Luận văn Phân lập vi khuẩn bacillus subtilis trong phân heo và thử đối kháng với e. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** NGUYỄN QUỲNH NAM PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TRONG PHÂN HEO VÀ THỬ ĐỐI KHÁNG VỚI E. COLI GÂY BỆNH TIÊU CHẢY TRÊN HEO Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Cơng Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TRONG PHÂN HEO VÀ THỬ ĐỐI KHÁNG VỚI E. COLI GÂY BỆNH TIÊU CHẢY TRÊN HEO Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Cơng Nghệ Sinh Học Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS.Nguyễn Ngọc Hải Nguyễn Quỳnh Nam Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** ISOLATE BACILLUS SUBTILIS IN PIG FECES AND TEST THE ANTAGONISM WITH E. COLI K88 Graduation thesis Major: Biotechnology Professor Student Dr. Nguyễn Ngọc Hải Nguyễn Quỳnh Nam Term: 2002 - 2006 Ho Chi Minh City 09/2006 iii LỜI CẢM TẠ Con xin thành kính khắc ghi cơng lao khĩ nhọc của cha mẹ, Ngƣời đã sinh thành, dƣỡng dục và hy sinh tất cả để cho anh em con ăn học nên ngƣời. Con xin cảm ơn gia đình đã là chỗ dựa vững chắc cho con vững bƣớc qua mọi khĩ khăn. Em xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nơng Lâm Tp. HCM, ban Chủ Nhiệm bộ mơn Cơng Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện cho em thực hiện thành cơng khĩa luận. TS. Nguyễn Ngọc Hải đã tận tình hƣớng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi và trang bị cho em những kiến thức cần thiết nhất để em hồn tất khĩa luận này. Tồn thể Thầy, Cơ đã trang bị cho em những kiến thức quí báu. Các Thầy, Cơ tại phịng thực tập vi sinh đã hết lịng giúp đỡ và cho em những kinh nghiệm quí báu để em thực hiện thành cơng khĩa luận này. Các anh chị, các bạn cùng thực tập trong phịng vi sinh đã khuyến khích , ủng hộ và giúp đỡ để em thực hiện tốt khĩa luận này. Các bạn lớp cơng nghệ sinh học 28 đã luơn ở bên mình, động viên và nhiệt tình giúp đỡ mình trong suốt thời gian mình học tập cũng nhƣ trong lúc mình thực hiện khĩa luận này. Tp Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 07 năm 2006 Nguyễn Quỳnh Nam iv TĨM TẮT Enterotoxigenic E. coli là nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy phổ biến trên heo con và heo đang cai sữa, trong khi những hạn chế của kháng sinh trong việc khống chế E. coli gây bệnh tiêu chảy, thì các chế phẩm sinh học từ Bacillus subtilis chƣa thực sự hiệu quả trong phịng và trị bệnh. Trong đề tài này chúng tơi phân lập các chủng Bacillus subtilis trong phân heo cĩ khả năng ức chế mạnh sự phát triển của E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo. Chúng tơi phân lập đƣợc 22 chủng Bacillus subtilis trong phân heo, cĩ 13 chủng tạo đƣợc vịng kháng khuẩn với E. coli, cĩ thể sự tổng hợp của kháng sinh ức chế sự phát triển của E. coli đƣợc kích thích bởi một nồng độ E. coli đủ lớn, kháng sinh đƣợc Bacillus subtilis tổng hợp từ giai đoạn rất sớm của sự phát triển ( 0 giờ - 12 giờ ) khi cĩ sự hiện diện của E. coli. Cĩ 5 chủng cho thấy sự ức chế mạnh mẽ E. coli và nhạy cảm với các loại kháng sinh đƣợc thử nghiệm trừ colistin v MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ ............................................................................................................... i Tĩm tắt ................................................................................................................... ii Mục lục .................................................................................................................. iii Danh mục các chữ viết tắt ..................................................................................... iv Danh sách các hình ................................................................................................ v Danh sách các bảng ............................................................................................... vi 1. MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................. 1 1.2. Mục đích và yêu cầu .................................................................................. 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................ 3 2.1. E. coli gây bệnh tiêu chảy ......................................................................... 3 2.2. Enterotoxigenic E. coli .............................................................................. 4 2.2.1. Độc tố nhạy nhiệt LT ...................................................................... 4 2.2.1.1. Cấu tạo của LT-1 .................................................................. 4 2.2.1.2. Cơ chế tác động của độc tố LT-1 ......................................... 4 2.2.2. Độc tố kháng nhiệt .......................................................................... 5 2.2.2.1. Độc tố kháng nhiệt STa ........................................................ 5 2.2.2.2. Độc tố kháng nhiệt STb ........................................................ 6 2.2.3. Yếu tố gắn vào thành tế bào ruột của ETEC ................................... 7 2.3. Chế phẩm sinh học .................................................................................... 9 2.3.1. Định nghĩa ....................................................................................... 9 2.3.2. Cơ chế tác động .............................................................................. 9 2.3.3. Ứng dụng của chế phẩm sinh học .................................................. 9 2.3.4. Yêu cầu của chế phẩm sinh học .................................................... 10 2.3.5. Đặc điểm của chế phẩm sinh học ở dạng bào tử Bacillus subtilis 10 2.4. Bacillus subtilis ....................................................................................... 11 2.4.1. Đặc điểm phân loại ........................................................................ 11 2.4.2. Đặc điểm hình thái ........................................................................ 11 2.5. Kháng sinh đƣợc tổng hợp bởi Bacillus subtilis ...................................... 13 2.5.1. Giới thiệu ........................................................................................ 13 2.5.2. Peptide antibiotic đƣợc tổng hợp bằng ribosome ........................... 14 2.5.2.1. Subtilin ............................................................................... 14 2.5.2.2. Subtilosin ............................................................................ 15 2.5.2.3. Sublancin ............................................................................ 16 2.5.2.4. TasA ................................................................................... 16 2.5.3. Peptide antibiotic khơng đƣợc tổng hợp bằng ribosome ............... 18 2.5.3.1. Surfactin ............................................................................. 17 2.5.3.2. Fengycin ............................................................................. 19 2.5.3.3. Mycosubtilin ....................................................................... 29 2.5.3.4. Bacilysocin ......................................................................... 20 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 22 vi 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài .................................................... 22 3.1.1. Thời gian ....................................................................................... 22 3.1.2. Địa điểm ........................................................................................ 22 3.2. Vật liệu thí nghiệm ................................................................................... 22 3.2.1. Mẫu thí nghiệm ............................................................................. 22 3.2.2. Hĩa chất ......................................................................................... 22 3.2.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ...................................................... 22 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ......................................................................... 22 3.3.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo ...................... 22 3.3.2. Các phản ứng thử sinh hĩa ............................................................ 23 3.3.3. Thử đối kháng với E. coli trên mơi trƣờng TSA ........................... 24 3.3.4. Đánh giá sự đối kháng với E. coli trên mơi trƣờng TSB .............. 24 3.3.5. Thử kháng sinh đồ ......................................................................... 24 3.3.6. Đánh giá khả năng phân giải tinh bột trên mơi trƣờng thạch tinh bột 1% ........... 24 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................... 25 4.1. Kết quả .................................................................................................... 25 4.1.1. Kết quả phân lập Bacillus subtilis trong phân heo ........................ 25 4.1.2. Kết quả thử đối kháng với E. coli trên mơi trƣờng TSA ............... 27 4.1.3. Kết quả đối kháng trên mơi trƣờng TSB ....................................... 29 4.1.4. Kết quả thử kháng sinh đồ ............................................................. 30 4.1.5. Kết quả đánh giá khả năng phân giải tinh bột ............................... 32 4.2. Thảo luận .................................................................................................. 32 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................ 33 5.1. Kết luận ................................................................................................... 33 5.2. Đề nghị .................................................................................................... 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 34 PHỤ LỤC ............................................................................................................ 39 vii DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ETEC : Enterotoxigenic E. coli EAEC : Enteroaggregative E. coli LT : Heat-labile toxin ST : Heat-stable toxin CT : Cholera enterotoxin EAST : Enteroaggreative stable-toxin ENS : Enteric nervous system GC-C : Guanylate cyclase C ABC : ATP-binding cassette viii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 4.1 : Kết quả phân lập trên mơi trƣờng TSA .............................................. 25 Hình 4.2 : Đối kháng giữa Bacillus subtilis với E. coli trên mơi trƣờng TSA với nồng độ pha lỗng canh khuẩn E. coli là 10-2 ............................................................... 27 Hình 4.3 : Kết quả kháng sinh đồ ........................................................................ 31 Hình 4.4 : Hình phân giải tinh bột của Bacillus subtilis Biểu đồ 4.1: Biểu đồ biểu hiện sự thay đổi E. coli qua các thời điểm ................. 28 ix DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 4.1 : Kết quả độ lớn vịng kháng khuẩn của các chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc với E. coli ở nồng độ pha lỗng là 10-2 trên mơi trƣờng TSA ................... 27 Bảng 4.2 : Kết quả số lƣợng CFU/ml của E. coli qua từng khoảng thời gian 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ .......................................................................................... 29 Bảng 4.3 : Kết quả thử kháng sinh đồ đối với 5 chủng đƣợc thử đối kháng ....... 30 Bảng 4.4 : Kết quả tạo vịng phân giải tinh bột của các chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc trên mơi truờng thạch tinh bột 1% ................................................................. 32 1 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU 2. 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Enterotoxigenic E. coli là vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy phổ biến trong đƣờng tiêu hĩa của heo và ngƣời, chiếm đến 66,7% trƣờng hợp tiêu chảy trên heo cịn non và heo đang cai sữa gây thiệt hại lớn cho ngƣời chăn nuơi. Do tính chất đề kháng rất nhanh đối với nhiều loại kháng sinh của E. coli, thì việc sử dụng kháng sinh trở nên kém hiệu quả, đồng thời việc sử dụng kháng sinh dẫn đến xáo trộn hệ vi sinh vật nội tại và làm xuất hiện ngày càng nhiều những chủng vi khuẩn đề kháng với kháng sinh gây lo ngại cho ngƣời tiêu dùng, do đĩ sử dụng probiotic đƣợc xem nhƣ là một giải pháp thay thế hiệu quả cho kháng sinh. Hiện nay Bacillus subtilis đƣợc tập trung nghiên cứu nhiều do cĩ nhiều ƣu điểm thỏa mãn đƣợc yêu cầu của sản phẩm probiotic hơn so với các chủng vi sinh vật khác. Mặc dù vậy vẫn chƣa cĩ một sản phẩm probiotic từ Bacillus subtilis cĩ thể ngăn ngừa một cách cĩ hiệu quả bệnh tiêu chảy. Bên cạnh đĩ một số sản phẩm probiotic phịng bệnh tiêu chảy trên thị trƣờng của Việt Nam nhƣ Biosubtyl, Subtyl thì chủng vi khuẩn đƣợc sử dụng khơng phải vi khuẩn thuộc nhĩm Bacillus subtilis, đồng thời các chủng này kháng đƣợc nhiều loại kháng sinh (Ngơ Thị Hoa, 2000) nên cĩ khả năng phổ biến các gene kháng kháng sinh cho các vi khuẩn trong đƣờng ruột của thú. Do đĩ tiếp tục phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis cĩ khả năng ức chế một cách cĩ hiệu quả vi khuẩn E. coli gây bệnh tiêu chảy và khơng mang các gene kháng kháng sinh là điều cần thiết. Trƣớc tình hình đĩ đƣợc sự phân cơng của khoa cơng nghệ sinh học trƣờng Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh, với sự hƣớng dẫn của Ts. Nguyễn Ngọc Hải chúng tơi thực hiện đề tài “ Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo và thử đối kháng với E. coil gây bệnh tiêu chảy trên heo ”. 2 1.2 MỤC ĐÍCH , YÊU CẦU 1.2.1 Mục đích Phân lập đƣợc chủng vi khuẩn Bacillus subtilis cĩ khả năng đối kháng mạnh với chủng vi khuẩn E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo, nhằm phục vụ cho việc ứng dụng vào trong chăn nuơi. 1.2.2 Yêu cầu Phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo ở các hộ nuơi heo ở Đồng Nai và Bình Dƣơng. Chọn lọc đƣợc dịng Bacillus subtilis kháng khuẩn đối với E. coli. Đánh giá sự đối kháng giữa chủng Bacillus subtilis với E. coli gây bệnh trong mơi trƣờng TSB. Đánh giá sự an tồn về mặt sinh học của chủng vi khuẩn phân lập đƣợc bằng phƣơng pháp kháng sinh đồ. Đánh giá khả năng phân giải tinh bột trên mơi trƣờng thạch tinh bột 1%. 3 3. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4. 2.1 E. coli gây bệnh tiêu chảy Escherichia coli là vi khuẩn đƣờng ruột gram -, là lồi chiếm ƣu thế trong đƣờng tiêu hĩa của ngƣời và động vật, hầu hết E. coli là những chủng cĩ lợi giúp cân bằng hệ thống vi sinh vật đƣờng ruột tuy nhiên cĩ một số chủng cĩ khả năng gây bệnh cho ngƣời và động vật, trẻ sơ sinh và động vật cịn non dễ bị xâm nhiễm bởi những chủng gây bệnh khi hệ thống vi sinh vật đƣờng ruột bị rối loạn, cơ thể thú bị suy giảm miễn dịch, hoặc cơ thể thú nhạy cảm với một số chủng vi khuẩn nhất định. Để cĩ thể gây bệnh các chủng E. coli này cần phải gắn đƣợc vào tế bào thành ruột, tránh sự bảo vệ của cơ thể vật chủ, gia tăng số lƣợng sau đĩ làm tổn thƣơng các tế bào thành ruột, các loại E. coli gây bệnh khác nhau cĩ cơ chế gây bệnh khác nhau, do đĩ dựa vào sự tƣơng tác của E. coli với tế bào thành ruột cĩ thể chia các chủng E. coli gây bệnh thành ít nhất 6 loại: enterotoxigenic E. coli (ETEC), enterohemorrhagic E. coli (EHEC), enteroaggregative E. coli (EAEC), enteropathogenic E. coli (EPEC), enteroinvasive E. coli (EIEC), diffusely adherent E. coli (DAEC) (12). Các chủng E. coli gây bệnh cịn đƣợc phân biệt với nhau bằng các phản ứng ngƣng kết kháng nguyên. Sự xâm nhiễm của các chủng E. coli gây bệnh dẫn đến các rối loạn trong hệ thống tiêu hĩa, nhiễm trùng đƣờng tiết niệu, rối loạn hệ thần kinh trung ƣơng, sau khi cố định trên tế bào thành ruột các chủng E. coli này tiết ra độc tố làm tổn thƣơng các tế bào thành ruột, tất cả những gene qui định độc tính của vi khuẩn đƣợc mã hĩa trên cùng plasmid hoặc đƣợc tập trung trong một vùng nhiễm sắc thể của bộ gene vi khuẩn, cĩ một vài tính trạng riêng biệt đƣợc mã hĩa trên transposome hay phage. Trong 6 loại trên thì enterotoxigenic E. coli là loại phổ biến nhất gây bệnh trên heo. 2.2 Enterotoxigenic E. coli (ETEC) Enterotoxigenic E. coli là những chủng vi khuẩn cĩ khả năng tiết ra ít nhất là một thành viên trong trong 2 loại độc tố enterotoxin là: LT (heat-labile toxin), ST (heat-stable toxin). ETEC cĩ khả năng gây ra hiện tƣợng tiêu chảy trên heo, trên ngƣời và các lồi thú khác. Mỗi chủng ETEC cĩ thể mang gene mã hĩa cho 1 loại độc tố 4 hoặc cĩ thể cả 2 loại độc tố khác nhau, những gene này cĩ khả năng cùng đƣợc biểu hiện và gây bệnh cho tế bào vật chủ, trong đĩ thì LT cĩ ảnh hƣởng rất lớn đối với độc tính của vi khuẩn (11). 2.2.1 Độc tố nhạy nhiệt LT LT là độc tố nhạy cảm với nhiệt cĩ cấu trúc và cơ chế gây độc gần giống với cholera enterotoxin (CT) đƣợc sản xuất từ Vibrio cholerae, gene mã hĩa cho cấu trúc của độc tố LT nằm trên plasmid cĩ nguồn gốc từ vi khuẩn Vibrio cholerae. LT cĩ hai nhĩm chính là LT-1 và LT-2, hai độc tố này khơng cho đáp ứng miễn dịch chéo với nhau. LT-1 đƣợc biểu hiện trong các chủng E. coli gây bệnh trên ngƣời và động vật cịn LT-2 chỉ đƣợc tìm thấy trên những chủng E. coli phân lập đƣợc trên động vật và một số rất ít chủng phân lập đƣợc trên ngƣời tuy nhiên khơng cĩ bằng chứng cho thấy LT-2 cĩ khả năng gây bệnh do đĩ cơ chế tác động của độc tố LT tập chung chủ yếu vào LT-1. 2.2.1.1 Cấu tạo của LT-1 LT1-1 trọng lƣợng phân tử là 86 kDa đƣợc cấu tạo từ 1 tiểu đơn vị A cĩ trọng lƣợng phân tử 28 kDa và 5 tiểu đơn vị B cĩ trọng lƣợng phân tử 11,5 kDa, 5 tiểu đơn vị B sẽ gắn vào các thụ thể trên tế bào ruột cịn tiểu đơn vị A cĩ hoạt tính enzyme và tự phân cắt thành 2 tiểu đơn vị là A1 và A2 nối với nhau bằng cầu nối disulfic, LT-1 cĩ hai loại là LTh-1 cĩ độc tính trên ngƣời và LTp-1 cĩ độc tính trên heo. 2.2.1.2 Cơ chế tác động của độc tố LT-1 Sau khi gắn vào màng tế bào chủ LT-1 đƣợc chuyển vào trong tế bào, mục tiêu của LT-1 là adenylate cyclase, enzyme này nằm trên lớp màng phân cực của tế bào biểu mơ ruột. Tiểu đơn vị A1 cĩ hoạt tính ADP-ribosyltransferase hoạt động chuyển ADP từ NAD gắn vào tiểu đơn vị alpha của protein liên kết với GTP làm hoạt hĩa hoạt tính adenylate cyclase của tiểu đơn vị này, quá trình gắn ADP vào tiểu đơn vị làm adenylate cyclase hoạt động liên tục từ đĩ gia tăng hàm lƣợng cAMP nội bào, khi hàm lƣợng cAMP nội bào tăng, cAMP sẽ gắn vào và hoạt hĩa enzyme protein kinase A, enzyme này hoạt động làm phosphoryl hĩa kênh clorua nằm ở phía trên màng tế bào biểu mơ ruột, sự phosphoryl hĩa dẫn đến sự gia tăng hoạt động của kênh do đĩ ion clorua sẽ bị tiết ra ngồi qua các khe tiết đồng thời ức chế sự hấp thụ NaCl từ bên ngồi vào bởi các tế bào lơng ruột, do đĩ tăng nồng độ ion trong ruột làm nƣớc bên 5 trong tế bào bị kéo ngƣợc ra ngồi và dẫn đến hiện tƣợng tiêu chảy bên cạnh đĩ cịn cĩ các cơ chế khác liên quan đến hệ thống thần kinh ruột (ENS) và sự đáp ứng miễn dịch của tế bào thành ruột với độc tố cho nên cĩ ít nhất một cơ chế tác động đồng thời với cơ chế tăng hàm lƣợng cAMP. LT bị sử lý để mất hoạt tính ADP-ribosyltransferase cịn cĩ tác động nhƣ một tá dƣợc. LT-2 cĩ 55 – 57 % tƣơng đồng với LT-1 ở tiểu đơn vị A, nhƣng khơng cho thấy sự tƣơng đồng ở tiểu đơn vị B, LT-2 cĩ hai kiểu kháng nguyên khác nhau là LT-2a và LT-2b hai kiểu kháng nguyên này cĩ sự tƣơng đồng với nhau là 71% ở tiểu đơn vị A và 66% ở tiểu đơn vị B. LT-2 cĩ cơ chế tác động tƣơng tự LT-1 là gia tăng hàm lƣợng cAMP nội bào, khác biệt là receptor của LT-2 là GD1 cịn của LT-1 là GM1, tuy nhiên nhƣ đề cập ở trên thì khơng cĩ bằng chứng cho thấy LT-2 gây độc cho tế bào của ngƣời và động vật. 2.2.2 Độc tố kháng nhiệt (heat-stable toxin ST) ST là protein nhỏ chỉ đƣợc cấu tạo từ một đơn vị, nhƣng trong cấu trúc chứa nhiều amino acid cystein, do đĩ trong cấu trúc protein chứa nhiều cầu nối disulfic tính chất này dẫn đến khả năng kháng nhiệt của độc tố. Độc tố này cĩ hai loại, cĩ cấu trúc và cơ chế hoạt động khác biệt nhau là STa và STb, gene mã hĩa cho hai loại độc tố này đƣợc đƣợc qui định trên plasmid, một số gene đƣợc phát hiện nằm trên transposon. 2.2.2.1 Độc tố kháng nhiệt STa STa cĩ trọng lƣợng phân tử là 2kDa, cĩ hai dạng khác nhau là STap trong cấu trúc chứa 18 amino acid cĩ khả năng gây độc cho heo và ngƣời, dạng cịn lại là STah cấu tạo từ 19 amino acid chỉ gây độc cho ngƣời. Ban đầu STa đƣợc tổng hợp dƣới dạng pre-protoxin chứa 72 amino acid, sau đĩ đƣợc phân cắt thành peptide cĩ 52 acid amine, dạng peptide này đƣợc chuyển vào vùng periplasm sau đĩ hình thành cầu nối disulfic nhờ enzyme DsbA đƣợc mã hĩa trên genome của vi khuẩn, sau đĩ dạng protoxin sẽ đƣợc cắt thành dạng toxin hồn chỉnh và đƣợc khuếch tán qua vách tế bào. Ngồi ETEC ra thì STa cịn đƣợc tổng hợp bởi một vài chủng vi khuẩn gram (–) khác nhƣ Yersinia enterocolitica và V. cholerae non-O1, bên cạnh đĩ STa cĩ 50% protein tƣơng đồng với độc tố EAST1 ST của EAEC. 6 Receptor của STa là enzyme xuyên màng đƣợc gọi là guanylate cyclase C (GC-C), GC-C nằm trên phần đầu màng của tế bào biểu mơ ruột, protein này là receptor của hormone guanylin của thú, hocmone này cĩ 15 amino acid trong đĩ cĩ 4 cystein đĩng vai trị giúp cân bằng trạng thái bình thƣờng của ruột, cơ chế tác động của receptor này với guanylin dựa vào cơ chế ligand-receptor, đĩ là cơ chế receptor gắn với ligand tiếp nhận các thơng tin ngoại bào từ đĩ thúc đẩy sự hoạt động của các enzyme nội bào. Tƣơng tự nhƣ vậy sau khi liên kết với receeptor STa thúc đẩy họat tính guanylate cyclase của enzyme này làm gia tăng hàm lƣợng cGMP nội bào, cGMP hoạt hĩa protein kinase G hoạt động của enzyme này làm tăng hoạt động của kênh clorua, làm đẩy mạnh việc tiết ion clorua và ức chế sự hấp thu NaCl dẫn đến dịch ruột bị tiết ra ngồi gây nên hiện tƣợng tiêu chảy. Độc tố STa tác động nhanh hơn LT do khơng cần phải chuyển vào bên trong tế bào mà truyền tín hiệu trực tiếp vào bên trong. Ngồi GC-C ra thì STa cĩ thể cịn cĩ các receptor khác tuy nhiên GC-C là receptor chiếm ƣu thế nhất. 2.2.2.2 Độc tố kháng nhiệt STb STb ban đầu cũng đƣợc tổng hợp dƣới dạng pretoxin cĩ 72 acid amine sau đĩ đƣợc chế biến thành dạng protein hồn chỉnh cĩ 48 acid amine, protein này cĩ trọng lƣợng phân tử là 5,1kDa, cấu trúc của STb khơng tƣơng đồng với STa mặc dù trong cấu tạo của nĩ cũng cĩ 4 amino acid cystein, STb làm tổn thƣơng các tế bào ruột do tác động lên các lơng ruột dẫn đến các lơng tơ trên tế bào biểu mơ bị mất hoặc bị thu ngắn lại, receptor của STb vẫn chƣa đƣợc xác định cĩ thể độc tố này gắn vào những vùng khơng chuyên biệt trên màng tế bào trƣớc khi đƣợc đƣa vào trong, tác động của STb trong tế bào khơng giống nhƣ STa thay vì phân tiết clorua, độc tố này dẫn đến việc phân tiết bicarbonat, STb khơng làm gia tăng hàm lƣợng cAMP hay cGMP nội bào mà tác động của nĩ làm tăng hàm lƣợng calcium nội bào bằng cách hấp thu từ bên ngồi, ngồi ra tác động của nĩ cịn làm tăng sự phân tiết PGE2 và serotonin cho thấy tác động của STb cĩ liên quan đến hệ thống thần kinh ruột (ENS). Cơ chế tác động của độc tố LT và ST đƣợc trình bày ở hình bên dƣới 7 2.2.3 Các yếu tố gắn vào thành tế bào ruột của ETEC Để cĩ thể gây bệnh các chủng ETEC phải gắn đƣợc vào thành tế bào biểu mơ ruột, khả năng gắn đƣợc vào thành tế bào ruột non càng lớn thì mức độ gây bệnh càng lớn, việc gắn vào thành tế bào ruột đƣợc thực hiện bởi một thành phần trên lớp capsule của vi khuẩn gọi là fimbriae, fimbriae cĩ cấu tạo nhỏ và chiếm một số lƣợng lớn hơn tiêm mao (flagella) của vi khuẩn, fimbriae cĩ nhiều hình dạng và cấu trúc khác nhau, mỗi fimbriae cĩ một receptor chuyên biệt trên thành biểu mơ ruột các receptor này cĩ cấu tạo là IMTGP (intestinal mucin-type glycoprotein). Fimbriae xuất hiện trên cả vi khuẩn E. coli gây bệnh cũng nhƣ khơng gây bệnh nĩ giúp cho vi khuẩn chống việc bị loại thải bởi nhu động ruột, một vi khuẩn cĩ thể cĩ nhiều loại fimbriae khác nhau, fimbriae nằm trên capsule cho nên kháng nguyên bề mặt là kháng nguyên K tuy nhiên nĩ đƣợc cấu tạo là protein nên cịn đƣợc gọi là kháng nguyên F, các fimbriae khác nhau đƣợc phân biệt bằng hình thái và khả năng ngƣng kết hồng cầu. Mỗi loại ETEC gây bệnh cho những lồi khác nhau thƣờng biểu hiện một loại fimbriae riêng biệt. 8 Bảng bên dƣới thể hiện một vài kháng nguyên và đối tƣợng gây bệnh của nĩ (13). Kháng nguyên Đối tƣợng gây bệnh Serogroup O K88 Heo con 08, 045, 0138, 0141, 0147, 0149, 0157 987P Heo con 09, 020, 0141 K99 Cừu, bê 08, 09, 020, 0101 K99 Heo con 064, 0101 K41 Bê 09, 0101 CFA\1 Ngƣời 015, 025, 063, 078 CFA\2 Ngƣời 06,08 Khả năng tổng hợp enterotoxin và hiện diện của fimbriae cĩ sự liên hệ với nhau (13). Fimbriae Enterotoxin ST LT LT+ST K880 987P K99 K41 CFA\1 CFA\2 + + + + - - + - - + - - + + + - - + 2.3 Chế phẩm sinh học (probiotic) 2.3.1 Định nghĩa Probiotic đã đƣợc sử dụng hàng ngàn năm trƣớc khi mà các sản phẩm sữa chua (yaourt) đƣợc sử dụng. Cĩ nhiều định nghĩa khác nhau về probiotic, hiện nay thuật ngữ probiotic đƣợc sử dụng để chỉ những sản phẩm chứa vi sinh vật sống để cải thiện hệ vi sinh vật nội tại (Trần Thị Dân, 2005). Cĩ nhiều chế phẩm sinh học khác nhau đã đƣợc thƣơng mại hĩa, cĩ loại chỉ chứa một lồi vi sinh vật, cĩ loại chứa hai hay nhiều loại vi 9 sinh vật khác nhau. Các loại vi sinh vật cĩ lợi đƣợc sử dụng phổ biến nhất là các lồi của lactobacilli, streptococcus, bifidobacterium ssp, bacillus ssp.v.v..(2), (9). 2.3.2 Cơ chế tác động Tuy đã đƣợc sử dụng từ rất lâu nhƣng cơ chế tác động của probiotic vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu một cách rõ ràng do hiệu quả tác động của nĩ chịu ảnh hƣởng bởi nhiều yếu tố khác nhau. Fuller (1992) đã đề nghị cơ chế tác động của probiotic cĩ thể là (2)  Cạnh tranh thụ thể kết dính trên biểu mơ tế bào tiêu hĩa.  Cạnh tranh chất dinh dƣỡng giới hạn với vi sinh vật gây bệnh, tuy nhiên cơ chế này chƣa đƣợc chứng minh một cách rõ ràng trong điều kiện in vivo.  Sản xuất chất kháng khuẩn nhƣ các acid hữu cơ, bacteriocin.v.v.  Kích thích hệ miễn dịch. Probiotic cĩ giá trị khoa học, tuy nhiên lợi ích của nĩ chỉ thể hiện khi thú cĩ sức khỏe kém, stress hoặc xáo trộn hệ vi sinh vật đƣờng ruột (2). 2.3.3 Ứng dụng của chế phẩm sinh học Probiotic đƣợc sử dụng để phịng và chữa trị một phổ lớn các bệnh đƣờng ruột nhƣ là bệnh tiêu chảy do sự xâm nhiễm của vi sinh vật gây bệnh, virus, sử dụng kháng sinh và dinh dƣỡng, bệnh viêm ruột, hội chứng dễ bị kích thích của ruột, ngồi ra cịn đƣợc sử dụng để bổ sung các enzyme tiêu hĩa mà cơ thể tiết ra khơng đủ nhƣ sucrase, maltase (9). Các vi sinh vật cĩ lợi trong probiotic sẽ ức chế vi sinh vật gây bệnh để hệ thống vi sinh vật trong đƣờng ruột cĩ thể phục hồi. Probiotic giúp cho thú tăng trọng nhanh hơn trên một đơn vị thức ăn do vi sinh vật trong probiotic tiết ra các enzyme tiêu hĩa nhƣ amylase, protease làm tăng hệ số chuyển hĩa thức ăn của thú. 2.3.4 Yêu cầu của chế phẩm sinh học An tồn là điều tiên quyết đối với một chế phẩm sinh học, các chủng vi sinh vật đƣợc sử dụng làm chế phẩm sinh học phải khơng mang gene gây độc cho ngƣời và động vật. Chủng vi sinh vật đƣợc chọn để làm chế phẩm phải chống chịu đƣợc điều kiện pH thấp của dạ dày, muối mật, enzyme tiêu hĩa đồng thời phải cĩ khả năng bám và tạo khuẩn lạc trên thành ruột (9). 10 Chế phẩm sinh học phải cho đƣợc hiệu quả cao trong phịng, trị bệnh hoặc trong cải thiện dinh dƣỡng của thú. Vi sinh vật đƣợc sử dụng làm chế phẩm sinh học phải cĩ tính đối kháng mạnh với nhiều chủng vi sinh vật khác nhau hoặc làm tăng hiệu quả sử dụng thức ăn một cách cĩ ý nghĩa. Giá thành cĩ ý nghĩa rất lớn đối với sự phổ biến của sản phẩm, vi sinh vật đƣợc tuyển chọn làm chế phẩm sinh học phải phát triển mạnh, qui trình nuơi cấy và sản xuất phải đơn giản khơng tốn kém. Dễ sử dụng và bảo quản, cách sử dụng phải đơn giản, vi sinh vật phải tồn tại đƣợc trong thời gian dài ở điều kiện bảo quản bình thƣờng. 2.3.5 Đặc điểm của chế phẩm sinh học ở dạng bào tử Bacillus subtilis Điều khác biệt đối với các sản phẩm probiotic khác là các sản phẩm probiotic cĩ nguồn gốc từ bacillus sp đƣợc sản xuất ở dạng bào tử do đĩ những sản phẩm này cĩ nhiều ƣu điểm hơn so với các sản phẩm khác là dễ sản xuất, giá thành sản xuất rẽ, bào tử chịu đựng đƣợc các điều kiện trong quá trình sản xuất, dễ bảo quản, thời gian bảo quản dài, bào tử cĩ khả năng đề kháng tốt với acid dạ dày, muối mật, enzyme tiêu hĩa….Trong các lồi vi khuẩn khác nhau thuộc giống bacillus thì Bacillus subtilis đƣợc tập trung nhiều nhất vì các dịng vi khuẩn của Bacillus subtilis khơng mang những gene gây độc cho ngƣời và thú, quá trình hình thành bào tử của Bacillus subtilis đƣợc nghiên cứu một cách chi tiết, đồng thời những nghiên cứu gần đây cho thấy bào tử của Bacillus subtilis cĩ khả năng nảy mầm đƣợc trên phần đầu của ruột non (3). Điều này làm cho việc nghiên cứu Bacillus subtilis để sản xuất probiotic đƣợc đẩy mạnh. 2.4 Bacillus subtilis 2.4.1 Đặc điểm phân loại Theo phân loại của Bergey (1994). Bacillus subtilis thuộc. Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Lồi: Bacillus subtilis 2.4.2 Đặc điểm hình thái Bacillus subtilis là trực khuẩn, gram (+), sinh nội bào tử, kích thƣớc 0,5- 0,8μm x 1,8-3μm là vi khuẩn hiếu khí tùy nghi, tế bào ít khi tạo thành chuỗi thƣờng ở 11 dạng đơn bào, hiện diện nhiều trong đất, nƣớc, trong đƣờng tiêu hĩa của ngƣời và động vật. Hình dạng của Bacillus subtilis trên mơi trƣờng TSA là khuẩn lạc khơ, cĩ rìa răng cƣa, cĩ đƣờng kính 3-5mm nằm sát trên bề mặt thạch. Hình 2.1: Khuẩn lạc Bacillus subtilis trên mơi trƣờng TSA và nhuộm gram của Bacillus subtilis Các phản ứng sinh hĩa đƣợc sử dụng để để khẳng định Bacillus subtilis. Phản ứng lecithinase (-), khả năng phân giải casein (+), khả năng phân giải tinh bột (+), phân giải gelatin (+), phản ứng khử nitrate (+), phản ứng khử citrate (+), VP (+), indol (-), lên men khơng sinh hơi các loại đƣờng nhƣ: glucose, mannitol, saccharose, xylose, arabinose. Bacillus subtilis là vi khuẩn gram (+) đƣợc tập trung nghiên cứu nhiều nhất cho đến thời điểm hiện nay, bộ genome của lồi này đã đƣợc giải mã tồn bộ, bộ gene cĩ 4 Mbp (23), trọng lƣợng của bộ genome khoảng 2,4×109 đến 2,6×109 dalton đặc biệt trong genome của Bacillus subtilis cĩ nhiều gene qui định cho khả năng kháng lại kháng sinh nhƣ gene kháng thiostrepton, streptomycin, erythromycin, spectinomycin, chloramphenicol, penicilin.v.v…(8) tuy nhiên bất kể là gene kháng kháng sinh đƣợc qui định trên genome hay trên plasmid nĩ cũng là nguồn cung cấp gene kháng kháng sinh cho các vi sinh vật đƣờng ruột. Ở điều kiện kỵ khí Bacillus subtilis sử dụng nitrate nhƣ chất nhận điện tử cuối cùng, nếu trong mơi trƣờng thiếu nitrate thì Bacillus subtilis phát triển bằng cách lên men. Trong mơi trƣờng nuơi cấy Bacillus subtilis tiết ra exopolysacharide để gắn kết các tế bào lại với nhau để tạo màng sinh học (biofilm) (10). Màng sinh học giúp cho Bacillus subtilis cĩ ƣu thế trong việc cạnh tranh với các vi sinh vật khác trong mơi 12 trƣờng tự nhiên đồng thời màng sinh học nổi lên trên bề mặt mơi trƣờng giúp cho vi khuẩn cĩ thể tiếp xúc trực tiếp với oxy trong khơng khí. Sản xuất các chất diệt khuẩn khác nhau, cĩ nhiều nghiên cứu cho thấy Bacillus subtilis cĩ khả năng sản xuất nhiều hợp chất kháng khuẩn khác nhau cĩ khả năng ức chế sự phát triển của một số vi sinh vật gây bệnh nhƣ Clostridium perfringens, Helicobacter pylori, Escherichia coli 078:K80.v.v… (5). Vi khuẩn Bacillus subtilis đƣợc ứng dụng để sản xuất các loại enzyme khác nhau nhƣ amylase, protease đồng thời cũng đƣợc ứng dụng để sản xuất sản phẩm lên men truyền thống natto của Nhật Bản. Khi gặp điều kiện bất lợi Bacillus subtilis cĩ khả năng hình thành bào tử, bào tử cĩ thể tồn tại rất lâu trong tự nhiên cĩ thể đến hàng ngàn năm và cĩ thể phát triển lại thành tế bào sinh dƣỡng hồn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi. Hiện nay bào tử của Bacillus subtilis đang đƣợc quan tâm để sản xuất ra các vaccin thế hệ mới, bằng kĩ thuật di truyền đã chuyển gene qui định độc tố thƣơng hàn vào Bacillus subtilis và trong quá trình hình thành bào tử gene này cũng đƣợc biểu hiện để sản xuất ra những protein kháng nguyên trên lớp vỏ bào tử (7). 2.5 Kháng sinh đƣợc tổng hợp bởi Bacillus subtilis 2.5.1 Giới thiệu Peptide antibiotic là sản phẩm chuyển hĩa bậc hai của nhiều loại vi sinh vật khác nhau, giúp chúng cĩ ƣu thế trong cạnh tranh với các vi sinh vật khác trong mơi trƣờng cũng nhƣ trong quá trình tạo bào tử và nảy mầm. Peptide antibiotic cĩ bản chất là các peptide cĩ trọng lƣợng phân tử nhỏ, depsipeptide, peptidolactone, lipopeptide, đƣợc phân thành hai lớp là peptide đƣợc tổng hợp bằng ribosome cịn đƣợc gọi là bacteriosin, cịn lại là lớp peptide khơng đƣợc tổng hợp bằng ribosome (16). Bacillus subtilis cĩ khả năng tổng hợp hơn 20 loại kháng sinh khác nhau nhƣ subtilin, subtilosin A, TasA, sublancin cĩ bản chất là bacteriocin cịn bacilysin, chlorotetain, mycobacillin, rhizocticins, bacillaene, difficidin và các lipopeptide cĩ tính kháng khuẩn là các antibiotic khơng đƣợc tổng hợp bằng ribosome (20). Bacteriocin đƣợc tổng hợp dƣới dạng tiền peptide cĩ chứa một đoạn tín hiệu giúp cho enzyme tiết nhận biết, đồng thời ức chế sự tác động của bacteriocin trong tế bào, dạng tiền peptide sau đĩ đƣợc chuyển lên màng nguyên sinh chất tại đây xãy ra 13 các phản ứng biến đổi sau dịch mã, cắt đoạn peptide tín hiệu ở đầu C của tiền chất để thành dạng hồn chỉnh, sau đĩ đƣợc tiết ra ngồi bằng phức hợp bơm protein ABC (ATP-binding cassette transport complex) gắn với màng tế bào chất (16). Các peptide antibiotic khơng tổng hợp bằng ribosome thì đƣợc tổng hợp bằng các enzyme cĩ cấu trúc phân tử lớn, bên trong cấu trúc đƣợc chia thành nhiều module khác nhau mỗi module chịu trách nhiệm hoạt hĩa một amino acid chuyên biệt, các module đƣợc sắp xếp theo trình tự tƣơng ứng với trình tự các amino acid trên chuỗi peptide (16). Lipopeptide cĩ tính kháng khuẩn đƣợc chia thành 3 họ khác nhau là surfactin, fengycin và iturin, lipopeptide đƣợc cấu tạo bằng vịng peptide cĩ cấu tạo từ 7 (họ surfactin và iturin) hoặc 10 (họ fengycin) amino acid liên kết với nhĩm –COOH và nhĩm hydroxy (họ surfactin và fengycin) hoặc nhĩm amino (họ iturin) tại vị trí β của acid béo. Chiều dài của chuỗi acid béo thay đổi từ C13 đến C16 đối với lipopeptide thuộc họ surfactin, từ C14 đến C17 đối với họ iturin và từ C14 đến C18 trong trƣờng hợp của họ fengycin (20). 2.5.2 Peptipe antibiotic đƣợc tổng hợp bằng ribosome 2.5.2.1 Subtilin Subtilin là bacteriocin thuộc nhĩm I lantibiotic, những antibiotic thuộc nhĩm Lantibiotic cĩ tính kháng khuẩn mạnh đối với vi khuẩn gram dƣơng nhƣ Propionibacterium acnes, staphylococci, streptococci và clostridia. Cấu tạo của subtilin cĩ chứa các amino acid khơng bình thƣờng lanthionin, β-methyllanthionin, D- alanin, dehydroalanin, dehydrobutyrin, cầu nối sulfic đƣợc hình thành giữa các amino acid này tạo nên nhiều cấu trúc dạng vịng trong cấu tạo của subtilin. Các amino acid khơng bình thƣờng đƣợc tạo ra do quá trình biến đổi sau dịch mã của subtilin (28). Subtilin cĩ khả năng chịu nhiệt rất cao, khơng mất hoạt tính khi hấp autoclave ở pH 2, tác động của subtilin là ức chế sự phát triển của vi sinh vật bằng cách gắn với màng nguyên sinh chất bằng tƣơng tác giữa điện tử tự do sinh ra bởi sự dehydrate với các nhĩm sulfhydryl trên màng nguyên sinh chất làm ảnh hƣởng đến hệ thống vận chuyển các chất cĩ trọng lƣợng phân tử nhỏ và hệ thống trao đổi proton. Subtilin đƣợc tổng hợp trong pha tăng trƣởng và đạt nồng độ cao nhất ở đầu pha cân bằng (29). 14 Operon của subtilin gồm cĩ spaS mã hĩa cho tiền peptide của subtilin, spaB và spaC mã hĩa cho enzyme thực hiện các phản ứng biến đổi sau dịch mã, spaT mã hĩa cho enzyme chuyển dạng tiền chất của subtilin lên màng tế bào chất , spaR và spaK mã hĩa cho protein điều hịa quá trình tổng hợp subtilin (27), spaI mã hĩa cho thành phần protein của lipopeptide SpaI giúp bảo vệ tế bào vi khuẩn chống lại sự tác động của subtilin, spaF, spaE, spaG mã hĩa cho hệ thống chuyển ABC thực hiện tiết subtilin ra ngồi mơi trƣờng bên ngồi (26). Cấu trúc của subtilin, thứ tự các gene trên operon spaIEFG đƣợc thể hiện ở Hình 2.2 (phụ lục). Quá trình điều hịa, tổng hợp, biến đổi sau dịch mã và phân tiết của subtilin. Sự tổng hợp subtilin đƣợc điều hịa bằng hệ thống điều hịa hai thành phần là protein SpaK và SpaR. SpaK là protein xuyên màng với đầu cuối N nằm trong tế bào chất. Khi nồng độ vi sinh vật trong mơi trƣờng nuơi cấy tăng cao hoặc cĩ sự hiện diện của subtilin hay các antibiotic cĩ cấu trúc tƣơng tự (nisin) trong mơi trƣờng nuơi cấy. SpaK tiếp nhận tín hiệu rồi truyền vào bên trong bằng cách tự phosphoryl hĩa His ở vị trí 247 ở đầu N sau đĩ sẽ chuyển gốc phosphat đến amino acid Asp ở vị trí 51 của protein SpaR , SpaR sẽ gắn vào promoter thúc đẩy sự biểu hiện của gene spaB, spaT, spaC, spaS đồng thời cũng điều hịa sự tổng hợp của spaI, spaF, spaE, spaG. Ngồi ra operon của subtilin cịn đƣợc điều hịa bởi yếu tố H (27). Subtilin ban đẩu đƣợc tổng hợp ở dạng tiền chất cĩ 56 amino acid, dạng tiền chất này đƣợc SpaT chuyển lên màng tế bào chất, tại đây dạng tiền chất của subtilin đƣợc biến đổi thành dạng subtilin hồn chỉnh cĩ 32 amino acid. Sau đĩ subtilin đƣợc chuyển ra ngồi bằng hệ thống chuyển ABC do SpaF, SpaE, SpaG hợp thành. Lipoprotein SpaI định vị ở bề mặt ngồi của lớp màng tế bào cĩ tác dụng ngăn chặn sự tác động của subtilin vừa đƣợc tiết ra lên màng tế bào chất của Bacillus subtilis (26). 2.5.2.2 Subtilosin Subtilosin là bacteriocin cĩ tính kháng khuẩn mạnh đối với Listeria monocytogenes và Bacillus cereus (24), cấu trúc dạng vịng, tiền peptide cĩ 43 amino acid, Asn ở vị trí 9 tạo liên kết với Gly ở đầu cuối C, đoạn tín hiệu ở đầu cuối N đƣợc cắt để tạo thành cấu trúc dạng vịng, Phe và Thr đƣợc biến đổi sau dịch mã dẫn đến sự 15 hình thành cầu nối nội phân tử để hình thành dạng antibiotic hồn chỉnh dạng vịng cĩ 32 amino acid (25). Cấu trúc của subtilosin đƣợc thể hiện ở Hình 2.3A (phụ lục). Tồn bộ gene chịu trách nhiệm cho tồn bộ quá trình tổng hợp subtilosin đƣợc mã hĩa trên cùng 1 operon. Operon sbo-alb đƣợc điều kiển bởi promotor ở upstream của sboA, giữa 2 gene sboA và albA cĩ một cấu trúc terminator cho nên các enzyme chịu trách nhiệm tổng hợp và phân tiết subtilosin đƣợc tổng hợp với số lƣợng ít hơn cơ chất của nĩ. Operon của subtilosin bao gồm các gene là sboA mã hĩa cho dạng tiền chất của subtilosin, albA, albF và albE mã hĩa cho protein thực hiện các phản ứng biến đổi sau dịch mã và hồn chỉnh subtilosin, albB, albC, albD và albG mã hĩa cho protein chịu trách nhiệm cho sự tự đề kháng của Bacillus subtilis với subtilosin (24). Cấu trúc của operon đƣợc thể hiện ở Hình 2.3B (phụ lục). Quá trình điều hịa, tổng hợp, biến đổi sau dịch mã và phân tiết của subtilin. Sự tổng hợp của subtilosin đƣợc kiểm sốt bởi hệ thống điều hịa spo0-abrB, ở pha tăng trƣởng AbrB sẽ gắn trực tiếp với promotor của operon sbo-alb ức chế sự biểu hiện của operon này, ở đầu phag cân bằng do sự thiếu dinh dƣỡng trong mơi trƣờng và nồng độ cao của tế bào (25), các enzyme trên màng của tế bào tiếp nhận tín hiệu, các enzyme này truyền tín hiệu vào bên trong bằng một loạt các phản ứng phosphoryl hĩa cuối cùng là phosphoryl hĩa SpoA, quá trình này cũng là sự mở đầu của quá trình tạo bào tử, SpoA đƣợc phosphoryl hĩa sẽ ức chế sự biểu hiện của abrB dẫn đến thúc đẩy sự biểu hiện của operon sbo-alb. Quá trình dịch mã đƣợc thực hiện bởi RNA polymerase đƣợc kiểm sốt bởi yếu tố điều hịa A, trong điều kiện thiếu oxy operon sbo-abl đƣợc điều hịa bởi hệ thống truyền tín hiệu ResDE (25), (24). Tiền chất của subtilocin đƣợc tổng hợp ở dạng thẳng cĩ 42 amino acid sau đĩ đƣợc AlbA và AlbF biến đổi thành dạng hồn chỉnh. Trong cấu tạo của AlbB cĩ hai nhĩm Cys một ở giữa đoạn cuối N, một ở đầu C , nhĩm này đƣợc xem là trung tâm S- Fe là trung tâm hoạt động của các enzyme thực hiện các phản ứng hydrate hĩa hoặc dehydrate cơ chất, cịn AlbF trong cấu trúc cĩ một đoạn peptide tƣơng tự nhƣ là peptidase nằm giữa đầu N cịn ở đầu C cĩ cấu trúc tƣơng tự nhƣ cấu trúc protein gắn vào peptide cho nên hai enzyme này đƣợc thực hiện các phản ứng biến đổi dạng pre- subtilocin thành dạng hồn chỉnh (24). 16 Sau khi đƣợc biến đổi thành dạng hồn chỉnh thì subtilocin đƣợc tiết ra ngồi chủ yếu bằng AlbC cĩ sự tham gia của AlbD. AlbB cĩ tác dụng giữ cho Bacillus subtilis tránh đƣợc sự tác động của subtilocin (24). 2.5.2.3 Sublancin Sublancin thuộc nhĩm AII lantibiotic vì trên đoạn peptide tín hiệu cĩ 1 motif GS kế tiếp nĩ là một site cắt, do đĩ sublancin đƣợc tiết ra ngồi bằng hệ thống chuyển ABC hai chức năng là cắt đoạn peptide tín hiệu và tiết sublancin ra mơi trƣờng, trong cấu tạo cĩ 3 cầu nối nội phân tử gồm 2 cầu nối disulfic của 4 Cys và một cầu nối sulfic của -methyllanthionine và dehydrobutyrine, tƣơng tự nhƣ antibiotic thuộc họ lantibiotic, sublansin khơng tác động với vi khuẩn gram âm nhƣng cĩ khả năng ức chế mạnh đối với vi khuẩn gram dƣơng kể cả tế bào dinh dƣỡng lẫn bào tử. Sublancin là bacteriocin rất bền, bảo quản ở điều kiện bình thƣờng trong thời gian 2 năm khơng làm mất hoạt tính của sublancin (21). Operon của sublancin gồm các gene sunA, sunT, bdbA, bdbB, bdbC, và bdbD. SunA là tiền peptide của sublancin cĩ 56 amino acid sau đĩ đoạn tín hiệu bị cắt đi trong quá trình phân tiết tạo thành dạng hồn chỉnh cĩ 37 amino acid, sunT mã hĩa cho hệ thống chuyển ABC vì trong cấu trúc của SunT cĩ 4 cấu trúc xuyên màng, ở đầu N tồn tại domain cĩ hoạt tính peptidase, cịn ở đầu C là domain liên kết với ATP (21).Gene bdbB là gene quan trọng cho sự tổng hợp sublancin nĩ mã hĩa cho enzyme xúc tác phản ứng tạo cầu nối disulfic giữa hai Cys bên trong cấu tạo của sublancin, bdbA, bdbC và bdbD thì khơng cĩ tác động lớn đối với việc tổng hợp sublansin. Cấu trúc của sublancin, trình tự amino acid và cấu trúc operon của sublancin đƣợc trình bài ở Hình 2.4 (phụ lục). 2.5.2.4 TasA TasA là peptide kết hợp với bào tử của Bacillus subtilis, TasA cĩ phổ kháng khuẩn rộng đƣợc tổng hợp và tiết vào mơi trƣờng 30 phút sau khi quá trình tạo bào tử đƣợc bắt đầu, đồng thời TasA cũng đƣợc chuyển vào giữa lớp màng kép của tiền bào tử sau đĩ định vị trong lớp peptidoglycan vách của lõi bào tử, TasA giúp cho Bacillus subtilis chiếm ƣu thế trong quá trình tạo bào tử và nảy mầm (30). Operon của TasA bao gồm 3 gene là yqxM, sipW và tasA. yqxM là gene mã hĩa cho kháng sinh đƣợc tổng hợp trong mơi trƣờng cĩ nồng độ muối cao (32), SipW chịu 17 trách nhiệm cắt đoạn peptide tín hiệu và chuyển TasA ra ngồi mơi trƣờng và giữa lớp màng kép của tiền bào tử trong cấu tạo của SipW cĩ 4 đoạn peptide xuyên màng, amino acid serine ở vị trí 47 và Histidin ở vị trí 87 là trung tâm hoạt động của đoạn peptide đĩng vai trị là peptidase của SipW (31). Gene tasA mã hĩa cho tiền peptide của TasA. Trong cấu trúc của đoạn peptide tín hiệu ở vị trí 7 và 9 là kế tiếp là một đoạn peptide kỵ nƣớc (G ở vị trí 10 đến A ở vị trí 15) cấu trúc bậc 3 cĩ dạng α-helic cho phép đoạn peptide này cĩ thể xuyên màng, kế tiếp là đoạn peptide chứa 3 L, 5 amino acid, kế tiếp là site cắt cho peptidase. Trình tự amino acid tiền chất của TasA và cấu trúc của operon đƣợc đƣợc biểu diễn ở Hình 2.5A (phụ lục). Quá trình điều hịa tổng hợp và phân tiết của TasA. TasA đƣợc tổng hợp ngay đầu phag cân bằng cho nên nĩ đƣợc điều hịa bởi các yếu tố điều hịa chuyển phag. Tƣơng tự nhƣ subtilosin quá trình tổng hợp TasA đƣợc điều hịa hệ thống spo0-abrB nhƣng RNA polymerase chịu trách nhiệm dịch mã cho operon cùa TasA đƣợc điều hịa bởi yếu tố điều hịa H (31). Sau khi đƣợc tổng hợp dạng tiền chất của TasA đƣợc chuyển lên màng tế bào chất, hai Lys ở vị trí 7 và 9 mang điện tích dƣơng liên kết với màng tế bào chất, sau đĩ đoạn peptide kỵ nƣớc sẽ xuyên qua màng tế bào chất đồng thời kéo đoạn peptide cịn lại xuyên màng sau đĩ peptidase trong SipW cắt đoạn tín hiệu rồi giải phĩng TasA hoạt động, đoạn tín hiệu sau đĩ tiếp tục đƣợc cắt rồi loại ra khỏi màng tế bào chất (36). Cơ chế chuyển TasA vào giữa lớp màng kép của tiền bào tử cũng xãy ra tƣơng tự. Khác với các loại protein tiết khác TasA sau khi đƣợc chuyển qua màng tế bào chất thì một phần khơng khuếch tán ra mơi trƣờng mà định vị trong lớp peptidoglycan của vách tế bào Bacillus subtilis và bào tử (33). Vị trí của TasA bên trong vách tế bào và bào tử đƣợc thể hiện ở Hình 2.5B (phụ lục). 2.5.3 Peptide antibiotic khơng đƣợc tổng hợp bằng Ribosome. 2.5.3.1 Surfactin Surfactin cĩ cấu tạo là lipopeptide do sự liên kết của một chuỗi heptapeptide với acid béo cĩ một gốc –OH ở vị trí β tạo nên vịng lacton.Chiều dài của chuỗi acid béo thay đổi từ 13–16 C (20). Surfactin cĩ hoạt tính bề mặt rất mạnh do đĩ nĩ cĩ tính đối kháng mạnh đối với vi khuẩn, virus và kháng lại các tế bào ung thƣ nhƣng ít tác động đối với nấm. Tác động của surfactin làm ức chế các kênh chuyển ion trên trong lớp 18 màng lipid kép đồng thời ức chế hoạt tính của enzyme cylic AMP phosphodiesterase (35). Chuỗi heptapeptide của surfactin cĩ trình tự amino acid là NH2-Gly-Leu-DLeu- Val-Asp-DLeu-Leu-COOH, chuỗi peptide này đƣợc tổng hợp bằng các phản ứng enzyme. Các gene mã hĩa cho các enzyme này nằm trên cùng một operon gọi là srf operon. srf operon cĩ tất cả 4 gene là srfA, srfB, srfC và srfD. SrfA (402 kDa) là enzyme hoạt hĩa 3 amino acid đĩ là Gly, Leu, DLeu. SfrB (401 kDa) là enzyme hoạt hĩa 3 amino acid kế tiếp, SrfC (144 kDa) hoạt hĩa Leu cịn lại và tách chuỗi peptide ra ngồi.Trong cấu tạo của các enzyme này đƣợc đƣợc chia thành nhiều modul khác nhau mỗi modul chịu trách nhiệm hoạt hĩa một amino acid chuyên biệt. Bên trong mỗi modul đƣợc chia thành các domain là domain A (adenylation), domain C (condensation), domain T (thiolation), domain E (epimerization) mỗi domain thực hiện một bƣớc trong trong quá trình hoạt hĩa amino acid của modul. Domain A thực hiện phản ứng adenyl hĩa cơ chất tạo thành aminoacyladenylate, trung tâm hoạt động của domain A liên kết với ion Mg2+. Domain T với cofactor là 4′-phosphopantetheine (ppan) thực hiện phản ứng hoạt hĩa liên kết thioeste. Domain C thực hiện phản ứng tạo liên kết este giữa 2 amino acid. Trong những modul thực hiện hoạt hĩa amino acid cĩ cấu hình D thì cĩ thêm domain E chịu trách nhiệm chuyển amino acid từ cấu hình L sang cấu hình D (34). Cấu trúc của surfactin, quá trình điều hịa, cấu trúc của operon srf, quá trình tổng hợp chuỗi amino acid của surfactin đƣợc thể hiện ở Hình 2.6 (phụ lục). Quá trình điều hịa và tổng hợp surfactin. Surfactin đƣợc tổng hợp để đáp ứng với nồng độ cao của vi sinh vật trong mơi trƣờng, srf operon đƣợc đƣợc điều hịa dƣơng bởi ComA. Nhƣng quá trình phosphoryl hĩa ComA đƣợc điều hịa bởi nhiều yếu tố khác nhau. Các modul của 3 enzyme SrfA, SrfB, SrfC đƣợc xắp xếp theo trình tự tƣơng ứng với trình tự của amino acid của chuỗi peptide. Khi quá trình bắt đầu Gyl sẽ gắn vào domain A của modul 1 để thực hiện phản ứng adenyl hĩa sau đĩ đƣợc chuyển qua domain T để tạo phản ứng thioeste với cofactor 4′-phosphopantetheine. Ở modul thứ 2 Leu đƣợc gắn vào domain A, domain C của modul 2 thực hiện phản ứng tạo liên kết este của Gly với gốc amine tự do của Leu sau đĩ đƣợc chuyển qua domain T của 19 modul 2 để thực hiện các phản ứng tiếp theo. Ở modul cuối cùng cĩ domain TE nhận biết và tách đoạn peptide ra ngồi (34). Heptapeptide sau khi đƣợc tổng hợp sẽ tồn tại ở dạng vịng hoặc dạng thẳng sau đĩ sẽ liên kết với β-hydroxyl acid béo cuối cùng là đƣợc tiết ra ngồi. 2.5.3.2 Fengycin (18), (34) Fengycin là lipopeptide vịng cĩ hoạt tính đối kháng mạnh với nấm. Fengycin bao gồm một peptide cĩ 10 amino acid cĩ trình tự L-Glu · D-Orn · L-Tyr · D-allo-Thr · L-Glu · D-Ala (D-Val) · L-Pro · L-Glu · D-Tyr · L-Ile với một cầu nối lacton giữa L-Tyr và L-Ile liên kết với 1 chuỗi β-hydroxyl acid béo cĩ mạch cacbon dài từ 14 đến 18. Fengycin đƣợc tổng hợp nhiều trong phag tăng trƣởng và đạt nồng độ cực đại ở cuối phag tăng trƣởng, fengycin vẫn đƣợc duy trì ở nồng độ thấp với hàm lƣợng ổn định trong phag cân bằng. Operon mã hĩa cho các enzyme tổng hợp fungycin gồm fenC mã hĩa cho enzyme hoạt hĩa cho L-Glu và D-Orn, fenD mã hĩa cho enzyme hoạt hĩa cho L-Tyr và D-allo-Thr, fenE mã hĩa cho enzyme hoạt hĩa cho L-Glu · D-Ala (D-Val), fenA mã hĩa cho enzyme hoạt hĩa L-Pro, L-Glu và D-Tyr, fenB mã hĩa cho enzyme hoạt hĩa cho amino acid cuối cùng là L-Ile, cuối cùng là gene mã hĩa cho enzyme chịu trách nhiệm tổng hợp chuỗi acid béo. Chuỗi 81 nucleotide trên phần upstream của fenC cĩ 2 điểm khởi đầu dịch mã và 4 promotor, 2 promotor cĩ cấu trúc tƣơng ứng với promotor đƣợc điều hịa bởi yếu tố điều hịa A, điều này giải thích tại sao fengycin đƣợc tổng hợp trong phag tăng trƣởng, 2 promotor cĩ cấu trúc tƣơng ứng với yếu tố điều hịa F duy trì sự tổng hợp fengycin trong phag cân bằng. Cấu trúc của fengycin, fen operon, trình tự nucleotide của phần upstream của fenC đƣợc trình bày ở Hình 2.7 (phụ lục). 2.5.3.3 Mycosubtilin (19), (34) Mycosubtilin là lipopeptide cĩ tính kháng sinh thuộc họ iturin. Mycosubtilin cĩ cấu tạo là một chuỗi β-amino acid béo cĩ chiều dài từ 14-17 C liên kết với 1 heptapeptide mạch vịng cĩ trình tự amino acid là Asn-DTyr-DAsn-Gln-Pro-DSer-Asn. Các lipopeptide thuộc họ iturin cĩ tính đối kháng mạnh với nấm nhƣng cĩ tác động rất hạn chế với vi khuẩn, trong cấu tạo của chuỗi heptapeptide cĩ DTyr ở amino acid thứ 2 20 đồng thời cĩ thêm 2 amino acid cĩ cấu hình D ở vị trí 3 và 6. Cấu trúc của mycosubtilin đƣợc trình bày ở Hình 2.8A (phụ lục). Operon của mycosubtilin bao gồm các gene fenF mã hĩa cho protein FenF (45,2 kDa) cĩ hoạt tính malonyl-CoA transacylases, mycA mã hĩa cho protein MycA (449,3 kDa) trong cấu tạo của MycA cĩ 2 modul chịu trách nhiệm hoạt hĩa Asn và tổng hợp chuỗi acid béo. Trong modul chịu trách nhiệm tổng hợp acid béo đƣợc chia thành nhiều domain mỗi domain thực hiện một bƣớc chuyên biệt trong quá trình tổng hợp acid béo, thứ tự sắp xếp của các domain này là AL (acyl-CoA ligase), ACP (acyl carrier protein), KS (β -keto acyl synthetase), AMT (amino transferase). Tiếp theo là gene mycB mã hĩa cho protein MycB (612,3 kDa) chịu trách nhiệm hoạt hĩa 4 amino acid là DTyr, DAsn, Glu, Pro. Gene cuối cùng trong operon là mycC mã hĩa cho MycC (297.9 kDa) hoạt hĩa cho 2 amino acid cuối cùng là DSer và Asn. Cấu trúc của Mycosubtilin operon đƣợc trình bày chi tiết ở Hình 2.8B (phụ lục). Khác với sự tổng hợp của surfactin, acid béo của mycosubtilin đƣợc tổng hợp kèm với quá trình tổng hợp chuỗi peptide. Acid béo đƣợc tổng hợp trên 1 modul của MycA sau khi tổng hợp, acid béo đƣợc gắn nhĩm amino vào vị trí β, modul cịn lại hoạt hĩa Asn và chuyển vào domain T, sau đĩ liên kết este đƣợc tạo ra giữa acid béo với gốc amine tự do của Asn. Qúa trình tổng hợp chuỗi peptide xãy ra tƣơng tự với quá trình tổng hợp của surfactin. Các bƣớc của quá trình tổng hợp acid béo, gắn gốc amine, tạo liên kết este đƣợc trình bày chi tiết ở Hình 2.8C (phụ lục). 2.5.3.4 Bacilysocin (17) Bacilysocin là phospholipid cĩ tính kháng khuẩn mạnh đối với nấm, đƣợc tổng hợp khi bắt đầu phag cân bằng sau đĩ thì giảm dần. Bacilysocin là kháng sinh cĩ bản chất phospholipid đƣợc phát hiện đầu tiên trên Bacillus subtilis. Cấu trúc của bacilysocin là 1-(12-methyltetradecanoyl)-3-phosphoglyceroglycerol đƣợc thể hiện ở hình bên dƣới. 21 Bacilysocin đƣợc tổng hợp từ tiền chất là phosphatidylglycerol, là một phospholipid chủ yếu của Bacillus subtilis. Quá trình chuyển phosphatidylglycerol thành bacilysocin đƣợc thực hiện bởi enzyme lysophospholypase đƣợc mã hĩa bởi gene ytpA. Quá trình tổng hợp bacilysocin đƣợc thể hiện ở Hình 2.9 (phụ lục). 22 5. PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 3.1.1 Thời gian Từ 02/2006-05/2006. 3.1.2 Địa điểm Địa điểm thực hiện đề tài tại phịng vi sinh truyền nhiễm, Khoa Chăn nuơi Thú y trƣờng Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh. 3.2 Vật liệu thí nghiệm 3.2.1 Mẫu thí nghiệm Phân heo lớn, khỏe mạnh đƣợc lấy từ các hộ chăn nuơi ở Đồng Nai và Bình Dƣơng Chủng E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo và Bacillus subtilis đối chứng dƣơng đƣợc cung cấp bởi phịng vi sinh truyền nhiễm, Khoa Chăn nuơi Thú y đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh. 3.2.2 Hĩa chất Hĩa chất: mơi trƣờng TSB, mơi trƣờng Simon Citrate Agar, mơi trƣờng nitrate, mơi trƣờng đƣờng maltose, mơi trƣờng tinh bột, mơi trƣờng lịng đỏ trứng, thuốc thử NaOH 40%, α- napton, α-napthilamine, acid sulfonilic, kháng sinh ……….. 3.2.3 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm Thiết bị: Nồi hấp vơ trùng, tủ ấm, bình điều nhiệt, kính hiển vi, cân điện tử. Dụng cụ: Đĩa petri, ống nghiệm, phễu, bình tam giác,........ 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo Qui trình phân lập Bacillus subtilis trong phân heo. Lấy 0,2g đến 0,3g phân heo cho vào ống nghiệm chứa 9ml nƣớc cất vơ trùng, pha lỗng thành 10-2, nung ở nhiệt độ 80°C trong 1 giờ, pha lỗng thành 10-3 trang vào đĩa TSA ủ ở 37°C trong 24 giờ, giữ giống những khuẩn lạc đặc trƣng trong ống thạch nghiêng chứa mơi trƣờng TSA ủ ở 37°C trong 24 giờ sau đĩ đem thử sinh hĩa để khẳng định. 23 1ml 1ml 1ml Mẫu votex to = 80oC 0,2g-0,3g 10 -1 10 -2 1 giờ 10-3 0,1ml ủ ở 37oC cấy trang 24giờ Đĩa mơi trƣờng TSA chọn khuẩn lạc đặc trƣng giữ giống 3.3.2 Các phản ứng thử sinh hĩa Thực hiện các phản ứng sinh hĩa sau để khẳng định Phản ứng lecithinase (-), maltose (-), khử nitrate (+), khử citrate (+), khả năng phân giải tinh bột (+), phản ứng VP (+), catalase (+) kết quả quả thử sinh hĩa đƣợc đối chứng với chủng Bacillus subtilis đối chứng dƣơng của phịng thí nghiệm đƣợc gọi là chủng số 1 trong các thí nghiệm bên dƣới. 3.3.3 Thử đối kháng với E. coli trên mơi trƣờng thạch Cấy E. coli và những chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc vào riêng mỗi ống nghiệm chứa 5ml mơi trƣờng TSB ủ ở 37°C trong 24 giờ, thử đối kháng của Bacillus subtilis với các nồng độ pha lỗng canh khuẩn E. coli khác nhau: khơng pha lỗng, 10- 24 1 , 10 -2 , 10 -3 , sau đĩ trang dung dịch vi khuẩn E. coli của từng độ pha lỗng lên bề mặt đĩa petri chứa 15 ml mơi trƣờng TSA, dùng que cấy vịng lấy 1 vịng canh khuẩn trong ống canh khuẩn Bacillus subtilis cấy thành đốm trên đĩa petri, ủ 37°C trong 24 giờ, dùng compa để đo vịng kháng khuẩn, vịng kháng khuẩn đƣợc tính bằng hiệu số giữa đƣờng kính vịng kháng khuẩn với đƣờng kính khuẩn lạc, chọn 5 chủng cho vịng kháng khuẩn lớn nhất để thực hiện đối kháng trên mơi trƣờng TSB. 3.3.4 Đánh giá sự đối kháng với E. coli trong mơi trƣờng TSB Cấy E. coli và chủng vi khuẩn Bacillus subtilis vào riêng mỗi ống nghiệm chứa 5 ml mơi trƣờng TSB ủ ở 37°C trong 24 giờ, lấy 0,5 ml canh khuẩn của từng chủng Bacillus subtilis cho vào mỗi bình tam giác chứa 50 ml mơi trƣờng TSB, sau đĩ cho vào mỗi bình tam giác 0,5ml canh khuẩn E. coli. Đánh giá số lƣợng vi khuẩn E. coli ở khoảng thời gian 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ bằng phƣơng pháp trang đĩa trên mơi trƣờng TSA. Đối chứng âm đƣợc thiết kế bằng cách cho 0,5 ml canh khuẩn E. coli vào bình tam giác chứa 50 ml mơi trƣờng TSB. 3.3.5 Thử kháng sinh đồ Nuơi cấy trong ồng TSB 5ml trong 24 giờ ở 37°C, pha lỗng để đƣợc nồng độ vi khuẩn ở nồng độ tƣơng ứng với ống McFarland tiêu chuẩn 0.5 dùng tăm bơng vơ trùng trãi đều vi khuẩn trên đĩa petri chứa 15 ml mơi trƣờng TSA, đặt đĩa giấy tẩm kháng sinh trên bề mặt thạch, ủ ở 37°C trong 24 giờ, đo vịng kháng khuẩn so sánh với chuẩn của từng loại kháng sinh. Kháng sinh đƣợc sử dụng: gentamycin, ciprofoxacin, amoxicillin, colistin, norfloxacin, kanamicin, amox\cla.acid. 3.3.6 Đánh giá khả năng phân giải tinh bột trên mơi trƣờng thạch tinh bột 1% Đổ 15 ml mơi trƣờng tinh bột 1% vào đĩa petri, sử dụng que cấy, cấy các chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc ủ ở 37°C trong 24 giờ, nhỏ dung dịch iod dùng compa đo vịng phân giải tinh bột, tính vịng phân giải là hiệu số giữa đƣờng kính vịng phân giải và đƣờng kính khuẩn lạc. 25 6. Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết Quả 4.1.1 Kết quả phân lập Bacillus subtilis trong phân heo Phân heo đƣợc pha lỗng ở nồng độ 10-2 nung ở 80oC trong 1 giờ, pha lỗng ra 10 -3 , rồi trang trên mơi trƣờng TSA kết quả đƣợc thể hiện ở Hình 4.1, bắt khuẩn lạc đặc trƣng, khuẩn lạc đặc trƣng của Bacillus subtilis là khuẩn lạc khơ rìa nhăn, nằm sát bề mặt thạch. Hình 4.1: Kết quả phân lập trên mơi trƣờng TSA Các khuẩn lạc đặc trƣng đƣợc giữ giống, nhuộm gram, thử sinh hĩa. Kết quả thu đƣợc 35 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis cĩ kết quả thử sinh hĩa là:  Phản ứng lecithinase (-)  Phản ứng khử nitrate (+)  Phản ứng khử citrate (+)  Sử dụng maltose (-)  Phản ứng catalase (+)  Phản ứng VP (+)  Phát triển trong điều kiện yếm khí (+) Tất cả các chủng này đƣợc thử đối kháng với E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo 4.1.2 Kết quả đối kháng với E. coli trên mơi trƣờng TSA Chúng tơi thực hiện thử đối kháng giữa Bacillus subtilis với E. coli ở những nồng độ pha lỗng canh khuẩn E. coli khác nhau: khơng pha lỗng, 10-1, 10-2, 10-3. Khi khơng pha lỗng canh khuẩn E. coli hoặc độ pha lỗng là 10-1 thì khơng chủng nào tạo 26 đƣợc vịng kháng khuẩn, ở nồng độ pha lỗng 10-2 của canh khuẩn E. coli thì cĩ tất cả 13 chủng tạo đƣợc vịng kháng khuẩn kết quả đƣợc thể hiện ở Bảng 4.1, ở nồng độ pha lỗng 10-3 thì khơng thấy tạo vịng kháng khuẩn. Khi khơng pha lỗng canh khuẩn hoặc ở độ pha lỗng 10-1 thì nồng độ E. coli quá cao nên cĩ thể chịu đựng đƣợc sự tác động của kháng sinh do Bacillus subtilis tiết ra hoặc cĩ một cơ chế nào đĩ ức chế sự tổng hợp và phân tiết cuả kháng sinh, ở nồng độ pha lỗng canh khuẩn E. coli là 10-2 đĩ là nồng độ phù hợp cho sự tổng hợp và phân tiết kháng sinh ức chế E. coli của Bacillus subtilis nên tạo đƣợc vịng kháng khuẩn rõ ràng đƣợc thể hiện ở Hình 4.2. Ở nồng độ pha lỗng 10-3 khơng cĩ chủng nào tạo vịng kháng khuẩn, cĩ thể nồng độ E. coli khơng đủ lớn để khích thích Bacillus subtilis tổng hợp kháng sinh. Cĩ thể sự tổng hợp kháng sinh ức chế vi khuẩn E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo của các chủng Bacillus subtilis đƣợc thử nghiệm đƣợc kích thích ở một nồng độ E. coli đủ lớn. Bảng 4.1: Kết quả độ lớn vịng kháng khuẩn của các chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc với E. coli ở nồng độ pha lỗng 10-2 trên mơi trƣờng TSA. Chủng Vịng kháng Khuẩn / mm S2 Chủng Vịng kháng khuẩn / mm S2 n = 3 X n = 3 X 1 0 0 14 4,33 0,083 2 0 0 18 5 0 3 0 0 23 2,33 1,083 4 0 0 24 0 0 5 4 0 25 0 0 6 2 0,25 26 1,33 1,33 7 4,33 0,33 27 1,33 1,33 8 0,66 1,33 29 0 0 10 3,83 0,58 33 0 0 11 3,16 0,585 34 0 0 12 0,833 2,08 35 2,5 0,25 13 3,16 0,083 n: Số lần lặp lại X : Giá trị trung bình S2: Biến lƣợng 27 Theo kết quả đối kháng trên thạch TSA ở nồng độ pha lỗng canh khuẩn E. coli là 10-2 thì chủng số 7, 5, 10, 14, 18 tạo vịng kháng khuẩn lớn nhất nên đƣợc sử dụng để đánh giá sự đối kháng trong mơi trƣờng TSB. Hình 4.2: Đối kháng giữa Bacillus subtilis với E. coli trên mơi trƣờng TSA với nồng độ pha lỗng canh khuẩn E. coli là 10-2. 4.1.3 Kết quả đối kháng giữa Bacillus subtilis với E. coli trong mơi trƣờng TSB Khi cho đối kháng giữa Bacillus subtilis và E. coli trong mơi trƣờng TSB sau từng thời điểm đánh giá sự thay đổi của số lƣợng E. coli trong mơi trƣờng. Vì Bacillus subtilis phát triển tạo thành màng biofilm trên bề mặt mơi trƣờng, trong mơi trƣờng lƣợng Bacillus subtilis tự do khoảng 105 vi khuẩn / ml nên giới hạn độ pha lỗng để đếm số lƣợng vi khuẩn E. coli ở độ pha lỗng 10-5, 10-6, 10-7. Ta cĩ kết quả đƣợc thể hiện ở biểu đồ bên dƣới. 28 0 5 10 15 log 0 giờ 12 giờ 24 giờ 36 giờ chủng 5 chủng 7 chủng 10 chủng 14 chủng 18 đối chứng âm Biểu đồ biểu hiện sự thay đổi số lƣợng E. coli qua các thời điểm 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ. Bảng 4.2: Bảng số lƣợng CFU/ml của E. coli qua từng khoảng thời gian 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ. Thời gian Chủng 0 giờ 12 giờ 24 giờ 36 giờ 5 4,45.10 10 29,8.10 8 15,75.10 7 < 10 6 7 4,45.10 10 19,95. 10 8 9,55. 10 7 < 10 6 10 4,45.10 10 17,26. 10 8 8,3. 10 7 < 10 6 14 4,45.10 10 19,95. 10 8 13,67. 10 7 < 10 6 18 4,45.10 10 23,4. 10 8 2,6. 10 7 < 10 6 Đối chứng âm 4,45.1010 22,15.1011 61,76.1011 23.1012 Biểu đồ trên cho thấy sự giảm số lƣợng E. coli qua từng thời điểm 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, ở thời điểm 36 giờ kết quả khơng thấy sự hiện diện của E. coli ở độ pha lỗng 10-5 ở tất cả các chủng. Kết quả trên cho thấy số lƣợng E. coli giảm dần qua 29 từng thời điểm cịn đối chứng âm thì số lƣợng E. coli tăng dần, sự giảm số lƣợng E. coli do Bacillus subtilis sản xuất chất kháng khuẩn tiêu diệt E. coli đồng thời cĩ sự cạnh tranh chất dinh dƣỡng giữa Bacillus subtilis và E. coli cùng với các tƣơng tác khác trong mơi trƣờng đã làm giảm số lƣợng vi khuẩn E. coli. Việc số lƣợng vi khuẩn E. coli giảm ngay từ giai đoạn đầu từ 0 giờ đến 12 giờ, cho thấy Bacillus subtilis tổng hợp kháng sinh ức chế E. coli từ giai đoạn rất sớm, sự giảm E. coli trong giai đoạn này chủ yếu là sự tác động của kháng sinh do Bacillus subtilis tiết ra vì trong giai đoạn này nguồn dinh dƣỡng trong mơi trƣờng cịn nhiều, đồng thời số lƣợng của 2 lồi vi khuẩn chƣa cao nên ít xãy ra các tƣơng tác khác với nhau trong mơi trƣờng. Kết quả trên cho thấy đƣợc cả 5 chủng mặc dù tạo vịng kháng khuẩn khơng lớn nhƣng cho thấy sự ức chế một cách hiệu quả E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo trong mơi trƣờng TSB. 4.1.4 Kết quả thử kháng sinh đồ Chủng Kháng sinh 7 5 10 18 14 Gentamicin Nhạy Nhạy Nhạy Nhạy Nhạy Ciprofoxacin Nhạy Nhạy Nhạy Nhạy Nhạy Amoricillin Nhạy Nhạy Nhạy Nhạy Nhạy Colistin Kháng Kháng Kháng Kháng Kháng Norfloxacin Nhạy Nhạy Nhạy Nhạy Nhạy Kanamicin Nhạy Nhạy Nhạy Nhạy Nhạy Amox/Clav acid Nhạy Nhạy Nhạy Nhạy Nhạy Bảng 4.3: Kết quả thử kháng sinh đồ đối với 5 chủng đƣợc thử đối kháng Tất cả 5 chủng đều rất nhạy cảm với các loại kháng sinh đƣợc sử dụng trừ colistin, điều này cĩ thể do nguồn gốc phân lập vì các chủng Bacillus subtilis đƣợc phân lập trên những heo khỏe mạnh nuơi trong các hộ gia đình với số lƣợng nhỏ nên ít xuất hiện bệnh, cho nên hầu nhƣ khơng bị xử lý với kháng sinh nên ít xãy ra hiện tƣợng đề kháng với kháng sinh, đồng thời thức ăn chủ yếu là thức ăn thừa của ngƣời và các loại thức ăn cĩ tính chất tự nhiên khác nên khơng cĩ kháng sinh đƣợc bổ sung 30 trong thức ăn. Tất cả các chủng đều kháng với colistin vì colistin là kháng sinh chỉ tác động chuyên biệt đối vi khuẩn gram (-). Kết quả kháng sinh đồ cho thấy cả 5 chủng đều an tồn về mặt sinh học vì khơng chứa plasmid hoặc các gene kháng kháng sinh của các kháng sinh đƣợc sử dụng do đĩ nĩ khơng phải là nguồn truyền những gene kháng kháng sinh cho các vi sinh vật gây bệnh trong đƣờng ruột tuy nhiên cần mở rộng thử nghiệm với các loại kháng sinh khác. Hình 4.3: Kết quả thử kháng sinh đồ của chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc. 4.1.5 Kết quả đánh giá khả năng phân giải tinh bột trên mơi trƣờng thạch tinh bột 1% Trong 22 chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc trong phân heo cĩ 6 chủng tạo đƣợc vịng phân giải lớn là chủng 8 (9,66 mm), 18 (8,66 mm), 24 (14,66 mm), 25 (9,83 mm), 34 (10,66 mm), 29 (9,83). Các chủng này cho thấy đƣợc khả năng phân giải tinh bột cao đặc biệt là chủng 24 tạo đƣợc vịng phân giải là 14,66 mm. Tuy khơng cho đối kháng với E. coli nhƣng với khả năng phân giải tinh bột cao chủng 24 là ứng cử viên cho việc sản xuất probiotic từ Bacillus subtilis cĩ tác động làm tăng hiệu quả chuyển hĩa thức ăn của thú, tuy nhiên cần phải đánh giá thêm một vài đặc điểm khác nhƣ khả năng tổng hợp protease, tính an tồn đối với thú và các đặc điểm khác yêu cầu đối với chủng vi sinh vật đƣợc chọn để sản xuất probiotic. Trong 6 chủng tạo vịng phân giải lớn cĩ chủng 18 (8,66mm), là chủng đối kháng mạnh với E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo cho nên chủng 18 là ứng cử viên để tạo sản phẩm probiotic 2 chức năng. Một là khống chế E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo, hai là giúp tăng hệ số chuyển hĩa thức ăn của thú. 31 Bảng 4.4: Kết quả tạo vịng phân giải tinh bột của các chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc trên mơi trƣờng tinh bột 1% Chủng Đƣờng kính vịng Phân giải / mm S2 Chủng Đƣờng kính vịng phân giải / mm S2 n = 3 X n = 3 X 1 6,66 0,33 14 6 1 2 6,66 8,33 18 8,66 0,33 3 8 1 23 6,33 1,33 4 0 0 24 14,66 2,33 5 7,5 5,25 25 9,83 0,083 6 9,33 0,33 26 7 1 7 6,66 1,33 27 7,5 0,75 8 9,66 7,58 29 9,83 0,58 10 4,33 0,33 33 9,33 0,33 11 8,16 1,58 34 10,66 5,33 12 8,5 0,75 35 9 0,25 13 5,33 0,33 n: Số lần lặp lại S2: Biến lƣợng X : Giá trị trung bình đƣờng kính vịng phân giải Hình 4.4: Hình minh họa sự phân giải tinh bột của Bacillus subtilis. 32 4.2 Thảo luận Enterotoxigenic E. coli là nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy rất phổ biến trên ngƣời và trên heo, do tính chất đề kháng rất nhanh với nhiều loại kháng sinh khác nhau, cho nên việc sử dụng kháng sinh để kiểm sốt E. coli trở nên kém hiệu quả, bên cạnh đĩ sử dụng kháng sinh làm xáo trộn hệ vi sinh vật nội tại và xuất hiện ngày càng nhiều các chủng vi khuẩn đề kháng với kháng sinh gây lo ngại cho ngƣời tiêu dùng, do đĩ cần tìm một biện pháp để thay thế kháng sinh trong phịng và trị bệnh tiêu chảy nĩi riêng và các bệnh đƣờng ruột nĩi chung. Sử dụng probiotic đƣợc là một giải pháp thay thế hiệu quả nhất ở thời điểm hiện nay. Cĩ nhiều sản phẩm probiotic trên thị trƣờng để phịng các bệnh đƣờng ruột, các sản phẩm này đƣợc dán nhãn là bào tử của Bacillus subtilis tuy nhiên những nghiên cứu gần đây cho thấy, phần lớn các sản phẩm là bào tử của của những lồi Bacillus khác nhƣ Bacillus clausii, Bacillus pumilus và một số chủng Bacillus cereus (Le H. Duc, 2004). Những nghiên cứu gần đây đã làm gia tăng sự lo ngại của ngƣời tiêu dùng về tính an tồn của những sản phẩm này, nhất là những sản phẩm chứa bào tử của các chủng Bacillus cereus, là nguyên nhân gây ra nhiều bệnh đƣờng ruột. Bên cạnh đĩ các chủng này đề kháng đƣợc với nhiều loại kháng sinh do đĩ nĩ là nguồn phổ biến gene kháng kháng sinh cho vi sinh vật trong đƣờng ruột. Trong 22 chủng Bacilus subtilis phân lập đƣợc trong phân heo, cĩ 5 chủng đối kháng mạnh với E. coli trên mơi trƣờng TSA và TSB, kết quả kháng sinh đồ cho thấy các chủng này nhạy cảm với đa số kháng sinh đƣợc thử nghiệm trừ colistin cĩ tác động chuyên biệt với vi khuẩn gram (-). Các chủng này là ứng cử viên để tạo sản phẩm probiotic cĩ tác dụng khống chế E. coli gây bệnh. 33 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Cĩ sự hiện diện của vi khuẩn Bacillus subtilis cĩ khả năng đối kháng với E. coli gây bệnh tiêu chảy trong phân heo. Cĩ thể sự tổng hợp kháng sinh ức chế sự phát triển E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo của Bacillus subtilis đƣợc kích thích bởi một nồng độ vi khuẩn E. coli đủ lớn Kháng sinh ức chế sự phát triển của E. coli đƣợc tổng hợp từ giai đoạn đầu của sự phát triển. Năm chủng Bacillus subtilis cho thấy khả năng ức chế mạnh sự phát triển của E. coli và đều nhạy cảm với tất cả kháng sinh đƣợc thử nghiệm trừ colistin. Chủng 18 là ứng cử viên để tạo ra sản phẩm probiotic cĩ 2 chức năng: Một là khống chế E. coli gây bệnh, hai là tăng hiệu quả chuyển hĩa thức ăn của thú.  5.1. Đề nghị Sự tổng hợp kháng sinh ức chế sự phát triển của Bacillus subtilis cĩ thể đƣợc kích thích bởi sự hiện diện của E. coli trong mơi trƣờng đây là điều khác biệt so với quá trình điều hịa tổng hợp của các kháng sinh khác do Bacillus subtilis tiết ra. Chúng tơi cĩ một số đề nghị sau.  Đánh giá hàm lƣợng kháng sinh tiết ra trong mơi trƣờng nuơi cấy qua từng thời điểm.  Đánh giá khả năng đối kháng với nhiều loại vi sinh vật khác.  Kiểm tra sự an tồn của các chủng trên chuột.  Đánh giá khả năng chống chịu của bào tử với pH thấp và enzyme pepsin của dạ dày, khả năng đề kháng với muối mật. 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt 1. Trần Linh Thƣớc, 2003. Phƣơng pháp phân tích vi sinh vật trong nƣớc, thực phẩm và mỹ phẩm, NXB Giáo Dục, 232 trang 2. PGS.TS.Trần Thị Dân, 2005.Cơng nghệ sinh học trong chăn nuơi gia súc, NXB Nơng Nghiệp Tài liệu tiếng nƣớc ngồi 3. Gabriella Casula and Simon M. Cutting, 2002. Bacillus Probiotics: Spore Germination in the Gastrointestinal Tract. Appl Environ Microbiol 68(5): 2344– 2352 American Society for Microbiology, American. 4. Ngo Thi Hoa, Loredana Baccigalupi, Ashley Huxham, Andrei Smertenko, Pham Hung Van, Sergio Ammendola, Ezio Ricca, and Simon M. Cutting, 2000. Characterization of Bacillus Species Used for Oral Bacteriotherapy and Bacterioprophylaxis of Gastrointestinal Disorders. Appl Environ Microbiol 66(12): 5241–5247. American Society for Microbiology.American 5. Irina V. Pinchuk, Philippe Bressollier, Bernard Verneuil, Bernard Fenet, Irina B. Sorokulova, Francis Mégraud, and Maria C. Urdaci,2001. In Vitro Anti- Helicobacter pylori Activity of the Probiotic Strain Bacillus subtilis 3 Is Due to Secretion of Antibiotics. Antimicrob Agents Chemother. 45(11): 3156–3161. American Society for Microbiology.American 6. Teresa M. Barbosa, Cláudia R. Serra, Roberto M. La Ragione, Martin J. Woodward, and Adriano O. Henriques,2005. Screening for Bacillus Isolates in the Broiler Gastrointestinal Tract. Appl Environ Microbiol. 71(2): 968–978. American Society for Microbiology.American 7. Le H. Duc, Huynh A. Hong, Neil Fairweather, Ezio Ricca, and Simon M. Cutting, 2003. Bacterial Spores as Vaccine Vehicles. Infect Immun. 2003 71(5): 2810–2818. American Society for Microbiology.American 8. Dennis J. Henner AND James A. Hoch,1980. The Bacillus subtilis Chromosome.Microbiological Review, p. 57-82. American Society for Microbiology. American 35 9. Rial D. Rolfe, 2000. The Role of Probiotic Cultures in the Control of Gastrointestinal Health. Journal of Nutrition.130:396S-402S. The American society for nutritional sciences.American 10. Steven S. Branda, José Eduardo González-Pastor, Sigal Ben-Yehuda, Richard Losick, and Roberto Kolter, 2001. Fruiting body formation by Bacillus subtilis. Proc Natl Acad Sci U S A . 98(20): 11621–11626. The National Academy of Sciences 11. Emil M. Berberov, You Zhou, David H. Francis, Michael A. Scott, Stephen D. Kachman, and Rodney A. Moxley,2004. Relative Importance of Heat-Labile Enterotoxin in the Causation of Severe Diarrheal Disease in the Gnotobiotic Piglet Model by a Strain of Enterotoxigenic Escherichia coli That Produces Multiple Enterotoxins. Infection and Immunity, p. 3914-3924 Vol. 72, No. 7. American society for microbiology.American 12. James P. Nataro and James B. Kaper,1998. Diarrheagenic E. Coli. Clin Microbiol, 11(1): 142–201 American Society for Microbiology 13. WIM GAASTRA AND FRITS K. DE GRAAF,1982. Host-Specific Fimbrial Adhesins of Noninvasive Enterotoxigenic Escherichia coli Strains MICROBIOLOGICAL REVIEWS, p. 129-161 Vol. 46, No. 2 14. Ronggai Sun, Timothy J. Anderson, Alan K. Erickson, Eric A. Nelson, and David H. Francis, 2000. Inhibition of Adhesion of Escherichia coli K88ac Fimbria to Its Receptor, Intestinal Mucin-Type Glycoproteins, by a Monoclonal Antibody Directed against a Variable Domain of the Fimbria. Infection and Immunity, p. 3509-3515, Vol. 68, No. 6. American society for microbiology.American 15. Le H. Duc, Huynh A. Hong, Teresa M. Barbosa, Adriano O. Henriques, và Simon M.Cutting, 2004. Characterization of Bacillus Probiotics Available for Human Use. Appl Environ Microbiol, 70(4): 2161–2171. American society for microbiology.American 16. Robert E. W. Hancock and Daniel S. Chapple, 1999. Peptide Antibiotics. Antimicrob Agents Chemother, 43(6): 1317–1323. American society for microbiology.American 36 17. Norimasa Tamehiro, Yoshiko Okamoto-Hosoya, Susumu Okamoto, Makoto Ubukata, Masa Hamada, Hiroshi Naganawa, and Kozo Ochi, 2002. Bacilysocin, a Novel Phospholipid Antibiotic Produced by Bacillus subtilis 168. Antimicrob Agents Chemother, 46(2): 315–320. American society for microbiology.American 18. Tsuey-Pin Lin, Chyi-Liang Chen, Li-Kwan Chang, Johannes Scheng-Ming Tschen, and Shih-Tung Liu, 1999. Functional and Transcriptional Analyses of a Fengycin Synthetase Gene, fenC, from Bacillus subtilis. J Bacteriol, 181(16): 5060–5067. American society for microbiology.American 19. Erwin H. Duitman, Leendert W. Hamoen, Martina Rembold, Gerard Venema, Harald Seitz, Wolfram Saenger, Frank Bernhard, Richard Reinhardt, Manuel Schmidt, Christian Ullrich, Torsten Stein, Frank Leenders, and Joachim Vater, 1999. The mycosubtilin synthetase of Bacillus subtilis ATCC6633: A multifunctional hybrid between a peptide synthetase, an amino transferase, and a fatty acid synthase. Proc Natl Acad Sci U S A, 9; 96(23): 13294–13299. The National Academy of Sciences 20. Valérie Leclère, Max Béchet, Akram Adam, Jean-Sébastien Guez, Bernard Wathelet, Marc Ongena, Philippe Thonart, Frédérique Gancel, Marlène Chollet- Imbert, and Philippe Jacques, 2005. Mycosubtilin Overproduction by Bacillus subtilis BBG100 Enhances the Organism's Antagonistic and Biocontrol Activities. Appl Environ Microbiol, 71(8): 4577–4584, American society for microbiology.American 21. Sun H. Paik, Anu Chakicherla, and J. Norman Hansen, Identification and Characterization of the Structural and Transporter Genes for, and the Chemical and Biological Properties of Sublancin 168, a Novel Lantibiotic Produced by Bacillus subtilis 168 22. Ronald Dorenbos, Torsten Stein, Jorrit Kabel, Claude Bruand, Albert Bolhuis, Sierd Bron, Wim J. Quax, and Jan Maarten van Dij, 2002. Thiol-Disulfide Oxidoreductases Are Essential for the Production of the Lantibiotic Sublancin 168, J. Biol. Chem, doi:10.1074/jbc.M201158200. American society for microbiology.American 37 23. Torsten Stein, Stefanie Düsterhus, Anke Stroh, and Karl-Dieter Entian, 2004, Subtilosin Production by Two Bacillus subtilis Subspecies and Variance of the sbo-alb Cluster, Appl Environ Microbiol, 10.1128/AEM.70.4.2349-2353.2004. American society for microbiology.American 24. Guolu Zheng, Robin Hehn, and Peter Zuber, 2000. Mutational Analysis of the sbo-alb Locus of Bacillus subtilis: Identification of Genes Required for Subtilosin Production and Immunity, J Bacteriol, 182(11): 3266–3273. American Society for Microbiology 25. Guolu Zheng, Liang Z. Yan, John C. Vederas, and Peter Zuber, 1999. Genes of the sbo-alb Locus of Bacillus subtilis Are Required for Production of the Antilisterial Bacteriocin Subtilosin, Journal of Bacteriology p. 7346-7355, Vol. 181, No. 23 0021-9193/99/$04.00+0. American Society for Microbiology 26. Torsten Stein, Stefan Heinzmann, Stefanie Düsterhus, Stefan Borchert,1 and Karl-Dieter Entian, 2005. Expression and Functional Analysis of the Subtilin Immunity Genes spaIFEG in the Subtilin-Sensitive Host Bacillus subtilis MO1099, Journal of Bacteriology, No.3 0021-9193/05/$08.00+0. American Society for Microbiology. American 27. C. KLEIN, C. KALETTA, AND K.-D. ENTIAN, 1993. Biosynthesis of the Lantibiotic Subtilin Is Regulated by a Histidine Kinase/Response Regulator System, Applied and Enviromental Microbiology, 0099-2240/93/010296- 08$02.00/0. American Society for Microbiology. American 28. C. KLEIN AND K.-D. ENTIAN, 1994. Genes Involved in Self-Protection against the Lantibiotic Subtilin Produced by Bacillus subtilis ATCC 6633, Applied and Enviromental Microbiology No. 8 0099-2240/94/$04.00+0. American Society for Microbiology. American 29. YONG JOON CHUNG, MARK T. STEEN, AND J. NORMAN HANSEN, 1992. The Subtilin Gene of Bacillus subtilis ATCC 6633 Is Encoded in an Operon That Contains a Homolog of the Hemolysin B Transport Protein, Journal of Bacteriology, o. 4, 21-9193/92/041417-06$02.00/0, Journal of Bacteriology. American Society for Microbiology. American 38 30. Axel G. Stưver and Adam Driks, 1999. Regulation of Synthesis of the Bacillus subtilis Transition-Phase, Spore-Associated Antibacterial Protein TasA. Journal of Bacteriology. No. 17 0021-9193/99/$04.00+0. American Society for Microbiology. American 31. Harold Tjalsma, Axel G. Stưver, Adam Driks, Gerard Venema, Sierd Bron, and Jan Maarten van Dijl, 2000. Conserved Serine and Histidine Residues Are Critical for Activity of the ER-type Signal Peptidase SipW of Bacillus subtilis. J. Biol. Chem. 33, 25102-25108,. American Society for Microbiology. American 32. Axel G. Stưver and Adam Driks, 1999. Control of Synthesis and Secretion of the Bacillus subtilis Protein YqxM. Journal of Bacteriology, No. 22 0021- 9193/99/$04.00+0. American Society for Microbiology. American 33. Axel G. Stưver and Adam Driks, 1999. Secretion, Localization, and Antibacterial Activity of TasA, a Bacillus subtilis Spore-Associated Protein. J Bacteriol. 181(5): 1664–1672. American Society for Microbiology. American 34. Stephan A. Sieber and Mohamed A. Marahiel, 2003. Learning from Nature's Drug Factories: Nonribosomal Synthesis of Macrocyclic Peptides. J Bacteriol, (24): 7036–7043. American Society for Microbiology. American 35. DIRK VOLLENBROICH,1 GEORG PAULI,2 MUHSIN OZEL,2 AND JOACHIM VATER1, 1997. Antimycoplasma Properties and Application in Cell Culture of Surfactin, a Lipopeptide Antibiotic from Bacillus subtilis. Appied and enviromental microbiology. No. 1 0099-2240/97/$04.0010. American Society for Microbiology. American 36. Harold Tjalsma, Albert Bolhuis, Jan D. H. Jongbloed, Sierd Bron, and Jan Maarten van Dij, 2000. Signal Peptide-Dependent Protein Transport in Bacillus subtilis: a Genome-Based Survey of the Secretome. Microbiol Mol Biol Rev, 64(3): 515–547. American Society for Microbiology. American 39 PHỤ LỤC A B CHình 2.2 : A , cấu trúc của subtilin , B, thứ tự các gene trên operon spaIFEG 40 Hình 2.3A : A , cấu trúc của subtilocin . B , trình tự các amino acid của presubtilocin Hình 2.3B: Cấu trúc operon của subtilocin . Operon của subtilocin gồm 1 gene sboA mã hĩa cho tiền peptide của subtilocin và 7 gene albA , albB , albC , albD , albE , albF , albG mã hĩa cho các protein tổng hợp và phân tiết subtilocin . Giữa 2 gene sboA và albA cĩ một cấu trúc terminator 41 Hình 2.4A : Cấu trúc của sublancin . Cĩ 4 Cys trong chuỗi peptide của sublancin hình thành 2 cầu nối disulfic , một cầu nối sulfic giữa -methyllanthionine và dehydrobutyrine .Trong cấu tạo của sublancin cịn cĩ một dehydroxyalanine ở vị trí amino acid ở vị trí 16 . Hình 2.4 B: Trình tự của chuỗi amino acid của pre-sublancin . Trên trình tự của chuỗi tín hiệu cĩ 1 motif GS giúp cho phần peptide cĩ hoạt tín peptidase của SunT nhận biết và cắt đoạn tín hiệu để giải phĩng sublancin ở dạng hồn chỉnh 42 Hình 2.5 : A , trình tự amino acid tiền chất của TasA . B , cấu trúc operon của TasA Hình 2.5B : Vị trí của TasA trong quá trình hình thành bào tử 43 A B C Hình 2.6 : A , cấu trúc của surfactin . B , cấu trúc và quá trình điều hịa của srf operon . C , quá trình tổng hợp chuỗi peptide của surfactin : Cầu nối lacton 44 A B C Hình 2.7 : A, cấu trúc của fengycin . B, cấu trúc operon của fengycin . C . trình tự nucleotide trên phần upstream của operon fen . 2 promotor ở vị trí -35 và -10 cĩ điểm khởi đầu dịch mã là TATGG +1(6) đƣợc điều hịa bởi yếu tố điều hịa A , 2 promotor ở vị trí -35F và -10F cĩ điểm khởi đầu dịch mã là CTTTT +1(20) đƣợc điều hịa bởi yếu tố điều hịa : Cầu nối macrolacton 45 A Hình 2.8A : Cấu trúc của mycosubtilin : Cầu nối Macrolactam B Hình 2.8B : Cấu trúc của Mycosubtilin operon Hình 2.8C : Qúa trình tổng hợp acid béo , gắn nhĩm amine vào vị trí và tạo liên kết với Asn 46 Hình 2.9 : Quá trình tổng hợp bacilysocin , phản ứng 1 đƣợc thực hiện bởi enzyme CDP diglyceride synthase , phản ứng 2 đƣợc xúc tác bởi phosphatidylglycerol- phosphate synthase , phản ứng 3 đƣợc xúc tác bởi phosphatidylglycerol-phosphate phosphatase.