phòng, cuối cùng tráng lại nhiều lần bằng nước cất. - Khử trùng trong buồng cấy: Hạt đậu xanh được khử trùng trong điều kiện vô trùng bằng cồn trong thời gian 1 phút, tráng lại bằng nước cất khử trùng 1 đến 2 lần. Thêm dung dịch Javen lắc đều trong 20 - 25 phút, sau đó rửa bằng nước cất khử trùng 3 đến 4 lần. Thí nghiệm với nồng độ cồn 60%,70%,80%, 90%, nồng độ javen 50%,60%,70%. Ngâm hạt đã được khử trùng trong khoảng thời gian 5 giờ. Tạo mô sẹo Hạt đậu xanh đã khử trùng được đặt lên đĩa petri có lót giấy thấm vô trùng, dùng panh và dao mỏng tách bỏ lớp vỏ và phần nội nhũ, thu phôi đặt lên môi trường MS cơ bản có bổ sung 2,4D nồng độ từ 3 - 13mg/l, saccharose 3%, agar 0,9%, pH 5,8. Nuôi 1 tuần trong tối và 3 ngày dưới ánh sáng đèn phòng nuôi cấy với cường độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ 250C ± 10C. Đánh giá tỷ lệ tạo mô sẹo theo công thức: t cp N N Ci  (%) Trong đó:Ncp là số hạt tạo mô sẹo Nt là tổng số hạt nuôi cấy Ci là tỷ lệ tạo mô sẹo (%) Đánh giá tốc độ phát triển của mô sẹo của các giống thông qua chỉ số tăng trưởng của khối mô sẹo thu được sau 10 ngày nuôi cấy Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 Tái sinh cây Mô sẹo phôi thu được từ môi trường tốt nhất được cấy chuyển sang môi trường tái sinh cây trên nền MS cơ bản, bổ sung BAP (1,5mg/l; 2,0mg/l; 2,5mg/l; 3mg/l; 3,5 mg/l). Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30 mô, lặp lại 3 lần. Kết quả được đánh giá sau 10 đến 15 ngày cấy chuyển. Đánh giá tỉ lệ tái sinh theo công thức: sv r c N N R  (%) Trong đó: Rc là khả năng tái sinh cây (%) Nr là tổng số mô tái sinh cây Nsv là tổng số mô nuôi cấy Kéo dài chồi đậu xanh Khi chồi đạt chiều cao 2 – 2,5 cm được cấy chuyển sang môi trường kéo dài chồi trên môi trường MS cơ bản; muối B5 3g/l; thạch agar 9g/l; đường saccharose 30g/l; nước dừa 100ml/l; GA3 với nồng độ (0,5mg/l; 1mg/l; 1,5mg/l; 2mg/l); pH 5,7. Đánh giá khả năng kéo dài chồi của cây sau 10 ngày cấy chuyển. Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30 chồi và lặp lại 3 lần. Chồi phát triển tốt là những chồi sau 10 ngày cấy chuyển có chiều cao đảm bảo cho cấy chuyển ra rễ, chồi mập và không bị héo ngọn. Tạo cây hoàn chỉnh Các chồi sau khi kéo dài được chuyển sang môi trường ra rễ để tạo cây hoàn chỉnh. Môi trường ra rễ là môi trường MS cơ bản; thạch agar 9g/l; đường saccharose 30g/l; nước dừa 100ml/l; α – NAA (0,2 mg/l; 0,3 mg/l; 0,4mg/l); pH 5,6. Mỗi bình cấy từ 2- 3 chồi. Đánh giá khả năng hình thành và phát triển rễ của cây tái sinh sau 3 tuần và 4 tuần. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 2.2.2. Phƣơng pháp đánh giá khả năng chịu mất nƣớc của mô sẹo 2.2.2.1. Phƣơng pháp xử lý mô sẹo bằng thổi khô Mô sẹo phôi đậu xanh sau 10 ngày nuôi cấy được đặt lên đĩa petri trải giấy lọc vô trùng và thổi khô bằng luồng khí vô trùng của buồng cấy ở các ngưỡng thời gian khác nhau, từ 0; 3; 5; 7; 9; 11 giờ. Xác định độ mất nước của mô sẹo sau 3, 5, 7, 9, 11 giờ xử lý. Độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau khi xử lý bằng thổi khô được tính theo công thức: f df L W WW W   (%) Trong đó: WL: độ mất nước (%) Wf: khối lượng mô tươi (mg) Wd: khối lượng mô sau thổi khô (mg) 2.2.2.2. Chọn lọc mô sẹo sống sót sau khi xử lý bằng thổi khô và tái sinh cây Cấy mô sẹo sau khi xử lý mất nước bằng thổi khô lên môi trường tái sinh cây (MS cơ bản; đường saccharose 30g/l; thạch agar: 9g/l; 3g muối B5; BAP 3mg/l; pH: 5,7). + Tỷ lệ sống sót của mô sẹo được đánh giá 15 ngày thổi khô được tính theo công thức: t sv v N N S  (%) Trong đó:Sv:tỷ lệ mô sống sót (%) Nsv:số mô sống sót Nt:tổng số mô xử lý + Tỷ lệ tái sinh cây: sv r c N N R  (%) Trong đó: Rc:khả năng tái sinh cây (%) Nr:số mô tái sinh cây Nsv: số mô sống sót Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 2.2.2.3. Tạo cây hoàn chỉnh từ mô sẹo chọn lọc Các chồi đậu xanh được tách thành một dòng cây và cấy chuyển trên môi trường tạo cây hoàn chỉnh. Nuôi 4 tuần dưới ánh sáng đền neon trong phòng nuôi cấy với cường độ 200 lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ phòng nuôi 25 0 C  10C. Môi trường tạo cây hoàn chỉnh: MS cơ bản; thạch agar 9g/l; đường saccharose 30g/l; nước dừa 100ml/l; α - NAA: 0,3 mg/l; pH 5,6. 2.2.2.4. Phƣơng pháp ra cây Cây nuôi cấy trong ống nghiệm là cây được sống trong điều kiện tối ưu về mọi mặt trong điều kiện môi trường vô trùng. Khi đưa cây ra ra ngoài ống nghiệm, cây phải chịu tác động của điều kiện bất lợi của môi trường. Do đó để đạt được cây có khả năng sống cao thì trong thời gian đầu mới đưa cây ra phải bảo vệ cẩn thận; từng bước cho cây làm quen dần với những điều kiện sống bên ngoài, cây con dần cứng cáp và phát triển được ở ngoài tự nhiên. Các bước ra cây được tiến hành như sau: - Các bình cây được mở nút, cho nước vào ngâm, sau đó lắc nhẹ cho thạch rời khỏi rễ cây, dùng panh cặp nhẹ kéo ra (chú ý tránh dập nát) rửa cẩn thận cho hết lớp agar bám quanh gốc bằng nước sạch. - Chuẩn bị giá thể trồng cây: Đậu xanh kém chịu nước nên tỷ lệ đất: cát: trấu hun là 1:1,5:1,5. Giá thể trồng cây được đựng vào khay trồng với bề dày khoảng 10 cm. - Trồng cây: cây con được trồng vào khay, sau đó dùng dung dịch MS cơ bản pha loãng 10 lần phun nhẹ nhàng vào gốc. - Chăm sóc cây đậu xanh non: cây đậu xanh trồng trong khay để ra nơi đủ ánh sáng nhưng tránh nắng và tránh mưa trực tiếp. Sau 2 tuần cây sống ra rễ mới, lá mới có thể đưa ra ngoài vườn ươm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 2.2.3. Phƣơng pháp tạo đa chồi từ mắt lá mầm Khử trùng hạt: hạt đậu xanh được rửa sạch bằng nước cất vô trùng, sau đó rửa bằng cồn 70% trong vòng một phút, lắc hạt với dung dịch javen 60% trong vòng 20 - 25 phút, tráng sạch bằng nước cất vô trùng ba lần. Môi trường nảy mầm hạt: Hạt đậu xanh đã được khử trùng cấy vào bình tam giác trong môi trường nảy mầm: MS cơ bản, đường saccharose 30g/l; thạch agar 9g/l; pH 5,8. Khảo sát khả năng nảy mầm của hạt, theo dõi sự phát triển và tỷ lệ nảy mầm. Môi trường tạo đa chồi: Sau khi hạt nảy mầm dùng dao cắt bỏ phần trụ rễ cách phần mắt lá mầm khoảng 3- 4 mm. Tách đôi lá mầm thành 2 mẫu cấy, cắt bỏ lá mầm, dùng kim nhọn gây tổn thương ở mắt lá mầm. Các mảnh lá mầm được cấy trên môi trường tạo đa chồi: MS cơ bản, đường saccharose 30g/l; thạch agar: 9g/l; 3g muối B5; BAP 3mg/l; pH: 5,7. Đánh giá tỷ lệ tạo chồi và số chồi / mảnh cấy. Môi trường kéo dài chồi: các chồi được tách riêng và cấy vào môi trường kéo dài chồi: MS cơ bản; thạch agar 9g/l; đường saccharose 30g/l; GA3 1mg/l; nước dừa 100ml/l; pH 5,7. Môi trường ra rễ: Sau khi chồi có kích thước 4 - 5cm cấy chuyển sang môi trường ra rễ gồm có: MS cơ bản; đường saccharose 30g/l; thạch agar 9g/l; nước dừa 100ml/l, α - NAA0,3mg/l. Ra cây và chế độ chăm sóc: Cây tái sinh hoàn chỉnh được ra bầu và đưa ra trồng ở ngoài (phương pháp và điều kiện ra cây giống như mục phương pháp ra cây ở mục 2.2.2) 2.2.4. Phƣơng pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu Mỗi thí nghiệm được nhắc lại 3 lần. Sử dụng toán thống kê để xác định các trị số thống kê như trung bình mẫu ( x ), phơng sai (2), độ lệch chuẩn (), và sai số Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 trung bình mẫu ( x S ), với n ≤ 30, α = 0,05. Các số liệu được xử lý trên máy vi tính bằng chương trình Excel [16]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. HỆ THỐNG TÁI SINH CÂY ĐẬU XANH TỪ MÔ SẸO 3.1.1. Ảnh hƣởng nồng độ các chất đến kết quả khử trùng hạt Hạt đậu xanh được rửa sạch bằng nước cất vô trùng, ngâm với cồn trong vòng một phút ở các thang nồng độ 60%; 70%; 80%; 90%. Sau đó được lắc nhẹ và đều trong dung dịch javen với nồng độ: 50%; 60%; 70% trong vòng 25 phút. Kết quả nghiên cứu cho thấy, cồn 70% và javen 60% đảm bảo cho hạt nảy mầm cao, khả năng bị nhiễm và bị thối rất thấp. Nồng độ cồn và javen thấp tỷ lệ nhiễm cao; nồng độ cồn và javen cao tỷ lệ hạt bị thối cao. 3.1.2. Ảnh hƣởng của các chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây từ mô sẹo 3.1.2.1. Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi đậu xanh Phôi đậu xanh sau khi khử trùng được cấy lên môi trường MS cơ bản bổ sung 2,4D với nồng độ khác nhau. Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30 phôi, lặp lại 3 lần. Theo dõi khả năng hình thành mô sẹo sau 10 ngày nuôi cấy, chúng tôi thu được kết quả ở bảng 3.1. Kết quả bảng 3.1 cho thấy, trên các loại môi trường có bổ sung 2,4D với nồng độ khác nhau và giống đậu xanh khác nhau, phôi đậu xanh đều có khả năng tạo mô sẹo sau 10 ngày nuôi cấy. Ở môi trường có nồng độ 11 mg/l 2,4D thích hợp nhất cho khả năng tạo mô sẹo của phôi giống đậu xanh ĐX06, tỉ lệ mô sẹo đạt cao nhất là 100%. Còn ở môi trường có nồng độ 3mg/l – 10mg/l 2,4D tỷ lệ tạo mô sẹo thấp. Sử dụng 2,4D cao hơn 11mg/l khả năng tạo mô sẹo của phôi đậu xanh ĐX06 bắt đầu giảm. Đặc biệt với nồng độ 2,4D 13 mg/l, khả năng tạo mô sẹo giảm mạnh (79,50%). Các giống VN93-1; VN99-3; VC1973A; VC3902A; VC6148; Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 VC6372; VC2768A, tỉ lệ mô sẹo đạt cao nhất là 99% khi sử dụng 2,4D với nồng độ 10mg/l. Bảng 3.1. Khả năng tạo mô sẹo của các giống đậu xanh (%) Công thức Nồng độ 2.4D (mg/l) VN 93-1 VN 99-3 VC 1973A ĐX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A 1 3 85,17 86,50 80,15 81,05 87,15 82,05 87,05 81,15 2 4 86,09 86,29 83,25 81,15 86,90 83,50 86,90 81,25 3 5 86,34 87,30 86,32 86,35 87,30 87,10 87,10 85,35 4 6 89,21 87,20 86,30 87,50 87,90 87,50 87,60 84,50 5 7 92,72 91,02 87,15 89,55 90,20 88,55 90,25 89,55 6 8 95,23 91,20 93,10 94,10 91,90 94,20 91,05 90,10 7 9 96,37 93,07 97,05 95,05 94,07 94,50 92,10 92,05 8 10 99,14 98,10 99,20 97,50 98,50 97,10 99,50 95,50 9 11 94,14 97,23 96,23 100,00 96,03 96,00 96,03 92,00 10 12 94,04 92,05 84,10 84,10 92,15 84,10 90,15 85,10 11 13 82,03 80,80 79,50 79,50 82,50 79,30 83,50 83,50 Ở môi trường có nồng độ 3 mg/l – 9 mg/l 2,4D tỷ lệ tạo mô sẹo thấp. Sử dụng 2,4D cao hơn 10mg/l và khả năng tạo mô sẹo phôi đậu xanh của 7 giống trên đều giảm. Đặc điểm hình thái của mô sẹo các giống đậu xanh được trình bày ở bảng 3.2. Kết quả bảng 3.2 cho thấy, trên các loại môi trường có bổ sung 2,4D với nồng độ khác nhau và giống đậu xanh khác nhau, hình dạng mô sẹo cũng khác nhau sau 10 ngày nuôi cấy. Ở môi trường có nồng độ 8mg/l – 13mg/l 2,4D các mô sẹo đều có hình dạng sần sùi, nhưng nồng độ 2,4D từ 8mg/l - Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 10mg/l đối với 7 giống đậu xanh VN93-1; VN99-3; VC1973A; VC3902A; VC6148;VC6372; VC2768A, các mô sẹo đó bó chặt còn nồng độ 2,4D cao hơn 10mg/l mô sẹo sần sùi nhưng không bó chặt. Đối với giống đậu xanh ĐX06 nồng độ 2,4D từ 8 mg/l – 11mg/l các mô sẹo có hình dạng sần sùi và bó chặt, còn nồng độ 2,4D cao hơn 11mg/l thì các mô sẹo đó không bó chặt lại. Nồng độ 2,4D từ 3 mg/l – 7mg/l tất cả các giống đậu xanh đều có hình dạng nhẵn. Bảng 3.2. Hình dạng mô sẹo của các giống đậu xanh Công thức Nồng độ 2,4D mg/l VN 93-1 VN 99-3 VC 1973A ĐX 06 VC3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A 1 3 Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn 2 4 Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn 3 5 Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn 4 6 Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn 5 7 Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn 6 8 Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi 7 9 Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi 8 10 Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi 9 11 Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi 10 12 Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi 11 13 Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 Kết quả theo dõi tốc độ sinh trưởng của mô sẹo được trình bày ở bảng 3.3 Bảng 3.3. Tốc độ sinh trưởng mô sẹo của các giống đậu xanh (đvms) (1 đơn vị mô sẹo (đvms) có kích thước khoảng 3 mm2) Công thức 2.4-D (mg/) VN 93-1 VN 99-3 VC 1973A ĐX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A 1 3 2,700,10 2,630,15 2,53 0,15 2,500,26 2,60 0,25 2,650,50 2,580,15 2,600,50 2 4 2,600,36 2,670,35 2,66 0,25 2,630,40 2,60 0,10 2,70 0,15 2,750,10 2,60 0,15 3 5 2,730,21 2,630,51 2,83 0,21 2,700,21 2,75 0,25 2,78 0,25 2,700,25 2,80 0,35 4 6 3,030,72 3,200,53 3,00 0,35 3,100,35 3,15 0,15 3,05 0,45 3,150,40 3,10 0,52 5 7 3,200,20 3,270,25 3,37 0,15 3,270,25 3,37 0,35 3,38 0,25 3,480,15 3,27 0,25 6 8 3,300,10 3,300,10 3,40 0,15 3,450,15 3,40  0,15 3,45 0,35 3,550,25 3,44 0,32 7 9 3,370,15 3,600,50 3,50 0,10 3,530,40 3,55  0,42 3,50 0,20 3,600,20 3,52 0,21 8 10 3,490,25 3,700,15 3,60 0,15 3,800,15 3,75  0,15 3,650,45 3,650,45 3,75 0,35 9 11 2,900,20 3,100,25 3,00 0,35 3,850,35 2,75  0,25 2,6 0,25 2,850,50 2,95  0,25 10 12 2,700,15 2,800,50 2,65 0,42 3,3  0,20 2,78  0,27 2,58 0,26 2,750,20 2,75  0,26 11 13 2,300,20 2,450,20 2,43 0,25 2,500,27 2,33  0,10 2,50 0,30 2,600,18 2,50 0,25 Bảng 3.3 cho thấy, sau 10 ngày nuôi cấy ở môi trường có nồng độ 3mg/l - 10 mg/l 2,4D mô sẹo của phôi giống đậu xanh ĐX06 có kích thước khối mô tăng dần và đạt kích thước lớn nhất ở môi trường có nồng độ 11mg/l 2,4D. Sử dụng 2,4D cao hơn 11mg/l kích thước mô sẹo của phôi đậu xanh ĐX06 bắt đầu giảm. Đặc biệt với nồng độ 2,4D 13 mg/l, kích thước mô sẹo giảm mạnh (2,5 đvms). Các giống VN93-1; VN99-3; VC1973A; VC3902A; VC6148; VC6372; VC2768A, các phôi nuôi cấy trong môi trường bổ sung từ 3 mg/l – 9 mg/l kích thước khối mô sẹo tăng dần và đạt cao nhất kích thước Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 lớn nhất khi sử dụng 2,4D với nồng độ 10mg/l. Ở môi trường có nồng độ 2,4D cao hơn 10mg/l và kích thước mô sẹo phôi đậu xanh của 7 giống đó bắt đầu giảm dần. Như vậy môi trường bổ sung nồng độ 2,4D 11mg/l thích hợp nhất với giống đậu xanh ĐX06 và nồng độ 2,4D cao hơn 10 mg/l đối với 7 giống đậu xanh còn lại, vì ở nồng độ đó tỷ lệ tạo mô sẹo, hình dạng cũng như kích thước mô sẹo là tốt nhất. Nồng độ 2,4D cao hơn tỉ lệ tạo mô sẹo và kích thước khối mô đều giảm. Sau một thời gian nuôi cấy ngắn, các mô sẹo này đều vàng và nhanh bị chết. Hiện tượng này cũng thường xuyên gặp khi nuôi cấy mô thực vật, có thể do khi nồng độ các chất sinh trưởng quá cao, thì sự phân chia tế bào xảy ra nhanh, sự định hướng cho sự biệt hoá cơ quan khó khăn nên các mô sẹo tạo ra dễ bị biến dạng. Hơn nữa khi nồng độ các chất sinh trưởng quá cao đặc biệt ở các loại mô sẹo hoặc chồi được cấy chuyển nhiều lần trên môi trường luôn duy trì các chất kích thích, các mẫu nuôi cấy này luôn tích tụ hàm lượng hoocmon ngoại sinh cao, dẫn đến các tế bào và mô dễ bị độc và nhanh chết. Còn nếu sử dụng nồng độ 2,4D thấp quá trình tạo mô sẹo và phát triển của mô sẹo rất chậm. Mai trường và cs (2001) chỉ sử dụng BAP với nồng độ 4mg/l sau 1 tuần bắt đầu thấy sự hình thành các đám mô sẹo [16]. Kaviraj và cs (2006) tái sinh cây đậu xanh hoàn chỉnh từ mô sẹo đã sử dụng 2,4D trong giai đoạn tạo mô sẹo với nồng độ 9mg/l – 15mg/l và kết quả thu được với môi trường bổ sung 10mg/l 2,4D tạo 100% mô sẹo [34]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả nhận được của nhóm Kaviraj và cs (2006). Như vậy môi trường bổ sung 11mg/l 2,4D là môi trường thích hợp nhất cho khả năng tạo mô sẹo phôi của giống đậu xanh ĐX06 và môi trường bổ sung 10mg/l 2,4D là môi trường thích hợp nhất cho khă năng tạo mô sẹo phôi đậu xanh của 7 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 giống còn lại, vì ở môi trường này tỉ lệ tạo mô sẹo và kích thước mô đều cao nhất. Hình 3.1. Hình ảnh mô sẹo phôi đậu xanh nuôi cấy trên môi trường có bổ sung 2,4D A:Mô sẹo phôi đậu xanh trên môi trường có bổ sung 10mg/l của giống đậu xanh VN93-1 B: Mô sẹo phôi đậu xanh trên môi trường có bổ sung 11mg/l của giống đậu xanh ĐX06 3.1.2.2. Ảnh hƣởng của BAP đến khả năng tái sinh cây từ mô sẹo phôi đậu xanh BAP (6 - Benzyl amino purine) là chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin. BAP ảnh hưởng rõ rệt và rất đặc trưng lên sự phân hoá cơ quan của thực vật, đặc biệt là sự phân hoá chồi. BAP là chất có hiệu quả và sử dụng rộng rãi cho cảm ứng chồi trong cây họ đậu bao gồm cả đậu xanh (Gulati, Jaiwal, 1994) [20]. Mô sẹo thu được của các giống đậu xanh được chia thành những khối mô nhỏ có kích thước khoảng 3x3 mm, cấy lên môi trường MS cơ bản có chứa BAP với nồng độ khác nhau (2mg/l; 3mg/l; 4mg/l). Mỗi công thức được tiến hành trên 30 mô sẹo, lặp lại 3 lần. Sau đó theo dõi khả năng tái sinh cây của mô sẹo sau 10 và 15 ngày cấy chuyển. Kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của nồng độ BAP tới khả năng tái sinh cây từ mô sẹo phôi đậu xanh được thể hiện ở bảng 3.4. A B Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tái sinh cây từ mô sẹo phôi đậu xanh (%) Công thức Nồng độ BAP (mg/) VN 93-1 VN 99-3 VC 1973A ĐX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A Sau 10 ngày 1 2 60,2 2,5 61,03,5 66,0 2,5 63 4,0 60,01,5 63,0 5,0 65,0 1,5 60,0 4,1 2 3 98,6 1,2 88,02,1 77,3 1,1 87,0 2,4 77,52,5 75,8 1,5 82,7 2,5 86,8 2,5 3 4 63,31,5 64,02,0 62,0 3,5 63,0 1,5 61,5 1,5 60,5 4,5 61,5 4,0 63,1 2,5 Sau 15 ngày 1 2 65,2 1,5 66,03,0 67 2,1 63,53,5 62,0 1,0 66,0 1,0 67 1,8 66,0 3,8 2 3 99,0 1,0 90,01,9 78,0 1,2 88,0 1,8 78,5 1,5 77,0 1,5 84,7 2,5 87,0 2,5 3 4 65,52,5 66,02,8 63,0 2,5 64,0 1,5 65,0 1,5 63,0 2,5 63,5 3,0 64,1 1,5 Bảng 3.4 cho thấy, dưới ảnh hưởng của BAP thì tỉ lệ tái sinh cây của cả 8 giống đậu xanh khá cao sau 10 ngày, trong đó tỉ lệ tái sinh cây thấp nhất trên môi trường có nồng độ BAP 2 mg/l (60% - 66%) và cao nhất khi nồng độ BAP là 3 mg/l (77,3% - 98,6%). Bổ sung nồng độ BAP cao hơn (4mg/l) không làm tăng tỷ lệ tái sinh ở cây đậu xanh mà còn giảm tỷ lệ tái sinh (60,5% - 64,0%). Sau 15 ngày tỉ lệ tái sinh cây tăng lên không đáng kể. Các giống đậu xanh khác nhau tỷ lệ tái sinh cũng khác nhau. Tỷ lệ tái sinh cao nhất là giống VN93-1 (98,6% sau 10 ngày, 100% sau 15 ngày), giống VC6148 tỷ lệ tái sinh thấp nhất (75,8% sau 10 ngày, 77% sau 15 ngày). Sự Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 khác nhau này cho thấy cùng điều kiện môi trường nuôi cấy các giống khác nhau (kiểu di truyền khác nhau) khả năng tái sinh cũng khác nhau. Khả năng tái sinh và số chồi/mô sẹo được dùng để đánh giá ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả tái sinh của các giống đậu xanh nghiên cứu. Kết quả thí nghiệm tạo chồi được thể hiện ở bảng 3.5. Bảng 3.5. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo chồi ở đậu xanh Công thức Nồng độ BAP (mg/l) Số chồi / một mô sẹo VN 93-1 VN99-3 VC 1973A ĐX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A 1 2 1,230,31 1,660,63 1,660,32 1,66  0,63 1,660,63 1,66 0,32 1,66 0,32 1,660,63 2 3 2,330,39 2,560,39 2,700,27 2,660,329 2,660,63 2,75 0,25 2,55 0,25 2.700,32 3 4 1,670,29 2,200,35 2,660,32 2,400,32 2,350,15 2,66 0,44 2,50 0,14 2,430,20 Sau 10 ngày tái sinh, số chồi/mô cao nhất đạt 2,75 chồi trên môi trường có bổ sung 3mg/l BAP. Môi trường bổ sung nồng độ BAP 2mg/l và 4 mg/l đều cho tỷ lệ tạo chồi thấp hơn. Kết quả cho thấy trong thí nghiệm của chúng tôi tỷ lệ tái sinh và số lượng chồi nhiều hơn so với báo cáo của Mai Trường và cs (2001) [15]. Từ kết quả nghiên cứu trên chúng tôi cho rằng nồng độ BAP 3mg/l là tốt nhất cho sự tái sinh của 8 giống đậu xanh nghiên cứu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 Hình 3.2. Hình ảnh tái sinh đậu xanh trên môi trường bổ sung3mg/l BAP 3.1.2.3. Ảnh hƣởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi của đậu xanh GA3 (axit Gibberelic) là chất kích thích thuộc nhóm Gibberelin, nó tác động làm cho tế bào dãn ra và phân chia, làm tăng chiều cao của cây. Khi chồi đạt chiều cao 2 – 2,5 cm được cấy chuyển sang môi trường kéo dài chồi có bổ sung GA3 với nồng độ : 0,5mg/l; 1mg/l;1,5mg/l; 2mg/l. Kết quả cho thấy, sau 10 ngày cấy chuyển sang môi trường kéo dài chồi có bổ sung GA3 với nồng độ khác nhau đều làm cho chồi của đậu xanh dài ra. Nhưng trong 3 công thức nồng độ trên thì công thức môi trường bổ sung GA3 với nồng độ 1,5mg/l làm cho chồi đậu xanh được kéo dài và mập nhất, còn nồng độ GA3 0,5 mg/l và 1mg/l thì chồi kéo dài chậm hơn. Nồng độ GA3 2mg/l chồi kéo dài nhanh nhất nhưng cây yếu và sau một thời gian thì bị héo ngọn. Hiện nay chưa thấy nghiên cứu nào nói về môi trường kéo dài chồi ở đậu xanh có sử dụng GA3, do vậy, từ kết quả thu được ở trên chúng tôi cho rằng nồng độ GA3 1,5 mg/l là tốt nhất cho kéo dài chồi ở đậu xanh. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 Hình 3.3. Hình ảnh kéo dài chồi đậu xanh trên môi trường bổ sung GA3 3.1.2.4. Ảnh hƣởng của α-NAA đến khả năng ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh α - NAA là chất kích thích sinh trưởng thực vật thuộc nhóm auxin, có tác dụng mạnh đến quá trình hình thành và phát triển rễ thực vật. Để tạo rễ cây tái sinh chuẩn bị cho khâu tiếp theo là đưa ra ngoài đồng ruộng, chúng tôi đã nghiên cứu môi trường ra rễ cây đậu xanh nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản bổ sung α-NAA với các nồng độ khác nhau. Theo dõi khả năng tạo rễ của các cây tái sinh sau 3 tuần và 5 tuần cấy chuyển, chúng tôi thu được kết quả ở bảng 3.6. Bảng 3.6 cho thấy, bổ sung α-NAA với các nồng độ từ 0,2 mg/l đến 0,4 mg/l đều giúp cho các chồi tạo rễ với tỉ lệ cao. Song nồng độ α-NAA cao thì tỉ lệ tạo rễ và chiều dài rễ phát triển càng kém đi. Môi trường có nồng độ α - NAA là 0,3 mg/l là môi trường thích hợp nhất cho sự ra rễ của đậu xanh, ở môi trường này tỉ lệ tạo ra rễ cao nhất (đạt 100%) và chiều dài rễ là cao nhất. Từ kết quả thu được cho thấy ngoài việc sử dụng BAP để tạo rễ ở đậu xanh (Mai Trường và cs, 2001) [16] và sử dụng IAA kết hợp với α-NAA (Ignacimuthu và cs,1999) [31], chúng tôi chỉ sử dụng α-NAA bổ sung vào môi trường khả năng tạo rễ với tỷ lệ cũng cao (100%). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 Bảng 3.6. Ảnh hưởng củ α-NAA tới khả năng ra rễ của cây tái sinh từ mô sẹo phôi đậu xanh (tỷ lệ ra rễ của đậu xanh = số chồi ra rễ/ tổng sô chồi cấy chuyển (%)) Công thức Nồng độ α-NAA VN 93-1 VC 99-3 VC 1973A ĐX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC2768A Sau 3 tuần 1 0,2 75,674,5 71,03,0 68,74,3 68,74,3 60,54,5 63,04,0 66,53,5 65,0 2,5 2 0,3 98,61,4 97,0 1,1 97,0 1,4 97,0 1,4 97,52,5 97,51,5 94,72,5 96,8 2,0 3 0,4 72,3 2,7 64,0 4,0 64,0 2,5 64,0 2,5 61,01,5 60,52,5 61,54,5 63,1 5,0 Sau 5 tuần 1 0,2 85,5 1,5 76,03,0 68,74,3 73,53,5 68,01,0 69,01,0 70,01,5 76,0 3,8 2 0,3 99,0 1,0 98,0 1,9 97,0 1,4 98,0 1,8 98,51,5 98,01,5 94,72,5 97,0 2,5 3 0,4 65,5  2,5 66,0 2,0 64,0 2,5 64,0 1,5 65,01,5 63,02,5 63,53,0 64,5 1,5 Hình 3.4. Hình ảnh cây đậu xanh ra rễ trên môi trường bổ sung 0,3mg/l α-NAA Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 3.1.3. Nhận xét về môi trƣờng tái sinh cấy cây đậu xanh từ mô sẹo (1) Môi trường thích hợp nhất cho tạo mô sẹo của phôi đậu xanh là môi trường có bổ sung 10 mg/l 2,4D đối với các giống VN93-1; VN99-3; VC1973A; VC3902A; VC6148; VC6372; VC2768A. Còn giống đậu xanh ĐX06 thích hợp với môi trường có nồng độlà 11mg/l 2,4D. (2) Các mô sẹo có nguồn gốc từ phôi đậu xanh đều có khả năng tái sinh cây cao, khả năng sinh trưởng của chồi mạnh. Tỷ lệ tái sinh, số chồi trung bình và kích thước chồi cao nhất trên môi trường có bổ sung BAP với nồng độ 3mg/l. (3) Môi trường thích hợp cho tạo cây hoàn chỉnh là môi trường có bổ sung 0,3 mg/l α -NAA, tại môi trường này tỷ lệ tạo rễ, số rễ/cây và kích thước rễ là cao nhất. 3.2. ĐỘ MẤT NƢỚC VÀ KHẢ NĂNG CHỊU MẤT NƢỚC CỦA MÔ SẸO PHÔI CÁC GIỐNG ĐẬU XANH 3.2.1. Mức độ mất nƣớc của mô sẹo phôi đậu xanh dƣới tác động của thổi khô Để chọn ra các dòng tế bào có khả năng chịu mất nước, một số tác giả đã tiến hành cho các tế bào mô sẹo bị mất nước lý học bằng luồng khí vô trùng của bàn cấy. Đối với mô sẹo đậu xanh, trong thí nghiệm này chúng tôi đã xử lý mất nước lý học bằng luồng khí vô trùng ở các ngưỡng thời gian là 0, 3, 5, 7, 9, 11 giờ liên tục, lượng nước trong mô giảm dần tới mức không có thể bay hơi được nữa. Kết quả xác định khả năng chịu mất nước của mô sẹo dưới tác động của thổi khô đối với các giống VN93-1; VN99-1; VC1973A; ĐX06; VC3902A; VC6148; VC6372; VC2768A ở các ngưỡng thời gian là 0, 3, 5, 7, 9,11 giờ liên tục được thể hiện ở bảng 9 và hình 3.6. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 Bảng 3.7.Độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau khi sử lý bằng thổi khô (% khối lượng tươi) Thời gian thổi khô (giờ) VN 93- 1 VN 99-3 VC 1973A ĐX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A 0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 3 48,84 50,00 70,60 62,15 50,28 64,18 60,22 57,29 5 65,22 65,86 79,05 73,92 69,86 73,92 72,28 69,26 7 85,75 82,38 81,44 82,53 85,38 82,53 76,29 84,26 9 87,79 89,67 83,19 85,99 86,67 85,99 81,68 85,65 11 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 0 3 5 7 9 11 Thêi gian thæi kh« (giê) Tû lÖ m Êt n• íc (% ) 0 2 40 6 80 100 120 VN 93- 1 VN 99-3 VC 1973A DX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A Hình.3.5. Độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau xử lý bằng thổi khô Độ mất nước của mô tăng theo thời gian thổi khô ở tất cả các giống. Sau 3 giờ đến 5 giờ thổi khô, mức độ mất nước giống VC1973A là cao nhất (70,60 - 79,05% khối lượng tươi), sau đó là giống VC6148 (64,18 -73,92 % khối lượng tươi, giống VN93- 1 có mức độ mất nước thấp nhất (48,84% - 65,22% khối lượng tươi). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 Ở các ngưỡng thổi khô 7 giờ, 9 giờ, 11 giờ, độ mất nước của mô giảm dần. Nhìn chung, tốc độ mất nước giữa các giống không có sự sai khác đáng kể. Kết quả của chúng tôi phù hợp với nhận xét của các tác giả khi chọn dòng tế bào chịu thổi khô ở lúa, ở lạc [14], [7]. 3.2.2. Khả năng chịu mất nƣớc của mô sẹo phôi đậu xanh sau khi xử lý bằng thổi khô Tỉ lệ sống sót của mô sẹo phôi đậu xanh được đánh giá sau khi nuôi phục hồi 1 tuần. Quan sát khả năng phục hồi mô sẹo phôi đậu xanh sau khi xử lí bằng thổi khô được cấy lên môi trường tái sinh chúng tôi thấy, sau 2-3 ngày những mô sẹo sống sót đã hút nước và sinh trưởng bình thường. Tỉ lệ sống sót của mô sẹo tỉ lệ nghịch với thời gian xử lí (bảng 3.8 và hình 3.7). Bảng 3.8. Tỷ lệ sống sót (%) của mô sẹo phôi đậu xanh sau thổi khô 1 tuần nuôi phục hồi Thời gian thổi khô (giờ) Tỷ lệ sống sót của mô sẹo phôi đậu xanh sau thổi khô 1 tuần VN 93- 1 VN 99-3 VC 1973A ĐX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A 0 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 3 100,00 96,29 85,00 95,00 96,00 92,00 92,40 95,38 5 100,00 88,00 75.00 91,00 92,00 68,00 85,83 90,20 7 96,43 80,00 42,86 64,38 65,38 44,82 76,43 72,18 9 88,00 44,00 23,80 50,00 51,00 34,61 66,35 55,78 11 00,00 00,00 00,00 00,00 00,00 00,00 00,00 00,00 Sau 3, 5, 7, 9, 11 giờ thổi khô, tỉ lệ mô sẹo phôi đậu xanh sống sót của giống VN93- 1 là lớn nhất và cuối cùng là giống VC1973A có tỉ lệ mô sẹo sống sót thấp nhất, sau 9 giờ thổi khô chỉ còn 23,80 %. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 Như vậy cùng một mức độ mất nước như nhau nhưng khả năng chịu đựng của mô sẹo có sự khác nhau rõ rệt giữa các giống nghiên cứu. 0 3 5 7 9 11 Thêi gian thæi kh« (giê) Tû lÖ sè ng sã t ( % ) 0 20 40 60 80 100 120 VN 93- 1 VN 99-3 VC 1973A ĐX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A Hình 3.6. Tỷ lệ sống sót (%) của mô sẹo phôi đậu xanh sau thổi khô và nuôi phục hồi trên môi trường tái sinh * Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo phôi đậu xanh sống sót sau khi xử lý bằng thổi khô Kết quả nghiên cứu khả năng tái sinh cây của 8 giống đậu xanh nghiên cứu sau 3 tuần nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.9 và hình 3.8. Kết quả ở bảng 3.9 và hình 3.8 cho thấy, tất cả các giống đậu xanh nghiên cứu đều có khả năng tái sinh sau 3 tuần nuôi cấy. Ở ngưỡng xử lí bằng thổi khô 3 giờ, tất cả 8 giống đậu xanh đều có khả năng tái sinh cao và thời gian xử lí càng cao thì tỉ lệ tái sinh càng giảm. Giống có tỷ lệ tái sinh cao nhất là giống VN93 -1, giống VC1973A có tỷ lệ tái sinh thấp nhất ở các ngưỡng thời gian xử lý, sau 9 giờ xử lí thổi khô tỉ lệ tái sinh chỉ còn 10,5%. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 Bảng 3.9. Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo phôi đậu xanh sống sót sau khi xử lý bằng thổi khô Thời gian thổi khô (giờ) Tỷ lệ tái sinh của mô sẹo phôi đậu xanh sau khi thổi khô (%) VN 93- 1 VN 99-3 VC1973A ĐX 06 VC3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A 0 98,6 90,0 78,3 88,0 78,5 77,8 84,7 87,8 3 96,4 88,1 85,5 87,8 89,8 95,0 85,6 89,5 5 87,2 84,7 66,9 84,4 82,0 83,0 67,7 70,6 7 80,6 79,6 50,1 79,0 74,7 76,0 52,2 50,7 9 20,0 15,7 10,5 17,3 20,2 16,3 10,7 12,8 0 3 5 7 9 V N 9 3- 1 V C 19 73 A V C 39 02 A V C 63 720 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Thêi gian thæi kh« (giê) Tû lÖ t¸i sinh %) VN 93- 1 VN 99-3 VC 1973A DX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A Hình 3.7. Khả năng tái sinh cây của các mô sẹo phôi đậu xanh sống sót sau khi xử lý bằng thổi khô Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 Như vậy kết quả cho thấy, hầu hết mô sẹo phôi đậu xanh của các giống qua xử lý mất nước 3h khi sống sót thường có khả năng tái sinh cây cao hơn so với đối chứng không bị xử lý (0h). Điều này có thể do xử lí mất nước, khi đặt lên môi trường tái sinh, các tế bào hút nước mạnh hơn, nên sức sống, sức sinh trưởng và khả năng tái sinh cao hơn. Theo Lê Trần Bình và cs (1995), nguyên nhân là do quá trình xử lý đã giết chết những tế bào mẫn cảm, chọn ra những tế bào có sức sống và khả năng tái sinh cao. Hiện tượng này cũng được phát hiện khi xử lý mất nước ở một số đối tượng cây khác như ở thuốc lá và mảnh lá cây Craterosticgma plantagineum, lạc [9], [7]. Kết quả các thí nghiệm đã thu được 289 dòng mô chịu mất nước của 8 giống đậuxanh và 715 dòng cây xanh. Hình 3.8. Tái sinh mô sẹo sau khi xử lý thổi khô 3.2.3. Nhận xét về khả năng chịu mất nƣớc bằng xử lý thổi khô của các giống đậu xanh nghiên cứu (1) Cả 8 giống đậu xanh nghiên cứu đều có khả năng chịu hạn ở mức độ mô sẹo và có biểu hiện khác nhau giữa các giống. (2) Những mô sẹo sống sót đều có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 (3) Kết quả thu được 289 dòng mô chịu mất nước và 715 dòng cây xanh của 8 giống đậu xanh nghiên cứu. Đây là nguồn vật liệu phong phú cho chọn dòng chịu hạn ở cây đậu xanh tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước. 3.3. KẾT QUẢ TÁI SINH CÂY ĐẬU XANH TỪ MẮT LÁ MẦM 3.3.1. Môi trƣờng nảy mầm của hạt Hạt đậu xanh của 8 giống được khử trùng (điều kiện khử trùng giống như phần khử trùng hạt của mục 2.2.1) cấy trên môi trường nảy mầm, ở giai đoạn này hạt chủ yếu sử dụng chất dinh dưỡng có sẵn trong hạt nên môi trường chưa cần cung cấp chất kích thích sinh trưởng. Ở cả 8 giống đậu xanh, sau một ngày nuôi cấy hạt bắt đầu nứt vỏ, 3 ngày hạt nảy mầm hoàn chỉnh. Hình 3.9. Hạt đậu xanh nảy mầm sau 3 ngày (A, B), Hạt đậu xanh được tách ra để tạo đa chồi (C, D) 3.3.2. Môi trƣờng tạo đa chồi Môi trường tạo đa chồi ở đa số các loài thực vật cần sử dụng các chất điều hoà sinh trưởng như IAA, BAP, IBA,…Trong quá trình thí nghiệm A B C D Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 chúng tôi đã sử dụng BAP để tạo đa chồi ở đậu xanh. Việc sử dụng nồng độ các chất điều hoà sinh trưởng thích hợp có ý nghĩa quan trọng đối với từng giai đoạn phát triển của cây, đây là nguyên tắc cơ bản trong nuôi cấy mô tế bào. Sau 3 ngày, khi hạt nảy mầm dùng dao mổ tách hạt thành hai mảnh, dùng kim nhọn gây tổn thương ở mắt lá mầm, cấy các mảnh đó trong môi trường MS cơ bản có bổ sung BAP với nồng độ khác nhau (1,5mg/l; 2mg/l; 2,5mg/l; 3mg/l; 3,5mg/l). Mỗi bình cấy 10 – 15 mảnh lá mầm. Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30 lá mầm, lặp lại 3 lần. Khả năng tạo chồi và số chồi / mảnh lá mầm được dùng để đánh giá khả năng thích ứng của giống và ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng trong hệ thống nuôi cấy in vitro, kết quả phân tích được thể hiện ở bảng 3.10. Bảng 3.10. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo đa chồi ở đậu xanh Công thức Nồng độ BAP Số chồi / một lá mầm VN 93-1 VN99-3 VC 1973A ĐX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A 1 1,5 1,33 0,329 1,660,639 1,660,329 1,660,639 1,660,639 1,660,329 1,660,329 1,66 0639 2 2 1,660,639 2,330,329 2,000,577 2,330,329 1,660,329 2,330,086 2,000,57 2,300,639 3 2,5 1,670,329 2,300,375 2,660,329 2,430,352 2,350,144 2,660,144 2,500,144 2,330,202 4 3 2,330,329 2,660,329 3,000,577 2,660,329 2,660,639 3,350,259 3,150,329 3,000,577 5 3,5 1,330,329 1,670,329 1,330,329 1,570,190 1,660,329 2,330,329 1,480,069 1,330,369 Từ bảng 3.10 cho thấy sự khác biệt số lượng chồi từ mắt lá mầm môi trường tạo đa chồi bổ sung BAP với nồng độ 3 mg/l cho số chồi đạt tối đa trên một lá mầm dao động từ 2,33  0,329 đến 3,35  0,259 gặp ở tất cả 8 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 giống đậu xanh: VN93-1; VN99-1; VC1973A; VC3902A; VC6148; VC6372; VC2768A; ĐX06. Số lượng chồi không chỉ phụ thuộc vào nồng độ BAP mà trong quá trình làm thí nghiệm mà chúng tôi còn thấy rằng, nếu gây tổn thương đúng vị trí, không quá sâu hay quá nông sẽ tạo được số chồi nhiều nhất. Cũng sử dụng lá mầm để tái sinh và môi trường tái sinh có bổ sung BAP nhưng nhóm nghiên cứu của Mai Trường và cs chỉ thu được số chồi tối đa là 3 chồi/lá mầm. Như vậy có thể kết luận rằng gây tổn thương mắt lá mầm đúng vị trí và môi trường tạo đa chồi bổ sung 3mg/l BAP tạo được số chồi / lá mầm là cao nhất. Hình 3.10. Hình ảnh tạo đa chồi từ mắt lá mầm 3.3.3. Môi trƣờng kéo dài chồi Sau khoảng 10 ngày khi chồi được hình thành, tách riêng từng chồi và cấy chuyển sang môi trường kéo dài chồi có bổ sung 1,5 mg/l GA3 và các chất dinh dưỡng khác nhau để cho chồi phát triển thuận lợi. Sau 10 ngày cấy trên môi trường kéo dài chồi, chồi đậu xanh đạt kích thước 4 - 5 cm được chuyển sang môi trường ra rễ. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 Hình 3.11. Hình ảnh kéo dài chồi đậu xanh trên môi trường bổ sung GA3 3.3.4. Môi trƣờng ra rễ Hệ rễ được hình thành khi chuyển các chồi sang môi trường ra rễ có bổ sung 0,3mg/l α – NAA, khoảng 30 ngày, khi cây hoàn chỉnh với bộ rễ phát triển tốt đạt chiều cao 7 – 8 cm, cây được chuyển ra ngoài nuôi cấy trong các khay. Hình 3.12. Hình ảnh cây đậu xanh ra rễ trên môi trường bổ sung 0,3mg/l α-NAA 3.3.5. Ra cây và chế độ chăm sóc Khi cây con trong ống nghiệm có kích thước 5 - 7 cm với hệ rễ phát triển được đưa ra ngoài nuôi cấy trong khay (điều kiện nuôi cấy như phương pháp ra cây mục 2.2.1). Sau khoảng 30 ngày cây đậu xanh ra hoa và kết quả. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 Hình 3.13. Cây đậu xanh tái sinh được trồng trong khay (A), Cây đậu xanh tái sinh được trồng trong chậu ra hoa kết quả (B, C, D) 3.3.6. Nhận xét về môi trƣờng tái sinh từ mắt lá mầm (1). Môi trường bổ sung 3mg/l BAP và gây tổn thương đúng vị trí trí tạo được số lượng chồi / lá mầm là cao nhất. (2) Môi trường bổ sung 1,5 mg/l GA3 sau 10 ngày nuôi cấy chồi tạo được chồi đạt kích thước cấy chuyển ra rễ tốt nhất. (3) Cả 8 giống đậu xanh đều có khả năng tạo đa chồi và tái sinh thành cây hoàn chỉnh, cây tái sinh đều có khả năng ra hoa kết quả khi trồng trong điều kiện trồng và chăm sóc trong khay. A B C D Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận 1.1. Thăm dò môi trường nuôi cấy mô sẹo đậu xanh cho thấy: môi trường có bổ sung 11mg/l 2,4D là môi trường thích hợp cho tạo mô sẹo giống đậu xanh ĐX06. Môi trường có bổ sung 10mg/l 2,4D thích hợp cho tạo mô sẹo 7 giống còn lại. Nồng độ 3mg/l BAP cho tỷ lệ tái sinh, số chồi trung bình, kích thước trung bình chồi là cao nhất và môi trường có bổ sung 0,3mg/l α-NAA là thích hợp cho tạo cây hoàn chỉnh. 1.3. Đánh giá khả năng chịu mất nước của các giống đậu xanh ở mức độ mô sẹo trên cơ sở xác định độ mất nước, khả năng chịu mất nước, khả năng sống sót và khả năng tái sinh cây đã cho thấy cả 8 giống đậu xanh đều có khả năng chịu mất nước ở mức độ mô sẹo. Đã chọn được 289 dòng mô chịu mất nước và 715 dòng cây xanh tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước. 1.3. Thăm dò môi trường tái sinh cây đậu xanh từ mắt lá mầmcho thấy, môi trường có bổ sung 3mg/l BAP và gây tổn thương đúng vị trí sẽ tạo được số chồi/ lá mầm cao. Môi trường có bổ sung 1,5 mg/l GA3 là môi trường tốt nhất để kéo dài chồi; môi trường bổ sung 0,3 mg/l α – NAA là môi trường thích hợp cho tạo rễ chồi đậu xanh. 1.4. Cả 8 giống đậu xanh đều có khả năng tạo đa chồi từ mắt lá mầm và tái sinh thành cây hoàn chỉnh, có khả năng ra hoa kết quả khi trồng ra chậu. 2. Đề nghị 2.1. Tiếp tục sử dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro vào việc chọn dòng chịu hạn từ các giống đậu xanh nghiên cứu trên. 2.2. Cần có những nghiên cứu chuyển gen thích hợp để cải tiến các giống đậu xanh có chất lượng cao và khảnăng chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trường tốt. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Nguyễn Thị Luyện, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Lò Mai Thu, Chu Hoàng Mậu (2009), Hoàn thiện hệ thống tái sinh in vitro ở cây đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) phục vụ cho chuyển gen”. Tạp chí Khoa học&Công nghệ-Đại học Thái Nguyên, 54(6): 123-128. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt 1. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng, Giáo trình cao học nông nghiệp, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội (188 trang). 2. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa, Nxb Đại học Quốc Gia, Hà Nội. 3. Lê Trần Bình, Võ Thị Ngọc Diệp, Lê Thị Muội (1995), “Nghiên cứu khả năng chịu lạnh và chịu khô ở mô sẹo lúa của các giống lúa có nguồn gốc sinh thái khác nhau”, Tạp chí sinh học, 17(1), tr. 19 – 55. 4. Bùi Bảo Hoàn (1993), Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào trong bảo quản, nhân giống và chọn dòng chịu lạnh ở khoai lang (Ipomoea batatas L.), Luận văn thạc sĩ sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội. 5. Nguyễn Hữu Hồ và Nguyễn Văn Uyển (2005), Nghiên cứu hai kiểu tái sinh in vitro cây khoai lang Inpomoea Batatas, Những vấn đề cơ bản trong khoa học sự sống ; NXB khoa học và kỹ thuật, 1242 – 1245. 6. Nguyễn Thị Thuý Hường, Trần Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2009), “Phát triển hệ thống tái sinh in vitro ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merill) phục vụ chuyển gen”. Tạp chí Khoa học&Công nghệ-Đại học Thái Nguyên, 52(4): 82-88. 7. Ngô Thị Liêm (2006),Nghiên cứu sự đa dạng di truyền và khả năng chịu hạn của một số giống lạc (Arachis hypogaea L.), Luận văn thạc sĩ sinh học, trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên. 8. Trần Đình Long, Lê Khả Tường (1998), Cây đậu xanh. NXB Nông nghiệp. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 9. Nguyễn Hoàng Lộc (1992), Chọn dòng chịu muối NaCl và chịu mất nước ở thuốc lá (Nicotiana tabacum L.), luận án phó tiến sĩ sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội, 107 trang. 10. Chu Hoàng Mậu (2001), Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để tạo các dòng đậu tương và đậu xanh đột biến đột biến thích hợp cho vùng núi đông bắc Việt Nam. Luận án tiến sĩ Sinh học. Viên Công nghệ Sinh học, Hà Nội. 11. Nguyễn Thị Phương Nam và cộng sự (2007), “Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro cây ngô và ứng dụng trong nghiên cứu chuyển gen tạo protein giàu sắt nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”, Những vấn đề cơ bản trong khoa học sự sống, NXB Khoa học và kỹ thuật, 887 -89. 12. Đinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả năng chịu hạn và chọn dòng chịu hạn ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội. 13. Nguyễn Thị Thanh và Võ Phan MiSa (2007), “Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh in vitro và ứng dụng chuyển gen ở hồ tiêu; Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống”, NXB Khoa học và kỹ thuật, 820 – 824. 14. Nguyễn Thị Tâm (2004), Nghiên cứu khả năng chịu nóng và chọn dòng chịu nóng ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật, Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội. 15. Phan Hữu Tôn (2004), Giáo trình Công nghệ sinh học trong chọn tạo giống cây trồng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. 16. Mai Trường, Nguyễn Hữu Hổ, Lê Tấn Đức, Nguyễn Văn Uyển (2001), “Hệ thống tái sinh cây đậu xanh từ cuống tử điệp nuôi cấy in vitro”. Tạp chí sinh học, 23: 33-35. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 17. Nguyễn Hải Tuất, Ngô Kim Khôi (1996), Xử lý thống kê kết quả nghiên cứu thực nghiệm trong nông lâm ng nghiệp trên máy vi tính, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội Tài liệu tiếng anh 18. Abdul B., Frinch R. P., Cocking E. C. (1999), Plant regeneration from protoplast of wild rice (Oryza rufipogon Griff)”, Plant cell Rep, 10, pp. 200 – 203 19. Adkins S. M., Shiraishi T., Kunavuvatchaidach R.,Godwin I. D. (1995), “Somaclonal variation in rice drought – tolerance and other agronomic characters”, Aust J Bot, 4, pp. 201 – 209. 20. Amutha S., Muruganantham M., and Ganapathi A. (2006), “Thidiazuron- induced high-frequency axillary and adventitious shoot regeneration in Vigna radiata (L.) Wilczek”. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant, 42:26–30. 21. Bajai S., Rajam H. (1996), “Spermidine for effcient regeneration”, Rice Bio Quar, 26, pp. 6. 22.Bertin P., Kinet J. M. Bouharmont J. (1995), “Heritable chilling tolerance improvement in rice through somaclonal variation and cell line selection”, Aust J Bot, 44, pp. 91 – 105. 23. Bertin P., Kinet J. M. Bouharmont J. (1997), “ Somaclonal variation and improvement of chilling tolerance in rice: Chance in chilling – induce chlorophyll fluorescence”, Crop Sci, 37, pp. 1727 – 1735. 24. Biwas G. C., Zapata F. J.(1993), “High – frequence plant regeneratin from protoplast of indica rice (Oryza sativa L.) using mantose”, J plant Physiol, 141, pp. 475. 25. Chandler S. F.,Vasil I. K.(1984), “Selection and characteerrizationlof Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 NaCl tolerance cell from embryogenesis cultures of Pennisetum purpureum Schum”, Plant Sci Lett, 37, pp. 157- 164. 26. Collin H. A., Dix P.J. (1990), “Culture systems and selection procedure. In: Plant cell line selection. VCH Verlagsgesellschaft”. 27. Dix P.J (1986), Plant cell culture technology, Yeoman M.M. (eds), Oxford, Blackwel Scientific Publication, pp. 143 – 201. 28. Dix P.J.(1990), Plant cell line selection (Procedures and Applications), VCH Verlagsgllchaft MBH 29. Gulati A. and Jaiwal P.K. (1993). “In vitro selection of salt-resistant Vigna radiata (L.) Wilczek plants by adventitious shoot formation from cultured cotyledon explants”. J. Plant Physiol. 142: 99–10. 30. Gulati A, Jaiwal PK (1994), “Plant regeneration from cotyledonary node explants of mungbean (Vigna radiata (L.) Wilczek)”. Plant Cell Rep 13:523–527. 31. Ignacimuthu S. & Franklin G. (1999), “Regeneration of plantlets from cotyledon and embryonal axis explants of Vigna mungo L. Hepper”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 55: 75–78. 32. Jayanti Sen & Spra Guha Mukherjee (1998), “In vitro intoduction of multiple shoots and plant regeneration in Vigna, In vitro Cell.Dev. Biol. plant, 34: 276 – 280. 33. K. Ramakrishnan · R. Gnanam · P. Sivakumar A. Manickam, “In vitro somatic embryogenesis from cell suspension cultures of cowpea (Vigna unguiculata (L.) Walp)”, Plant Cell Rep (2005) 24: 449–461. 34. Kaviraj C.P., G. Kiran, R.B. Venugopan, P.B.Kavi Kishor, Srinath Rao (2006), “Somatic embryogenesis and plant regeneration from cotyredorary Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 explants of green gram (Vigna radiata (L.) Wilczek)- A recalcitrant grain legume”. In vitro Cell.Der. Biol. plant. 42: 134 – 138. 35. Mundy J., Chua N. H. (1988), Abcisis and water stress induce the expression of a novel rice gene”, EMBOJ, 8, pp. 2279 – 2286. 36.Muruganantham M., Amutha S.,Selvaraj N., Vengadesan G., Ganapathi A. (2007), “Efficient Agrobacterium- ediated transformation of Vigna mungo using immature cotyledonary-node explants and phosphinothricin as the selection agent”. In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant, 43:550–557. 37. Norbor M. W. (1990), Environmental stress resistance. In: Plant Cell Line Selection, Weihein, New York, Basel, Cambridge, VCH, pp. 167 – 186. 38. Prem R. anand, Ganapathi A., Ramesh V. Anbazhagan, Gengadesan G., and Selvaraj N (2001), “High frequency plant regeneration via somatic embryogenesis in cell suspension cultures of cowpea, vigna unguiculata (L.) walp”. In Vitro Cell. Dev. Biol-Plant, 36:475-480. 39. Poddar K., Vishnoi R. K., Kothari S. L. (1998), “Plant regeneration from embryogenesis callus”, Rice Bio quar, 35, pp. 9. 40. Raghava. R. N. V., Nabors M. V., (1985), “Plant negeneration from tissue cultures of Pokali rice is promoted by optizing callus to medium volume ratio and by a medium conditioning factor produced by embryogeneic callus”, Cell Tiss Org Cult, 4, pp. 241 – 248. 41. Rudrabhatla Sairam, Siva Chennareddy, Madasamy Parani, Shulu Zhang, Diaa Al-abed, Wissam Abou-Alaiw, and Stephen Goldman (2005), “Obpc symposium: Maize 2004 & beyond – plant regeneration, gene discovery, and genetic engineering of plants for crop improvement”. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant, 41:411–423. 42. Renato A. Avenido & Kazumi Hattori (1999), “Differences in shoot Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 regeneration response from cotyledonary node explants in Asiatic Vigna species support genomic grouping within subgenus Ceratotropis (Piper) Verdc.” Plant Cell, Tissue and Organ Culture 58: 99–110. 43. Renato A Avenido, Jo Motoda and Kazumi Hattori (2001), “Direct shoot regeneration from cotyledonary nodes as a marker for genomic groupings within the Asiatic Vigna (subgenus Ceratotropis {Piper} Verdc.) species”. Plant Growth Regulation, 35: 59–67. 44. Sita L. Mahala, T. Leela, B. Kiran Kumar, B. Naresh, Prathibha Devi (2006), “In vitro plant regeneration from the petioles of primary leaves of mungbean (Vigna radiata L.)”. Plant Biotechnology, 23: 409–411. 45. Sonia, Raman Saini, Rana P. Singh, Pawan K. Jaiwal (2007), “Agrobacterium tumefaciens mediated transfer of Phaseolusvulgaris - amylase inhibitor-1 gene into mungbean (Vigna radiata (L.)Wilczek) using bar as selectable marker”. Plant Cell Rep 26:187–198 1.