Luận văn Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật elisa và bước đầu nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kỹ thuật pcr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. NGUYỄN ANH KHOA PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Cơng nghệ sinh học Tp. HCM, 8/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNHCẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Cơng nghệ sinh học Tp. HCM, 8/2006 Sinh viên thực hiện NGUYỄN ANH KHOA Niên khĩa: 2002 - 2006 Giáo viên hƣớng dẫn PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY SURVEYING SUGARCANE MOSAIC DISEASE BY ELISA AND THE FIRST STEP TO RESEARCH AND DETECT RATOON STUNTING DISEASE BY PCR Graduation thesis Major: Biotechnology HCMC, 9/2006 Professor BUI CACH TUYEN Student NGUYEN ANH KHOA Term: 2002- 2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khĩa: 2002 – 2006 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ANH KHOA Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9 / 2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9 / 2006 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ANH KHOA Giáo viên hƣớng dẫn: PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN iii LỜI CẢM ƠN  Tơi xin chân thành bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến:  PGS. TS. Bùi Cách Tuyến đã tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn tất khĩa luận tốt nghiệp này.  TS. Bùi Minh Trí đã chỉ bảo cho tơi nhiều kiến thức trong thời gian thực hiện đề tài.  ThS. Nguyễn Văn Cƣờng cùng các anh chị trong Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hĩa Sinh – trƣờng Đại học Nơng Lâm TP. Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ tơi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp.  ThS. Hà Đình Tuấn, Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng Bến Cát đã giúp đỡ tơi trong quá trình thu mẫu tại đây.  Xin chân thành cảm ơn đến quí Thầy Cơ bộ mơn Cơng Nghệ Sinh Học đã nhiệt tình chỉ dạy cũng nhƣ đĩng gĩp ý kiến chân thành cho tơi trong suốt thời gian làm khĩa luận này.  Xin gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp Cơng Nghệ Sinh Học 28 đã luơn ủng hộ, động viên và giúp đỡ tơi hồn thành khĩa luận tốt nghiệp này. Sinh viên thực hiện Nguyễn Anh Khoa iv TĨM TẮT NGUYỄN ANH KHOA, Đại học Nơng Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8 năm 2006. “PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KĨ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KĨ THUẬT PCR” Giáo viên hƣớng dẫn: PGS. TS. Bùi Cách Tuyến. Đề tài khảo sát sự nhiễm bệnh khảm lá mía (Sugarcane Mosaic) và cằn mía gốc (Ratoon stunting disease) đƣợc thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng (TTNCMĐ) tỉnh Bình Dƣơng và nơng trƣờng Thọ Vực tỉnh Đồng Nai. Đây là nghiên cứu nhằm gĩp phần thống kê tình hình nhiễm bệnh khảm lá mía và cằn mía gốc trên một số giống mía sản xuất và nhập nội tại 2 vùng trồng mía này. Đặc biệt đề tài là bƣớc đi đầu tiên trong nghiên cứu, phát hiện bệnh cằn mía gốc do vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) gây ra trên cây mía ở nƣớc ta bằng kỹ thuật PCR. Nghiên cứu gĩp phần quan trọng trong cơng tác tuyển chọn giống sạch bệnh cũng nhƣ cơng tác phịng chống và kiểm sốt dịch bệnh trên cây cĩ mía hiệu quả hơn. Kết quả đạt đƣợc - Các giống mía sản xuất và nhập nội đƣợc khảo sát đều khơng bị nhiễm bệnh khảm lá mía thơng qua kết quả chẩn đốn bằng ELISA. - Phát hiện đƣợc bệnh cằn mía gốc bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi và nhuộm mơ mẫu. Kết quả: tỉ lệ mơ khoẻ mạnh trên các giống mía khảo sát tại TTNCMĐ là 70,5%, tại nơng trƣờng Thọ vực là 75,18%. - Xác định sơ bộ các nhân tố ảnh hƣởng đến quá trình nuơi cấy vi khuẩn Lxx. - Đề xuất phƣơng pháp nuơi cấy vi khuẩn Lxx và hồn thiện quy trình phát hiện vi khuẩn Lxx bằng kỹ thuật PCR. v SUMMARY This is Nguyen Anh Khoa studying at Nong Lam University and finishing the thesis on 9 th 2006. The thesis entiled “Surveying sugarcane mosaic disease by ELISA and the first step to research and detect ratoon stunting disease by PCR ”. Surveying sugarcane mosaic disease and ratoon stunting disease (RSD) on some sugarcane species produced and imported at sugarcane researching center at Binh Duong and at Tho Vuc farm at Dong Nai. That is basic to contribute statistics to situation of sugarcane mosaic disease at the areas. Specially, the thesis is the first step to research and detect RSD caused by bacteria Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) on sugarcane in our country. The researching is an important contribution to select pathogenic free species, to prevent and to control epidemic diseases on sugarcane effectively. The results of this research are as follows: - DAS-ELISA result data show that all investigatived sugarcane species produced and imported at sugarcane researching center at Binh Duong, is not found SCMV. - Detecting Lxx by microscopy and STM stainning. Results: 70,5% of phloem vessel do not infected by Lxx on sugarcane species at Binh Duong provine and 75,18% phloem of vessel do not infected by Lxx on sugarcane at Tho Vuc farm. - Preliminary defining factors effecting the Lxx bacteria culturing process. - Proposing the method to culture Lxx bacteria and to perfect Lxx bacteria detecting process by PCR. vi MỤC LỤC Nội dung Trang LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ iii TĨM TẮT .......................................................................................................................iv MỤC LỤC ......................................................................................................................vi DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ ........................................................................ix DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ HÌNH CHỤP ................................................................ x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...........................................................................xi Phần 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1 1.1. Cơ sở tiến hành và ý nghĩa của nghiên cứu ...................................................... 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu ......................................................................................... 2 1.3. Giới hạn đề tài ................................................................................................... 2 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................. 3 2.1. Sơ lƣợc về cây mía ............................................................................................ 3 2.1.1. Lịch sử phát hiện ....................................................................................... 3 2.1.2. Phân loại .................................................................................................... 3 2.1.3. Nguồn gốc và phân bố ............................................................................... 3 2.1.4. Nhân giống ................................................................................................ 4 2.1.5. Sản lƣợng ................................................................................................... 4 2.1.6. Chế biến và sử dụng .................................................................................. 5 2.2. Bệnh trên cây mía ............................................................................................. 5 2.3. Bệnh khảm lá mía ............................................................................................. 7 2.3.1. Nguồn gốc và phân bố ............................................................................... 7 2.3.2. Triệu chứng................................................................................................ 7 2.3.3. Tác nhân gây bệnh ..................................................................................... 8 2.3.4. Các chủng virus gây bệnh khảm lá mía..................................................... 9 2.3.5. Qui luật phát sinh phát triển bệnh ............................................................. 9 2.3.6. Tầm quan trọng kinh tế ............................................................................. 9 2.3.7. Phịng trừ ................................................................................................. 10 2.3.8. Các phƣơng pháp xác định bệnh khảm lá mía ........................................ 10 vii 2.3.8.1. Dựa vào trạng thái dấu vết bệnh ...................................................... 10 2.3.8.2. Phƣơng pháp chẩn đốn dùng kính hiển vi ...................................... 10 2.3.8.3. Phƣơng pháp ELISA (Enzym-link immunosorbent assay) .............. 10 2.3.8.4. Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) ........................... 12 2.4. Bệnh cằn mía gốc ............................................................................................ 14 2.4.1. Nguồn gốc và phân bố ............................................................................. 14 2.4.2. Triệu chứng.............................................................................................. 14 2.4.2.1. Triệu chứng bên ngồi ..................................................................... 14 2.4.2.2. Triệu chứng bên trong cây ............................................................... 15 2.4.3. Tác nhân gây bệnh ................................................................................... 16 2.4.4. Quy luật phát sinh phát triển bệnh .......................................................... 16 2.4.5. Tầm quan trọng kinh tế ........................................................................... 17 2.4.6. Kiểm sốt bệnh ........................................................................................ 17 2.4.7. Các phƣơng pháp chẩn đốn bệnh cằn mía gốc trên cây mía ................. 17 2.4.7.1. Phƣơng pháp chẩn đốn trực tiếp bằng kính hiển vi ....................... 17 2.4.7.2. Phƣơng pháp huyết thanh học .......................................................... 17 2.4.7.3. Phƣơng pháp nhuộm STM (dựa vào đáp ứng của kí chủ) ............... 19 2.4.7.4. Phƣơng pháp chẩn đốn dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử ........... 19 2.5. Tình hình nghiên cứu về bệnh khảm lá mía và bệnh cằn mía gốc ................. 19 2.5.1. Trên thế giới ............................................................................................ 19 2.5.2. Trong nƣớc .............................................................................................. 20 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................... 22 3.1. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 22 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................................. 22 3.3. Vật liệu nghiên cứu ......................................................................................... 22 3.3.1. Các giống mía nghiên cứu ....................................................................... 22 3.3.2. Virus gây bệnh......................................................................................... 22 3.3.3. Vi khuẩn gây bệnh ................................................................................... 22 3.3.4. Hĩa chất thí nghiệm ................................................................................ 23 3.3.5. Thiết bị và dụng cụ .................................................................................. 23 3.4. Phƣơng pháp tiến hành ................................................................................... 23 3.4.1. Phƣơng pháp điều tra lấy mẫu ................................................................. 23 viii 3.4.2. Phƣơng pháp phát hiện SCMV bằng kỹ thuật ELISA ............................ 24 3.4.3.1. Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu và bố trí thí nghiệm ............................. 24 3.4.3.2. Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA .......................... 26 3.4.3. Phƣơng pháp nhận dạng bệnh cằn mía gốc trên đồng ruộng .................. 27 3.4.4. Phƣơng pháp phát hiện vi khuẩn Lxx bằng kính hiển vi và bằng phƣơng pháp nhuộm STM .................................................................................... 27 3.4.5. Phƣơng pháp nuơi cấy và nhận dạng khuẩn lạc vi khuẩn Lxx ................ 28 3.4.6. Phƣơng pháp PCR phát hiện vi khuẩn Lxx .............................................. 29 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................ 31 4.1. Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA ......................................... 31 4.2. Nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kỹ thuật PCR ......................... 32 4.2.1. Điều tra sự nhiễm bệnh cằn mía gốc dựa vào triệu chứng. Phát hiện vi khuẩn Lxx bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi và phƣơng pháp nhuộm STM. ............................................................................................ 32 4.2.2. Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuơi cấy vi khuẩn Lxx và nhận dạng khuẩn lạc của nĩ trên mơi trƣờng nuơi cấy ....................... 36 4.2.3. PCR phát hiện vi khuẩn Lxx .................................................................... 37 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 41 5.1. Kết luận .......................................................................................................... 41 5.2. Đề nghị ............................................................................................................ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 43 PHỤ LỤC ................................................................................................................... xii ix DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ BẢNG TRANG Bảng 1.1. Thống kê về nhĩm tác nhân gây bệnh và số lƣợng bệnh. ........................ 6 Bảng 3.1. Thành phần các chất trong phản ứng PCR và chu kỳ nhiệt ..................... 30 Bảng 4.1. Kết quả chẩn đốn bệnh cằn mía gốc bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi ........................................................................ 34 Bảng 4.2. Kết quả chẩn đốn bệnh cằn mía gốc trên các giống sản xuất tại TTNCMĐ và nơng trƣờng Thọ Vực bằng phƣơng pháp nhuộm STM. .. 35 Bảng 4.3. So sánh kết quả chẩn đốn của hai phƣơng pháp: dùng kính hiển vi và nhuộm STM. .......................................................... 36 Sơ đồ 2.1. Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp ..................................... 11 Sơ đồ 2.2. Sơ đồ tổng quát của kỹ thuật RT - PCR ................................................. 13 Sơ đồ 3.1. Sơ đồ điều tra .......................................................................................... 24 Sơ đồ 3.2. Sơ đồ tách chiết mẫu lá cho ELISA ........................................................ 25 Sơ đồ 3.3. Sơ đồ bố trí giếng trên đĩa ELISA .......................................................... 25 x DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Cây mía ..................................................................................................... 3 Hình 2.2. Bệnh hại phổ biến trên cây mía ............................................................... 6 Hình 2.3. Triệu chứng bệnh khảm lá mía ................................................................ 7 Hình 2.4. Sugarcane mosaic virus ............................................................................ 8 Hình 2.5. Cơ chế phản ứng đổi màu trong DAS- ELISA ......................................... 12 Hình 2.6. Lxx gây những vết chuyển màu ở thân mía. ............................................. 15 Hình 2.7. Vi khuẩn Leifsonia xyli subsp xyli dƣới kính hiển vi điện tử (x30.000 lần) (K. E. Damann, 2002). ..................................................... 16 Hình 4.1. Kết quả chẩn đốn SCMV qua quan sát sự đổi màu trên đĩa ELISA. ..... 32 Hình 4.2. Vi khuẩn Lxx dƣới kính hiển vi (độ phĩng đại 1000 lần) ........................ 34 Hình 4.3. Mẫu thân nhuộm safranin dƣới kính hiển vi (x 40 lần (A) và x 100 lần (B)). ............................................................... 35 Hình 4.4. Khuẩn lạc nhỏ tƣơng tự nhƣ khuẩn lạc Lxx trên mơi trƣờng sau 2 ngày nuơi cấy (A); và khuẩn lạc của nĩ sau khi phân lập (B). ...... 36 Hình PL1. Nhận dạng triệu chứng và thu mẫu. ........................................................ xvi Hình PL2. Lá mía cĩ triệu chứng khảm. .................................................................. xvi Hình PL3. Kết quả âm tính trong phân tích ELISA. ................................................ xvi Hình PL4. Bệnh đốm vịng thƣờng xuất hiện trên các cây khảo sát. ....................... xvi Hình PL5. Quá trình điều tra và thu mẫu. ................................................................ xvi Hình PL6. Gốc mía bị cằn. ....................................................................................... xvi Hình PL7. Đốt thân mía bị nhiễm Lxx nên ngắn lại. ................................................ xvii Hình PL8. Thân mía bị bệnh cĩ đƣờng kính nhỏ hơn thân bình thƣờng. ................ xvii Hình PL9,10. Vết đổi màu bên trong thân. ....................................................................... xvii xi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ELISA: enzym linked immunosorbent assay. DAS-ELISA: double antibody sandwich-enzyme linked immunosorbent assay. TTNCMĐ: Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng. RT-PCR: Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction. cDNA: Complementary Deoxyribonucleotide acid. ctv: Cộng tác viên. NCM: Màng nitrocellulose ddNTP: Dideoxyribonucleoside triphosphate. DEPC: Diethyl pyrocarbonate. dNTP: Deoxyribonucleoside triphosphate. p-NPP: p - nitrophenol phosphate. PVP: Polyvinylpyrrolidone. BSA: Bovine serum albumin. PBS: Dung dịch chứa PVP, BSA, Tween–20 và sodium azide. RNA: Ribonucleic acid. bp: Base pair. EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid. mRNA: Messenger RNA. PCR: Polymerase chain reaction. RNase: Ribonuclease. SCMV: Sugarcane Mosaic Virus. RSD: Ratoon stunting disease. Lxx: Leifsonia xyli subsp. xyli. STM: Stainning transpiration. TTPT: Trung tâm phân tích. Taq: Thermus aquaticus. 1 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1. Cơ sở tiến hành và ý nghĩa của nghiên cứu Hiện nay cây mía (Saccharum spp.) đang là một trong những loại cây cơng nghiệp cho hiệu quả kinh tế cao ở nƣớc ta cũng nhƣ nhiều nƣớc trên thế giới nhƣ Cuba, Ấn Độ, Australia,.v.v. vì vậy diện tích trồng mía cũng nhƣ sự ra đời của nhiều giống mới khơng ngừng gia tăng trong những năm gần đây. Tuy nhiên mía là cây trồng một lần nhƣng lại cĩ khả năng cho thu hoạch nhiều vụ, nên đây cũng là một trong những điều kiện thuận lợi cho nhiều loại sâu bệnh gây hại tồn tại và phát triển (Nguyễn Huy Ƣớc, 1994). Hơn nữa khi cơ cấu giống mía phong phú hơn, thời tiết khí hậu cĩ nhiều biến đổi cũng gĩp phần làm cho dịch bệnh đa dạng hơn. Các bệnh quan trọng ảnh hƣởng đến năng suất mía hiện nay cĩ rất nhiều, trong đĩ phải kể đến bệnh khảm lá mía và bệnh cằn mía gốc. Bệnh khảm lá mía do virus Sugarcane Mosaic gây ra là bệnh rất phổ biến và cĩ ảnh hƣởng lớn đến ngành sản xuất mía đƣờng của nhiều nƣớc trên thế giới. Thiệt hại nghiêm trọng về năng suất đã đƣợc ghi nhận tại các vùng trồng mía lớn thuộc châu Mỹ, châu Úc; mức thiệt hại cĩ thể lên đến 50% đối với các giống mẫn cảm (Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999). Bệnh thƣờng gây hại ở các vùng ơn đới và ít hơn tại các vùng nhiệt đới. Cụ thể theo kết quả điều tra của Đỗ Ngọc Diệp và ctv (1987), bệnh khảm lá mía đã xuất hiện nhƣng rải rác, thiệt hại gây ra chƣa ở mức đáng quan tâm. Chính vì vậy mà hiện nay ở nƣớc ta bệnh khảm lá mía chƣa đƣợc quan tâm đúng mức trên cả phƣơng diện thống kê giống – vùng bị bệnh và các phƣơng pháp chẩn đốn bệnh hiệu quả. Do vậy việc điều tra phát hiện bệnh khảm lá trên các giống mía nhập nội và sản xuất tại TTNCMĐ tỉnh Bình Dƣơng nhằm thống kê lại tình hình nhiễm bệnh khảm lá mía trên các giống khảo sát, kiểm định giống mới nhập nhằm nâng cao hiệu quả chọn lọc giống và kiểm sốt bệnh. Bệnh cằn mía gốc (RSD) gây ra bởi vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) đây là một loại vi khuẩn gram dƣơng nhỏ chỉ gây bệnh trên mía. Bệnh cĩ thể gây tổn thất lên đến 50% tổng sản lƣợng mía thu đƣợc (Davis, 1980). Việc chẩn đốn phát hiện Lxx rất khĩ vì nĩ ít gây ra các triệu chứng lâm sàng đặc trƣng cĩ thể phát hiện đƣợc trên đồng ruộng. Nhìn chung cây bị nhiễm Lxx sẽ phát triển chậm hơn so với các cây khác cùng 2 độ tuổi. Do vậy ngƣời sản xuất thƣờng lầm tƣởng hay lẫn lộn nguyên nhân của sự chậm lớn trên là do vùng đất trồng kém dinh dƣỡng, độ ẩm khơng thích hợp hay cây bị thiếu chất. Các phƣơng pháp phát hiện Lxx nhƣ là nhìn dƣới kính hiển vi, phát hiện bằng phƣơng pháp miễn dịch học,.v.v. cũng đƣợc phát triển nhƣng độ chính xác và độ nhạy chƣa cao. Do vậy, việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đốn nhanh và chính xác bệnh là một yêu cầu cần thiết, cĩ ý nghĩa rất quan trọng, phục vụ cho cơng tác chọn giống, kiểm định giống từ đĩ đề ra các khuyến cáo nhằm kiểm sốt và quản lí bệnh cĩ hiệu quả. Trƣớc tình hình trên, đƣợc sự hƣớng dẫn của PGS. TS. Bùi Cách Tuyến và sự hỗ trợ từ TTNCMĐ tỉnh Bình Dƣơng chúng tơi đã thực hiện đề tài “Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA và bƣớc đầu nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kỹ thuật PCR”. Đề tài đƣợc thực hiện trên một số giống mía nhập nội và sản xuất tại tỉnh Bình Dƣơng (Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng) và Đồng Nai (Nơng trƣờng Thọ Vực)”. 1.2. Mục tiêu nghiên cứu - Đánh giá tình hình nhiễm bệnh khảm lá mía và bệnh cằn mía gốc trên một số giống mía sản xuất tại TTNCMĐ tỉnh Bình Dƣơng và nơng trƣờng Thọ Vực tỉnh Đồng Nai. - Kiểm định các giống mía mới nhập nội năm 2005. - Phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng phƣơng pháp quan sát vi khuẩn Lxx dƣới kính hiển vi và phƣơng pháp nhuộm STM (Stainning transpiration). - Nuơi cấy phân lập vi khuẩn Lxx. - Phát hiện trực tiếp vi khuẩn Lxx trong dịch chiết nƣớc mía bằng kỹ thuật PCR. 1.3. Giới hạn đề tài - Thời gian thực hiện đề tài cĩ hạn vì vậy khơng thể tiến hành điều tra khảo sát và theo dõi diễn biến bệnh trên các giai đoạn tăng trƣởng đƣợc. - Nghiên cứu phân lập vi khuẩn Lxx cần thời gian dài vì đây là loại vi khuẩn khĩ nuơi cấy trên mơi trƣờng. 3 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Sơ lƣợc về cây mía 2.1.1. Lịch sử phát hiện Cây mía (Saccharum spp.) đã đƣợc biết từ rất lâu (cách nay khoảng 2200 năm), khi quân đội của Alexander chinh phục Ấn Độ vào năm 326 trƣớc Cơng Nguyên họ đã thấy đƣợc cây mía (Hình 2.1). Cây mía đến Persia vào thế kỉ thứ 6 và ngƣời Ả Rập đã mang cây mía đến Ai Cập vào năm 641 sau Cơng Nguyên trong quá trình chinh phục các miền đất của họ. Cây mía cũng đƣợc mở rộng phân bố bằng cách này đến Syria, Cyprus, Crete, và đến Tây Ban Nha vào khoảng những năm 714 sau cơng nguyên. Vào những năm 1150 ngành cơng nghiệp mía đƣờng ở Tây Ban Nha rất phát triển với khoảng 30000 ha mía đƣợc trồng. Vào khoảng năm 1420 ngƣời Bồ Đào Nha đã đƣa cây mía đến Madeira nơi mà chúng ngay lập tức lan rộng sang các quần đảo Canary, Azores. Nhà máy xử lí mía hoạt động đầu tiên vào năm 1516 ở nƣớc cộng hịa Dominica. Sản phẩm đƣờng đƣợc đƣa đến Cuba, Jamaica, Puerto Rico vào những năm cuối của thế kỷ 15. 2.1.2. Phân loại Cây mía thuộc họ Gramineae, giống Saccharum (S) là hỗn hợp của sáu lồi cỏ lƣu năm thuộc giống Saccharum L., trong đĩ cĩ hai lồi hoang dại (S. spontaneum L. và S. robustum Brvaes & Jeswiet ex Grassl) và 4 lồi cây trồng ở vƣờn (S. officinarum L., S. barberi Jeswiet, S. sinense Roxb., và S. edule Hassk . Bốn lồi cây trồng ở vƣờn cĩ sự lai giống phức tạp và luơn cĩ thể giao phấn chéo với nhau. Tất cả các loại giống mía thƣơng mại đƣợc trồng hiện nay đều là các giống lai giữa các lồi này với nhau. 2.1.3. Nguồn gốc và phân bố Cây mía đƣợc cho là cĩ nguồn gốc từ vùng nam Thái Bình Dƣơng.  S. spontaneum xuất hiện trong quần thể hoang dại ở phía đơng và nam Châu Phi, từ suốt vùng trung đơng đến Ấn Độ, Trung Quốc, Triều Tiên và Malaysia, và từ suốt vùng Thái Bình Dƣơng đến New Guinea. Hình 2.1. Cây mía (Nguồn: Philipe Rott, 2000) 4  Trung tâm xuất xứ của cây mía cĩ thể là ở miền nam Ấn Độ nơi đã xuất hiện giống S. robustum cĩ số lƣợng NST nhỏ nhất dọc theo bờ sơng ở New Guinea và một ít ở các đảo liền kề và đã trở thành cây bản xứ của khu vực này.  S. officinarum cịn gọi là “noble cane” giống với các cây mía nguồn gốc ở New Guinea. Loại mía này chỉ phù hợp với vùng nhiệt đới với điều kiện đất đai và khí hậu thuận lợi.  S. barberi cĩ thể cĩ nguồn gốc ở Ấn Độ.  S. sinense cĩ xuất xứ một phần ở Ấn Độ, Indonesia, Trung Quốc, nam Trung Quốc và Triều Tiên.  S. edule là loại khơng thể sản xuất mùa màng nhƣ S. robustum và chỉ tìm thấy đƣợc ở New Guinea và các đảo kế cận. Cây mía hiện tại là cây trồng chính tại nhiều nƣớc vùng nhiệt đới. Vĩ độ cao nhất mà cây mía đƣợc trồng là tại Natal, Argentina và tại cực nam của Australia (khoảng 30 độ S), và khoảng 34 độ N phía tây nam Pakistan, và 37 độ N ở nam Tây Ban Nha. 2.1.4. Nhân giống Để nhân giống mía ngƣời ta thƣờng trồng bằng thân mía cắt từ cây mía chƣa trƣởng thành cĩ thời gian trồng từ 6 - 8 tháng tuổi. Những đoạn thân này đƣợc gọi là "setts", "seed", "seed - cane" hay "seed - pieces". “Sett” đƣợc cho là tốt nhất nếu đƣợc lấy từ đốt thứ ba từ dƣới lên của cây mía vì chồi ở đốt này cịn non và ít bị khơ. “Sett” cĩ thể đƣợc trồng xiên theo một gĩc 45OC hay cũng cĩ thể đặt nằm ngang luơn lên trên luống. Ƣớc tính cần 12.500 - 20.000 “sett” để trồng hết 1 hecta. Mía là cây trồng quanh năm với thời gian từ 3 - 6 năm trƣớc khi đƣợc đốn bỏ và trồng lại. Vụ đầu tiên đƣợc gọi là mía tơ và thƣờng mất khoảng 9 - 24 tháng để cây trƣởng thành, nĩ phụ thuộc vào vùng địa lý. Các vụ mía gốc mất khoảng 1 năm để trƣởng thành và thƣờng thì sau khoảng hai vụ mía gốc là ngƣời ta đã thay bằng các ruộng mía mới, điều này phụ thuộc vào năng suất và sự chậm suy tàn của giống. 2.1.5. Sản lƣợng Năng suất cao nhất của mía về chỉ số calories trên đơn vị diện tích là 10 tấn đƣờng (sucrose) trên hecta ở Barbardos. Sản lƣợng cao nhất đạt đƣợc ở Hawaii là 22 tấn sucrose trên hecta, nhƣng giống mía này cần đến 2 năm hay hơn mới cĩ thể đạt đƣợc trạng thái thành thục ở khu vực này. Sản lƣợng mía đã đƣợc cải thiện và gia tăng đáng 5 kể trong suốt 100 năm qua nhờ quá trình cải tiến giống, đặc biệt là nhờ vào việc sử dụng phân bĩn, kiểm sốt đƣợc cơn trùng và các loại bệnh, cơ giới hĩa đồng ruộng và nhà máy, và việc tạo ra nhiều giống mới cho năng suất cao. 2.1.6. Chế biến và sử dụng Trƣớc khi sản phẩm đƣờng đƣợc làm ra lần đầu tiên ở Ấn Độ khoảng 1000 năm trƣớc cơng nguyên, nhờ vào việc đun sơi dịch chiết nƣớc mía thì cây mía ban đầu đƣợc trồng chỉ nhằm mục đích làm thực phẩm mà thơi. Ngày nay cây mía đƣợc nhiều ngành cơng nghiệp sử dụng và là một trong những sản phẩm đƣợc sử dụng rộng rãi và cĩ giá trị của mỗi quốc gia. - Khoảng 1 tấn đƣờng thơ cĩ thể thu đƣợc khi chế biến 8 - 9 tấn mía. Loại đƣờng thơ màu nâu này cĩ thể đƣợc tinh chế thành đƣờng trắng sạch hơn. - Cây mía đƣợc sử dụng trong nhiều mục đích khác hơn nữa chứ khơng riêng gì việc sản xuất ra đƣờng:  Mật đƣờng là sản phẩm phụ trong quá trình chế biến đƣờng, nĩ là chất lắng xuống khi khơng cịn khả năng kết tinh thành đƣờng. Gần 2,7% mật đƣờng hình thành khi chiết xuất 1 tấn mía. Mật đƣờng đƣợc sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau: dùng để làm phân bĩn cho đất trồng mía, đƣợc vơ trùng và lên men để tạo ra nhiều loại sản phẩm khác nhau nhƣ cồn vơ trùng, rƣợu rum, hay ethyl alcohol.  Sản phẩm cịn lại sau quá trình ép nƣớc mía đĩ là bã mía đƣợc dùng nhƣ là nguồn nhiên liệu chính của các nhà máy đƣờng, nĩ cịn đƣờc dùng để làm giấy, bìa cứng, bảng và tƣờng bằng giấy ép cứng. 2.2. Bệnh trên cây mía Theo thống kê ở các nƣớc trồng mía hiện nay thì cĩ tất cả 126 bệnh hại mía trên thế giới (Philippe Rott, 2000), trong đĩ cĩ 73 bệnh hại phổ biến. Bệnh hại đƣợc gây ra bởi 8 nhĩm tác nhân chính cho ở Bảng 1.1. Trong đĩ bệnh do virus là loại bệnh khĩ kiểm sốt nhất và gây thiệt hại nghiêm trọng nhƣ bệnh khảm lá mía (Sugarcane Mosaic), bệnh vàng gân lá (Yellow leaf syndrome), bệnh Fiji (Fiji disease),.v.v. Bệnh do nấm gây ra cĩ số lƣợng nhiều nhất cũng nhƣ là gây thiệt hại nhiều nhất nhƣ bệnh đốm vịng (Ring spot), bệnh mốc sƣơng (Downy mildew), bệnh than (Smut). 6 Bảng 1.1. Thống kê về nhĩm tác nhân gây bệnh và số lƣợng bệnh đang xảy ra trên cây mía (Hà Đình Tuấn, 2004). Nhĩm tác nhân gây bệnh Số lƣợng bệnh gây ra 1. Bệnh do virus 9 2. Bệnh do phytoplasma 2 3. Bệnh do vi khuẩn 9 4. Bệnh do nấm 68 5. Tuyến trùng và chƣa rõ tác nhân 24 6. Thực vật bán ký sinh 3 7. Dinh dƣỡng, mơi trƣờng 9 8. Hình hƣởng của thuốc trừ cỏ 2 Tổng cộng 126 Vi khuẩn gây ra 4 loại bệnh nghiêm trọng là bệnh gơm (Gumming), bệnh cháy lá (Leaf scald), bệnh cằn mía gốc (Ratoon strunting disease) và bệnh sọc đỏ (Red stripe). Hình 2.2. Bệnh hại phổ biến trên mía cây mía (Philippe Rott, 2000) Chú thích: A: Bệnh khảm lá mía; B: Bệnh vàng gân lá (YLSD); C: Bệnh thối đỏ; D: Bệnh than (Smut); E: Bệnh gơm (Gumming disease); F: Bệnh cằn mía gốc. 7 2.3. Bệnh khảm lá mía 2.3.1. Nguồn gốc và phân bố Bệnh khảm đƣợc cơng nhận đầu tiên vào năm 1892, đƣợc xem nhƣ là một đặc tính bất thƣờng trên mía bởi Musschenbrock ở Java. Ơng đã đặt tên cho nĩ là bệnh đốm sọc vàng “gelestrepenziekte”. Nguồn gốc của bệnh khảm trên mía thì khơng đƣợc biết rõ, nhƣng qua các lần quan sát, theo dõi thì Brandes đã kết luận rằng kí chủ là virus cĩ cùng một điểm phát sinh. Nên theo ơng virus này phải xuất phát từ New Guinea, nơi mà mía là một lồi địa phƣơng. Ngƣời ta phỏng đốn rằng bệnh cĩ từ thời kì tiền sử và lan đến các vùng khác cùng với sự di chuyển của cây mía từ New Guinea. 2.3.2. Triệu chứng Theo Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân (1999), triệu chứng đặc trƣng của bệnh là các vết khảm xanh nhợt hoặc vàng trên lá. Vết bệnh sau đĩ sẽ chuyển thành vết chết hoại, hiện tƣợng này đơi khi cịn thấy trên thân. Sự biểu hiện triệu chứng cịn phụ thuộc vào chủng virus, cây kí chủ và điều kiện mơi trƣờng, đặc biệt là yếu tố nhiệt độ. Bênh khảm virus đƣợc xác định chủ yếu trên lá, mức độ khác nhau tùy vào dịng mía, điều kiện sinh trƣởng, nhiệt độ và chủng virus cĩ liên quan. Triệu chứng thơng thƣờng là vết đốm đặc trƣng màu xạnh nhạt mờ ảo, tƣơng phản trên phiến lá, hoặc những vùng màu xanh nhạt hay biến vàng là kết quả phân bố của các mức độ hàm lƣợng diệp lục tố khác nhau (Hình 2.3). A B C Hình 2.3. Triệu chứng của bệnh khảm lá mía. (Bailey, 1998) Chú thích: A: Cây cịi cọc và vàng lá; B: Vết khảm màu xanh nhợt trên lá; C: Vết khảm vàng trên lá non. 8 Những vùng biến vàng thơng thƣờng thấy rõ nhất ở lá non, lá đang sinh trƣởng mạnh. Sự phân bố của những vùng biến vàng cũng khác nhau, đơi khi chỉ xuất hiện những vết sọc rất nhạt trên mặt lá, nhƣng phổ biến hơn là các vùng biến vàng chiếm phần lớn trên nền lá màu xanh bình thƣờng, và phân bố đều hơn trên mặt lá. Bệnh đơi khi gây những vùng hoại tử kéo dài bên trong mơ tế bào thân. Ở phần mắt lĩng của thân nhiễm bệnh cĩ màu hồng đến hơi nâu. Sau khi cây bị nhiễm bệnh, virus cĩ thể lan đến tồn bộ các bộ phận của cây, nhƣng triệu chứng khảm chỉ xuất hiện trên lá non, đang phát triển, và khơng xuất hiện ở chổ khác đã phát triển đầy đủ trƣớc đĩ. Ở lá bị bệnh, tế bào của vùng biến vàng cĩ thể bị kìm hãm nên tại đĩ sự sinh trƣởng giảm, cĩ ít hoặc khơng cĩ sự khác biệt về cấu trúc mơ về tế bào so với lá bình thƣờng. Lục lạp ở những vùng biến vàng thì nhỏ, ít về số lƣợng và phần lá biến vàng mỏng hơn so với vùng màu xanh của lá bình thƣờng. 2.3.3. Tác nhân gây bệnh Sugarcane mosaic virus là tác nhân gây ra bệnh khảm lá mía, thuộc nhĩm Potyvirus. Những nghiên cứu về điện di cho thấy virus SCMV cĩ hình sợi, kích thƣớc 750 x 13nm, acid nucleic của virus là dạng sợi đơn RNA, RNA cĩ hệ số kết tủa là 34 - 38,9 S. Trọng lƣợng phân tử là 2,7 - 3,1 x 106 daltons, trong đĩ gồm 33,5% A, 20,3% G, 16,2% C và 30% U. Á đơn vị protein của SCMV cĩ trọng lƣợng phân tử là 28.500 - 36.500 daltons và cĩ 264 - 273 gốc amino acid. Thể vùi của virus trong tế bào cây cĩ dạng hình trụ. Ngƣỡng pha lỗng là 10-2 - 10-5. Những phân tử virus đƣợc sắp xếp ngẫu nhiên trong tế bào chất, trong khi những siêu thể vùi với lớp màng mỏng xuất hiện giữa chất nguyên sinh và thành tế bào. Nhiều đặc tính của virus SCMV cũng đƣợc nghiên cứu. Hệ số lắng đọng là 176 ± 5S và mật độ lơ lửng là 1,3327 của SCMV-D, và giá trị 148 ± 2 – 170 ± 5S tƣơng ứng với 1,285 – 1,3421 của SCMV –J. Hình 2.4. SCMV dƣới kính hiển vi điện tử (x 30.000 lần) (Nguồn: www. Plantpathology) 9 2.3.4. Các chủng virus gây bệnh khảm lá mía Cĩ nhiều chủng virus khác nhau, khác biệt trong khả năng gây nhiễm và mức độ thiệt hại do chúng gây ra. Những chủng virus khác nhau thƣờng tạo ra những triệu chứng tƣơng tự nhau trên hầu hết các dịng mía thƣơng mại hiện nay. Tuy nhiên chúng cũng cĩ thể đƣợc phân biệt bằng các dịng chỉ thị chọn lọc. Theo Koike và Gillaspie (1989) thì cĩ tổng cộng 14 chủng virus SCMV gây bệnh khảm lá phân bố khắp thế giới là A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, N. 2.3.5. Qui luật phát sinh phát triển bệnh Virus khảm lá mía lan truyền qua nhiều loại rệp muội theo phƣơng thức nửa bền vững. Rệp ngơ Rhapalosiphum maidis Fitch, rệp bơng Aphis gossipii, rệp đào Myzus persicae, rệp mía Melanaphis sacchari … là mơi giới chủ yếu truyền bệnh. Ngồi ra bệnh cịn cĩ thể truyền qua con đƣờng nhân giống vơ tính. Virus gây bệnh cũng cĩ thể truyền qua hạt ngơ. Cây mía mẫn cảm với bệnh ở giai đoạn cây con. Sự phát triển của bệnh trên đồng ruộng phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ: sức chống chịu của giống mía, sự cĩ mặt của các chủng virus gây bệnh và sự tồn tại của quần thể rệp trên đồng ruộng. Điều kiện canh tác cũng ảnh hƣởng đến sự mẫn cảm của cây và hoạt động của rệp. Virus cĩ phạm vi kí chủ rộng, gây hại trên một số loại cây trồng nhƣ ngơ, cao lƣơng và nhiều loại cỏ khác. 2.3.6. Tầm quan trọng kinh tế Trong suốt thời kì từ năm 1928 - 1930, khi bệnh khảm lan rộng nhanh chĩng ở Tây Hamiphere, thì việc năng suất giảm 30 - 40% là phổ biến, đơi khi lên đến 60 - 80%. Bệnh khảm thƣờng xuyên kéo dài là yếu tố gây ra sự giảm tồn bộ năng suất, khơng kể cĩ hay khơng các yếu tố khác cĩ liên quan đến (Koike và Gillaspie, 1989). Sự mất mát về kinh tế phụ thuộc vào tính mẫn cảm với bệnh của các dịng mía, chủng virus gây bệnh, sự tƣơng tác với các bệnh khác, quần thể mơi giới, thời tiết và điều kiện mơi trƣờng canh tác. Sự kết hợp của bệnh khảm và các bệnh khác làm giảm sự sinh trƣởng của cây cao hơn khi bệnh tác động riêng rẻ. Ngƣời ta đã theo dõi và nhận thấy rằng cĩ sự giảm sút lớn về năng suất khi bệnh khảm và bệnh cằn gốc mía cùng xuất hiện trên các giống CP44-101, CP52-68 và NCo hơn từng bệnh riêng lẻ (Koike và Gillaspie, 1989). 10 2.3.7. Phịng trừ Sử dụng giống kháng, chọn nguồn giống khỏe, sạch bệnh làm vật liệu trồng. Tiêu diệt cây bệnh và cỏ dại, hạn chế bệnh lây lan, ẩn náu trên đồng ruộng. Luân canh với cây trồng khác họ. Xử lí hom giống bằng nhiệt độ hoặc thuốc hĩa học. Nuơi cấy mơ phân sinh ngọn hoặc nuơi cấy mơ kết hợp với xử lí nhiệt. Tránh trồng và đốn mía vào thời kỳ cĩ mật độ cao của quần thể mơi giới. 2.3.8. Các phƣơng pháp xác định bệnh khảm lá mía 2.3.8.1. Dựa vào trạng thái dấu vết bệnh Phƣơng pháp này đơn giản và nhanh nhất nhƣng hiện tƣợng dƣơng tính giả và âm tính giả cũng cao nhất. Đơn giản vì vết bệnh dễ biến đổi, nhiều khi cây bị bệnh mà vết bệnh khơng phát ra ngồi. Một số trƣờng hợp khác nhƣ vết bệnh khơng rõ ràng, bệnh trong giai đoạn tiềm ẩn cũng gây khĩ khăn trong chẩn đốn. 2.3.8.2. Phƣơng pháp chẩn đốn dùng kính hiển vi Phƣơng pháp đơn giản là sử dụng dịch chiết từ lá cây bệnh hoặc thơng qua làm tinh khiết cố định bằng hĩa chất trên lƣới đồng để quan sát dƣới kính hiển vi điện tử. Đây là phƣơng pháp trực tiếp và đơn giản. 2.3.8.3. Phƣơng pháp ELISA (Enzym-link immunosorbent assay) Phƣơng pháp ELISA là phƣơng pháp miễn dịch liên kết enzym. Năm 1972 - 1973, ELISA đƣợc sử dụng đầu tiên trong y học để chẩn đốn virus. Đến năm 1977 Clark và Adam lần đầu tiên ứng dụng ELISA để xác định virus hại thực vật tại Scottlen. Đây là kỹ thuật khá nhạy và tƣơng đối đơn giản, cho phép xác định kháng nguyên (KN) và kháng thể (KT) ở nồng độ rất thấp (khoảng 0,1ng/ml), rẻ tiền, an tồn và độ chính xác cao (Phạm Văn Ty, 2001). Cĩ 3 phƣơng pháp chính làm nền tảng cơ bản cho tất cả các dạng ELISA là: - Direct ELISA: Đây là dạng đơn giản nhất của phƣơng pháp ELISA. Trong đĩ, kháng nguyên cần phát hiện sẽ đƣợc gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể và sẽ đƣợc phát hiện bằng một kháng thể duy nhất (kháng thể này đã đƣợc gắn enzyme). - Indirect ELISA: Phƣơng pháp này khác Direct ELISA ở chỗ kháng thể bắt kháng nguyên khơng đƣợc gắn enzyme mà nĩ là mục tiêu gắn đặc hiệu của một kháng thể khác (kháng thể này mới là kháng thể đƣợc gắn với enzyme). 11 - Sandwich ELISA: Đây là một dạng ELISA đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong thực tiễn do nĩ cho phản ứng mạnh và nhạy. Đƣợc gọi là “sandwich” là do kết quả thí nghiệm đƣợc đánh giá thơng qua sự kết hợp của hai loại kháng thể là kháng thể bắt (capture antibodies) và kháng thể phát hiện (detection antibodies). Kỹ thuật này cũng đƣợc phân làm hai dạng là Direct sandwich ELISA (DAS-ELISA - Double antibody sandwich) và Indirect sandwich ELISA (TAS-ELISA - Triple antibody sandwich). Trong phạm vi khĩa luận này, chúng tơi đã sử dụng kỹ thuật DAS ELISA (Double Antibody Sandwich) để thực hiện chẩn đốn SCMV. Đây là một dạng của Direct sandwich ELISA với kháng thể sử dụng là kháng thể đa dịng. Quy trình các bƣớc thực hiện DAS ELISA đƣợc sơ đồ hĩa nhƣ Sơ đồ 2.1. Sơ đồ 2.1. Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp Phân tích kết quả ELISA dựa trên sự đổi màu của các giếng (Hình 2.5) và bằng máy đọc ELISA. Máy đọc ELISA hoạt động dựa trên nguyên lí quang phổ kế, đo giá trị OD của các giếng ở bƣớc sĩng 405 nm. Cho kháng thể vào mỗi đĩa ELISA Ủ, rửa Thêm kháng nguyên vào Ủ, rửa Bổ sung kháng thể cĩ gắn enzyme Ủ, rửa Thêm cơ chất tạo màu Ủ, đọc kết quả 12 Hình 2.5. Cơ chế phản ứng đổi màu trong DAS- ELISA. 2.3.8.4. Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Phƣơng pháp này do K. Mullis và ctv phát minh năm 1985 và đƣợc sử dụng rộng rãi nhất, trở thành một cơng cụ cần thiết trong các thí nghiệm phân tử. Năm 1993, Henson và French đã đƣa kỹ thuật PCR vào việc chẩn đốn bệnh hại thực vật và phát triển đến nay. PCR là một phản ứng sinh hĩa phụ thuộc vào nhiệt độ, sử dụng đặc điểm của quá trình sao chép DNA với sự tham gia của một loại enzym chịu nhiệt (thƣờng dùng enzym “Taq” đƣợc chiết xuất từ vi khuẩn từ suối nƣớc nĩng Thermus apquaticus), cĩ 2 đoạn ngắn DNA một sợi làm mồi và dùng các đoạn DNA mạch đơn làm khuơn để tổng hợp nên sợi mới bổ sung với nĩ. Đối với một số loại virus cĩ cấu trúc acid nucleic là RNA nĩi chung và virus SCMV nĩi riêng thì bƣớc phiên mã ngƣợc (reverse transcriptase - RT) là cần thiết để tồng hợp nên complementary DNA (cDNA) trƣớc khi tiến hành phản ứng PCR. Phản RT - PCR gồm 2 quá trình: (Sơ đồ 2.2)  Quá trình reverse transcriptase (RT) 13 Để chuyển RNA thành DNA, phản ứng này dựa trên khả năng của enzyme phiên mã ngƣợc, một polymerase RNA phụ thuộc DNA để tạo ra một sợi DNA bổ sung (first-strand cDNA) sử dụng mRNA nhƣ một khuơn mẫu.  Quá trình PCR Để khuyếch đại cDNA vừa tạo thành ở quá trình Reverse Transcriptase Complementary DNA đƣợc xem nhƣ DNA khuơn mẫu để thực hiện phản ứng PCR. Phản ứng PCR gồm ba chu kỳ: biến tính, bắt cặp và kéo dài. Khởi đầu quá tình tổng hợp DNA cần cung cấp đoạn mồi oligonucleotit (cĩ độ từ 6 - 30 nucletides). Đoạn này gắn kết với DNA khuơn tại điểm khởi đầu sao chép và đƣợc enzym DNA- polymerase điều khiển để tổng hợp nên một sợi DNA đặc thù. Sơ đồ 2.2. Sơ đồ tổng quát của kỹ thuật RT-PCR (Trích dẫn Vương Hồ Vũ, 2005). Trong kỹ thuật PCR, các đoạn mồi đƣợc chọn nằm ở 2 đầu đoạn DNA cần nhân lên, sao cho các sợi DNA đƣợc tổng hợp mới đƣợc bắt đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi nằm trên sợi kia, cho sản phẩm cĩ độ dài nằm giữa 2 đoạn mồi này. Độ dài của sản phẩm PCR cĩ thể từ vài trăm đến hàng ngàn cặp nucleotid. 14 Nhƣ vậy sau mỗi chu kỳ, các điểm bám cho các đoạn mồi lại xuất hiện trên mỗi sợi DNA mới đƣợc tổng hợp. Hỗn hợp phản ứng lại đƣợc nâng nhiệt độ thích hợp sao cho các sợi ban đầu tách khỏi sợi mới đƣợc tổng hợp, các sợi này sau đĩ đƣợc dùng làm khuơn cho chu kỳ tiếp theo. Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ (thƣờng từ 25-35 chu kỳ), tính theo lý thuyết ta cĩ: 2n bản sao các phân tử DNA mạch kép nằm giữa 2 đoạn mồi. Nhƣ vậy, từ một đoạn DNA định trƣớc đƣợc nhân lên với một số lƣợng rất lớn. 2.4. Bệnh cằn mía gốc 2.4.1. Nguồn gốc và phân bố Bệnh cằn mía gốc hiện nay đƣợc xếp vào loại bệnh cĩ tầm quan trọng kinh tế lớn trên thế giới (Davis và Bailey, 2000). Nguyên nhân là do sự phân bố rộng khắp của nĩ trên thế giới, sự thiếu các triệu chứng cĩ thể nhận diện đƣợc ở cây kí chủ, thiếu các đặc tính của tác nhân gây bệnh, sự nghiên cứu về bệnh, và những chiến lƣợc cần thiết để kiểm sốt bệnh cĩ hiệu quả. Do vậy bệnh cằn mía gốc hiện đang là một trong những bệnh đang gây hậu quả nghiêm trọng cho các vùng trồng mía trên thế giới. Bệnh cằn mía gốc đƣợc phát hiện đầu tiên ở Queensland trong thời gian từ năm 1944 - 1945, lúc này trên giống mía Q28 đang trồng ngƣời ta phát hiện ra cĩ hiện tƣợng bị hủy hoại bất thƣờng. Sau đĩ ngƣời ta phát hiện ra rằng RSD đã phân bố khắp vùng Queensland, và cĩ mặt ở hầu hết các vùng trồng mía trên thế giới. 2.4.2. Triệu chứng 2.4.2.1. Triệu chứng bên ngồi Hầu nhƣ khơng cĩ triệu chứng bên ngồi cĩ thể nhận ra đƣợc từ cây mía bị bệnh ngoại trừ sự cằn cọc và phát triển kém của cây. Tuy nhiên những đặc điểm trên đều cĩ thể thấy đƣợc ở những vùng đất trồng kém dinh dƣỡng, độ ẩm khơng thích hợp hay cây bị thiếu dinh dƣỡng. Về sự phát triển của chồi thì cây bị bệnh phát triển chậm hơn cây sạch bệnh đặc biệt là trong mùa khơ khi mà các gốc mía dƣờng nhƣ khơng phát triển trong vài tuần hay cả khi cả tháng. Những gốc mía này thƣờng rất khỏe và khơng cĩ sự bất thƣờng nào ở hệ thống rễ cũng nhƣ ở thân hay chồi ở dƣới đất. Sự cằn cỗi biểu hiện khơng đồng nhất giữa các chồi nhiễm bệnh, và ruộng nhiễm bệnh biểu hiện cả sự đi lên và đi xuống của sự phát triển, ngay cả khi tất cả các cây đều bị nhiễm bệnh. 15 2.4.2.2. Triệu chứng bên trong cây Khi chẻ đơi thân cây bị nhiễm bệnh bằng một con dao sắc thì sẽ thấy ở phần dƣới các mắt mía cĩ những chấm đổi màu hình dấu chấm hay dấu phẩy. Sự đổi màu thƣờng diễn ra từ đốt dƣới rồi mới lên đến các nốt bên trên, thƣờng định vị ở những vùng dƣới bẹ lá ngay tại vị trí của nơi xuất dịch cây. Trong vùng này là nơi phát sinh ra lá và các nhánh của các bĩ mạch. Sự đổi màu do RSD khơng diễn ra ở phẩn giữa đốt. Màu của mơ nhiễm bệnh khác nhau về mức độ đậm nhạt và cƣờng độ phụ thuộc vào mức độ nhiễm bệnh và các giống mía khác nhau, và nĩ cũng cĩ thể khác nhau bên trong các giống. Một vài giống thì khơng biểu hiện các triệu chứng này. Các vùng bị biến đổi màu này rất đa dạng cĩ thể là màu vàng, cam, hồng, đỏ, và hơi đỏ nâu và những màu này thƣờng nổi bật lên trên trên nền màu trắng sáng của mơ tế bào. Cĩ trƣờng hợp bệnh tạo ra những vết đổi màu kem, khĩ cĩ thể phân biệt trong tồn bộ đốt khi so sánh với mơ của cây khỏe mạnh. Nhƣng khi các vệt này xuất hiện tại một nốt mà nốt kế cận lại khơng biểu hiện thì vẫn khơng chắc là nĩ cĩ bị bệnh cằn mía gốc hay khơng. Để chẩn đốn chính xác, thì các vệt đổi màu phải xuất hiện trên tất cả các nốt của cây. Triệu chứng của RSD trên chồi mía 1 - 2 tháng tuổi là sự chuyển hồng tại các đốt cịn non, nhƣng nĩ diễn ra chỉ trong vài dịng mía và dƣới những điều kiện canh tác khác nhau. Sự đổi màu diễn ra và khuyếch tán từ nốt lên 1 - 2 cm đến đỉnh sinh trƣởng của nốt kết cận. Phần đầu của đỉnh sinh trƣởng khơng liên kết với RSD. Những triệu chứng ban đầu đƣợc thấy rõ nhất khi cắt các chồi non theo chiều dọc. A B C Hình 2.6. Triệu chứng của cây mía bị bệnh cằn mía gốc (Irvine, 1999). Chú thích: A: Cây bệnh cằn cọc kém phát triển; B: Đốt thân ngắn; C: Vết đổi màu trong thân cây mía bị bệnh. 16 Các triệu chứng khác xảy ra trên cây mía bị bệnh cằn mía gốc là cây cịi cọc, kém phát triển hơn so với các cây cùng độ tuổi, đốt thân ngắn đƣờng kính thân nhỏ hơn so với cây mía bình thƣờng (Hình 2.6). 2.4.3. Tác nhân gây bệnh Đẩu tiên ngƣời ta cho rằng tác nhân gây bệnh là virus. Tuy nhiên Davis (1980) đã chứng minh đƣợc bệnh là do vi khuẩn Clavibacter xyli subsp. xyli gây ra khi ơng nuơi cấy thành cơng vi khuẩn này. Vi khuẩn Clavibacter xyli subsp. xyli cĩ kích thƣớc 0,25 - 0,35 x 1 - 4 μm (đơi khi dài đến 10μm) và sinh sản theo cách thức nhân đơi. Hình dạng thẳng hay gậy mảnh, nhƣng một vài tế bào lại căn phình ra ở ngoại biên hay ở giữa tế bào. Mesosome thƣờng hiện diện và thỉnh thoảng xuất hiện khi hình thành vách ngăn. Gần đây vi khuẩn Clavibacter xyli subsp. xyli đƣợc phân loại trở lại sang một giống mới, là Leifsonia xyli subsp. xyli (Evtushenko, 2000) (Hình 2.7). Vi khuẩn Lxx vẫn giữ nguyên đƣợc khả năng xâm nhiễm và gây bệnh khi đã đƣợc lọc, ly tâm, qua quá trình đơng lạnh và rã đơng, ly tâm, điện di. Lxx cĩ thể chữa trị đƣợc bằng cách đốt nĩng và nĩ nhạy cảm với các dung mơi hữu cơ và cĩ ái lực ion cao đƣợc ứng dụng trong việc lọc và tinh sạch mẫu virus. Chữa trị bằng tetracycline khơng cĩ hiệu quả đối với RSD, điều này cĩ nghĩa là phytoplasma khơng cĩ trong thành phần cấu tạo. Protein của Lxx điện di với gel polyacryamide giống với băng điện di của các chủng vi khuẩn nhƣ Corynebacterium michiganensis, và các tác nhân gây bệnh cĩ chứa 2,4 - diaminobutyric acid. 2.4.4. Quy luật phát sinh phát triển bệnh Bệnh lây truyền giữa các ruộng mía thơng qua các dụng cụ thu hoạch nhƣ dao, máy cắt mía,.v.v. do dịch chiết nƣớc mía từ cây bị bệnh vẫn cịn dính trên dụng cụ khi chuyển sang ruộng khác thu hoạch. Bởi vì bệnh thƣờng khĩ nhận ra đƣợc bằng các triệu chứng bên ngồi nên các vi khuẩn này đã lan truyền từ vùng này sang vùng khác và từ quốc gia này sang các quốc gia khác thơng qua các chƣơng trình trao đổi giống cây trồng. Hình 2.7. Vi khuẩn Lxx dƣới kính hiển vi điện tử (x30.000 lần) (K. E. Damann, 2002) 17 2.4.5. Tầm quan trọng kinh tế Hình hƣởng của RSD gây ra trên cây mia chủ yếu là làm giảm năng suất của cây, tác động này phụ thuộc vào yếu tố giống và điều kiện thời tiết. Năng suất giảm mạnh mẽ khi cây bị hạn hán và cĩ thể giảm đáng kể trong điều kiện đƣợc tƣới tiêu hợp lí. Bệnh trầm trọng hơn khi mía bƣớc vào vụ mía gốc do đĩ bệnh làm giảm tốc độ phát triển của mía gốc và số vụ mía gốc của giống mía. Hàm lƣợng đƣờng thƣờng khơng bị ảnh hƣởng ngoại trừ khi cây bị chết. 2.4.6. Kiểm sốt bệnh Giữ vệ sinh dụng cụ thu hoạch: trƣớc và sau mỗi lần thu hoạch chúng ta đều phải làm sạch các dụng cụ thu hoạch trƣớc khi cắt sang vƣờn cây sạch bệnh. Chúng ta cĩ thể dùng cách đốt, hay sử dụng hĩa chất khơng lây nhiễm. Làm sạch cây giống trƣớc khi trồng ta dùng phƣơng pháp ngâm chúng trong dịng nƣớc nĩng ở 52OC trong vịng 4 tiếng là cĩ thể loại Lxx ra khỏi vật liệu trồng. Dùng giống kháng với bệnh cằn mía gốc. 2.4.7. Các phƣơng pháp chẩn đốn bệnh cằn mía gốc trên cây mía 2.4.7.1. Phƣơng pháp chẩn đốn trực tiếp bằng kính hiển vi Dịch chiết nƣớc mía thu đƣợc bằng cách đẩy khí từ đầu này sang đầu kia của một đoạn thân cây mía và xem trực tiếp dƣới kính hiển vi (khơng cần nhuộm). Kết quả dƣơng tính trong chẩn đốn phụ thuộc vào kinh nghiệm của ngƣời quan sát rất nhiều, nguyên nhân ở đây là rất khĩ để nhận ra vi khuẩn trong dịch chiết nƣớc mía, đặc biệt là khi nồng độ của chúng trong dịch chiết thấp. 2.4.7.2. Phƣơng pháp huyết thanh học  Nhuộm kháng thể huỳnh quang (flourescent antibody staining) Harris và Gillaspie (1978) là những ngƣời đầu tiên đƣa ra phƣơng pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp (indirect flourescent antibody technique - FAT) sử dụng kháng huyết thanh đặc hiệu với Lxx để chẩn đốn RSD. Brlansky và ctv (1982) đã phát hiện Lxx trực tiếp trên mẫu mía bằng cách dùng kháng thể IgG đặc hiệu để gắn kết Lxx với tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC). 18 Davis (1985) tăng độ nhạy của FAT lên 100 lần bằng kỹ thuật đếm trực tiếp kháng thể gắn huỳnh quang trên màng lọc (FADCF). Màng lọc đƣợc kiểm tra cĩ vi khuẩn gắn huỳnh quang hay khơng bởi kính hiển vi huỳnh quang ở độ phĩng đại 1200 lần.  Phân tích miễn dịch học enzym liên kết với mơ mẫu (Tissue Blot Enzym Immunoassay) Kỹ thuật Tissue Blot Enzym Immunoassay (TBIA) là một dạng thay đổi của kỹ thuật dot - blot assay, trong đĩ vi khuẩn đƣợc tách ra khỏi mơ bị bệnh nhờ ly tâm và dính lên màng nitrocellulose (NCM). Sau đĩ vi khuẩn sẽ đƣợc nhuộm kháng thể. Những giếng màu xanh xuất hiện trên màng NCM là mẫu dƣơng tính đối với vi khuẩn Lxx khi đem phân tích miễn dịch học.  Dot Blot Assay Thu dịch chiết từ đốt mía (50 μl) trộn với 10 mM PBS, pH 7,2 theo tỉ lệ 1:1 về thể tích. 96 mẫu dịch chiết đã trộn với PBS đƣợc lọc qua màng màng lọc NCM kích thƣớc lỗ 0,45 μm trên thiết bị lọc. Tháo màng lọc ra khỏi thiết bị và đem sấy ở 80OC trong 60 phút trƣớc khi đem nhuộm bằng phƣơng pháp EIA/TBIA. Các phản ứng dƣơng tính đƣợc nhận diện bằng các đốm màu xanh đậm trên màng.  Evaporative - binding Enzym Linked immunosorbent assay (EB - ELISA) Phƣơng pháp EB - ELISA do Croft và ctv đƣa ra năm 1994 để chẩn đốn RSD. Dịch chiết nƣớc mía thu đƣợc ly tâm ở 3000 vịng trong 15 phút hay 13000 vịng trong 5 phút. Dịch nổi đƣợc loại bỏ và tái huyền phù phần cặn lắng bằng 550 μl dịch đệm. Mẫu phân tích đƣợc cho bay hơi hồn tồn trong buồng ủ thống khí ở 350C. Sau khi ủ mẫu đƣợc đem đổ đĩa với hỗn hợp sữa khơng kem và kháng thể. Phƣơng pháp EB - EIA cĩ thể phát hiện vi khuẩn nuơi cấy trong mơi trƣờng với mật độ thấp hơn 105 tế bào/ml và 5.105 tế bào/trong dịch nhiễm.  Liquid Transfer Enzyme immunoassay (LT - EIA) Leaman và ctv (1991) sử dụng phƣơng pháp LT- EIA để chẩn đốn RSD và so sánh phƣơng pháp này với phƣơng pháp FADCF. LT - EIA phát hiện đƣợc Lxx ở mật độ 5.101 tế bào/ml chiết và cho độ chính xác đến 98%. FADCF cĩ khả năng phát hiện 5.10 1 tế bào/ml và với độ chính xác đến 100%. Tuy nhiên, FADCF khĩ cĩ khả năng thực hiện đƣợc trên nhiều mẫu cùng lúc. Phƣơng pháp LT - EIA thích hợp cho việc kiểm tra một số lƣợng mẫu lớn. 19 2.4.7.3. Phƣơng pháp nhuộm STM (dựa vào đáp ứng của kí chủ) Cắt chéo vào mắt mía của một cây mía trƣởng thành bị nhiễm Lxx để xử lý với dung dịch thuốc nhuộm cĩ chứa Safranin. Quan sát sự chuyển màu bên trong thân mía: vùng chuyển thành màu đỏ là khơng cĩ vi khuẩn Lxx và vùng chuyển màu vàng là cĩ chứa vi khuẩn Lxx. 2.4.7.4. Phƣơng pháp chẩn đốn dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử  Chẩn đốn dựa vào việc sử dụng các đầu dị DNA Chung và ctv (1994) đã sử dụng kỹ thuật lai tại vết bệnh (dot blot hybridization) với 7 đầu dị DNA đặc hiệu cho Lxx.  Kỹ thuật PCR. Kỹ thuật PCR đƣợc phát triển nhằm phát hiện Lxx (Pan và các cộng sự, 1998; Taylor và các cộng sự, 2003). Mồi cho các phản ứng này đƣợc thiết kế từ vùng ITS (intergenic transcribed spacer region) giữa gen rRNA 16S và 23S của operon rRNA vi khuẩn Lxx. 2.5. Tình hình nghiên cứu về bệnh khảm lá mía và bệnh cằn mía gốc 2.5.1. Trên thế giới  Bệnh khảm lá mía - Năm 1927, bệnh khảm virus ở Australia làm giảm năng suất khoảng 39 - 46%, thiệt hại trên giống Q28 là năng suất vụ tơ giảm 27% và ở vụ gốc giảm 67% (Koike và Gillaspie,1989). - Theo Koike và Gillaspie (1989), dịng A của virus gây bệnh khảm lần đầu tiên đƣợc phát hiện năm 1943 trên giống SP34-120 ngồi sản xuất, và cho đến nay ngƣời ta đã tìm thấy 13 dịng virus gây bệnh khảm này tại Mỹ. Trong lịch sử Hawaii là vùng bị bệnh virus tàn phá nặng nề nhất. - Theo nghiên cứu của Salomon và ctv (2000), bệnh khảm virus làm giảm năng suất mía 30 - 40% tại quốc gia này. - Jang và Zhuo (2002) phát hiện đƣợc SCMV gây bệnh trên bắp ở Trung Quốc bằng phƣơng pháp RT - PCR.  Bệnh cằn mía gốc - Năm 1945, Steind đã cĩ những báo cáo đầu tiên về triệu chứng của bệnh tại Australia. - Năm 1980, Davis tiến hành nuơi cấy vi khuẩn Lxx 20 - Năm 1998, Y Pan và các cộng sự đã đƣa ra protocol để chẩn đốn Lxx dựa vào cặp mồi Cxx trong dịch khuẩn lạc nuơi cấy và trong dịch chiết nƣớc mía. - Năm 2003, Stevens Brumbley đã phát triển cặp mồi để phát hiện Lxx trong dịch chiết nƣớc mía cĩ tính đặc hiệu hơn và đƣợc chứng minh là cĩ độ nhạy cao. - Năm 2004, Luis E. A. Camargo và ctv đã giải đƣợc trình từ genome của vi khuẩn Gram dƣơng Lxx tác nhân gây bệnh trên cây mía. - Viện khoa học nơng nghiệp Tây Nam Trung Quốc năm 2004 cũng đã phát hiện đƣợc vi khuẩn Lxx ở Quảng Tây bằng kỹ thuật PCR. 2.5.2. Trong nƣớc  Bệnh khảm lá mía Nƣớc ta do điều kiện lịch sử hình thành nên việc nghiên cứu bệnh hại mía nĩi chung và bệnh khảm lá mía nĩi riêng cịn rất mới mẻ so với các nƣớc trong khu vực, cụ thể là: - Theo nghiên cứu của Đỗ Ngọc Diệp và ctv (1987) đã kết luận rằng bệnh khảm lá mía ở nƣớc ta chỉ xuất hiện rải rác, thiệt hại chƣa ở mức đáng quan tâm. Bệnh sau đĩ đƣợc cơng bố gây hại vào năm 1996 (Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999) - Nguyễn Huy Ƣớc (1999) cũng đã đề cập đến 4 bệnh virus phổ biến trên mía, trong đĩ cĩ bệnh khảm mía và đƣa ra một số phƣơng pháp phịng trừ. - Gần đây cĩ một nghiên cứu sơ về thành phần bệnh hại trên cây mía ở vùng Đơng Nam Bộ (Hà Đình Tuấn, 2004) cũng cĩ đề cập đến sự xuất hiện khơng nhiều của bệnh khảm lá mía. - Trƣơng Lê Bạch Liên (2005) cũng đã thực hiện việc điều tra trên quy mơ nhỏ các giống mía trồng tại TTNCMĐ và một số vùng lân cận. Kết quả chỉ ra rằng tình hình nhiễm bệnh là rất ít.  Bệnh cằn mía gốc RSD là một loại bệnh đã đƣợc phát hiện từ lâu, trong lịch sử cũng đã cĩ nhiều vùng bị thiệt hại năng nề do RSD gây ra. Tuy nhiên tình hình nghiên cứu về bệnh cằn mía gốc trên cây mía của nƣớc hiện nay vẫn chƣa đƣợc chú ý đi sâu nghiên cứu nhiều. Cụ thể là: - Năm 1967 – 1986, đã cĩ cuộc điều tra về bệnh học của cây mía ở miên Bắc và lúc này ngƣời ta phát hiện cĩ 22 bệnh (Nguyễn Huy Ƣớc, 1999). 21 - Năm 1963 trạm thực nghiệm mía Quảng Ngãi xác đinh đƣợc 11 loại bệnh hại mía, trong đĩ bệnh đốm vàng và cháy lá gây thiệt hại nặng nhất. - Tổng kết của Hồng Thị Mỹ năm 1966 thì ở khu vực phía Nam cĩ 13 loại bệnh trên mía (Đỗ Ngọc Diệp và ctv, 1987). - Theo Phan Gia Tân (1999) thì cĩ 12 loại bệnh xuất hiện phổ biến trên cây mía do tác nhân virus, vi khuẩn, và nấm và 6 loại bệnh khác do yếu tố dinh dƣỡng. - Tổng kết của Rott và ctv (2000) qua điều tra sơ bộ năm 1999, ở Việt Nam cĩ 21 bệnh phổ biến gây hại trên cây mía. - Mới đây, ngƣời ta thống kê lại lần nữa số bệnh trên các giống mía miền Đơng Nam Bộ là 3 bệnh do virus, 5 bệnh do vi khuẩn, 31 bệnh do nấm, 1 bệnh do phytoplasma, 4 bệnh chƣa biết tác nhân và một số bệnh khác do yếu tố mơi trƣờng gây ra (Hà Đình Tuấn, 2004). 22 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nội dung nghiên cứu Đề tài thực hiện gồm cĩ 2 nội dung chính sau: - Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA trên một số giống mía sản xuất và nhập nội tại Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng tỉnh Bình Dƣơng. - Bƣớc đầu nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kỹ thuật PCR trên một số giống mía sản xuất tại TTNCMĐ và nơng trƣờng Thọ Vực. + Phát hiện Lxx bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi và phƣơng pháp nhuộm STM. + Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuơi cấy vi khuẩn Lxx và nhận dạng khuẩn lạc của nĩ trên mơi trƣờng nuơi cấy. + PCR phát hiện vi khuẩn Lxx trong dịch chiết nƣớc mía. 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 10 tháng 05 đến ngày 10 tháng 08 năm 2006. Địa điểm thực hiện: Phịng Cơng Nghệ Sinh Học Thực Vật - Trung tâm Phân tích Thí nghiệm (TTPT) Trƣờng Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng tỉnh Bình Dƣơng và nơng trƣờng ThọVực tỉnh Đồng Nai. 3.3. Vật liệu nghiên cứu 3.3.1. Các giống mía nghiên cứu 6 giống mía sản xuất đƣợc trồng tại TTNCMĐ gồm: C90-127, VN84-4137, DLM24, R570, VN85-1427, ROC26. 10 giống mía Thái Lan nhập nội năm 2005 là: KU00-1-58, K95-2-156, KU00-1-92, K95-161, K95-156, KU60-1, U-THONG483, K95-50, KU98-009 , KU60-2. 5 giống mía tại nơng trƣờng Thọ Vực: My55-14, VN84-4137, QĐ368, VĐ85-177, VN85-1427. 3.3.2. Virus gây bệnh Virus Sugarcane Mosaic (SCMV) gây bệnh khảm lá mía. 3.3.3. Vi khuẩn gây bệnh Vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) gây bệnh cằn mía gốc. 23 3.3.4. Hĩa chất thí nghiệm - Các hĩa chất nằm trong kít DAS-ELISA (Biorad) gồm: Dung dịch đệm li trích, dung dịch đệm cho kháng thể, kháng thể, đối chứng âm, đối chứng dƣơng, kháng thể gắn enzym, P-nitrophenyl phosphate (pNPP). - Dung dịch đệm rửa PBS- Tween. - Dầu khống dùng để xem kính ở độ phĩng đại 1000 lần. - Hĩa chất pha mơi trƣờng nuơi cấy Lxx gồm: Bacto agar, pepton đậu nành, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4.7H2O, glucose, bovine serum albumin (BSA), cysteine, nalidixic acid, methionine. - Hĩa chất cho phản ứng PCR gồm: Taq DNA polymerase, dung dịch đệm (buffer), MgCl2, dNTPs, polyvinyl pyrolidone (PVP), primer C2. - Hĩa chất sử dụng trong điện di: Agarose, TAE 0,5X (Tris acetate 40 mM; EDTA 0,1 mM; pH 8), blue/orange loading dye 6X (Promega), ethium bromide (nồng độ 5.10-3 % theo thể tích). 3.3.5. Thiết bị và dụng cụ - Cối chày, eppendorf, bình cồn, bơng gịn, đĩa petri, ống đong, dao, ống bơm. - Micropipet 10-100-1000 μl, đầu típ các loại, eppendorf (các loại). - Đĩa ELISA, máy rửa ELISA, tủ ủ, máy đọc ELISA, máy in. - Nồi hấp vơ trùng (autoclave), tủ sấy, tủ cấy vơ trùng (microflow). - Máy cất nƣớc, máy đo pH, máy khấy từ, máy đánh sĩng, máy ly tâm. - Que trang, que cấy các loại, bercher, màng lọc vơ trùng (0,2 và 0,45 μm) - Máy PCR, bồn điện di, lị viba, máy chụp gel, kính hiển vi quang học. 3.4. Phƣơng pháp tiến hành 3.4.5. Phƣơng pháp điều tra lấy mẫu Để đảm bảo tính ngẫu nhiên trong quá trình thí nghiệm thì cơng tác điều tra lấy mẫu trên mỗi giống đƣợc thực hiện nhƣ sau: - Liên hệ bộ mơn Bảo vệ thực vật và bộ mơn giống ở TTNCMĐ để xác định các giống mía cần thu thập và lấy mẫu. - Tại mỗi ruộng điều tra (trung bình là 1 hecta) chọn 5 điểm khảo sát. - Lấy mẫu ngẫu nhiên 5 mẫu/ruộng. 1 mẫu lá (hay mẫu thân) dùng trong phân tích bệnh khảm lá mía hay cằn mía gốc tại 1 điểm điều tra đƣợc lấy ngẫu nhiên 24 từ 3 cây của 3 hom mía nằm trên 3 hàng xen kẽ nhau (ví dụ nhƣ hàng 1, 3, 5 hay hàng 2, 4, 6) (xem Sơ đồ 3.1). 5 điểm lấy mẫu theo đƣờng chéo gĩc H1 x x … o x H3 o x … x x H5 x x … o x Chọn ngẫu nhiên 3 cây trên 3 hàng để lấy mẫu điều tra Tại 1 điểm điều tra Sơ đồ 3.1. Sơ đồ điều tra Chú thích: H1,3,5: Hàng mía điều tra; O: Bụi được kiểm tra; X: Bụi khơng điều tra. - Mẫu thân mía sau đĩ đƣợc chiết lấy dịch bằng cách đẩy khí: 1 đoạn thân cây mía (khoảng 10 – 20 cm) đƣợc chặt ra, dùng một ống bơm đẩy dịch chiết từ đầu này sang đầu kia, thu dịch chiết cho vào eppendorf cĩ ghi nhãn cẩn thận về mẫu nhƣ giống, tuổi cây, triệu chứng. - Mẫu lá và dịch chiết nƣớc mía đƣợc cho vào thùng xốp giữ lạnh và đem về trữ ở TTPT Đại học Nơng Lâm. 3.4.6. Phƣơng pháp phát hiện SCMV bằng kỹ thuật ELISA 3.4.3.1. Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu và bố trí thí nghiệm Chuẩn bị chày cối (hấp nƣớc DEPC) để khơ ở tủ âm trƣớc khi nghiền mẫu, pha dung dịch đệm ly trích mẫu (từ 20X xuống 1X). Khi nghiền mẫu thì cắt nhỏ mẫu ra bằng kéo (cĩ sự vơ trùng bằng cồn sau mỗi lần cắt mẫu) để dễ dàng nghiền mẫu. Cụ thể quy trình làm đƣợc tĩm tắt ở Sơ đồ 3.2. 1 2 5 4 3 25 Mẫu lá mía Cân 0,5 g Cắt nhỏ Cho vào cối nghiền + Extractionbuffer (2,5ml) Nghiền Cho dịch nghiền vào eppendorf Li tâm ở 4OC, 3 phút, 7000 vịng/phút Hút dịch trong chuyển sang eppendorf mới Trữ ở tủ mát 4OC Sơ đồ 3.2. Sơ đồ tách chiết mẫu lá cho ELISA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B Substrate BF 1 4 7 10 13 16 19 22 25 C Substrate BF 1 4 7 10 13 16 19 22 25 D Substrate PC 2 5 8 11 14 17 20 23 26 E Substrate PC 2 5 8 11 14 17 20 23 26 F Substrate NC 3 6 9 12 15 18 21 24 27 G Substrate NC 3 6 9 12 15 18 21 24 27 H Sơ đồ 3.3. Sơ đồ bố trí giếng trên đĩa ELISA Chú thích: Subs: Substrate; PC: Positive control; BF: Buffer extraction; 1, 2, 3,.v.v.: Mẫu chẩn đốn; NC: Negative control 26 Chuẩn bị đĩa và sơ đồ bố trí mẫu trên đĩa, mỗi đĩa đƣợc bố trí: 2 giếng đối chứng dƣơng, 2 giếng đối chứng âm, 2 giếng dung dịch đệm (buffer), 6 giếng chứa chất nền (substrate), cịn lại là các giếng chứa mẫu cần phân tích. Tuy nhiên để đảm bảo tính chính xác cao trong quá trình thực hiện phản ứng, chúng chúng tơi chỉ tiến hành vơ mẫu lá phân tích trong 54 giếng (từ B3 - G11). Mỗi mẫu đƣợc lặp lại 2 lần trên 2 giếng kề nhau theo chiều dọc của đĩa ELISA (Sơ đồ 3.3). 3.4.3.2. Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA  Quy trình đƣợc thực hiện nhƣ sau: - Bƣớc 1: Pha lỗng kháng thể đa dịng trong dung dịch đệm đến nồng độ 1/100. Cho hỗn hợp trên vào giếng BF, NC, PC và các giếng mẫu với thể tích 100 μl/giếng. Các giếng substrate đƣợc thay bằng nƣớc cất siêu lọc với thể tích tƣơng đƣơng trong suốt quá trình phân tích. Ủ đĩa ở 37OC trong vịng 2 giờ. Sau đĩ rửa đĩa 3 lần với dung dịch PBS - Tween bằng máy rửa ELISA. - Bƣớc 2: Cho 100 μl dịch đệm ly trích vào mỗi giếng BF, pha đối chứng dƣơng và đối chứng âm trong 1ml nƣớc cất siêu sạch, cho 100 μl đối chứng âm vào giếng NC và 100 μl đối chứng dƣơng vào giếng PC. Với các giếng mẫu, cho 100 μl dịch trích mẫu ở giai đoạn ly trích vào mỗi giếng. Ủ đĩa ở 4OC qua đêm. Rửa đĩa 3 lần với dung dịch PBS - Tween bằng máy rửa ELISA. - Bƣớc 3: Pha dung dịch kháng thể gắn enzym đến nồng độ 1/100. Cho 100 μl hỗn hợp trên vào giếng BF, NC, PC, và các giếng mẫu. Ủ đĩa ở 37OC trong vịng 2 giờ. Rửa đĩa 2 lần bằng dung dịch PBS - tween bằng máy rửa ELISA. - Bƣớc 4: Hịa tan pNPP dạng viên trong dung dịch đệm, cho vào tất cả các giếng substrate, BF, NC, PC và các giếng mẫu với thể tích 100 μl/giếng. Ủ đĩa ở 37OC trong 30 phút, đọc kết quả bằng máy đọc ELISA hoặc quan sát sự đổi màu của giếng bằng mắt thƣờng. Sau 30 phút, 1 giờ, 2 giờ đọc lại kết quả ELISA.  Các mẫu lá mía đƣợc chẩn đốn cĩ nhiễm bệnh hay khơng dựa vào: - Sự đổi màu trong phản ứng DAS-ELISA: giếng nào nếu màu vàng giống mẫu đối chứng dƣơng thì mẫu đĩ dƣơng tính (+), bị nhiễm SCMV. Các giếng khơng màu trùng với giếng đối chứng âm là mẫu âm tính (-), sạch bệnh khảm lá mía. - Kết quả đọc bằng máy đọc ELISA. 27  Cách tính kết quả: - Giá trị OD của mẫu = giá trị OD thơ - giá trị OD trung bình của các giếng Substrate. - Mẫu dƣơng tính: Nếu giá trị OD của mẫu > giá trị ngƣỡng. - Mẫu âm tính: Nếu giá trị OD của mẫu < giá trị ngƣỡng. (Giá trị ngƣỡng = 2 x giá trị OD trung bình của các giếng đối chứng âm). - Một số mẫu cĩ giá trị OD gần ngƣỡng thì khơng chắc chắn là dƣơng tính vì vậy cần đọc kết quả sau 30 phút, 1 giờ, 2 giờ để cĩ đƣợc kết quả chính xác. 3.4.7. Phƣơng pháp nhận dạng bệnh cằn mía gốc trên đồng ruộng Quan sát đồng ruộng, trên từng ruộng mía, với thời gian trồng và chặt sau khi thu hoạch xong thì sự sinh trƣởng của các cây khơng đều, cĩ cây cao, cĩ cây thấp. Kiểm tra các cây thấp chậm phát triển này cĩ bị bệnh cằn mía gốc hay khơng bằng cách dùng dao bén chặt dọc thân cây mía và quan sát sự đổi màu của các bĩ mạch.  Chỉ tiêu quan sát - Cây sinh trƣởng và phát triển chậm hơn bình thƣờng, nếu cây bị bệnh đứng gần cây khỏe mạnh thì rất dễ dàng nhận diện. - Cĩ hay khơng sự đổi màu của các bĩ mạch bên trong thân cây mía. - Đốt thân ngắn, đƣờng kính thân giảm so với bình thƣờng. 3.4.8. Phƣơng pháp phát hiện vi khuẩn Lxx bằng kính hiển vi và bằng phƣơng pháp nhuộm STM Dịch nƣớc mía sau khi chiết đƣợc đem kiểm tra bằng kính hiển vi. Làm tiêu bản mẫu dịch chiết nƣớc mía trên lam kính. Đậy lamen và quan sát vi khuẩn Lxx dƣới kính hiển vi ở độ phĩng đại là 1000 lần (xem dƣới giọt dầu). Vi khuẩn Lxx cĩ hình gậy, chiều rộng từ 0,25 - 0,35 x 1 - 4 μm, nổi lên trên nền tối của kính hiển vi. Cây mía đƣợc 10 tháng tuổi thì mới cĩ thể kiểm tra đƣợc bằng phƣơng pháp STM, quy trình đƣợc thực hiện nhƣ sau: Nhổ cây mía sau đĩ chặt sát gốc cắm vào dung dịch thuốc nhuộm safranin (thành phần gồm Safranin 10%, cồn 96O và nƣớc cất). Để khoảng 30 phút lấy ra và gọt lấy phần ruột mía phía trong (cách gốc khoảng 5 cm). Gọt mỏng ngang thân mía đem soi trên kính hiển vi ở độ phĩng đại 40 - 100 lần, thu đƣợc kết quả các mạch dẫn cĩ màu đỏ hoặc màu vàng. Chỉ tiêu đánh giá nhƣ sau: - < 70 % mạch đỏ: Giống nhiễm nặng. 28 - 70 – 84,9 % mạch đỏ: Giống nhiễm trung bình. - 85 – 99,9 % mạch đỏ: Giống nhiễm nhẹ. - 100 % mạch đỏ: Giống khỏe mạnh. (Trích dẫn: Hà Đình Tuấn, 2004). 3.4.5. Phƣơng pháp nuơi cấy và nhận dạng khuẩn lạc vi khuẩn Lxx Thành phần mơi trƣờng nuơi cấy vi khuẩn Lxx gồm các thành phần sau: Thành phần hấp - Nƣớc cất = 1000 ml - Bacto agar = 17 g - Pepton = 8 g - K2HPO4 = 1 g - KH2PO4 = 1 g - MgSO4.7H2O = 0,2 g Thành phần lọc - Glucose = 0,5 g - Methionine = 1 g - Nalidixic acid = 0,01 g - BSA = 2 g - Cysteine = 0.1 g Albumin huyết thanh bị, cysteine, methionine, nalidixic acid và glucose đƣợc lọc vơ trùng và thêm vào các thành phần mơi trƣờng trên sau khi chúng đã đƣợc hấp vơ trùng (thêm vào khi nhiệt độ < 50OC), pH chỉnh về 6,6 với NaOH hay HCl. Đổ mơi trƣờng vào đĩa petri (khoảng 15 ml/đĩa). Cấy vi khuẩn bằng cách dùng pipet hút 1ml mẫu dịch chiết nƣớc mía nhiễm bệnh đem cấy lên đĩa mơi trƣờng. Dịch chiết nƣớc mía nuơi cấy đƣợc chiết bằng cách đẩy khí và xác định sự hiện diện của vi khuẩn Lxx bằng kính hiển vi và nhuộm STM. Dịch chiết sau đĩ đƣợc trải rộng khắp đĩa nhằm mục đích thu đƣợc khuẩn lạc đơn lẻ cấy chuyền sang mơi trƣờng khác. Mẫu dịch chiết đƣa vào nuơi cấy đƣợc pha lỗng ở mức độ 0 lần, 2 lần, 4 lần, 6 lần, 8 lần, và 10 lần. Đĩa cấy sau đĩ đƣợc ủ ở 28OC trong thời gian 3 tuần. Theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc vi khuẩn hàng ngày.  Chỉ tiêu theo dõi - Thời gian hình thành khuẩn lạc Lxx trên mơi trƣờng nuơi cấy (20-22 ngày). - Khuẩn lạc Lxx sau 20 ngày nuơi cấy cĩ màu trong suốt, kích thƣớc khuẩn lạc là từ 0,1 – 0,3 mm (Davis, 1980). - Kiểm tra hình dạng Lxx dƣới kính hiển vi ở độ phĩng đại 1000 lần. 29 3.4.6. Phƣơng pháp PCR phát hiện vi khuẩn Lxx  Phƣơng pháp chuẩn bị DNA mẫu cho PCR trực tiếp: Dịch chiết từ thân mía (100 μl) đƣợc đem ly tâm 20.000 vịng trong 10 phút ở nhiệt độ phịng. Dịch lắng thu đƣợc rửa hai lần bằng nƣớc cất vơ trùng (100 μl) trƣớc khi tái huyền phù lại với nƣớc cất vơ trùng (100 μl). Tồn bộ dung dịch đƣợc đun sơi trong vịng 5 phút và làm lạnh nhanh trong vịng 10 phút. Một thể tích khoảng 2 μl của dịch này đƣợc nhƣ mẫu để chạy phản ứng PCR  PCR phát hiện Lxx dựa vào cặp mồi và quy trình của Stevens Brumbley (2003) gồm các thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt cho ở Bảng 3.1. Bảng 3.1. Thành phần các chất trong phản ứng PCR và chu kỳ nhiệt Sản phẩm PCR sau phản ứng đƣợc điện di trên gel agarose 1,5 % (w/v), với ethidium bromide trong dung dịch đệm TAE 1X , hiệu điện thế là 90V trong 20 phút. Chỉ tiêu đánh giá: Sự xuất hiện băng DNA khuyếch đại chuyên biệt (520 bp) của vi khuẩn trên gel điện di.  Thực hiện phản ứng PCR - Thí nghiệm 1: PCR sử dụng quy trình chuẩn bị mẫu, thành phần các chất phản ứng, và chu kỳ nhiệt do S. Brumbley (2003) đƣa ra. Hĩa chất Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích/ phản ứng( μl) Chu kỳ nhiệt Bufer MgCl2 dNTPs Primer F Primer R PVP Taq DNA polymerase DNA mẫu H2O 10X 25 mM 25 mM 2,5 μM 2,5 μM 5U/1 μl 1X 3 mM 0,24 mM 0,25 μM 0,25 μM 1% w/v 1 U 2,5 3 0,24 2,5 2,5 2,5 0,2 2 9,56 96 – 5 phút – 1 chu kỳ 94 – 15 giây 57 – 30 giây 40 chu kỳ 72 – 30 giây 72 – 10 phút – 1 chu kỳ Tổng thể tích 25 μl 30 - Thí nghiệm 2: Khảo sát hiệu quả của hai phƣơng pháp chuẩn bị mẫu: Biến tính bằng nhiệt và li trích DNA vi khuẩn Lxx. Đo OD sản phẩm dịch chiết biến tính và thêm vào thành phần phản ứng PCR Lọc dịch chiết bằng màng lọc 0,4 μm trƣớc khi biến tính Thực hiện li trích DNA Lxx trong dịch chiết theo quy trình ly trích vi khuẩn. - Thí nghiệm 3: Khảo sát hiệu quả sử dụng của PVP trong PCR trực tiếp từ dịch chiết nƣớc mía. Tăng nồng độ PVP trong phản ứng PCR lên 1,5 – 2 lần. - Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của các thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt trong phản ứng PCR. Tăng lƣợng mẫu DNA đƣa vào. Tăng nồng độ primer. Tăng nồng độ primer kết hợp với tăng nồng độ Taq polymerase. Giảm nhiệt độ bắt cặp của primer xuống 2OC. Giảm nồng độ MgCl2. Giảm nồng độ MgCl2 kết hợp với giảm nhiệt độ bắt cặp.  Phƣơng pháp đổ gel agarose điện di + Bƣớc 1: Chuẩn bị gel agarose 1-2%. + Bƣớc 2: Làm nguội agarose đã đƣợc nấu chín đến 50 – 60OC, sau đĩ đổ vào khuơn đã đƣợc đặt lƣợc vào trƣớc. + Bƣớc 3: Lấy lƣợc ra, cho gel vào 1×TAE. + Bƣớc 4: Hút 2 µl loading dye trộn với 4 µl mẫu. + Bƣớc 5: Bơm vào các giếng một cách cẩn thận 4 µl mẫu + dung dịch đệm. + Bƣớc 6: Chạy điện di ở ở hiệu điện thế 90V/20 phút, cho đến khi thuốc nhuộm cách đầu tận cùng của gel là 1 cm. + Bƣớc 7: Lấy gel ra và ngâm vào dung dịch ethidium bromide (0,5 µg/ml) trong 20 phút. + Bƣớc 8: Rửa nhẹ gel dƣới vịi nƣớc chuyên dụng. + Bƣớc 9: Đọc kết quả dƣới tia UV, thẩm định kết quả với marker. + Bƣớc 10: Chụp bản gel để lƣu lại kết quả. 31 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA Kiểm tra và phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA trên 6 giống mía sản xuất và 10 giống nhập nội tại TTNCMĐ.  Kiểm tra bằng phƣơng pháp nhìn trực tiếp bằng mắt thƣờng: quan sát sự đổi màu của các giếng tuy nhiên trong 5 đĩa phân tích thì chỉ thấy giếng đối chứng dƣơng xuất hiện màu vàng, cịn tất cả các giếng cịn lại đều khơng cĩ màu. Kết quả lập lại tƣơng tự sau khi kiểm tra lại sau 30 phút, 1 giờ, 2 giờ (hình 4.1). - Kết luận: Tất cả các mẫu chẩn đốn đều âm tính (-) với SCMV. A B Hình 4.1. Kết quả chẩn đốn SCMV qua quan sát sự đổi màu trên đĩa ELISA. Chú thích: A: 2 giếng đối chứng dương cĩ màu vàng B: 2 giếng đối chứng âm khơng màu.  Kiểm tra bằng máy đọc ELISA: Kết quả cho ra âm tính với tất cả các mẫu phân tích, ngoại trừ đối chứng dƣơng (PC) là ra kết quả dƣơng tính (+). Kết quả cho tƣơng tự khi đọc lại sau 30 phút, 1 giờ, 2 giờ. - Kết luận: Tất cả các mẫu chẩn đốn đều âm tính (-) với SCMV. Từ kết quả phân tích ELISA là âm tính cho tất cả các mẫu này, ta cĩ thể kết luận rằng, các giống mía đƣợc điều tra cĩ kết quả âm tính với bệnh khảm lá mía. Điều này chứng tỏ bệnh khảm lá mía khơng xuất hiện trên các giống khảo sát. Kết quả này cũng phù hợp với những điều tra trƣớc đây về sự phân bố của bệnh là diễn ra ít hơn tại các vùng nhiệt đới (Lê Lƣơng Tề, 1999), và thực tế là các cuộc khảo sát gần đây tại TTNCMĐ đều cho kết quả là cĩ rất ít giống bị bệnh khảm (Hà Đình Tuấn, 2004; 32 Trƣơng Lê Bạch Liên, 2005). Kết quả gĩp phần thống kê tình hình nhiễm bệnh khảm lá mía trên các giống mía sản xuất khảo sát. Đặc biệt là, kết quả nghiên cứu cĩ ý nghĩa quan trọng trong cơng tác kiểm định các giống mía Thái Lan mới nhập nội năm 2005. Theo kết quả kiểm tra ELISA thì tất cả các giống mía Thái Lan nhập nội đều khơng bị nhiễm SCMV, từ đĩ cho phép tiến hành những nghiên cứu sâu hơn trong cơng tác lai tạo và chọn giống để thu đƣợc các giống mới năng xuất cao và sạch bệnh. Tuy nhiên kết quả trên vẫn chƣa khẳng định đƣợc trên tất cả các giống đã đƣợc kiểm tra ở trên nĩi riêng và các giống mía khác tại TTNCMĐ nĩi chung là khơng bị nhiễm bệnh đƣợc. Nguyên nhân cĩ thể giải thích là do: - Kỹ thuật ELISA chỉ cĩ tác dụng định tính chứ khơng cĩ tác dụng định lƣợng, do đĩ nếu trong mẫu cĩ hàm lƣợng virus tồn tại ở nồng độ thấp, khơng đủ độ nhạy cho ELISA phát hiện thì kết quả khi phân tích ELISA sẽ là âm tính (-). Cho nên kết quả ELISA này chỉ cĩ ý nghĩa trong một mức độ giới hạn nào đĩ và để cĩ kết quả chính xác hơn cần tiến hành phân tích với số lƣợng mẫu nhiều hơn trong cùng một giống cũng nhƣ kiểm tra bằng kỹ thuật sinh học phân tử (RT- PCR). - Quá trình khảo sát chỉ giới hạn trong 16 giống mía gồm 6 giống sản xuất và 10 giống Thái Lan nhập nội tại TTNCMĐ, trong khi giống mía tại đây thì cĩ rất nhiều. Do vậy chƣa thể kết luận đƣợc tồn bộ các giống mía đƣợc trồng tại đây là khơng bị nhiễm bệnh. Do vậy để chứng minh chính xác tác nhân gây bệnh là SCMV cần phải cĩ những nghiên cứu sâu hơn bằng kỹ thuật sinh học phân tử, cụ thể là kỹ thuật RT - PCR. Để tiến hành nghiên cứu này cần phải thực hiện ly trích RNA virus từ lá cây mía bị bệnh khảm lá mía, sau đĩ tiến hành tổng hợp cDNA và thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi chuyên biệt đƣợc thiết kế nhằm phát hiện SCMV. 4.2. Nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kỹ thuật PCR 4.2.1. Phát hiện Lxx bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi và phƣơng pháp nhuộm STM. Cơng tác điều tra và phát hiện bệnh cằn mía gốc đƣợc thực hiện trên 6 giống mía sản xuất tại TTNCMĐ và 5 giống mía tại nơng trƣờng Thọ Vực bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi (Hình 4.2) và nhuộm màu STM (Hình 4.3). 33 Hình 4.2. Vi khuẩn Lxx dƣới kính hiển vi (độ phĩng đại 1000 lần). Kết quả quan sát sự xuất hiện của vi khuẩn Lxx trong dịch chiết nƣớc mía dƣới kính hiển vi cho kết quả: trong 6 giống mía sản xuất đƣợc khảo sát tại TTNNCMĐ thì chỉ cĩ giống VN84-1437 và R570 là khơng nhiễm bệnh, cịn lại 4 giống mía khác là C90-127, DLM24, VN85-1427 và ROC26 đều thấy đƣợc sự xuất hiện của vi khuẩn Lxx dƣới kính hiển vi (xem Bảng 4.1). Tuy nhiên, phƣơng pháp chẩn đốn này cho tỉ lệ kết quả dƣơng tính giả và âm tính giả khá cao. Nguyên nhân ở đây là sự phát hiện vi khuẩn Lxx trong dịch chiết dƣới kính hiển vi ở độ phĩng đại 1000 lần là rất khĩ khi nồng độ vi khuẩn nhiễm bệnh hiện diện trong dịch chiết thấp. Bảng 4.1. Kết quả chẩn đốn bệnh cằn mía gốc trên các giống sản xuất tại TTNCMĐ và nơng trƣờng Thọ Vực bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi. TTNCMĐ Nơng trƣờng Thọ Vực STT Giống Kết quả STT Giống Kết quả 1 2 3 4 5 6 C90-127 VN84-4137 DLM24 R570 VN85-1427 ROC26 + - + - + + 1 2 3 4 5 Mi55-14 VN84-4137 QĐ368 VĐ85-177 VN85-1427 + - + + + Chú thích: - : Mẫu âm tính +: Mẫu dương tính. Thân mía đƣợc nhuộm bằng dung dịch thuốc nhuộm safranin, sau 30 phút làm tiêu bản xem dƣới kính hiển vi với độ phĩng đại 40 và 100 lần, ta sẽ thấy cĩ sự nhuộm màu 34 hay khơng nhuộm màu của các bĩ mạch khoẻ mạnh và bị nhiễm Lxx. (xem hình 4.3). Mạch đƣợc nhuộm màu đỏ của safranin là kết quả của sự thẩm thấu dung dịch thuốc nhuộm lên trên thân, cịn mạch khơng đƣợc nhuộm màu là do vi khuẩn Lxx tồn tại trong bĩ mạch làm tắt nghẽn sự lƣu thơng của dung dịch thuốc nhuộm đi lên lên trên. Hình 4.3. Mẫu thân nhuộm safranin dƣới kính hiển vi (x 40 lần (A) và x 100 lần (B)). Chú thích: a: mạch vàng cĩ chứa vi khuẩn; b: mạch đỏ là khơng cĩ vi khuẩn. Chẩn đốn bằng phƣơng pháp nhuộm STM cho kết quả: tất cả các giống mía sản xuất khảo sát tại TTNCMĐ và nơng trƣờng Thọ Vực đều bị nhiễm bệnh cằn mía gốc với các mức độ nhiễm bệnh khác nhau. (xem bảng 4.2). Bảng 4.2. Kết quả chẩn đốn bệnh cằn mía gốc dựa trên phƣơng pháp nhuộm STM. Chú thích: Tb: Trung bình TTNCMĐ Nơng trƣờng Thọ Vực TT Giống Tỉ lệ mạch nhuộm đỏ (%) Mức độ nhiễm bệnh TT Giống Tỉ lệ mạch nhuộm đỏ (%) Mức độ nhiễm bệnh 1 2 3 4 5 6 C90-127 VN84-4137 DLM24 R570 VN85-1427 ROC26 79,18 54,67 54,67 75,28 80,42 78,82 Tb Nặng Nặng Tb Tb Tb 1 2 3 4 5 My55-14 VN84-4137 QĐ368 VĐ85-177 VN85-1427 68,11 82,82 79,18 79,88 65,90 Nặng Tb Tb Tb Nặng Trung bình tỉ lệ mạch nhuộm đỏ 70,50 Trung bình 75,18 Trung bình a b 35 Bảng 4.2 cho thấy tỉ lệ mạch đƣợc nhuộm màu cĩ sự khác nhau giữa các giống: cao nhất ở giống VN84-4137 (82,82%) tại nơng trƣờng Thọ Vực, thấp nhất là giống VN84-4137 và DLM24 (54,67%) tại TTNCMĐ. Điều này tƣơng đƣơng với giống VN84-4137 tại Thọ Vực bị nhiễm trung bình, giống VN84-4137 và DLM24 bị nhiễm nặng với bệnh cằn mía gốc. Về kết quả phát hiện vi khuẩn Lxx thì phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi và phƣơng pháp nhuộm STM cho kết quả ở Bảng 4.3. Bảng 4.3. Kết quả chẩn đốn của hai phƣơng pháp: dùng kính hiển vi và nhuộm STM. Chú thích: STM: Nhuộm Safranin mơ cây mía - : Mẫu âm tính KHV: Chẩn đốn dựa vào kính hiển vi +: Mẫu dương tính Nhận xét: Kết quả chẩn đốn bệnh cằn mía gốc bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi và nhuộm STM trên các giống cho thấy rằng hầu nhƣ tất cả các giống sản xuất đƣợc kiểm tra tại TTNCMĐ và nơng trƣờng Thọ Vực đều bị nhiễm RSD. Nguyên nhân của tình hình trên cĩ thể là do thiếu sự nghiên cứu thống kê về tình hình bệnh, cũng nhƣ thơng kê số liệu về mức độ thiệt hại do bệnh cằn mía gốc gây ra ở nƣớc ta nĩi chung và các giống mía ở TTNCMĐ và nơng trƣờng Thọ Vực nĩi riêng. Từ đĩ ngƣời dân vẫn chƣa quan tâm đúng mức đến việc phịng chống tác nhân gây bệnh. Mặt khác, nguyên nhân cũng cĩ thể là do triệu chứng của bệnh cằn mía gốc khơng đặc trƣng và khĩ cĩ thể phân biệt đƣợc cây bị bệnh. Vì vậy ngƣời nơng dân sẽ khơng biết đƣợc ruộng mình bị nhiễm bệnh cằn mía gốc khi nào và đơi khi lầm lẫn TTNCMĐ Nơng trƣờng Thọ Vực STT Giống Phƣơng pháp chẩn đốn STT Giống Phƣơng pháp chẩn đốn KHV STM KHV STM 1 2 3 4 5 6 C90-127 VN84-4137 DLM24 R570 VN85-1427 ROC26 + - + - + + + + + + + + 1 2 3 4 5 My55-14 VN84-4137 QĐ368 VĐ85-177 VN85-1427 + - + + + + + + + + 36 rằng ruộng mình bị thiếu dinh dƣỡng hay bị sâu bệnh phá hoại. Kết quả cĩ ý nghĩa thực tiễn trong việc thống kê tình hình nhiễm bệnh RSD trên các giống mía khảo sát. 4.2.2. Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuơi cấy vi khuẩn Lxx và nhận dạng khuẩn lạc của nĩ trên mơi trƣờng nuơi cấy Vi khuẩn Lxx là vi khuẩn rất khĩ nuơi cấy trên mơi trƣờng nhân tạo, khuẩn lạc vi khuẩn theo nghiên cứu là phải mất đến khoảng 22 ngày nuơi cấy trên mơi trƣờng đặc trƣng mới hình thành đƣợc (Stevens Brumbley, 2003). Do vậy thời gian 2 tháng để nghiên cứu nuơi cấy vi khuẩn Lxx trên mơi trƣờng nhân tạo là quá ngắn và kết quả thu đƣợc cũng hạn chế, khơng cĩ bào tử của vi khuẩn Lxx hình thành. Tuy nhiên, sau quá trình nghiên cứu chúng tơi cũng thu đƣợc một số kết quả nhất định cụ thể nhƣ sau: - Quan sát và theo dõi quá trình hình thành khuẩn lạc của vi khuẩn Lxx trên mơi trƣờng nuơi cấy hàng ngày kể từ lúc bắt đầu cấy đến khoảng 15 - 22 ngày (ủ ở 28 OC). Theo đĩ thì chỉ sau khi cấy mẫu dịch chiết vào mơi trƣờng nuơi cấy 1 ngày thì các vi khuẩn đã bắt đầu mọc trên mơi trƣờng nuơi cấy. Đặc biệt là vào những ngày đầu tiên, đã cĩ sự xuất hiện của các khuẩn lạc giống nhƣ khuẩn lạc của vi khuẩn Lxx đƣợc Davis (1980) mơ tả ,đĩ là khuẩn lạc nhỏ đƣờng kính từ 0,1 - 0,3 mm, khơng màu. Tuy nhiên sau vài ngày nuơi cấy các khuẩn lạc này lớn dần lên và cĩ màu vàng (Hình 4.4). Thậm chí sau 15 - 20 ngày nuơi cấy vẫn cịn một số vùng trên đĩa nuơi cấy cĩ các khuẩn lạc cĩ kích thƣớc và hình dạng tƣơng tự, tuy nhiên khi phân lập ra mơi trƣờng trên đĩa khác thì lại khơng phải Lxx mà vẫn là loại vi khuẩn cĩ khuẩn lạc màu vàng này. A B Hình 4.4. Khuẩn lạc nhỏ tƣơng tự nhƣ khuẩn lạc Lxx trên mơi trƣờng sau 2 ngày nuơi cấy (A); và khuẩn lạc của nĩ sau khi phân lập (B). 37 - Theo quan sát thì cĩ khoảng 3 loại vi khuẩn tồn tại trên mơi trƣờng nuơi cấy và một số lồi nấm. Các loại này đều phát triển trên mơi trƣờng nuơi cấy đơi lúc nhanh (sau vài ngày) nhƣng cũng cĩ lúc chậm (nhiều đĩa nuơi cấy cĩ vi khuẩn mọc lên với hình dạng và kích thƣớc giống mơ tả, khuẩn lạc này giữ nguyên hình dạng và kích thƣớc cho đến 20 ngày sau nuơi cấy). Tuy nhiên đây khơng phải là vi khuẩn Lxx, mà vẫn là loại vi khuẩn cĩ khuẩn lạc màu vàng. Do hạn chế về mặt tài liệu nghiên cứu nên mơi trƣờng mà chúng tơi sử dụng để nuơi cấy vi khuẩn Lxx là mơi trƣờng SC (Davis, 1980) và cĩ bổ sung thêm một số thành phần theo Stevens Brumbley (2003) là chƣa hồn chỉnh. Theo nghiên cứu mới đây của Stevens Brumbley thì mơi trƣờng thích hợp hơn và thời gian hình thành bào tử ngắn hơn (khoảng 15 ngày) là do vi khuẩn đƣợc nuơi trên mơi trƣờng MSC (Teakle, 12992) cĩ bổ sung thêm methionine (L. E.Camargo và ctv, 2004). Cĩ sự tạp nhiễm trên là do thành phần mơi trƣờng nuơi cấy khơng thích hợp, các kháng sinh và acid amin khơng tinh nên khĩ tan trong dung dịch nƣớc. Mặt khác dịch vi khuẩn đƣa vào mơi trƣờng nuơi cấy là dịch khơng vơ trùng nên sẽ cĩ rất nhiều vi khuẩn hình thành trên mơi trƣờng rất giàu dinh dƣỡng cho vi khuẩn Lxx này. Do vậy cần thiết lập một quy trình chuẩn bị mẫu vơ trùng dành cho nuơi cấy vi khuẩn mới cĩ hiệu quả đƣợc. 4.2.3. PCR phát hiện vi khuẩn Lxx Song song với việc nuơi cấy vi khuẩn Lxx, chúng tơi cũng tiến hành chạy PCR trực tiếp trên dịch chiết của cây mía bị bệnh. Sau nhiều lần tiến hành thí nghiệm, thay đổi quy trình và sử dụng các chất bổ sung khác nhau vào phản ứng PCR, nhƣng kết quả PCR dựa vào cặp mồi của Stevens Brumbley (2003) đều khơng đạt đƣợc kết quả mong đợi. - Kết quả thí nghiệm 1: PCR theo protocol của Stevens Brumbley (2003). Kết quả điện di: Khơng cĩ sản phẩm trên gel điện di. Nhận xét: Nguồn mẫu DNA đƣợc chuẩn bị theo quy trình của Stevens Brumbley (2003) để chạy phản ứng PCR. Primer đƣợc đặt mới tại cơng ty Biorad với trình tự đƣợc blast trên NCBI cĩ kết quả cho bắt cặp đặc hiệu với vi khuẩn Lxx trên ngân hàng gen. Tuy nhiên kết quả điện di khơng cĩ thì nguyên nhân cĩ thể là do quy trình thực hiện chƣa tối ƣu hoặc do DNA mẫu 38 đƣa vào chƣa đƣợc biến tính tốt. - Thí nghiệm 2: Thay đổi cách chuẩn bị mẫu. Khảo sát hiệu quả của hai phƣơng pháp chuẩn bị mẫu: Biến tính bằng nhiệt và li trích DNA vi khuẩn Lxx. Chạy PCR theo thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt nhƣ ở thí nghiệm 1. Mẫu đƣợc chuẩn bị và đem đi đo OD, tính kết quả lƣợng DNA cĩ trong mẫu và thêm vào trong thành phần phản ứng PCR với nồng độ thƣờng dùng là 0,5 μM. Kết quả: khơng cĩ băng DNA trên gel điện di. Nhận xét: Do OD khơng cĩ tác dụng trong trƣờng hợp này vì dịch chiết nƣớc mía cĩ chứa nhiều nhân tố ức chế nên lƣợng DNA đo đƣợc khơng chính xác với thực tế DNA mẫu vi khuẩn trong mẫu. Tăng lƣợng DNA mẫu đƣa vào phản ứng PCR lên 1,5 và 2 lần cũng khơng cho kết quả vì điều này cũng đồng nghĩa với việc tăng các nhân tố ức chế phản ứng PCR. Hút DNA từ lớp trên của dịch biến tính đem chạy PCR. Tăng lƣợng DNA mẫu đƣa vào phản ứng với nồng độ gấp 1,5 lần, 2 lần. Kết quả: khơng cĩ băng DNA trên gel điện di. Nhận xét: DNA sau khi biến tính sẽ nằm ở lớp trên dung dịch vì vậy chúng tơi sử dụng lớp này chạy PCR nhằm thu lƣợng DNA sạch, Tuy nhiên kết quả PCR khơng cho sản phẩm khuyếch đại thì cĩ thể là do biến tính Lxx. Cĩ lẽ trong quá trình biến tính vi khuẩn bằng cách gia nhiệt, thành tế bào vi khuẩn bị phá vỡ và DNA vi khuẩn Lxx thốt ra ngồi, tuy nhiên quá trình này cũng giải phĩng ra các enzym phân hủy hoặc làm hƣ hỏng DNA vốn tồn tại trong tế bào. Do vậy chúng tơi thử nghiệm ly trích DNA vi khuẩn từ dịch chiết nƣớc mía. Thực hiện lọc mẫu dịch vi khuẩn ở màng lọc 0,4 μm; chuẩn bị mẫu cho phản ứng PCR, tƣơng tự nhƣ quy trình của Stevens Brumbley (2003). Nhận xét: Dùng màng lọc 0,4 μm lọc Lxx và kiểm tra vi khuẩn cĩ qua lỗ lọc khơng bằng cách quan sát dƣới kính hiển vi. Kết quả quan sát dƣới kính hiển vi kiểm tra khơng thấy cĩ sự hiện diện của vi khuẩn Lxx trong dịch lọc. Chúng tơi nhận định rằng cĩ thể màng lọc 0,4 μm cĩ kích thƣớc nhỏ nên vi khuẩn Lxx khơng qua đƣợc, hoặc cĩ qua nhƣng ít và khơng thể quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi. Do vậy chúng tơi vẫn tiếp tục thực hiện cách biến tính mẫu nhƣ quy trình của Stevens Brumbley và đem do OD sản phẩm, hút DNA mẫu ở lớp trên dịch biến tính để chạy PCR nhƣng vẫn khơng đạt đƣợc kết quả. Kết luận: Khơng 39 thể loại bỏ đƣợc các nhân tố ức chế phản ứng PCR trực tiếp trong dịch chiết nƣớc mía bằng cách ly tâm đƣợc. Li trích vi khuẩn Lxx trong dịch chiết nƣớc mía theo quy trình ly trích vi khuẩn thơng thƣờng. Kết quả: Khơng cĩ băng DNA vi khuẩn trên gel điện di sau li trích. Nhận xét: Cĩ thể do lƣợng vi khuẩn Lxx trong dịch chiết nƣớc mía cĩ ít nên thực hiện li trích DNA khơng cĩ kết quả. - Thí nghiệm 3: Khảo sát hiệu quả sử dụng của PVP trong PCR trực tiếp từ dịch chiết nƣớc mía. Kết quả: khơng cĩ sản phẩm PCR đích. Nhận xét: Tăng hàm lƣợng PVP vào phản ứng nhằm mục đích tăng cƣờng khả năng khử các nhân tố ức chế phản ứng PCR, tuy nhiên cĩ lẽ khi nồng độ PVP cao thì nĩ cũng quay lại ức chế phản ứng PCR do đĩ chúng tơi khơng tăng nồng độ PVP trong các thí nghiệm tiếp theo nữa. Do vậy chúng tơi tiếp tục làm thí nghiệm theo hai hƣớng. Thứ nhất là giữ nguyên cách chuẩn bị mẫu DNA cho PCR theo Stevens Brumbley (2003) và thay đổi quy trình phản ứng. Thứ hai là thay đổi quy trình chuẩn bị mẫu DNA cho PCR. - Thí nghiệm 4: Chuẩn bị mẫu theo quy trình của Stevens Brumbley. Khảo sát ảnh hƣởng của các thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt. Kết quả thí nghiệm: Khơng cĩ sản phẩm trên gel điện di. Tĩm lại, PCR là một hệ thống tƣơng thích các thành phần hĩa chất và chu trình nhiệt. Nhiều trƣờng hợp phản ứng PCR đƣợc thực hiện từ dịch DNA mẫu ly trích với mồi chuyên biệt nhƣng vẫn khơng ra kết quả. Vì vậy PCR trực tiếp từ dịch chiết nƣớc mía là một vấn đề rất khĩ thực hiện vì nguồn mẫu ban đầu là dịch chiết nƣớc mía khơng sạch, cĩ chứa nhiều nhân tố ức chế phản ứng PCR. Kết quả điện di sản phẩm sau các lần chạy PCR mà khơng cĩ băng DNA đích trên gel điện di thì cĩ thể là do rất nhiều nguyên nhân: - Cĩ thể là nguồn DNA mẫu đƣa vào trong phản ứng PCR khơng tinh sạch. Chúng tơi tiến hành ở đây là do trong dịch chiết cĩ quá nhiều chất lơ lửng, ức chế phản ứng PCR. Nguồn mẫu dịch chiết mà chúng tơi dùng để chạy phản ứng PCR đƣợc thu từ những cây cĩ triệu chứng điển hình ngồi đồng ruộng, kết hợp với kiểm tra quan sát sự xuất hiện vi khuẩn Lxx trong dịch chiết mía dƣới kính hiển vi và dƣơng tính khi nhuộm STM. Tuy nhiên mặc dù đã xác định đƣợc lƣợng mẫu đƣa 40 vào là cĩ vi khuẩn đích nhƣng cịn quá nhiều yếu tố khơng thể kiểm sốt đƣợc nhƣ các chất ức chế phản ứng cĩ trong dịch chiết nƣớc mía, lƣợng mẫu DNA thích hợp đƣa vào phản ứng. - Cĩ thể hĩa chất mà chúng tơi sử dụng sau nhiều lần thực hiện phản ứng đã làm đơng lạnh và rã đơng nhiều lần dẫn đến sự mất hoạt tính của hĩa chất đặc biệt là Taq DNA polymerase và primer. - Mặt khác các máy PCR khác nhau cũng cho kết quả khác nhau. Hiện TTPT cĩ 3 loại máy PCR và mỗi máy cĩ một chế độ lên xuống nhiệt độ theo chu kỳ nhiệt khác nhau (nhanh hay chậm) do vậy đây cũng là một nguyên nhân khơng thể loại trừ. Tuy nhiên sau khi thực hiện PCR luân phiên trên cả 3 loại máy vẫn khơng cĩ kết quả. 41 Phần 5. KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận - Các giống mía đƣợc khảo sát khơng bị nhiễm SCMV. - Tỉ lệ mơ cây khơng bị nhiễm bệnh cằn mía gốc trên các giống mía khảo sát trong phƣơng pháp nhuộm STM tại TTNCMĐ là 70,5%, tại nơng trƣờng Thọ vực là 75,18%. - Nuơi cấy phân lập vi khuẩn Lxx chƣa thu đƣợc khuẩn lạc. - Phát hiện vi khuẩn Lxx dựa vào kỹ thuật PCR trực tiếp dịch chiết nƣớc mía chƣa đạt đƣợc kết quả mong muốn. 5.2. Đề nghị - Tiến hành điều tra khảo sát tình hình bệnh khảm lá mía và cằn mía gốc trên nhiều giống mía ở các giai đoạn tăng trƣởng khác nhau, và thực hiện tại các vùng mía lận cận để cĩ cái nhìn tổng quát và chính xác hơn về tình hình diễn biến của bệnh tại 2 khu vực này. Đặc biệt là đối với bệnh cằn mía gốc, cần tiến hành bố trí thí nghiệm trên nhiều giống khác nhau đối chứng với giống khơng bị bệnh, để cuối cùng cĩ con số thống kê chính xác về tình hình và mức độ gây hại của bệnh hiện nay, từ đĩ cĩ những khuyến cáo thích hợp trong việc phịng trừ và kiểm sốt bệnh. - Qua quá trình tìm hiểu về bệnh cùng với sự hỗ trợ về kiến thức của GS. Stevens Brumbley (Australia), ngƣời đã cĩ kinh nghiệm nghiên cứu lâu năm về bệnh cằn mía gốc và vi khuẩn Lxx, chúng tơi xin đề nghị về quy trình nuơi cấy thu khuẩn lạc vi khuẩn Lxx, cũng nhƣ quy trình PCR trực tiếp từ dịch chiết nƣớc mía nhƣ sau trong các thí nghiệm tiếp theo nhƣ sau:  Quy trình nuơi cấy vi khuẩn Lxx  Xác định triệu chứng ngồi đồng ruộng.  Xác định cây nhiễm bệnh cằn mía gốc bằng phƣơng pháp nhuộm STM.  Thu dịch chiết (tiến hành vơ trùng), kiểm tra sự hiện diện của Lxx dƣới kính hiển vi điện tử hay đối pha (Phụ lục 1).  Nuơi cấy vi khuẩn trên mơi trƣờng MCS cĩ bổ sung các thành phần theo Stevens Brumbley (2003) và L. E Camargo (2004). 42  Tăng sinh trong mơi trƣờng lỏng S8 để thu sinh khối (Thành phần mơi trƣờng nuơi cấy cho ở Bảng phụ lục 2).  Quy trình PCR phát hiện vi khuẩn Lxx:  Nuơi cấy thu sinh khối vi khuẩn Lxx, thực hiện li trích DNA vi khuẩn Lxx theo quy trình cho ở Phụ lục 3.  Thực hiện phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn Lxx  Sau khi ổn định quy trình rồi thì tiến hành PCR trực tiếp từ dịch chiết nƣớc mía dựa trên đối chứng dƣơng là vi khuẩn Lxx đã nuơi cấy đƣợc. 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Bộ nơng nghiệp và phát triển nơng thơn, 8/2006. Báo cáo tổng kết mía đường năm 2005-2006. 2. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử. Nhà xuất bản nơng nghiệp. 3. Đỗ Ngọc Diệp, 2002. Nghiên cứu sâu đục thân hại mía và biện pháp phịng trừ ở vùng Đơng Nam Bộ. Luận án tiến sỹ, Đại học Nơng Nghiệp I, Hà Nội. 4. Hà Đình Tuấn, 2004. Điều tra thành phần hại mía trên một số giống mới nhập nội và khảo sát diễn biến bệnh hại quan trọng ở vùng mía nguyên liệu vùng Đơng Nam Bộ. Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp. Đại học Nơng Lâm TP. Hồ Chí Minh. 5. Lê Song Dự, Nguyễn Thị Quí Mùi, 1997. Cây mía. Nhà xuất bản Nơng nghiệp Tp. Hồ Chí Minh. 6. Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999. Bệnh vi khuẩn và virus hại cây trồng. Nhà xuất bản Giáo dục. 7. Nguyễn Thị Lang, 2002. Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu cơng nghệ sinh học. Nhà xuất bản Nơng nghiệp TP. Hồ Chí Minh. 8. Nguyễn Huy Ƣớc, 1994. Kỹ thuật trồng mía. Nhà xuất bản Nơng nghiệp. 9. Nguyễn Văn Tuất, 2002. Kỹ thuật chẩn đốn và giám định bệnh hại cây trồng. Nhà xuất bản Nơng nghiệp. 10. Phạm Văn Ty, 2001. Miễn dịch học. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Hà Nội. 11. Phan Gia Tân, 1990. Cây mía. Tủ sách ĐH Nơng Lâm. 12. Trƣơng Lê Bạch Liên, 2005. Điều tra và phát hiện bệnh khảm lá (Sugarcane Mosaic Virus) trên cây mía (Sacccharum spp) bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu xây dựng kỹ thuật RT-PCR. Luận văn tốt nghiệp kỹ sƣ Nơng học, Đại học Nơng Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 13. Vũ Triệu Mân, 2003. Chẩn đốn bệnh hại thực vật. Nhà xuất bản Nơng nghiệp. TIẾNG NƢỚC NGỒI 14. Andreas Westphal and T. Eril Mirkov, 2003. Need for improved detection of Ratoon stunting disease in Sugarcane in South Texas. Phytopathology 7: p 133 - 136. 44 15. Alfred. Hercules, 2000. Aurum Total RNA Mini Kit Instruction Manual Bio-Rad Laboratories, p 26-27. 16. Chemicon International, Inc - 28820 Single Oak Drive - Temecula, CA 92590, Introduction to Antibodies - Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) 17. Damann. K.E, Jr. 1988. Alkaline-induced metaxylem autofluorescence: a diagnostic symptom of ratoon stunting disease of sugarcane. Phytopathology 78: p 233 - 236. 18. Fegan, 1999. Sensitive and specific detection of Clavibacter xyli subsp. xyli, causal agent of ratoo stunting disease os sugarcane , with a polymerase chain reaction-based assay. Phytopathology, p 33 - 36. 19. John R. Crowther, 2001, The Elisa Guidebook – Volume 149, p 12 – 34. 20. Gillaspie Jr., A.G. Davis, M.J. (1992): Ratoonstunting disease of sugarcane. In Plant disease of International Importance. Disease of sugar, Forestand Plantation Crops, vol4 (A.N. Mukhopadhyay,J. Kamar, H.S. Chaube, U.S.Singh, eds). EnglewoodCliffs: New Jersey, Prentice Hall, p 41 – 61. 21. G.P. Rao, A. Salem Saumtally, Phillippe Rott. (2004). Sugarcane pathology. Volume III: Bacteria and nematode diseases, p 1 – 225. 22. Hoy J. W; Grisham M. P. and Damann K.E, 1999. Spread and increase of ratoon stunting disease and comparison of disease detection methods. In Plant disease. 23. Koike H, and Gillaspie A.G, 1989. Mosaic. In: Diseases of Sugarcane: Major diseases, (Edited by C. Recaud, B. T. Egan, A.G. Gillaspie, C. G. Hughes). International Society of Sugarcane Technologist, p 301-322. 24. P. Taylor and Stevens Brumbley, 2003. Development of PCR –based markers for detection of Leifsonia xyli subsp. xyli in fibrovascular fluid of infected sugarcane plants. CSIRO publishing. 25. Y Pan, 1998. A polymerase chain reaction protocol for detection of Clavibacter xyli subsp xyli, the causal bacterium of sugarcane ratoon stunting. Phytopathology: p 1 – 8. 26. Biowave vol.6 No.23 2004, tomato spotted wilt virus. 27. G.A. Dafalla, Plant Pathology Centre, Faculty of Agricultural Sciences,University of Gezira, Wad Medani, Sudan. 28. Introduction to Microbiology: Virus Genomes, 2005. xii PHỤ LỤC Phụ lục 1: Qui trình thu dịch chiết nƣớc mía. (Quy trình đƣợc đƣa ra bởi Stevens Brumbley - 2006) 1. Cắt hết lá của thân bị nhiễm bệnh. - Phụ thuộc vào chiều dài của mắt mía mà cắt đoạn thân ra cĩ chứa 3 - 4 mắt mía - Vì nồng độ vi khuẩn cao nhất ở dƣới thân cho nên lấy phần thân ở sát gốc mía. 2. Rửa thân bằng bàn chải và lau cho khơ bằng giấy lau. 3. Rửa sạch bằng nƣớc. 4. Ngâm thân mía vào trong dung dịch thuốc tẩy 10 % trong 10 phút. 5. Rửa sach dƣới vịi nƣớc máy. 6. Khử trùng thân mía bằng cồn 70 % và đốt để cho hết cồn cịn dƣ. 7. Cắt một đoạn thân mía ra và khử trùng đoạn thân này. 8. Dùng bơm đẩy khí từ một đầu và thu dịch chiết ở đầu kia bằng eppendorf vơ trùng. 9. Đổ dịch chiết trên vào mơi trƣờng nuơi cấy MSC. Kiểm tra mơi trƣờng nuơi cấy hàng ngày. xiii Phụ lục 2: Thành phần mơi trƣờng nuơi cấy vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Quy trình đƣợc đƣa ra bởi Stevens Brumbley - 2006) MƠI TRƢỜNG MSC ( CHO 1L MƠI TRƢỜNG)  Thành phần hấp vơ trùng: Corn meal agar = 17 g Bacto-agar = 4 g Bacto-peptone = 8 g MgSO47H2O = 0.2 g K2HPO4 (0.1 M ) = 13 ml KH2PO4 (0.1 M ) = 87 ml H2O = 800 ml  Thành phần lọc Glucose = 2 g Cysteine = 0.5 g Bovine serum albumin = 2 g H2O = 100 ml Bovine hemin chloride = 30 ml Hịa tan các thành phần hấp trong nƣớc và chỉnh về pH = 7,5 với 5 N NaOH. Hấp vơ trùng. Hịa tan các thành phần lọc vào trong nƣớc và thêm vào mơi trƣờng đƣợc hấp khi chúng ở 55OC bằng một màng lọc vơ trùng 0.22 m. MƠI TRƢỜNG LỎNG S8  Thành phần hấp vơ trùng Bacto - Soytone = 8 g Hemin chloride = 15 ml MgSO4 .7H2O = 0.2 g K2HPO4 = 0.35 g KH2PO4 = 1.1 g H2O = 885 ml  Thành phần lọc: Glucose = 2 g Cysteine = 0.5 g Bovine serum albumin = 2 g H2O = 100 ml 1) Hịa tan tất cả các thành phần trong nƣớc và chỉnh về pH 6,6 bằng NaOH 5N. 2) Hấp vơ trùng và trữ ở nhiệt độ phịng đến khi thêm các thành phần lọc vơ trùng vào. xiv Phụ lục 3: Quy trình li trích DNA vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Quy trình đƣợc đƣa ra bởi Stevens Brumbley - 2006) Quy trình gồm 14 bƣớc nhƣ sau: 1) Nuơi Lxx trong 50 ml mơi trƣờng lỏng S8. 2) Thu tế bào (ly tâm 6000 vịng trong 10 phút). 3) Huyền phù tế bào trong 2 ml lysis buffer (50 mM Tris, pH 8; 1 mM EDTA). 4) Ủ ở 37OC trong 30 phút. 5) Thêm 1/10 thể tích SDS vào để đạt nồng độ 1% SDS. 6) Thêm proteinase K đến nồng độ cuối cùng là 50 μg/ml. 7) Ủ ở 50 - 55OC trong 4 giờ. 8) Ly trích với phenol trung tính: chloroform : isoamyl alcohol cho đến khi bề mặt đƣợc rửa sạch. 9) Thêm ethanol lạnh vào với thể tích tăng 2 lần nhằm làm kết tủa acid nucleic. 10) Thu DNA bằng pipet, rửa cẩn thận bằng cồn 70%. 11) Xử lí bằng Rnase. 12) Tiếp tục thêm phenol : chloroform để kết tủa ethanol. 13) Thu DNA bằng pipet và rửa bằng cồn 70%. 14) Huyền phù DNA trong TE. xv Phụ lục 4: Danh sách bệnh hại mía quan trọng và phổ biến. Tên Việt Nam Tên tiếng Anh Tác nhân gây hại I Bệnh do nấm 1 Bệnh sọc nâu Brown stripe Cohliobalus stenospilus (Drechs) 2 Bênh mốc sƣơng Downy mildew Peronosclerospora sacchri (T. Miyake) 3 Bệnh đốm mắt én Eye spot Bipolaris sacchari shoemaker 4 Bênh đốm trắng White speck Bipolaris sacchari T.C.Lo 5 Bệnh cháy lá Leaf scorch Stagonospora sacchari Lo and Ling 6 Bệnh dứa Pinapple disease Ceratosystis paradoxa Moreau 7 Bệnh xoắn cổ lá Pokkah boeng Fusarium moniliform Sheldon 8 Bệnh thối đỏ Red rod Colectotrichum falcatum Went 9 Bệnh rỉ sắt đỏ Rust Puccinia melanopcephala H. &P. Syd 10 Bệnh rỉ sắt vàng Rust orange P. kuehnii Butl 11 Bệnh than Smut Ustilago senaminea Syd 12 Bệnh đốm vàng Yellow spot Mycovellosiella koepket 13 Bệnh đốm vịng Ring spot Leptosphaeria sacchari van Berda de Haan Bệnh do vi khuẩn 14 Bệnh gơm Gumming diease Xanthomonas camestris pv. Vasculorum 15 Bệnh thân ngọn đâm chồi Leaf scald Xanthomonas alibilineans (Ashby 1929) 16 Bệnh cằn mía gốc Ratoon stunting disease Leifsonia xyli subsp xyli (Davis et al, 1980) 17 Sọc đỏ Red stripe Pseudomonas rubrilineans (Lee et al) II Bệnh do Phytoplasma 18 Bênh chồi cỏ Grassy shoot 19 Bệnh trắng lá White leaf III Bệnh do virus 20 Bênh sọc vàng Chlorotich streak Chƣa rõ 21 Bệnh Fiji Fiji disease Fiji disease virus 22 Bệnh khảm Mosaic Sugarcane mosaic virus 23 Bệnh đốm sọc Streak Sugarcane streak virus 24 Vàng gân lá Sugarcane yellow leaf virus xvi Phụ lục 4: Một số hình ảnh về quá trình nghiên cứu bệnh khảm lá mía và cằn mía gốc. Hình PL1. Nhận dạng triệu chứng và thu mẫu. Hình PL2. Lá mía cĩ triệu chứng khảm. Hình PL3. Kết quả âm tính trong phân tích ELISA. Hình PL4. Bệnh đốm vịng thƣờng xuất hiện trên các cây khảo sát Hình PL5. Quá trình điều tra và thu mẫu. Hình PL6. Gốc mía bị cằn xvii Hình PL9,10. Vết đổi màu bên trong thân. Hình PL7. Đốt thân mía bị nhiễm Lxx nên ngắn lại. Hình PL8. Thân mía bị bệnh cĩ đƣờng kính nhỏ hơn thân bình thƣờng.